CN112574943A

CN112574943A - 一种体外模拟皮肤癣菌感染的模型及其建立方法和应用

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Publication number: CN112574943A
Application number: CN202011466649.4A
Authority: CN
Inventors: 王韫芳; 王璇; 张伟; 宿钰鑫
Original assignee: Shenzhen Yujie Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Yujie Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2020-12-14
Filing date: 2020-12-14
Publication date: 2021-03-30
Anticipated expiration: 2040-12-14
Also published as: CN112574943B

Abstract

本发明公开一种体外模拟皮肤癣菌感染的模型及其建立方法和应用，属于生物工程技术领域。本发明提供的体外模拟皮肤癣菌感染的模型包括基质胶、包埋在凝固的基质胶中的表皮类似物和癣菌菌丝，其中表皮类似物呈相对完整的实心球体结构，其外部为环绕分布的由基底层细胞和基底上层细胞组成的细胞层，内部为角化样非细胞层；菌丝侵入球体结构外部的基底层细胞且未侵入或仅少量侵入基底上层细胞，并且未侵入球体结构内部的角化样非细胞层；其可以有效模拟皮肤癣菌感染正常皮肤组织的状态，并且该模型可以在相差显微镜下直接观察感染过程，并可以利用高通量RNA测序等组学方法检测感染情况，可以有效用于研究皮肤癣菌感染的致病机理和筛选抗癣菌药物。

Description

一种体外模拟皮肤癣菌感染的模型及其建立方法和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种建立体外模拟皮肤癣菌感染的模型及其建立方法和在皮肤癣菌感染的致病机理研究和在抗癣菌药物筛选中的应用。

背景技术

皮肤癣菌感染，俗称“脚气病”，是最常见的人体真菌感染类型，感染通常局限于表皮层，绝大多数由特异性噬人表皮组织的红色毛癣菌引起。皮肤癣菌感染的临床及病理特征为慢性反复性感染，角化皮肤组织增厚、脱落，炎症反应较为轻微，但人体自身难以根除，病原体与人体宿主之间形成了较好的适应性。虽然并非严重的威胁生命的疾病，但这类感染经常性的引发人体局部疼痛不适，造成不良的社交后果，长期影响人的生活质量。然而，当前对于人体皮肤癣菌感染的致病机理尤其是其引发的慢性反复性感染且伴随皮肤轻微炎症的分子机制依然不清楚，而且也缺乏非常有效的根治性药物。解决这些问题有赖于合适的人皮肤癣菌感染疾病模型来对这类疾病进行深入的致病机理研究，进而用以发现新的治疗靶点和研发有效性药物。

目前，现有技术中有两大类经典的表皮模型用于皮肤癣菌感染的研究：1)二维培养的人原代角质细胞(皮肤干/祖细胞)，其仅具有单一细胞类型(类似于表皮的基底层干/祖细胞)，而缺乏体内表皮组织中如棘层细胞、颗粒层细胞以及角化层的非细胞物质等，该表皮模型不能模拟人体表皮组织的三维多细胞层有序的组织结构，因而难以真实再现人体表皮组织感染后的病理生理学反应，在皮肤癣菌致病机理研究中难以应用。2)气液相交培养方式产生的表皮类似物(文献1—Faway

Cambier L,Mignon B,Poumay Y,Lambert deRouvroit C.Modeling dermatophytosis in reconstructed human epidermis:A newtool to study infection mechanisms and to test antifungal agents.MedMycol.2017Jul 1；55(5):485-494.)，该文献1的表皮类似物(epidermis equivalent)中除了含有基底层干/祖细胞外、还包含分化的基底上层细胞，如棘层细胞、颗粒层细胞以及角化层的非细胞物质(即角化样非细胞层)等，而且这些细胞和组份在表皮类似物内有序排列成层状结构，如图1所示，该层状结构很好地模拟了体内表皮的组织结构特征，角化层朝向外部环境，基底层和基底上层等的细胞层处于内侧，作为仿生皮应用值得期盼。但是，利用这种结构建立的感染模型在皮肤癣菌感染后，在感染早期由于最外层角化层物质的阻挡，癣菌难以直接接触下层细胞，因而难以引发明显的细胞反应，也就阻碍了对于感染引发的细胞免疫响应研究；而当延长感染时间使癣菌可以穿透角化层物质直接接触细胞时，又会造成大量的癣菌繁殖并且紧紧黏附于表皮类似物的角化层物质而不利于使用高通量的组学方法(例如高通量RNA测序)进行感染机制的深入挖掘和新的致病机理的探索。另外，气液相交培养方式产生的模型的构建需要大量的起始皮肤细胞，且构建过程长而复杂，因而在皮肤癣菌感染的研究上难以大规模化应用；并且由于气液相交的培养方式的特殊性(即气液相交培养顶层不加液体，直接跟空气接触，下层加液体)，使得利用该方法建立的模型不易在显微镜下观察感染的进程。

发明内容

针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明的一个方面提供一种体外模拟皮肤癣菌感染的模型的建立方法，其包括以下步骤：

1)将至少一个具有分化功能的表皮细胞包埋在凝固的基质胶A中；

2)采用第一培养基培养包埋在凝固的基质胶A中的表皮细胞1～3天，再换为第二培养基继续培养5～8天，获得包埋在凝固的基质胶A中的细胞球；

3)将所述细胞球从凝固的基质胶A中游离出来，将游离出来的细胞球用含有癣菌(例如红色毛癣菌)分生孢子的基质胶B重悬并孵育使基质胶B凝固，使得细胞球和癣菌分生孢子包埋在凝固的基质胶B中；所述细胞球定义为表皮类似物，为实心球体结构，其外部环绕分布有由基底层细胞和基底上层细胞组成的细胞层，内部为角化样非细胞层；所述癣菌分生孢子分散在基质胶B中且未侵入表皮类似物的细胞层；

4)采用第三培养基共培养包埋在凝固的基质胶B中的表皮类似物和癣菌分生孢子20～26小时，建立体外模拟皮肤癣菌感染的模型；所述模型中包括包埋在凝固的基质胶B中的表皮类似物和由癣菌分生孢子生长产生的菌丝，其中：菌丝侵入球体结构外部的细胞层中的基底层细胞且未侵入或仅少量侵入基底上层细胞，且未侵入球体结构内部的角化样非细胞层，表皮类似物的球体结构相对完整。

上述方法中，步骤2)中所述第一培养基的配方为：Advanced DMEM/F12培养基+0.01％～1％BSA+0.2％～5％B-27细胞培养添加物+0.5％～1％谷氨酰胺添加剂+0.1～10mM N-乙酰基-L-半胱氨酸+1～10mM HEPES+5～20μM Forskolin+50～200ng/mL Wnt3a+20～100ng/mL EGF+10～1000U/mL青霉素+0.01～1mg/mL链霉素；所述第一培养基的配方优选为：Advanced DMEM/F12培养基+0.1％BSA+1％B-27细胞培养添加物+1％谷氨酰胺添加剂+10mM HEPES+1mM N-乙酰基-L-半胱氨酸+10μM Forskolin+100ng/mL Wnt3a+50ng/mL EGF+100U/mL青霉素+0.1mg/mL链霉素；

