CN109381700A

CN109381700A - 一种促进局部温热治疗法治疗hpv感染有效率的药物靶点

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Publication number: CN109381700A
Application number: CN201811346539.7A
Authority: CN
Inventors: 孙宇哲; 齐瑞群; 高兴华; 陈洪铎
Original assignee: First Hospital of China Medical University
Current assignee: First Hospital of China Medical University
Priority date: 2018-11-13
Filing date: 2018-11-13
Publication date: 2019-02-26

Abstract

本发明涉及疾病的治疗药物靶点领域，具体涉及到HSPA6在提升局部温热治疗法治疗人乳头瘤病毒感染有效率中作为药物靶点的应用。本发明提供HSPA6基因或蛋白作为增进局部温热治疗法治疗人乳头瘤病毒感染有效率的药物靶点，能够改善目前临床局部温热治疗法治疗人乳头瘤病毒感染有效率较低的缺陷，提高临床治愈率，扩大局部温热治疗法治疗人乳头瘤病毒感染的临床应用。

Description

一种促进局部温热治疗法治疗HPV感染有效率的药物靶点

技术领域

本发明涉及疾病的治疗药物靶点领域，具体涉及到HSPA6在提升局部温热治疗法治疗人乳头瘤病毒感染有效率中作为药物靶点的应用。

背景技术

人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus，HPV）是一种直径50nm左右的无包膜病毒，其核酸为双链环状DNA，长度约为8000bp，包含编码早期基因（E）和晚期基因（L）的编码序列与一段非编码控制序列（Long Control Region, LCR）。HPV感染人体皮肤及黏膜组织，可造成皮肤及黏膜组织的疣状增生改变。同时，HPV感染还是多种皮肤黏膜恶性肿瘤形成的危险因素，这些恶性肿瘤包括阴茎癌、口腔癌、喉癌、宫颈癌等。其中，宫颈癌被认为与HPV16和HPV18型感染密切相关（Human papillomavirus (HPV) and cervical cancer". WHO.June 2016. Retrieved 10 August 2016.）。

局部温热治疗法作为一种全新且极具潜力的治疗方法，目前正日益受到临床关注。这种特殊治疗方法一般需要患者将患病区域暴露于40至44℃的温度下持续刺激30至60分钟。临床上已经证实，44℃（±0.1°C）温热治疗可以有效清除包括趾疣在内的多种HPV感染性皮肤病，其有效率较传统治疗方法高出近10个百分点（Huo, W., et al., Localhyperthermia at 44 degrees C for the treatment of plantar warts: arandomized, patient-blinded, placebo-controlled trial. J Infect Dis, 2010.201(8): p. 1169-72）。并且，通过这种温热治疗，成功治愈了传统治疗无效的皮肤HPV感染合并其他复杂合并症的患者，凸显出温热治疗HPV感染性疾病的优势和潜力。虽然局部温热治疗法较传统疗法治疗HPV感染的有效率有所提升，但其总体有效率也仅达53.75%，并且局部温热治疗法治疗HPV感染的分子学机制并不十分清楚，这为局部温热治疗法在临床的进一步应用造成了障碍和挑战。因此，迫切需要找到一种可以提升温热治疗HPV感染有效率的方法。

热休克蛋白（Heat Shock Protein，HSP）是一种急性时相反应蛋白，且其序列在不同物种之间具有高度保守的特性。HSP可以被多种刺激因素诱导表达，包括氧化应激，重金属刺激，紫外线照射，以及热刺激等。研究最多的热休克蛋白成员热休克蛋白70家族（HSP70s）可作为分子伴侣（molecular chaperones）保护细胞内蛋白质在外界应急刺激下的正确折叠，避免蛋白质和肽段的聚合。而热休克蛋白90家族（HSP90s）则广泛参与到肿瘤形成的的多个环节之中，抑制细胞HSP90s的活性对恶性肿瘤有一定治疗效应。在所有的HSPs中，热休克蛋白40家族（DnaJ/HSP40s）是一组具有独特分子结构的热休克蛋白，其分子结构中的J结构域可介导HSP70s对ATP的水解活性，因此DnaJ/HSP40s也被称为HSP70s家族的共分子伴侣（co-chaperones）。本发明所提及的HSPA6属于热休克蛋白70家族（HSP70s），与常见的HSP70s家族成员不同，HSPA6是一种仅存在于大型哺乳类动物体内的严格的诱导型热休克蛋白，仅在受到外界应激刺激时表达（Wisniewska, M., et al., Crystalstructures of the ATPase domains of four human Hsp70 isoforms: HSPA1L/Hsp70-hom, HSPA2/Hsp70-2, HSPA6/Hsp70B', and HSPA5/BiP/GRP78. PLoS One, 2010. 5(1):p. e8625.）。虽然HSPA6在表达谱特征上与传统HSP70s家族成员HSP72差异较大，但其基因序列与HSP72高度相似，其功能性结构域更是完全相同（Noonan, E., C. Giardina, andL. Hightower, Hsp70B' and Hsp72 form a complex in stressed human colon cellsand each contributes to cytoprotection. Exp Cell Res, 2008. 314(13): p. 2468-76.），这提示HSPA6极有可能与HSP72有着共同的生物学功能。并且HSPA6在温热刺激下的特殊表达特点使其具有了高度可控性与后遗效应低等优势，因此具有相当的研究价值。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种可协助局部温热治疗法治疗人乳头瘤病毒感染的HSPA6分子靶点，能够改善目前临床局部温热治疗法治疗人乳头瘤病毒感染有效率较低的缺陷，提高临床治愈率，扩大局部温热治疗法治疗人乳头瘤病毒感染的临床应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：提供HSPA6基因或蛋白作为增进局部温热治疗法治疗人乳头瘤病毒感染有效率的药物靶点，该靶点具备热休克蛋白的特性。

