CN113358447B - 一种真菌细胞阳性蜡块及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种真菌细胞阳性蜡块及其制备方法和应用。所述制备方法,包括培养真菌,将真菌加入液态培养基中培养,待真菌细胞培养达到预定数量后,加入固定剂进行固定并灭活;制作真菌细胞阳性蜡块,在灭活后的溶液中加入对比细胞,混匀后离心,除去上清液得到沉淀物,加入液态琼脂,混匀后冷却凝固,加入固定剂进行固定,脱水、包埋,即得。液态培养基既能给真菌提供营养,又为后续使用琼脂作为介质制作细胞蜡块提供了便捷条件;加入对比细胞能使真菌散落在细胞和细胞团之中,在显微镜下观察真菌效果与检测组织更为接近,同时对比细胞可作为真菌染色的背景衬染,使真菌与背景对比清晰,更容易观察,制作方法简单容易操作,实用性强。
Description
技术领域
本发明涉及病理学技术领域,特别是涉及一种真菌细胞阳性蜡块及其制备方法和应用。
背景技术
真菌也称霉菌,广泛存在于自然界,大部分为非致病性,少数可感染人体形成真菌病。在临床病理诊断中,如能证实真菌感染,可为临床医生对患者进行抗感染治疗提供依据。在HE切片上不容易观察到组织细胞内的真菌,通过特殊染色可以很好的显示出真菌,为真菌感染的病理诊断提供证据。
在真菌特殊染色中,如果未设置阳性对照并且检测的组织片是阴性,就很难判断是组织本身没有真菌感染还是染色操作不成功。因此,在特殊染色中,阳性对照的设立是一个十分重要的质控措施,通常的做法是在每一张待染色片中设置一个已知阳性的组织作为对照,以保证染色结果的可靠性,同时为病理医生判断组织细胞是否有真菌提供对照参考。但在日常工作中,由于真菌的阳性标本不多见或已有阳性组织太小难以留存等原因,阳性对照组织不容易获得,所以染色操作时设立阳性对照较为困难。
发明内容
针对上述问题,本发明提供一种真菌细胞阳性蜡块的制备方法,制备得到的真菌细胞阳性蜡块接近真实的真菌感染组织细胞结构,用于阳性对照试验观察更真实,有效地保证真菌阳性片的来源,弥补了不便从日常组织样本中存留和获取阳性对照标本的缺点,便于进行染色质量控制,从而保证染色质量。
为了达到上述目的,采用了一种真菌细胞阳性蜡块的制备方法,包括以下步骤:
培养真菌:将真菌加入液态培养基中培养,待真菌细胞培养达到预定数量后,加入固定剂进行固定并灭活;
制作真菌细胞阳性蜡块:在灭活后的溶液中加入对比细胞,混匀后离心,除去上清液得到沉淀物,加入液态琼脂,混匀后冷却凝固,加入固定剂进行固定,脱水、包埋,即得。
上述制备方法中,液态培养基能给真菌提供营养,且为后续使用琼脂作为介质制作细胞蜡块提供了便捷条件;加入对比细胞能使真菌散落在细胞和细胞团之中,在显微镜下观察真菌效果与检测组织更为接近,同时对比细胞可作为真菌染色的背景衬染,使真菌与背景对比清晰,制备得到的真菌细胞阳性蜡块接近真实的真菌感染组织细胞结构,用于阳性对照试验观察更真实,更容易观察,制作方法简单容易操作,实用性强。
在其中一个实施例中,所述液态培养基为淀粉酶溶液,浓度为1wt%-5wt%。使用上述浓度的淀粉酶溶液在适宜的温度条件下非常适合真菌生长,作为培养基培养真菌,不仅原料容易获取,且培养条件也容易达到,操作简便,效果好。
在其中一个实施例中,所述淀粉酶溶液中的淀粉酶为α-淀粉酶。所述α-淀粉酶溶液易于获取,且能满足真菌生长的营养需求。
在其中一个实施例中,所述真菌细胞和所述对比细胞的浓度比为1:1-2,所述液态琼脂和沉淀物的体积比为1:0.5-1.5。在上述条件下,真菌细胞和对比细胞的参照对比更清晰明显,更容易观察。
在其中一个实施例中,所述对比细胞为胸腹水沉淀细胞。所述胸腹水沉淀细胞常见易得,且细胞含量丰富,将真菌混杂在这些脱落细胞中,所制作出来的真菌阳性蜡块,较接近真实的真菌感染的组织细胞结构,用于阳性对照实验观察更真实。