第二培养基的配方为：Advanced DMEM/F12培养基+0.01％～1％BSA+0.2％～5％B-27细胞培养添加物+0.5％～1％谷氨酰胺添加剂+0.1～10mM N-乙酰基-L-半胱氨酸+1～10mM HEPES+5～20μM Forskolin+50～200ng/mL Wnt3a+20～100ng/mL EGF+0.1～5μMA83-01+10～1000U/mL青霉素+0.01～1mg/mL链霉素；所述第二培养基的配方优选为：Advanced DMEM/F12培养基+0.1％BSA+1％B-27细胞培养添加物+1％谷氨酰胺添加剂+10mMHEPES+1mM N-乙酰基-L-半胱氨酸+10μM Forskolin+100ng/mL Wnt3a+50ng/mL EGF+1μMA83-01+100U/mL青霉素+0.1mg/mL链霉素。

上述方法中，步骤3)中将所述细胞球从凝固的基质胶A中游离出来的具体操作为：将包埋有细胞球的基质胶A置于含有培养基(例如第一培养基、第二培养基和第三培养基中的一种或其组合)的管中，将该管在冰上放置30-60分钟使凝固的基质胶A溶化游离出其中的细胞球，获得该细胞球。

上述方法中，步骤3)中含有癣菌分生孢子的基质胶B中癣菌分生孢子的浓度为1×10⁵～3×10⁵个分生孢子/μl；所述孵育的条件为：置于37±1℃的细胞培养箱中孵育5～10min。

上述方法中，步骤1)所述具有分化功能的表皮细胞为表皮干/祖细胞；步骤3)中所述基底层细胞为表皮干/祖细胞，其向外接触基质胶B，向内包围由基底层细胞分化产生的基底上层细胞，所述基底上层细胞向内包围角化样非细胞层；所述基底上层细胞包括棘层细胞和颗粒层细胞，所述角化样非细胞层包括死亡的颗粒层细胞和/或由其分泌的物质。

上述方法中，步骤4)中所述第三培养基的配方为：Advanced DMEM/F12培养基+0.01％～1％BSA+0.2％～5％B-27细胞培养添加物+0.5％～1％谷氨酰胺添加剂+0.1～10mM N-乙酰基-L-半胱氨酸+1～10mM HEPES+5～20μM Forskolin+50～200ng/mL Wnt3a+20～100ng/mL EGF+0.1～5μM A83-01；所述第三培养基的配方优选为：Advanced DMEM/F12培养基+0.1％BSA+1％B-27细胞培养添加物+1％谷氨酰胺添加剂+10mM HEPES+1mM N-乙酰基-L-半胱氨酸+10μM Forskolin+100ng/mL Wnt3a+50ng/mL EGF+1μM A83-01。

上述方法中，步骤4)中共培养的时间为24小时。

本发明的另一方面提供一种体外模拟皮肤癣菌感染的模型，其由上述的方法建立。

本发明又一方面提供一种体外模拟皮肤癣菌感染的模型，其包括基质胶、包埋在凝固的基质胶中的表皮类似物和癣菌菌丝，其中：表皮类似物呈相对完整的实心球体结构，其外部为环绕分布的由基底层细胞和基底上层细胞组成的细胞层，内部为角化样非细胞层；其中所述基底层细胞向外接触基质胶，向内包围所述基底上层细胞，所述基底上层细胞向内包围角化样非细胞层；所述菌丝侵入球体结构外部的细胞层中的基底层细胞且未侵入或仅少量侵入基底上层细胞，并且未侵入球体结构内部的角化样非细胞层。

上述的体外模拟皮肤癣菌感染的模型在皮肤癣菌感染的致病机理研究和在抗癣菌药物筛选中的应用也属于本发明的内容。

基于以上技术方案提供的体外模拟皮肤癣菌感染的模型的建立方法通过培养包埋在凝固的基质胶A中的具有分化功能的表皮细胞获得包埋在凝固的基质胶A中的细胞球，随后将该细胞球从凝固的基质胶A中游离出来，再用含有癣菌分生孢子的基质胶B重悬并使基质胶B凝固，然后共培养包埋在凝固的基质胶B中的细胞球和癣菌分生孢子，即可建立一种体外模拟皮肤癣菌感染的模型。建立的模型包括基质胶、包埋在凝固的基质胶中的细胞球和癣菌菌丝，其中细胞球为呈相对完整的实心球体结构，其外部为环绕分布的由基底层细胞和基底上层细胞组成的细胞层，内部为角化样非细胞层；其中基底层细胞向外接触基质胶，向内包围基底上层细胞，而基底上层细胞则向内包围角化样非细胞层，因此该细胞球可以模拟人正常皮肤组织，称为表皮类似物(epidermis equivalent)；癣菌菌丝侵入表皮类似物球体结构外部的细胞层中的基底层细胞且未侵入或仅少量侵入基底上层细胞，并且未侵入球体结构内部的角化样非细胞层，因此该模型可以模拟癣菌感染后直接接触基底层细胞及基底上层细胞时所引发的细胞免疫反应。

与现有皮肤癣菌感染的模型相比，本发明具有以下优点：

1)本发明建立的体外模拟皮肤癣菌感染的模型中表皮类似物为呈实心球体结构，其外部为环绕分布的由基底层细胞和基底上层细胞组成的细胞层，内部为角化样非细胞层；其中基底层细胞向外接触模型中的基质胶，向内包围基底上层细胞，而基底上层细胞则向内包围角化样非细胞层。这样的结构有利于模型中癣菌感染表皮类似物后直接接触其基底层细胞及基底上层细胞从而可以较为容易的模拟癣菌感染引发的细胞免疫响应。

2)本发明提供的建立体外模拟皮肤癣菌感染的模型的方法中，先将包埋在凝固的基质胶中的细胞球从基质胶A中游离出来，然后再用含有癣菌分生孢子的基质胶B重悬，随后孵育使含有细胞球和癣菌分生孢子的基质胶B凝固，其相对于直接将癣菌分生孢子与包埋在凝固的基质胶A中的细胞球共培养的方式更有利于癣菌分生孢子容易且均匀接触细胞球外部的细胞层，进而更有利于癣菌感染细胞球外部的细胞层中细胞。

3)本发明提供的体外模拟皮肤癣菌感染的模型包括基质胶、包埋在凝固的基质胶中的表皮类似物和癣菌菌丝，其中不含有液体成分，因此可在相差显微镜下直接观察癣菌感染呈球体结构的表皮类似物外部环绕的细胞过程，这样有利于选择合适的感染时间点也即癣菌已经接触到细胞但又未大量繁殖的时期，也有利于筛选抗癣菌的药物。而且，由于角化样非细胞层位于球体结构内部，癣菌不接触角化样非细胞层因此不会紧紧黏附于球体结构表面而造成癣菌遗传物质大量污染表皮类似物，故而可以利用高通量的RNA测序等组学方法来研究感染所引发的宿主细胞反应，因此利用本发明方法建立的模型更加有利于使用组学的方法来深入挖掘皮肤癣菌感染机制或者研究新的致病机理以及更有利于筛选抗癣菌药物。