本发明提供的HSPA6基因或蛋白作为增进局部温热治疗法治疗人乳头瘤病毒感染有效率的药物靶点，其基因序列如SEQ ID NO.1所示，蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供的HSPA6基因或蛋白作为增进局部温热治疗法治疗人乳头瘤病毒感染有效率的药物靶点在制备药物中的应用，该药物应具有靶向HSPA6基因或蛋白的特点。

本发明提供的HSPA6基因或蛋白作为增进局部温热治疗法治疗人乳头瘤病毒感染有效率的药物靶点在制备药物中的应用，其应用具有以下特征。

1) 在温热刺激下，靶向抑制角质形成细胞中HSPA6的基因的转录或表达。

2) 在温热刺激下，可抑制角质形成细胞增殖，并诱导角质形成细胞凋亡与死亡。

本发明提供的HSPA6基因或蛋白作为增进局部温热治疗法治疗人乳头瘤病毒感染有效率的药物靶点在制备药物中的应用，用于促进局部温热治疗法治疗人乳头瘤病毒感染的有效率。

与现有技术相比，本发明的有益效果。

1.在44℃温热刺激下人角质形成细胞中HSPA6表达显著上调，而敲除HSPA6基因后可明显抑制温热刺激下人角质形成细胞的增殖，并诱导细胞凋亡和细胞死亡。

2. 本发明提供的HSPA6基因或蛋白作为增进局部温热治疗法治疗人乳头瘤病毒感染有效率的药物靶点，可制备相关外用药物，可安全便捷地辅助临床温热治疗，达到更高的治疗疗效。

附图说明

图1为实时定量PCR实验结果，结果显示HaCaT细胞HSPA6基因在44℃温热刺激下mRNA表达量随孵育时间的变化趋势。在孵育2小时后表达量达最大值，随后逐渐下降。图中HSPA1A（HSP72）为阳性对照。

图2为实时定量PCR实验结果，结果显示CaSki细胞HSPA6基因在44℃温热刺激下mRNA表达量随孵育时间的变化趋势。在孵育2小时后表达量达最大值，随后逐渐下降。图中HSPA1A（HSP72）为阳性对照。

图3为Western Blot实验结果，结果显示HaCaT与CaSki细胞HSPA6基因在44℃温热刺激下蛋白质表达量随孵育时间的变化趋势。在HSPA6蛋白表达量在温热刺激后上升，至孵育4小时后表达量达最大值，随后逐渐下降。图中GAPDH为内对照蛋白。

图4为实时定量PCR实验结果，结果显示人原代角质形成细胞HSPA6基因在44℃温热刺激下mRNA表达量变化。在孵育2小时后mRNA表达量显著上调。

图5为 Western Blot实验结果，结果显示人原代角质形成细胞HSPA6基因在44℃温热刺激下蛋白质表达量变化。在孵育4小时后HSPA6蛋白表达量显著上调。图中GAPDH为内对照蛋白。

图6为免疫荧光实验结果，结果显示HaCaT细胞系，CaSki细胞系，以及人原代角质形成细胞HSPA6基因在44℃温热刺激下蛋白质表达及分布情况。在3种细胞中HSPA6的分布一致，孵育4小时后HSPA6蛋白质表达显著上调。

图7为 Western Blot实验，实验验证HSPA6-Cas9慢病毒在HaCaT细胞及CaSki细胞中对HSPA6基因的敲除效率，实验发现HSPA6-Cas9慢病毒成功敲除了HaCaT细胞及CaSki细胞的HSPA6基因。

图8为流式细胞术实验，实验显示44℃温热刺激可增加HaCaT细胞的凋亡比例，且HSPA6敲除型较野生型凋亡与死亡细胞比例均更高。

图9为MTS实验结果，结果显示44℃温热刺激可抑制HaCaT细胞系与CaSki细胞系的增殖活性，且HSPA6敲除可更进一步地抑制HaCaT细胞系与CaSki细胞系在温热刺激下的活性。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