在其中一个实施例中,所述胸腹水沉淀细胞包括:组织脱落细胞、白细胞和红细胞,或包括组织脱落细胞、白细胞、红细胞和肿瘤细胞。所述胸腹水沉淀细胞含有多种细胞成分,能更加真实地模拟真菌感染后的组织细胞结构。
在其中一个实施例中,所述固定剂为体积百分浓度10±2%的中性缓冲福尔马林液;所述培养真菌步骤中,所述固定并灭活的时间为4-8小时;所述制作真菌细胞阳性蜡块步骤中,所述固定时间为4-8小时。上述中性缓冲福尔马林液具有较强的组织穿透能力,组织固定效果好,能更好地保持组织的抗原性,有利于后续检测;上述固定、灭活步骤能尽量完整地保留真菌形态,将松散的真菌凝聚在一起。
在其中一个实施例中,所述制作真菌细胞阳性蜡块步骤中,所述离心的转速为2000-3000rpm、时间为5-10分钟。上述步骤能使真菌细胞和对比细胞混合均匀,更接近真实的真菌感染组织细胞结构,用于阳性对照试验观察更真实。
本发明还提供了所述制备方法得到的真菌细胞阳性蜡块。所述真菌细胞阳性蜡块,含有数量较多的真菌,可以把蜡块分割成小块备用,能大量用于日常各种真菌特殊染色的阳性对照。
本发明还提供了所述真菌细胞阳性蜡块在真菌特殊染色阳性对照中的应用。所述应用,有效保证了真菌阳性片的来源,弥补了不便从日常组织样本中存留和获取阳性对照标本的缺点,使每张真菌染色片都能设立阳性对照,便于进行染色质量控制,从而保证了染色质量。
本发明还提供了一种真菌特殊染色方法,包括以下步骤:
阳性蜡块染色:取所述制备方法得到的真菌细胞阳性蜡块,将所述真菌细胞阳性蜡块切片后染色,用作阳性参考。
上述真菌特殊染色方法,可使真菌细胞阳性蜡块在显微镜下观察到大量的真菌,对比清晰,容易观察,保证染色质量,便于进行染色质控。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明的一种真菌细胞阳性蜡块及其制备方法和应用,所述真菌细胞阳性蜡块,采用液态培养基制备,既能给真菌提供营养,又为后续使用琼脂作为介质提供了便捷条件;加入了对比细胞,能使真菌散落在细胞和细胞团之中,在显微镜下观察真菌效果与检测组织更为接近,且对比细胞可作为真菌染色的背景衬染,使真菌与背景对比清晰,更容易观察。同时,本发明的真菌细胞阳性蜡块含有数量较多的真菌,可以把蜡块分割成小块备用,能大量用于日常各种真菌特殊染色的阳性对照,制作方法简单容易操作,实用性强。
附图说明
图1是本发明实施例2真菌细胞阳性蜡块经六胺银法染色后的高倍放大图;
图2是本发明实施例3真菌细胞阳性蜡块经高碘酸-无色品红法染色后的高倍放大图。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
定义:
本发明所述的特殊染色:指为了显示与确定组织或细胞中的正常结构或病理过程中出现的异常物质、病变及病原体等,需要分别选用相应的显示这些成分的染色方法进行染色。其中,对于真菌常用的特殊染色方法为六胺银法(GMS法)、高碘酸-无色品红法(PAS法)。
六胺银法(GMS法):用铬酸氧化真菌壁的多糖而暴露出醛基,醛基还原六胺银内的银离子为黑色的金属银而显色。
高碘酸-无色品红法(PAS法):用高碘酸氧化真菌菌壁的多糖游离出醛基,后者与无色品红结合生成新的品红色复合物而被显色。
试剂、材料来源:淀粉酶溶液(珠海贝索公司,货号BA4187B)。
本实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明,均为市售来源;实验方法如无特殊说明,均为本领域的常规实验方法。
实施例1
制备真菌细胞阳性蜡块。
1、获取真菌标本:在阴暗潮湿处的墙壁上刮取真菌。本实施例中刮取得到的真菌包括曲菌、念珠菌等。