4)本发明在建立体外模拟皮肤癣菌感染的模型方法中能使用少至一个皮肤干/祖细胞(起始表皮细胞)，培养9天左右即可以建立模型；而文献1报道使用气液相交方法建立模型时的起始皮肤细胞则需要密度范围为2.5-10×10⁵个细胞/cm²，需要的时间则为3-4周；可见本发明建立模型所需的起始细胞用量远远低于现有技术中的气液相交方法，而建立体外模拟皮肤癣菌感染的模型所需的时间也远远小于现有技术中的气液相交方法。

附图说明

图1为文献1采用气液相交方法建立的皮肤癣菌感染其表皮类似物的模型感染0h,1h,2h,4h,6h,24h的PAS染色图像；

图2为细胞球和人正常皮肤组织的H&E染色图像，其中A幅为人正常皮肤组织的H&E染色图像，B幅为细胞球的H&E染色图像；

图3为感染组和对照组的表皮类似物在0h,24h,36h的相差图像，其中A幅为对照组的表皮类似物在0h,24h,36h的相差图像，B幅为感染组的表皮类似物被红色毛癣菌感染后0h,24h,36h的相差图像；

图4为表皮类似物被红色毛癣菌感染后0h,24h,36h的糖原颗粒染色图像；

图5为表皮类似物被红色毛癣菌感染后24h,36h的透射电镜图像；

图6为本发明建立的模型中表皮类似物和人正常皮肤组织在表皮细胞分化、表皮干/祖细胞相关标志及其他非表皮细胞标志的免疫组织化学染色图像；

图7为本发明建立的模型中表皮类似物和人正常皮肤组织在表皮细胞分化、表皮干/祖细胞相关标志的免疫荧光染色图像；

图8为本发明建立的模型和对照组中表皮类似物的基因差异表达，其中A幅表示基因表达上调和下调的火山图；B幅表示上调基因的GO分析结果；C幅表示对照组和红色毛癣菌感染组中表皮细胞分化和角质化相关基因的表达的热敏图；D幅表示对照组和红色毛癣菌感染组中诱导的先天免疫相关基因的表达的热敏图；

图9为本发明建立的模型和对照组中表皮类似物的IL-1受体结合的基因水平的表达柱状图；

图10为本发明建立的模型和对照组中表皮类似物的IL-1RN和IL-36RN的免疫组织化学染色图像；

图11为本发明建立的模型和对照组中表皮类似物的细胞培养上清中IL-1RN的蛋白表达(A)，和细胞裂解液中IL-1RN的蛋白表达(B)；

图12为在本发明建立的模型中用抗癣菌药(两性霉素B)处理12h后的糖原颗粒染色图像(A)；及透射电镜图像(B)。

具体实施方式

本发明旨在提供一种体外模拟皮肤癣菌感染的新式模型以及该模型的建立方法和应用。该新式模型包括基质胶、包埋在凝固的基质胶中的表皮类似物和癣菌菌丝，其中表皮类似物为呈相对完整的实心球体结构，其外部为环绕分布的由基底层细胞和基底上层细胞组成的细胞层，内部为角化样非细胞层；癣菌菌丝侵入表皮类似物球体结构外部的细胞层中，且未侵入球体结构内部的角化样非细胞层。该模型可在相差显微镜下直接观察癣菌菌丝感染球状结构的表皮类似物的过程，且更够有效利用高通量RNA测序等组学方法检测感染情况，因此可用于皮肤癣菌感染的致病机理研究和在抗癣菌药物筛选。

以下结合具体实施例和附图详细说明本发明的内容。

在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook，J.，Russell，DavidW.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种试验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

本发明提及的所有引物用已有技术合成。

实施例1：建立体外模拟皮肤癣菌感染的模型的方法

该实施例建立一种体外模拟皮肤癣菌感染的模型，以下描述包括：获得模型中的细胞球(本文中也称表皮类似物)的过程，获取皮肤癣菌分生孢子的过程，以及用该分生孢子感染表皮类似物细胞建立体外模拟皮肤癣菌感染的模型的过程。

I、表皮类似物的获取

该步骤对具有分化功能的表皮细胞进行培养得到表皮类似物。可使用任何商业来源的或用现有文献的方法获取的表皮干/祖细胞。以下对从人废弃的包皮组织(包皮组织来源于解放军第五医学中心泌尿外科，已获得患者的知情同意)中分离的表皮干/祖细胞进行培养得到表皮类似物的操作进行示例性描述。

1.1、人包皮组织的分离

1)从医院取回的人废弃的包皮组织(皮肤组织)用含有5×Penicillin-Streptomycin(Gibco)的1×PBS(无Ca²⁺、Mg²⁺PBS的配制：将8g NaCl，0.2g KCl，0.24gKH₂PO₄，1.44g Na₂HPO₄溶于1L去离子水中，待充分溶解后使用0.22μm滤膜过滤并放入高压锅高压蒸汽灭菌后使用，下同)洗三遍，去除血渍污渍；

2)用眼科剪尽可能去除皮肤组织的皮下组织和脂肪组织；

3)用手术刀把皮肤组织裁成1×3cm宽度长度，转移至15mL离心管内，离心管内加入适量的2.5U/mL Dispase酶(Gibco)，将15mL离心管插入试管旋转混匀器(Thermo)在37℃孵箱消化1.5-2h；

4)Dispase酶消化结束后，取出皮肤组织，用眼科镊轻轻的撕开皮肤组织上的表皮组织，用眼科剪将表皮组织先剪成小块，再用手术刀把组织剁碎；

5)剁碎的组织转移至15mL离心管，加入2.5mg/mL Collagenase A(Roche),0.1mg/mL DNase I(Sigma-Aldrich)在37℃水浴锅内消化10-15min，每隔3-5分钟轻轻地上下颠倒几次，目的是防止组织在管底沉积而消化不充分；