实施例。

1.实验材料。

1.1实验仪器及器材。

恒温水浴锅(Salvislab，型号WB20)，超净工作台(上海智城，型号ZHJH-C1115C)，恒温孵育箱(Thermo，型号371)，通风厨，低温高速离心机(Thermo Scientiifc, 型号SOVALL ST40R)，组织切片机(Leica，型号CM1950)，深低温冰箱(Thermo，型号7400V)，分光光度计(EPPENDORFINC，型号6131)，酶标仪(Tecan，型号SΜNRISE)，实时定量PCR仪(Applied Biosyste，型号HT7900)，凝胶成像分析仪(美国基因，型号GDS-8000)，电泳仪(BIO-RAD, 型号POWERPAC MNIVERSAL POWER SMPPLY)，电转仪(BIO-RAD，型号MINI TRANS-BLOT)，脱色微型圆周摇床(其林贝尔，型号BETS-M1)，制冰机(松下，型号SIM-F140AY65-PC)，试管架，离心管架，PCR管架等。

1.2实验试剂和耗材。

一次性细胞培养瓶，培养皿，RPMI1640培养基(Biological Industries，4°C储存)，胎牛血清(Biological Industries，-20°C储存)，双抗(Biological Industries，-20°C储存)，胰酶(Biological Industries，-20°C储存)，离心管(Thermofisher)，Qiazol细胞裂解液(Qiagen，常温储存)，细胞RNA提取试剂盒(Qiagen，常温储存)，RNA逆转录试剂盒(Promega，-20°C储存)，荧光定量PCR试剂盒(Promega，-20°C储存)，RIPA细胞裂解液(Beyotime， -20°C储存)，BCA蛋白浓度检测试剂盒(Beyotime，4°C储存)，Western blot凝胶配置试剂盒(Bio-rad，常温储存)，免疫组化染色试剂盒(迈新，4°C储存)，兔抗人HSPA6抗体(abcam，-20°C储存)，HRP标记的山羊抗兔IgG抗体(中杉新桥，-20°C储存)，HSPA6-Cas9慢病毒质粒(吉凯基因，-80°C储存)，慢病毒质粒转染试剂(吉凯基因，-80°C储存)，慢病毒质粒转染增强试剂(吉凯基因，-80°C储存)，PVDF膜(Millipore，常温储存)，电泳液(Beyotime，常温储存)，电转液(Beyotime，常温储存)，ECL显色试剂盒(Thermofisher，-20°C储存)，TBST(Solarbio，4°C储存)，脱脂牛奶(BD，4°C储存)，石蜡包埋剂(CITOTEST，常温储存)，乙醇，蒸馏水，去离子水，移液器，移液管，手套，口罩等。

2.试验方法。

2.1 HaCaT细胞及CaSki细胞的培养与温热处理。

（1）HaCaT细胞及CaSki细胞培养于含10%胎牛血清和1%双抗的RMPI1640培养基中，于37℃、5%CO₂的恒温孵育箱中培养。胰酶消化传代，以100万细胞接种于100mm培养皿中，在5% CO₂和37°C条件下培养过夜贴壁后进行44°C温热刺激。

（2）待HaCaT细胞及CaSki细胞贴壁后，将培养皿漂浮于44℃恒温水浴锅中，进行温热刺激30分钟，刺激完毕后返回孵育箱进行孵育，待到达相应实验时间节点时取出，进行实验操作。对照组采取37℃水浴刺激30分钟，其余操作相同。

2.2细胞RNA提取，mRNA逆转录与cDNA实时定量PCR检测。

（1）37℃及44℃温热刺激HaCaT细胞及CaSki细胞后分别孵育2、4、8、24小时后取出，弃培养基，PBS清洗3次，加入700μl Qiazol裂解液裂解细胞5分钟，收集裂解液，按照RNA提取试剂盒说明（向细胞裂解液中加入140μl氯仿，斡旋震荡15s后室温静置3min。4℃，15000g离心15min，小心吸取上清液并移入RNA分离提取柱中。室温8000g离心分离柱15s，丢弃流过液，重复此步骤至全部上清均离心过柱。向离心柱中加入700μl RWT缓冲液，室温8000g离心分离柱15s，丢弃流过液。向离心柱中加入500μl RPE缓冲液，室温8000g离心分离柱15s，丢弃流过液，并重复此步骤1次。室温全速(>18000g)离心2min，彻底干燥离心柱。向离心柱内膜上直接滴加无酶水30μl，室温，10000g离心30s，收集流过液即为细胞总RNA。)，按步骤进行RNA提取，收集，清洗以及洗脱操作，得到高纯度总RNA(OD260/280 > 2.0)并使用分光光度计检测RNA浓度 (>125 ng/μl)。

（2）按照RNA逆转录试剂盒说明书（从-20℃冰箱取出试剂盒中试剂，置于冰上缓慢融化备用。按照如下体积配置逆转录反应体系：无酶水0.6μl，5x Reaction Bμffer4μl, MgCl₂ 4μl，oligo引物0.5μl，random引物0.5μl，dNTP Mix 1μl，inhibitor 0.4μl，Reverse Transcriptase 1μl，充分混匀。加入1000ng RNA作为模板，总体积不超过8μl，剩余体积用无酶水补齐。充分混匀，离心后进行逆转录扩增。），按步骤添加逆转录体系，取1μgRNA作为模板进行逆转录。逆转录条件为：72℃ 逆转录15分钟，40℃逆转录 15分钟。