2、培养真菌:取一支5ml的试管,加入浓度为1wt%-5wt%的淀粉酶溶液1-3ml,在本实施例中,所述淀粉酶溶液为浓度1wt%的α-淀粉酶溶液2ml;将刮取的真菌放入所述淀粉酶溶液中,混匀,试管加盖塞紧放入37±5℃恒温培养箱内培养72±5小时待真菌细胞培养达到预定数量,在本实施例中,恒温培养箱温度为37℃,培养72小时;最后加入10%中性缓冲福尔马林液1-3ml,固定和灭活4-8小时,在本实施例中,加入10%中性缓冲福尔马林液2ml,固定和灭活6小时。
3、制作真菌细胞阳性蜡块:吸取0.3-0.7ml的胸腹水沉淀细胞,在本实施例中吸取0.5ml的胸腹水沉淀细胞,加入到上述固定好的真菌淀粉酶溶液内,混匀;再以2000-3000rpm转速离心5-10分钟,在本实施例中离心转速为2500rpm,离心时间为5分钟;弃去上清液,将沉淀物混匀,按体积比1:1的比例加入已加热溶化的琼脂,混匀;再将整个试管放入3-5℃冰箱冷却5-15分钟,在本实施例中,冰箱温度为4℃,冷却时间为10分钟,使琼脂硬化细胞凝固成团;然后用一次性竹签将琼脂块从离心管取出,使用切片刀将琼脂块切成厚度0.5-2mm的小块,在本实施例中厚度为1mm,放入脱水盒中,再放入10%中性缓冲福尔马林液固定4-8小时,在本实施例中,放入10%中性缓冲福尔马林液固定4小时;常规脱水、包埋,即得。
实施例2
六胺银法进行真菌特殊染色。
1、特殊染色:将实施例1中得到的真菌细胞阳性蜡块切片,按六胺银法(GMS法)进行真菌染色;
2、染色结果:显微镜下可观察到大量的真菌,真菌菌丝和孢子呈棕黑色至黑色,背景呈成绿色(复染亮绿),如图1所示,对比清晰。
实施例3
高碘酸-无色品红法进行真菌特殊染色。
1、特殊染色:将实施例1中得到的真菌细胞阳性蜡块切片,按高碘酸-无色品红法(PAS法)进行真菌染色;
2、染色结果:显微镜下可观察到大量的真菌,真菌菌丝和孢子呈紫红色,细胞核呈蓝色(复染苏木精),如图2所示,对比清晰。
实施例4
采用全血细胞作为对比细胞。
获取真菌标本、培养真菌:与实施例1相同;
制作真菌细胞阳性蜡块:吸取0.5ml的全血细胞,加入到上述固定好的真菌淀粉酶溶液内,混匀,其他操作与实施例1相同;
特殊染色:将上述操作得到的真菌细胞阳性蜡块切片,按高碘酸-无色品红法(PAS法)进行真菌染色;
染色结果:显微镜下可观察到大量的真菌,背景为一片红染的红细胞,对比度较差,跟真实病例切片差距较大。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (4)
1.一种真菌细胞阳性蜡块的制备方法,其特征在于,该真菌包括曲菌或念珠菌,该制备方法包括以下步骤:
培养真菌:将真菌加入液态培养基中培养,待真菌细胞培养达到预定数量后,加入固定剂进行固定并灭活;所述液态培养基为淀粉酶溶液,浓度为1wt%-5wt%;所述固定剂为体积百分浓度10±2%的中性缓冲福尔马林液;所述固定并灭活的时间为4-8小时;
制作真菌细胞阳性蜡块:在灭活后的溶液中加入对比细胞,所述真菌细胞和所述对比细胞的浓度比为1:1-2,所述对比细胞为胸腹水沉淀细胞,混匀后离心,除去上清液得到沉淀物,加入液态琼脂,所述液态琼脂和沉淀物的体积比为1:0.5-1.5,混匀后冷却凝固,加入固定剂进行固定,脱水、包埋,即得;所述胸腹水沉淀细胞包括:组织脱落细胞、白细胞和红细胞,或包括组织脱落细胞、白细胞、红细胞和肿瘤细胞;所述固定时间为4-8小时;所述离心的转速为2000-3000rpm、时间为5-10分钟。
2.权利要求1所述的制备方法得到的真菌细胞阳性蜡块。
3.权利要求2所述的真菌细胞阳性蜡块在真菌特殊染色阳性对照中的应用。
4.一种真菌特殊染色方法,其特征在于,包括以下步骤:
阳性蜡块染色:取权利要求1所述的制备方法得到的真菌细胞阳性蜡块,将所述真菌细胞阳性蜡块切片后染色,用作阳性参考。
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