6)消化10-15min后，显微镜下观察可以看到大量的皮肤细胞团块从组织上脱离下来，加入DMEM培养基(Gibco)终止；

7)4℃，1000rpm，离心5min；

8)离心得到的细胞团中加入适量的0.25％Trypsin-EDTA(Gibco)在37℃水浴锅内继续消化3-5min，直到把细胞消化成单个细胞；

9)消化得到的单个细胞，加入含血清的培养基(Advanced/DMEM-F12+10％FBS)终止消化，过40μm滤网；

10)4℃，1000rpm，离心5min；

11)用不含血清的DMEM培养基(Gibco)再清洗两到三遍，去除血清残留；

12)离心得到细胞沉淀(用1mL移液枪弃去上清液，尽量把上清液吸干净一点，避免之后加入基质胶时基质胶被稀释)，即得到散在的单个表皮细胞。

1.2、表皮细胞的扩增培养

对上述步骤1.1获得的表皮细胞进行扩增培养：

1)提前把BME-2(R&D)和/或Matrigel基质胶(Corning)置于4℃冰箱溶化备用；

2)用溶化好的BME-2或Matrigel轻轻重悬离心收集的表皮细胞，避免产生气泡；

3)向低吸附24孔板中按照每孔1×10²-1×10³个细胞/μL的密度，滴加30-50μL重悬有表皮细胞的BME 2或Matrigel悬液，37℃孵箱凝固5-10min，待胶凝固后，添加预热的用于扩增培养表皮细胞的第一培养基培养2天，再换为第二培养基继续培养，每隔两天更换一次第二培养基。在培养过程中包埋在基质胶中的人表皮细胞迅速增殖，并在继续培养后约5-8天形成若干单个直径约100-200μm的细胞球，这些细胞球分散包埋在凝固的基质胶中。

第一培养基配方可为：Advanced DMEM/F12培养基+0.01％-1％BSA(Sigma)+0.2％-5％B-27细胞培养添加物+0.5％-1％谷氨酰胺添加剂(Glutamax，均购自Gibco)+N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine，0.1-10mM，Sigma，为抗氧化剂)+1mM-10mMHEPES+Forskolin(5-20μM，Selleck，为腺苷酸环化酶激动剂)+Wnt3a(50-200ng/mL，R&D，为Wnt信号通路激动剂)+EGF(20-100ng/mL，R&D，为表皮细胞生长因子)+10-1000U/mL青霉素+0.01-1mg/mL链霉素；该实施例中具体为：Advanced DMEM/F12培养基+0.1％BSA+1％B-27细胞培养添加物+1％谷氨酰胺添加剂+10mM HEPES+N-乙酰基-L-半胱氨酸(1mM)+Forskolin(10μM)+Wnt3a(100ng/mL)+EGF(50ng/mL)+100U/mL青霉素+0.1mg/mL链霉素。

第二培养基的配方可为：Advanced DMEM/F12培养基+0.01％-1％BSA(Sigma)+0.2％-5％B-27细胞培养添加物+0.5％-1％谷氨酰胺添加剂(Glutamax，均购自Gibco)+N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine，0.1-10mM，Sigma，为抗氧化剂)+1mM-10mMHEPES+Forskolin(5-20μM，Selleck，为腺苷酸环化酶激动剂)+Wnt3a(50-200ng/mL，R&D，为Wnt信号通路激动剂)+EGF(20-100ng/mL，R&D，为表皮细胞生长因子)+A83-01(0.1-5μM，StemCell)+10-1000U/mL青霉素+0.01-1mg/mL链霉素；该实施例中具体为：Advanced DMEM/F12培养基+0.1％BSA+1％B-27细胞培养添加物+1％谷氨酰胺添加剂+10mM HEPES+N-乙酰基-L-半胱氨酸(1mM)+Forskolin(10μM)+Wnt3a(100ng/mL)+EGF(50ng/mL)+A83-01(1μM)+100U/mL青霉素+0.1mg/mL链霉素。

1.3、细胞球的鉴定

将细胞球和正常皮肤组织用苏木精-伊红染色(H&E染色)：

1)脱蜡与水化：将细胞球石蜡切片和人原代皮肤组织的石蜡切片浸没二甲苯2次，每次5分钟，100％乙醇2次，每次3分钟，95％乙醇3分钟，70％乙醇3分钟，蒸馏水冲洗；

2)苏木素染核10分钟，自来水冲洗；

3)1％稀氨水2分钟，自来水冲洗，95％乙醇浸泡1分钟；

4)伊红染色1.5分钟，自来水冲洗；

5)90％乙醇浸泡1分钟，无水乙醇浸泡4分钟，二甲苯10分钟，中性快干胶封片，采集图像。

图2A示出了人正常皮肤表皮组织中不同类型细胞的排列，其呈现出大小不一的多细胞组成的层状结构，小的基底层细胞位于内层，大的扁平的角化样非细胞层位于外层。图2B示出了按步骤1.2培养10天得到的某一细胞球的H&E染色结果，从形态上显示出由大小不一的多细胞组成的实心球状结构，由小的细胞组成的细胞层位于细胞球外部，大的扁平的角化样非细胞层位于细胞球内部且被外部细胞层细胞包围。经鉴定这些分散包埋在凝固的基质胶中的细胞球的细胞组成与人正常皮肤表皮组织细胞构成类似，球状结构的外部为由基底层细胞(表皮干/祖细胞)和基底上层细胞(棘层细胞和颗粒层细胞)组成的细胞层，球状结构的内部为角化样非细胞层(由死亡的颗粒层细胞及由其分泌的物质组成)，将该细胞球命名为表皮类似物。

II、红色毛癣菌和分生孢子的生产

该步骤使用从已被诊断为足癣的患者皮肤(已获得患者的知情同意)中通过常规微生物分离方法分离出典型的红色毛癣菌菌株作为感染用真菌。利用该分离出的毛癣菌菌株进行以下操作：

1)将红色毛癣菌菌株接种在沙氏葡萄糖琼脂(SDA)，在25℃孵箱内生长2周以达到融合；

2)刮除红色毛癣菌，并在25℃下于3％燕麦/1.5％琼脂上培养3周；

3)刮擦培养皿表面的癣菌，并将刮擦的癣菌加入无菌PBS；

4)将悬浮液通过40μm尼龙网过滤，以收集分生孢子；

5)收集的分生孢子在4℃，3000rpm，离心20分钟，用PBS洗涤两次；

6)得到的分生孢子悬浮在冷的PBS中，在4℃可以保存1个月。

III、体外模拟红色毛癣菌感染的模型的建立

一、该步骤利用上述步骤II中获得的红色毛癣菌分生孢子感染上述步骤I中培养获得的细胞球，具体包括以下操作：

1)将上述步骤I中培养获得的包埋有细胞球的凝固的基质胶(为与下面所用基质胶区分，步骤I中所用基质胶定义为基质胶A)置于含有少量的培养基(例如第一培养基、第二培养基、第三培养基或其组合)的离心管中，将该离心管在冰上放置30-60分钟使凝固的基质胶A溶化，基质胶A中的细胞球(表皮类似物)游离出来，使其沉淀(例如通过离心)，从沉淀中收集细胞球；