（3）按照cDNA荧光实时定量PCR试剂盒说明书（荧光实时定量PCR试剂盒操作说明：1）按照如下体积配置qPCR反应体系：无酶水7μl，HSPA6上游引物0.4μl，HSPA6下游引物0.4μl，qPCR MasterMix 10μl，CybrGreen染料0.2μl，充分混匀。2）每反应体系加入2μl cDNA作为反应模板，充分混匀，离心后进行qPCR扩增。），按步骤添加PCR反应体系，并添加2μl cDNA作为反应模板，进行PCR反应。反应条件为：1）95℃ 2分钟。2）95℃ 15秒 + 60℃ 1分钟，循环40次。PCR反应体系所用引物信息如表1.，反应结果由计算机分析得出。

2.3细胞蛋白质提取、测量及Western Blot检测。

（1）37℃及44℃温热刺激HaCaT细胞及CaSki细胞后分别孵育1，2、4、8、12，24小时后取出，弃培养基，冰镇PBS清洗3次，每个培养皿加入200μl RIPA裂解液裂解细胞5分钟。收集裂解液，于4℃，以15000g转速离心细胞裂解液10分钟，收集上清液。利用酶标仪和BCA检测试剂盒测定蛋白质浓度，蛋白质浓度如表2.所示。

（2）根据Western Blot凝胶配置试剂盒说明书（取分离胶A液3ml，分离胶B液5ml混匀，加入30μl 10%过硫酸铵与6μl TEMED，随后将混合液灌入玻璃板中。取浓缩胶A液1ml，浓缩胶B液1ml混匀，加入10μl 10%过硫酸铵与2μl TEMED，随后将混合液缓慢浇灌于之前的玻璃板中分离胶之上。缓慢插入10孔Western Blot专用胶孔梳，待凝胶逐渐凝固后取下玻璃板，4°C储存备用。），配置10%浓度凝胶。配置相应电泳液，并安装电泳仪。蛋白样品取20μg每孔进行上样，并进行电泳分离，电泳条件为100V，2小时。分离后切割凝胶并安装电转仪进行电转，电转条件为200mA，1小时。电转完毕后，剪切对应的PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2小时，兔抗人HSPA6单克隆抗体（1:1000稀释）4℃孵育过夜。TBST清洗3次，每次10分钟，HRP标记的山羊抗兔IgG（1:5000稀释）室温孵育2小时，TBST清洗3次，每次10分钟。

（3）按照说明书指示配置ECL发光试剂（ECL发光试剂配置说明：取A液1ml，B液1ml充分混合，4℃避光储存备用。），于ECL发光仪上对PVDF膜进行曝光，拍照。

2.4 人原代角质形成细胞培养。

（1）收取正常人包皮组织，冰镇PBS冲洗去血污，将包皮放置于75%酒精中浸泡1min消毒，后转入含有3%抗青霉菌链霉菌抗生素的冰PBS中进一步清洗修剪10分钟，尽量去除皮下脂肪，血管等组织，并将包皮剪至0.5×0.5cm大小。

（2）用0.25%Dispase II于4℃浸泡包皮组织24小时。

（3）取出包皮，用镊子小心剥离真表皮，收集真皮组织并用组织剪剪碎，用含0.02%EDTA的0.25%胰酶对表皮组织进行消化，消化条件为37℃，15分钟。

（4）反复吹打消化悬液，将表皮角质形成细胞分离。用含有10%血清的完全培养基中和胰酶，300目尼龙滤网过滤消化悬液，得到单细胞悬液。

（5）300g×5分钟离心细胞悬液，弃上清液，PBS洗涤细胞沉淀1次，相同条件离心后弃PBS。用K-SFM表皮细胞培养基重悬细胞，转移至100mm平皿中。在37℃、5%CO₂条件下恒温培养。

（6）原代角质形成细胞的温热处理，RNA及蛋白提取，荧光定量PCR及Western Blot实验操作同实验方法2.1，实验方法2.2和实验方法2.3。

2.5 细胞免疫荧光检测。

（1）消化HaCaT细胞，CaSki细胞以及人原代角质形成细胞，并以20万个/孔的密度接种于预先放置好细胞爬片的6孔板中。并分别设立37℃对照组和44℃实验组。

（2）待细胞贴壁生长后，将6孔板分别置于相对应条件下进行处理，处理细节如前所述。温热刺激后于37℃孵育箱中孵育4小时。

（3）取出细胞爬片，PBS冲洗3次。4%多聚甲醛与室温固定细胞15分钟，PBS冲洗3次后再用含0.2%TritonX-100的PBS于室温破膜20分钟。PBS冲洗3次。室温条件下使用含有1%BSA，0.2%Tween20的PBS对细胞进行封闭30分钟。

（4）PBS冲洗3次，充分吸干爬片上的PBS。使用兔抗人HSPA6免疫荧光抗体（使用上述封闭液进行相对应稀释，稀释比例为1:400）4℃孵育爬片细胞过夜。PBS冲洗细胞3次。FITC荧光标记的山羊抗兔二抗对细胞室温避光孵育1小时，PBS冲洗细胞3次。

（5）DAPI复染细胞，时间不超过1分钟。在爬片上滴加一滴50%甘油的PBS，并倒扣于载玻片上，并于激光共聚焦显微镜下观察细胞荧光强度与分布。

2.6 HSPA6-Cas9慢病毒转染与HSPA6敲除鉴定。

（1）根据慢病毒质粒转染说明书以及生产厂家的转染意见指导（慢病毒转染操作说明：将细胞按照4000个/孔的密度铺于96孔板中，37℃培养过夜。待细胞贴壁后，更换培养基为无血清、无双抗培养基培养备用。使用转染增强试剂稀释慢病毒质粒至病毒滴度为1x10⁷ TΜ/ml，并按照转染MOI=100计算转染病毒体积，加入相应细胞中。37℃培养细胞6h后，对细胞进行换液操作，更换回正常培养基继续37℃培养72h。培养72h后，对细胞进行传代操作，并于培养基中加入puromycin(1μg/ml)进行持续筛选培养。筛选时间大于3天。筛选培养后，通过Western Blot技术检测HSPA6蛋白质的敲除情况。），分别采用HSPA6-Cas9慢病毒质粒对HaCaT细胞进行转染，得到HSPA6敲除株，野生型HaCaT细胞作为阴性对照。

（2）利用Western Blot技术对HSPA6的敲除效率进行检测。操作步骤，抗体使用，孵育及曝光观察同实验方法2.3所述。

2.7 流式细胞术检测野生型、HSPA6敲除株细胞的凋亡与坏死。

HaCaT细胞以50万数量接种于6孔板中，并培育过夜使细胞贴壁生长。第二日，对实验组细胞施加44℃水浴刺激30分钟，对照组为37℃水浴刺激30分钟。温热刺激后返回恒温孵育箱孵育8个小时。随后取出细胞，胰酶消化，PBS清洗3次。根据细胞凋亡检测试剂盒说明书（用PBS将10X Binding Buffer稀释为1X备用。100μl稀释好的Binding Buffer在流式管中重悬细胞。每流式管中加入5μl APC标记的Annexin V染料。每流式管中加入10μl PI染料。室温避光孵育15分钟后上流式细胞仪检测。）对细胞进行重悬、PI染色与APC-Annexin V染色。避光室温孵育15分钟后进行流式细胞仪检测。凋亡与细胞死亡结果由计算机软件进行分析。

2.8 MTS法检测野生型、HSPA6敲除株细胞的增殖活性。

野生型、HSPA6敲除株HaCaT细胞与CaSki细胞分别培养传代，并以2000个/孔的细胞的密度接种于96孔板，并分别进行37℃和44℃温热刺激，刺激方式同实验方法2.1所述。根据MTS试剂盒说明书（从-20℃冰箱中取出MTS试剂，冰上缓慢融化。吸取适量MTS试剂于加样槽中，按照每孔10μl吸取MTS试剂，并缓慢加入96孔板对应细胞孔位，注意避免产生气泡。加入MTS后对96孔板进行适度振板操作，促进MTS试剂与培养基彻底混合。37℃避光孵育2h。孵育完毕后，将96孔板放入酶标仪中，检测490nm吸光值。）指示，分别于相应时间点（第0、1、2、3、4、5天）对实验组和对照组细胞进行MTS染色，37℃恒温避光孵育2个小时后，利用酶标仪对96孔板进行吸光度检测，并分析细胞增殖活性。

3.结果分析。

3.1 44℃温热刺激后，HaCaT细胞HSPA6基因mRNA表达量显著升高，且在温热后2小时达最大值，随后mRNA水平逐渐下降，至24小时时接近对照组水平（图1）。可见44℃温热刺激可以显著增加HSPA6基因的转录水平，表明在人角质形成细胞中，HSPA6是一种对温热刺激相当敏感的基因。

3.2 44℃温热刺激后，CaSki细胞HSPA6基因的mRNA表达量显著升高，且在温热后2小时达最大值，随后mRNA水平明显下降，至24小时时接近对照组水平（图2）。可见44℃温热刺激亦可以显著增加CaSki细胞中HSPA6基因的转录水平。

3.3 Western Blot结果显示，无论在HaCaT细胞或是CaSki细胞中，44℃温热刺激均可以引起HSPA6蛋白质的表达上调，且最大上调效应均出现在温热刺激后孵育4个小时的时间。同时，WB结果也发现，在未接受温热刺激的HaCaT细胞和CaSki细胞中，并不能检测到HSPA6蛋白质的表达（图3）。这提示HSPA6在角质形成细胞系中是一种对温热刺激极其敏感的热休克蛋白，并且保持着极低的基础表达量。这种高诱导性的热休克蛋白的特征具备进一步研究的价值。