2)将收集到的细胞球(一个或多个)用浓度为2×10⁵个分生孢子/μl(感染组)的30μl基质胶B重悬；基质胶B可与基质胶A相同或不同；

3)在37℃孵箱使含有分生孢子和表皮类似物的基质胶B凝固5-10分钟；

4)基质胶B凝固(其中包埋有分生孢子和细胞球)以后，添加第三培养基进行培养。其中第三培养基的配方为：Advanced DMEM/F12培养基+0.01％～1％BSA+0.2％～5％B-27细胞培养添加物+0.5％～1％谷氨酰胺添加剂+0.1～10mM N-乙酰基-L-半胱氨酸+1～10mMHEPES+5～20μM Forskolin+50～200ng/mL Wnt3a+20～100ng/mL EGF+0.1～5μM A83-01；具体为：Advanced DMEM/F12培养基+0.1％BSA+1％B-27细胞培养添加物+1％谷氨酰胺添加剂+10mM HEPES+1mM N-乙酰基-L-半胱氨酸+10μM Forskolin+100ng/mL Wnt3a+50ng/mLEGF+1μM A83-01。

二、体外模拟红色毛癣菌感染表皮类似物的模型的确定实验

用不添加分生孢子的基质胶B同步操作(对照组)。在培养24h，36h后分别收取感染组和对照组的样品，即感染组和对照组的包埋有表皮类似物的基质胶B。

2.1、相差显微镜观察

对样品石蜡切片进行相差显微镜观察，如图3所示，相对于对照组(图3中A幅)，感染组(图3中B幅)在24小时后菌丝会附着在表皮类似物上，红色毛癣菌分生孢子已感染该表皮类似物，而在36小时后会有大量菌丝覆盖在表皮类似物上。

2.2、癣菌感染表皮类似物的糖原颗粒(PAS)染色

1)将癣菌感染0h，24h，36h的感染组样品4℃固定过夜，固定结束后，用PBS洗两遍；

2)按照75％酒精一遍、85％酒精一遍、95％酒精一遍、100％酒精两遍、二甲苯两遍、浸蜡步骤进行脱水，每步脱水时间15-20分钟；

3)石蜡包埋机包埋，石蜡切片机进行切片，切片厚度为4μm；

4)按照二甲苯两遍、100％酒精两遍、95％酒精一遍、85％酒精一遍、75％酒精进行石蜡切片脱蜡；

5)脱蜡结束后，用蒸馏水洗两遍；

6)加入高碘酸溶液(Periodic Acid Solution)，室温孵育5min；

7)加入希夫试剂(Schiff’s Reagent，Sigma)，室温孵育15min；

8)加入苏木素(Vector laboratories)溶液衬核15-20s；

9)用PBS洗三遍，每次洗5min，镜下观察并摄取图像(Perkin Elmer)。

如图4所示，被癣菌感染的表皮类似物在24小时后，PAS染色的结果表明，某些菌丝侵入表皮类似物外部的细胞层中的基底层细胞，且没有或仅有少量的菌丝侵入细胞层的基底上层细胞，但并未侵入表皮类似物球状结构内部的角化样非细胞层，表皮类似物球状结构仍保持相对完整。感染36小时后，向球状结构外部细胞层的基地上层细胞以及内部的角化样非细胞层侵入的菌丝的生长严重破坏了表皮类似物的结构。

2.3、癣菌感染表皮类似物的透射电镜

将癣菌感染24h，36h的样品用2.5％戊二醛在4℃冰箱固定过夜，固定好的细胞送至北京大学医学部电镜中心制样、切片、染色与照相。

如图5所示，其中N代表细胞核，T代表红色毛癣菌，可在24小时样品中观察到有少量的红色毛菌丝渗透入表皮类似物球状机构外部的基底层细胞，在36小时的样品中发现较多的红色毛菌丝侵入和显著的细胞破裂。

通过以上实验结果可知：

由于细胞的严重破坏以及癣菌的大量繁殖并不利于对癣菌疾病机理的深入研究，而且易受癣菌本身的干扰，以上2.1-2.3的结果均表明对表皮类似物癣菌感染24小时左右(例如20～26小时)建立的感染模型较为适合。即上述步骤4)可以为：基质胶B凝固以后，添加第三培养基进行培养，培养20～26小时建立体外模拟红色毛癣菌感染表皮类似物的模型。

三、体外模拟红色毛癣菌感染的模型中表皮类似物的表皮特性鉴定

3.1模型中表皮类似物和正常皮肤组织的免疫组织化学染色

1)脱蜡与水化：将用于模型中的表皮类似物石蜡切片和人原代皮肤组织的石蜡切片浸没二甲苯2次，每次5分钟，100％乙醇2次，每次3分钟，95％乙醇3分钟，70％乙醇3分钟，蒸馏水冲洗；

2)将石蜡切片置于沸腾枸橼酸钠缓冲液中抗原修复，加热保持沸腾10分钟，自然冷却；

3)过氧化物酶封闭液室温作用10分钟，1×TBS缓冲液冲洗；

4)将1滴马血清滴入2.5ml TBS中配成封闭液，室温封闭60min；

5)滴加抗生物素蛋白/生物素阻断试剂盒中A液，室温放置15分钟；

6)滴加抗生物素蛋白/生物素阻断试剂盒中B液，室温放置15分钟；

7)利用下表1中第一抗体4℃孵育过夜；

8)免疫组织化学试剂盒ABC KIT中1滴马血清加入2.5ml TBS缓冲液，再加1滴蓝色标签的生物素化的抗体，室温孵育60分钟；

9)免疫组织化学试剂盒ABC KIT中1滴灰色标签的A和1滴灰色标签的B加入2.5mlTBS中，室温孵育60分钟；

10)配制NovaRED染剂：2.5mL蒸馏水中按顺序加入1.5滴试剂1、1滴试剂2、1滴试剂3和1滴试剂4；

11)NovaRED染剂分别进行染色，并用苏木素衬染细胞核，常规脱水透明，中性快干胶封片，Vectra扫片采集图像。

表1：用于表皮类似物和正常皮肤组织免疫组织化学染色的第一抗体

使用上表1中所示的皮肤基底层和基底上层的细胞特异性标志物，将表皮类似物与人正常皮肤组织进行免疫组织化学染色，结果如图6所示，可见人正常皮肤组织中干性细胞标志整合素α6(ITGA6)、转录因子P63、角蛋白14(CK14)以及细胞增殖标志Ki-67在基底层表达，成熟分化标志外皮蛋白(Involucrin)、角蛋白1(CK1)在棘细胞层、颗粒层表达，黑色素细胞(gp100)散在分布于基底层，正常皮肤组织由基底层到颗粒层(由内向外)逐渐分化成熟。表皮类似物中的干性细胞标志ITGA6、P63、CK14以及细胞增殖标志Ki-67在细胞球外部(相当于人正常皮肤组织的基底层细胞)表达，黑色素细胞(gp100)散在分布于外部，细胞球的外部内侧主要为成熟分化标志外皮蛋白Involucrin、CK1的表达，相当于人正常皮肤组织的基底上层细胞(包括棘层细胞和颗粒层细胞)，表明获得的表皮类似物由外而内逐渐分化成熟，相当于人正常皮肤组织由基底层到颗粒层。