3.4 44℃温热刺激并孵育2小时后，人原代角质形成细胞HSPA6基因mRNA表达量显著升高，可见HSPA6在原代细胞中也具备相同的mRNA热诱导效应（图4），该变化与细胞系所得到的数据相吻合。

3.5 44℃温热刺激并孵育4小时后，人原代角质形成细胞HSPA6基因蛋白质表达量显著升高，可见HSPA6在原代细胞中也具备相同的蛋白质热诱导效应（图5），同时，在未接受温热刺激的37℃对照组中，可观察到Western Blot实验并不能检测到HSPA6蛋白质的表达，该结果与细胞系所得到的数据一致。

3.6 细胞免疫荧光检测实验发现，44℃温热刺激可显著诱导HaCaT细胞，CaSki细胞，以及人原代角质形成细胞中HSPA6蛋白质的表达。在免疫荧光实验结果中，可发现在未接受刺激的37℃空白对照组中，HSPA6的表达量极低，而在44℃温热刺激后孵育4个小时的三种不同角质形成细胞中，HSPA6的表达强度有了显著升高。同时也可观察到，HSPA6的分布主要在细胞质中，少部分于细胞核内，温热刺激可显著增加细胞质中HSPA6的表达水平（图6）。说明，HSPA6在人角质形成细胞受到温热刺激时展示出高灵敏性和诱导性。

3.7 Western Blot试验对HSPA6-Cas9慢病毒敲除效率的验证。结果可发现在转染了HSPA6-Cas9慢病毒的HaCaT和CaSki细胞中，HSPA6蛋白表达水平在44℃温热刺激后完全检测不出（图7），从而证实HSPA6-Cas9慢病毒敲除HSPA6基因的效率。

3.8 利用流式细胞仪对温热刺激后野生型、HSPA6敲除株HaCaT细胞进行细胞凋亡与细胞死亡检测，结果显示，44℃温热刺激可以显著诱导HaCaT细胞的凋亡。而相对比野生型HaCaT细胞，HSPA6敲除的HaCaT细胞面对44℃温热刺激显示出更加明显的凋亡与坏死变化（图8）。上述实验证实，HSPA6敲除后HaCaT细胞在44℃温热刺激下显示出更明显的凋亡与坏死效应。由此可推测，HSPA6在角质形成细胞中扮演着重要的保护者作用，该保护作用可防止角质形成细胞在温热刺激下发生凋亡与死亡。因此，抑制HSPA6可以极大地促进温热刺激对HaCaT细胞的杀伤作用。

3.9 利用MTS试剂盒对野生型、HSPA6敲除株HaCaT细胞与CaSki细胞进行检测发现，44℃温热刺激下野生型HaCaT细胞与CaSki细胞均发生了明显的增殖活性下降的表现，而HSPA6敲除后的HaCaT细胞与CaSki细胞本身即可呈现出独立的增殖活性下降趋势，而联合44℃温热刺激后，该增殖活性下降更加显著（图9）。该实验结果进一步证明了HSPA6对HaCaT细胞的保护作用。

以上的全部实验数据提示，在人角质形成细胞中，44℃温热刺激可显著诱导HSPA6的表达。而高表达的HSPA6可进一步保护角质形成细胞，减轻温热刺激对其凋亡，死亡以及细胞增殖阻滞的效应。在HPV感染的角质形成细胞中，细胞的增殖效应下降必然会引发疣体生长减缓，而细胞的凋亡和死亡也将更多地释放细胞内HPV抗原，从而为免疫系统识别HPV感染提供条件。综上所述，抑制HSPA6在角质形成细胞中的功能，可增强角质形成细胞对温热刺激的反应，并促进角质形成细胞的抗病毒免疫反应，从而达到加速清除HPV感染的功效。