3.2、表皮类似物和人正常皮肤组织的免疫荧光

1)将用于模型中的表皮类似物和人正常皮肤组织用4％多聚甲醛(配方：将3.56gNaOH，42.7g PFA，13.6g KH₂PO₄溶于1L PBS中，磁力搅拌器65℃加热搅拌至澄清透亮后分装使用)4℃固定过夜，PBS洗两遍；

2)0.25％Triton X-100(Sigma)破膜10-15min，PBS洗两遍；

3)用和二抗种属来源相同的血清室温封闭1小时；

4)用和二抗种属来源相同的血清稀释一抗(如下表2中所示)，一抗的浓度按说明书进行稀释，一抗4℃冰箱孵育过夜，PBS洗三遍；

5)用和二抗(如下表3中所示)种属来源相同的血清稀释二抗，二抗室温避光孵育1小时，PBS洗三遍；

6)用DAPI(Sigma)衬染细胞核，室温避光孵育10分钟，PBS洗三遍；

7)水溶性封片剂封片；

8)激光共聚焦显微镜下观察并照相(Nikon TiE-A1)。

表2：用于表皮类似物和正常皮肤组织免疫荧光染色的第一抗体

表3：用于表皮类似物和正常皮肤组织免疫荧光染色的第二抗体

使用上表2和表3所示的皮肤干细胞/祖细胞标记物和皮肤分化标记物的免疫共染色结果如图7所示，可见表皮类似物有类似于人正常皮肤组织细胞结构的分层，和类似于人正常皮肤组织的标记物组成：CK14、ITGA6、Ki-67、整联蛋白β4(ITGB4)、CK5和SOX9主要在细胞球的外部(相当于基底层细胞)表达；在细胞球的内部(相当于角化样非细胞层)主要为Filaggrin和Involucrin表达，而在基底层细胞和角化样非细胞层之间(相当于基底上层细胞，其为基底层细胞分化的后代细胞，包括棘层细胞和颗粒层细胞)则主要为CK1和CK10的表达。

通过以上对用于模型中的表皮类似物的鉴定结果，明显可见该表皮类似物为实心球状结构，其外部环绕分布有由基底层细胞和基底上层细胞组成的细胞层，内部为角化样非细胞层，其中基底层细胞向外接触外部环境(模型的基质胶)，向内围绕基底上层细胞(包括棘层细胞和颗粒层细胞)，而基底上层细胞向内围绕球状结构的表皮类似物内部的角化样非细胞层，可见该球状结构的表皮类似物细胞由外向内逐渐分化成熟，细胞类型与人正常皮肤组织相同，因此该表皮类似物用于模型中能够模拟人正常皮肤组织，并且由此所建立的皮肤癣菌感染的模型，更加有利于癣菌感染后直接接触细胞球的基底层细胞及基底上层细胞从而可以较为容易的模拟癣菌感染所引发的细胞免疫响应。

综上所述，本发明建立了一种体外模拟红色毛癣菌感染的模型，该方法其先将包埋在凝固的基质胶A中的细胞球从基质胶A中游离出来，然后再用含有红色毛癣菌分生孢子的基质胶B重悬，随后孵育使含有细胞球和红色毛癣菌分生孢子的基质胶B凝固，这种方法相对于直接将红色毛癣菌分生孢子与包埋在凝固的基质胶A中的细胞球共培养的方式更有利于红色毛癣菌分生孢子容易且均匀接触细胞球的细胞，进而更有利于红色毛癣菌感染细胞球外部的细胞。另外，建立的模型包括基质胶、包埋在凝固的基质胶中的表皮类似物和癣菌菌丝，其中不含有液体成分，因此可在相差显微镜下直接观察癣菌感染呈球体结构的表皮类似物外部环绕的细胞过程，这样有利于选择合适的感染时间点(例如上述的感染后24小时左右)也即癣菌已经接触到细胞但又未大量繁殖的时期，也有利于筛选抗癣菌的药物。而且，由于角化样非细胞层位于球体结构内部，癣菌不接触角化样非细胞层因此不会紧紧黏附于球体结构表面而造成癣菌遗传物质大量污染表皮类似物，故而可以利用高通量的RNA测序(如下实施例2所述)等组学方法来研究感染所引发的宿主细胞反应，因此利用本发明方法建立的模型更加有利于使用组学的方法来深入挖掘皮肤癣菌感染机制或者研究新的致病机理以及更有利于筛选抗癣菌药物。

实施例2：体外模拟红色毛癣菌感染表皮类似物模型在致病机理研究中的应用

该实施例利用上述实施例1建立的体外模拟红色毛癣菌感染的模型(用第三培养基共培养包埋在凝固的基质胶中的红色毛癣菌分生孢子和表皮类似物24小时建立)，作为感染组；同步用第三培养基培养包埋在凝固的基质胶中的表皮类似物24小时，作为对照组；对感染组和对照组中的表皮类似物样品进行检测，分析红色毛癣菌的致病机理。

(1)感染组和对照组中表皮类似物的基因组学测序

对感染组和对照组中的表皮类似物分别进行高通量RNA测序(RNA-Seq)，研究宿主对抗红色毛癣菌入侵的基因表达变化。RNA测序由安诺优达公司完成，具体为：

1)将感染组和对照组的基质胶分别置于含有第三培养基的离心管中，将该离心管在冰上放置30-60分钟使基质胶溶化，以使表皮类似物从基质胶中游离出来；对于感染组的表皮类似物，用PBS洗涤以尽量去除粘附的菌丝；离心收集感染组和对照组的表皮类似物样品；

2)使用Trizol(Gibco)提取感染组的和对照组的表皮类似物样品的总RNA；

3)使用用于Illumina的NEBNext Ultra RNA库制备试剂盒(美国NEB)生成RNA测序库，RNA测序在Noves6000平台上进行。使用HISAT2将读段定位到人类参考基因组(hg4)。过滤了原始读取的低质量部分。使用HISAT2 v2.1.0将Clean Data与参考基因组进行比对。通过HTSeq v0.6.0对每个样品中每个基因的读数进行计数，然后计算FPKM(每千碱基密尔顿映射的片段数)以估计每个样品中基因的表达水平。差异表达基因(DEG)通过DESeq2使用计数进行分析P＜0.05且FC＞1.5的基因被鉴定为DEG，原始数据已上载到Gene ExpressionOmnibus数据库(登录号GSE134403)。