<110>中国医科大学附属第一医院

<120>一种促进局部温热治疗法治疗HPV感染有效率的药物靶点

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2358

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 1

agatccgagc cgggctggct gcagagaaac cgcagggaga gcctcactgc tgagcgcccc 60

tcgacggcgg agcggcagca gcctccgtgg cctccagcat ccgacaagaa gcttcagcca 120

tgcaggcccc acgggagctc gcggtgggca tcgacctggg caccacctac tcgtgcgtgg 180

gcgtgtttca gcagggccgc gtggagatcc tggccaacga ccagggcaac cgcaccacgc 240

ccagctacgt ggccttcacc gacaccgagc ggctggtcgg ggacgcggcc aagagccagg 300

cggccctgaa cccccacaac accgtgttcg atgccaagcg gctgatcggg cgcaagttcg 360

cggacaccac ggtgcagtcg gacatgaagc actggccctt ccgggtggtg agcgagggcg 420

gcaagcccaa ggtgcgcgta tgctaccgcg gggaggacaa gacgttctac cccgaggaga 480

tctcgtccat ggtgctgagc aagatgaagg agacggccga ggcgtacctg ggccagcccg 540

tgaagcacgc agtgatcacc gtgcccgcct atttcaatga ctcgcagcgc caggccacca 600

aggacgcggg ggccatcgcg gggctcaacg tgttgcggat catcaatgag cccacggcag 660

ctgccatcgc ctatgggctg gaccggcggg gcgcgggaga gcgcaacgtg ctcatttttg 720

acctgggtgg gggcaccttc gatgtgtcgg ttctctccat tgacgctggt gtctttgagg 780

tgaaagccac tgctggagat acccacctgg gaggagagga cttcgacaac cggctcgtga 840

accacttcat ggaagaattc cggcggaagc atgggaagga cctgagcggg aacaagcgtg 900

ccctgcgcag gctgcgcaca gcctgtgagc gcgccaagcg caccctgtcc tccagcaccc 960

aggccaccct ggagatagac tccctgttcg agggcgtgga cttctacacg tccatcactc 1020

gtgcccgctt tgaggaactg tgctcagacc tcttccgcag caccctggag ccggtggaga 1080

aggccctgcg ggatgccaag ctggacaagg cccagattca tgacgtcgtc ctggtggggg 1140

gctccacacg catccccaag gtgcagaagt tgctgcagga cttcttcaac ggcaaggagc 1200

tgaacaagag catcaaccct gatgaggctg tggcctatgg ggctgctgtg caggcggccg 1260

tgttgatggg ggacaaatgt gagaaagtgc aggatctcct gctgctggat gtggctcccc 1320

tgtctctggg gctggagaca gcaggtgggg tgatgaccac gctgatccag aggaacgcca 1380

ctatccccac caagcagacc cagactttca ccacctactc ggacaaccag cctggggtct 1440

tcatccaggt gtatgagggt gagagggcca tgaccaagga caacaacctg ctggggcgtt 1500

ttgaactcag tggcatccct cctgccccac gtggagtccc ccagatagag gtgacttttg 1560

acattgatgc taatggcatc ctgagcgtga cagccactga caggagcaca ggtaaggcta 1620

acaagatcac catcaccaat gacaagggcc ggctgagcaa ggaggaggtg gagaggatgg 1680

ttcatgaagc cgagcagtac aaggctgagg atgaggccca gagggacaga gtggctgcca 1740

aaaactcgct ggaggcccat gtcttccatg tgaaaggttc tttgcaagag gaaagcctta 1800

gggacaagat tcccgaagag gacaggcgca aaatgcaaga caagtgtcgg gaagtccttg 1860

cctggctgga gcacaaccag ctggcagaga aggaggagta tgagcatcag aagagggagc 1920

tggagcaaat ctgtcgcccc atcttctcca ggctctatgg ggggcctggt gtccctgggg 1980

gcagcagttg tggcactcaa gcccgccagg gggaccccag caccggcccc atcattgagg 2040

aggttgattg aatggccctt cgtgataagt cagctgtgac tgtcagggct atgctatggg 2100

ccttctagac tgtcttctat gatcctgccc ttcagagatg aactttccct ccaaagctag 2160

aactttcttc ccaggataac tgaagtcttt tgactttttg cggggagggc ggttcatcct 2220

cttctgcttc aaataaaaag tcattaattt attaaaactt gtgtggcact ttaacattgc 2280

tttcacctat attttgtgta ctttgttact tgcatgtatg aattttgtta tgtaaaatat 2340

agttatagac ctaaataa 2358

<210> 2

<211> 643

<212> PRT

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 2

Met Gln Ala Pro Arg Glu Leu Ala Val Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr

1 5 10 15

Tyr Ser Cys Val Gly Val Phe Gln Gln Gly Arg Val Glu Ile Leu Ala

20 25 30

Asn Asp Gln Gly Asn Arg Thr Thr Pro Ser Tyr Val Ala Phe Thr Asp

35 40 45

Thr Glu Arg Leu Val Gly Asp Ala Ala Lys Ser Gln Ala Ala Leu Asn

50 55 60

Pro His Asn Thr Val Phe Asp Ala Lys Arg Leu Ile Gly Arg Lys Phe

65 70 75 80

Ala Asp Thr Thr Val Gln Ser Asp Met Lys His Trp Pro Phe Arg Val

85 90 95

Val Ser Glu Gly Gly Lys Pro Lys Val Arg Val Cys Tyr Arg Gly Glu

100 105 110

Asp Lys Thr Phe Tyr Pro Glu Glu Ile Ser Ser Met Val Leu Ser Lys

115 120 125

Met Lys Glu Thr Ala Glu Ala Tyr Leu Gly Gln Pro Val Lys His Ala

130 135 140

Val Ile Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ser Gln Arg Gln Ala Thr