感染组和对照组的表皮类似物的基因组学测定结果如图8所示，其中A幅表示基因上调和下调火山图，其中每个点代表一个基因，可见在感染组的表皮类似物样品中，392个基因上调(A幅中横坐标上“1”处示出的深色点)，而109个基因下调(A幅中横坐标上“-1”处示出的深色点)。图8中B幅表示GO分析结果，可见感染组的表皮类似物样品中上调的基因显示与角质化包膜形成、角质细胞分化、肽交联和脂质消化有关，而这些细胞生物学过程有助于表皮屏障的形成。其中如图8中C幅所示，属于高度交联的角质化包膜形成的代表性上调基因包括外皮蛋白(IVL)，转谷氨酰胺酶(TGM1，TGM3)，角蛋白(CDSN)，cornifelin(CNFN)，角蛋白(KRT33A，KRT34，KRT4，KRT7，KRT77，KRT78，KRT80，KRT84)，晚期角化包膜蛋白(LCE1A，LCE1D，LCE1F，LCE2A，LCE2B，LCE2C，LCE2D，LCE3A，LCE3C，LCE3D，LCE3E，LCE6A)，富含脯氨酸的小蛋白(SPRRB2A，SPRR2C，SPRR2D，SPRR2E，SPRR2F，SPRR2G，SPRR3，SPRR4，PRR9)，激肽释放酶相关肽酶(KLK12，KLK13，KLK14，KLK6，KLK9)，丝氨酸蛋白酶抑制剂(SERPINB12，SERPINB4，desPINB4-4和SERPINB7-4))。以上这些数据表明，红色毛癣菌触发了表皮类似物的干/祖细胞进行终末分化，并导致形成了更成熟的角质层，紧密连接和脂质屏障(如文献Goleva,E.,Berdyshev,E.&Leung,D.Y.Epithelial barrier repair andprevention of allergy.J Clin Invest.129,1463-1474(2019)；Candi,E.,Schmidt,R.&Melino,G.The cornified envelope:a model of cell death in the skin.Nat Rev MolCell Biol.6,328-340(2005)中所描述)，这些变化对于抵抗皮肤感染至关重要。并且，这些基因表达水平的改变与红色毛癣菌感染患者中观察到的角质层增厚和脱屑的临床体征一致。另外，如图8中D幅所示，感染组中表皮类似物的红色毛癣菌感染还会诱导表皮细胞天然免疫应答的上调，其中包括上调的抗菌肽(CST3，DEFB4A，S100A7)和炎症细胞因子(CCL22，IL1F10，IL1RN，IL36B，IL36G，IL36RN)，结合图8中C幅所示，在这些上调的部分因子中还与白介素-1(IL-1)受体结合有关。

(2)感染组和对照组中表皮类似物的Q-PCR水平鉴定

1)将感染组和对照组的基质胶分别置于含有第三培养基的离心管中，将该离心管在冰上放置30-60分钟使基质胶溶化，以使表皮类似物从基质胶中游离出来；对于感染组的表皮类似物，用PBS洗涤以尽量去除粘附的菌丝；离心收集感染组和对照组的表皮类似物样品；按试剂盒说明书加入适量裂解液Buffer RLT充分裂解表皮类似物样品中的细胞；

2)上述裂解液加入等体积的70％乙醇，混匀；

3)吸取包含沉淀的混悬液，加入放置在2mL收集管内的离心柱(RNeasy Mini spincolumn)中，12000rpm离心30s；

4)弃滤液，向RNeasy spin column加入700μL Buffer RW1，12000rpm离心30s；

5)弃滤液，向RNeasy spin column加入500μL Buffer RPE，12000rpm离心30s；

6)弃滤液，向RNeasy spin column加入500μL Buffer RPE，12000rpm离心2min，弃滤液后再空离1min；

7)将RNeasy spin column放入一个新的1.5mL收集管，加入35μL RNeasy-freewater到spin column膜的中央，12000rpm离心1min洗脱RNA，收集管内即为提取的RNA溶液；

8)使用核酸蛋白分析仪测定样品RNA浓度；

9)按下表4所示合成体系合成cDNA，合成条件步骤：RNA按浓度计算总量1μg所需的体积V_RNA，加入RNA-free water补至16μL，PCR仪65℃加热变性5min，然后置于冰上2分钟；加入4μL 5×RT反转录试剂；进行反转录程序为37℃15分钟，50℃5分钟，98℃5分钟，4℃终止；

表4：cDNA合成体系

10)配置cDNA、SYBR、水混合液，实时定量96孔板中加入1μL检测引物(如下表5所示)，然后加入19μL混合液，盖好压紧封闭膜后放入实时定量PCR仪，程序为：95℃3分钟，95℃10秒，60℃35秒，65℃5秒，95℃5秒，循环45次。

表5：Q-PCR引物序列

Q-PCR检测结果如图9所示，可见在感染组中，表皮类似物中属于IL-1家族的这些基因进一步被上调。现有技术研究结果已经表明促炎症的IL-1信号是皮肤对癣菌感的反应中的保护因子(Yoshikawa,F.S.,Ferreira,L.G.&de Almeida,S.R.IL-1signalinginhibits Trichophyton rubrum conidia development and modulates the IL-17response in vivo.Virulence.6,449-457(2015))。而该实验的结果显示除了促炎的IL-1信号因子(例如IL1F10，IL36B，IL36G)上调外，几种抗炎的IL-1信号因子，如IL-1受体拮抗剂(IL-36RN和IL-1RN)的表达也上调(如图8中D幅和图9所示)。

(3)感染组和对照组中表皮类似物的免疫组织化学染色

按照上述实施例1中第III部分3.1的操作方法对感染组和对照组的表皮类似物进行免疫组织化学染色，其中使用的用于表皮类似物的免疫组织化学染色的第一抗体如下表6所示。

表6：用于表皮类似物的免疫组织化学染色的第一抗体

表7：用于癣菌感染前后表皮类似物的第二抗体

对感染组和对照组的表皮类似物进行免疫组织化学染色的结果如图10所示，可见在感染组中，表皮类似物中的IL-1RN表达显著增加，而IL-36RN并没有发生明显变化。

(4)感染组和对照组中表皮类似物的蛋白质印迹(WB)分析

1)分别收集感染组和对照组中表皮类似物的细胞培养上清和细胞沉淀；

2)细胞培养上清使用10kD Amicon Ultra-15过滤柱5000g条件下离心15分钟，收集浓缩上清按照试剂盒说明书进行定量检测；

3)细胞沉淀用RIPA裂解液(碧云天生物技术公司)裂解，获得细胞裂解液，用BCA蛋白检测试剂盒(Thermo)检测蛋白浓度；

4)所有蛋白样品在15％Bis-Tris凝胶上电泳，并转移到PVDF膜(Millipore)上；

5)电转结束以后，将PVDF膜放入牛奶溶液中，在摇床上进行室温封闭1小时；

6)封闭结束后，按照抗体说明书稀释一抗(如上表6所示)，一抗4℃冰箱孵育过夜；

7)二抗(如上表7所示)室温避光孵育一小时；

8)添加显影液在凝胶成像仪中进行显影(Bio-Rad)。

感染组和对照组中表皮类似物的IL-1RN的WB结果如图11所示，其中根据A幅所示，可见红色毛癣菌感染引起了细胞培养上清中IL-1RN的蛋白水平分泌增加，表明在红色毛癣菌感染中，IL-1促炎信号可能在受体水平上被分泌的IL-1受体拮抗剂竞争性抑制。