145 150 155 160

Lys Asp Ala Gly Ala Ile Ala Gly Leu Asn Val Leu Arg Ile Ile Asn

165 170 175

Glu Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ala Tyr Gly Leu Asp Arg Arg Gly Ala

180 185 190

Gly Glu Arg Asn Val Leu Ile Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp

195 200 205

Val Ser Val Leu Ser Ile Asp Ala Gly Val Phe Glu Val Lys Ala Thr

210 215 220

Ala Gly Asp Thr His Leu Gly Gly Glu Asp Phe Asp Asn Arg Leu Val

225 230 235 240

Asn His Phe Met Glu Glu Phe Arg Arg Lys His Gly Lys Asp Leu Ser

245 250 255

Gly Asn Lys Arg Ala Leu Arg Arg Leu Arg Thr Ala Cys Glu Arg Ala

260 265 270

Lys Arg Thr Leu Ser Ser Ser Thr Gln Ala Thr Leu Glu Ile Asp Ser

275 280 285

Leu Phe Glu Gly Val Asp Phe Tyr Thr Ser Ile Thr Arg Ala Arg Phe

290 295 300

Glu Glu Leu Cys Ser Asp Leu Phe Arg Ser Thr Leu Glu Pro Val Glu

305 310 315 320

Lys Ala Leu Arg Asp Ala Lys Leu Asp Lys Ala Gln Ile His Asp Val

325 330 335

Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Lys Val Gln Lys Leu Leu

340 345 350

Gln Asp Phe Phe Asn Gly Lys Glu Leu Asn Lys Ser Ile Asn Pro Asp

355 360 365

Glu Ala Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val Gln Ala Ala Val Leu Met Gly

370 375 380

Asp Lys Cys Glu Lys Val Gln Asp Leu Leu Leu Leu Asp Val Ala Pro

385 390 395 400

Leu Ser Leu Gly Leu Glu Thr Ala Gly Gly Val Met Thr Thr Leu Ile

405 410 415

Gln Arg Asn Ala Thr Ile Pro Thr Lys Gln Thr Gln Thr Phe Thr Thr

420 425 430

Tyr Ser Asp Asn Gln Pro Gly Val Phe Ile Gln Val Tyr Glu Gly Glu

435 440 445

Arg Ala Met Thr Lys Asp Asn Asn Leu Leu Gly Arg Phe Glu Leu Ser

450 455 460

Gly Ile Pro Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe

465 470 475 480

Asp Ile Asp Ala Asn Gly Ile Leu Ser Val Thr Ala Thr Asp Arg Ser

485 490 495

Thr Gly Lys Ala Asn Lys Ile Thr Ile Thr Asn Asp Lys Gly Arg Leu

500 505 510

Ser Lys Glu Glu Val Glu Arg Met Val His Glu Ala Glu Gln Tyr Lys

515 520 525

Ala Glu Asp Glu Ala Gln Arg Asp Arg Val Ala Ala Lys Asn Ser Leu

530 535 540

Glu Ala His Val Phe His Val Lys Gly Ser Leu Gln Glu Glu Ser Leu

545 550 555 560

Arg Asp Lys Ile Pro Glu Glu Asp Arg Arg Lys Met Gln Asp Lys Cys

565 570 575

Arg Glu Val Leu Ala Trp Leu Glu His Asn Gln Leu Ala Glu Lys Glu

580 585 590

Glu Tyr Glu His Gln Lys Arg Glu Leu Glu Gln Ile Cys Arg Pro Ile

595 600 605

Phe Ser Arg Leu Tyr Gly Gly Pro Gly Val Pro Gly Gly Ser Ser Cys

610 615 620

Gly Thr Gln Ala Arg Gln Gly Asp Pro Ser Thr Gly Pro Ile Ile Glu

625 630 635 640

Glu Val Asp

Claims

1.一种促进局部温热治疗法治疗HPV感染有效率的药物靶点，其特征在于，HSPA6基因或蛋白作为增进局部温热治疗法治疗人乳头瘤病毒感染有效率的药物靶点，该靶点具备热休克蛋白的特性。

2.一种促进局部温热治疗法治疗HPV感染有效率的药物靶点，其特征在于，HSPA6基因或蛋白作为增进局部温热治疗法治疗人乳头瘤病毒感染有效率的药物靶点。

3.HSPA6基因或蛋白作为增进局部温热治疗法治疗人乳头瘤病毒感染有效率的药物靶点在制备药物中的应用，其应用具有以下特征：

1) 在温热刺激下，靶向抑制角质形成细胞中HSPA6的基因的转录或表达；

4.如权利要求3 所述的HSPA6基因或蛋白作为增进局部温热治疗法治疗人乳头瘤病毒感染有效率的药物靶点在制备药物中的应用，其特征在于，用于促进局部温热治疗法治疗人乳头瘤病毒感染的有效率。

5.如权利要求3所述的 HSPA6基因或蛋白作为增进局部温热治疗法治疗人乳头瘤病毒感染有效率的药物靶点在制备药物中的应用，其特征在于，该药物应具有靶向HSPA6基因或蛋白的特点。