综上实验结果，利用本发明建立的模型来模拟红色毛癣菌感染人正常皮肤组织，表明红色毛癣菌感染皮肤后可能通过诱发皮肤细胞分泌IL-1受体拮抗剂IL-1RN来抑制促炎性的IL-1信号传导，防止炎症级联反应放大，从而使感染后的炎症反应轻微，并且有助于皮肤癣菌逃避人类宿主免疫应答，免于被宿主清除。该实施例结果表明上述实施例1建立的体外模拟红色毛癣菌感染的模型可以用来研究红色毛癣菌感染人正常皮肤的致病机理。

实施例3：体外模拟红色毛癣菌感染的模型在抗癣菌药物筛选中的应用

该实施例利用上述实施例1建立的体外模拟红色毛癣菌感染的模型(用第三培养基共培养包埋在凝固的基质胶中的红色毛癣菌分生孢子和表皮类似物24小时建立)对抗癣菌药物的敏感性进行测试。

1)实验组为向模型中添加两性霉素B(AmB)(一种常见的抗癣菌药)；对照组为不向模型中添加两性霉素B；

2)实验组和对照组再培养12小时后，分别按照上述实施例1中第III部分操作2.2和2.3对实验组和对照组的表皮类似物进行糖原颗粒(PAS)染色和透射电镜观察。

结果如图12所示，其中A幅为糖原颗粒染色图像，B幅为透射电镜图像，N代表细胞核，T代表红色毛癣菌；可见实验组用两性霉素B治疗12小时后，其对红色毛癣菌侵袭表皮类似物有明显的抑制作用，只有极少菌丝从表皮类似物的基底层细胞侵入并渗透到表皮类似物的球状结构外部细胞层中，且表皮类似物球状结构仍保持相对完整。表明本发明建立的体外模拟皮肤癣菌感染的模型确实能够用于筛选抗癣菌药物。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 深圳钰捷生物医学科技有限公司

<120> 一种体外模拟皮肤癣菌感染的模型及其建立方法和应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagtcaacgg atttggtcgt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttgattttgg agggatctcg 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aggaagggcc gtctatcaat c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cactgtcact tcgtggaact g 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cattgagcct catgctctgt t 21

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgctgtctga gcggatgaa 19

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agaggggcct tccctacag 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cagcagcctc aagcctgaa 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgaacccac aacgggagg 19

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

taatgctgcg gctaagagga g 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

actcggcatt gaaggtgctt t 21

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gggaccacgc tgatctctt 19

Claims

1.一种体外模拟皮肤癣菌感染的模型的建立方法，其包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述第一培养基的配方为：Advanced DMEM/F12培养基+0.01％～1％BSA+0.2％～5％B-27细胞培养添加物+0.5％～1％谷氨酰胺添加剂+0.1～10mM N-乙酰基-L-半胱氨酸+1～10mM HEPES+5～20μMForskolin+50～200ng/mL Wnt3a+20～100ng/mL EGF+10～1000U/mL青霉素+0.01～1mg/mL链霉素；所述第一培养基的配方优选为：Advanced DMEM/F12培养基+0.1％BSA+1％B-27细胞培养添加物+1％谷氨酰胺添加剂+10mM HEPES+1mM N-乙酰基-L-半胱氨酸+10μMForskolin+100ng/mL Wnt3a+50ng/mL EGF+100U/mL青霉素+0.1mg/mL链霉素；

第二培养基的配方为：Advanced DMEM/F12培养基+0.01％～1％BSA+0.2％～5％B-27细胞培养添加物+0.5％～1％谷氨酰胺添加剂+0.1～10mM N-乙酰基-L-半胱氨酸+1～10mMHEPES+5～20μM Forskolin+50～200ng/mL Wnt3a+20～100ng/mL EGF+0.1～5μM A83-01+10～1000U/mL青霉素+0.01～1mg/mL链霉素；所述第二培养基的配方优选为：AdvancedDMEM/F12培养基+0.1％BSA+1％B-27细胞培养添加物+1％谷氨酰胺添加剂+10mM HEPES+1mM N-乙酰基-L-半胱氨酸+10μM Forskolin+100ng/mL Wnt3a+50ng/mL EGF+1μM A83-01+100U/mL青霉素+0.1mg/mL链霉素。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤3)中将所述细胞球从凝固的基质胶A中游离出来的具体操作为：将包埋有细胞球的基质胶A置于含有少量培养基的管中，将该管在冰上放置30-60分钟使凝固的基质胶A溶化游离出其中的细胞球，获得该细胞球。

4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，步骤3)中含有癣菌分生孢子的基质胶B中癣菌分生孢子的浓度为1×10⁵～3×10⁵个分生孢子/μl；

所述孵育的条件为：置于37±1℃的细胞培养箱中孵育5～10min。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，步骤1)所述具有分化功能的表皮细胞为表皮干/祖细胞；步骤3)中所述基底层细胞为表皮干/祖细胞，其向外接触基质胶B，向内包围由基底层细胞分化产生的基底上层细胞，所述基底上层细胞向内包围角化样非细胞层；所述基底上层细胞包括棘层细胞和颗粒层细胞，所述角化样非细胞层包括死亡的颗粒层细胞和/或由其分泌的物质。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述第三培养基的配方为：Advanced DMEM/F12培养基+0.01％～1％BSA+0.2％～5％B-27细胞培养添加物+0.5％～1％谷氨酰胺添加剂+0.1～10mM N-乙酰基-L-半胱氨酸+1～10mM HEPES+5～20μMForskolin+50～200ng/mL Wnt3a+20～100ng/mL EGF+0.1～5μM A83-01；所述第三培养基的配方优选为：Advanced DMEM/F12培养基+0.1％BSA+1％B-27细胞培养添加物+1％谷氨酰胺添加剂+10mM HEPES+1mM N-乙酰基-L-半胱氨酸+10μM Forskolin+100ng/mL Wnt3a+50ng/mL EGF+1μM A83-01。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)中共培养的时间为24小时。

8.一种体外模拟皮肤癣菌感染的模型，其由权利要求1-7中任一项所述的方法建立。

9.一种体外模拟皮肤癣菌感染的模型，其包括基质胶、包埋在凝固的基质胶中的表皮类似物和癣菌菌丝，其中：表皮类似物呈相对完整的实心球体结构，其外部为环绕分布的由基底层细胞和基底上层细胞组成的细胞层，内部为角化样非细胞层；其中所述基底层细胞向外接触基质胶，向内包围所述基底上层细胞，所述基底上层细胞向内包围角化样非细胞层；所述菌丝侵入球体结构外部的细胞层中的基底层细胞且未侵入或仅少量侵入基底上层细胞，并且未侵入球体结构内部的角化样非细胞层。

10.权利要求8或9所述的体外模拟皮肤癣菌感染的模型在皮肤癣菌感染的致病机理研究和在抗癣菌药物筛选中的应用。