CN106282347A - HoxC11作为生物标志物在制备肺腺癌的预诊断试剂中的应用 - Google Patents

HoxC11作为生物标志物在制备肺腺癌的预诊断试剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了HoxC11基因或HoxC11蛋白可用于制备肺腺癌的预诊断试剂和试剂盒，制备肺腺癌的预诊断预后评估试剂或治疗药物等。本发明从肺腺癌和正常肺组织样本中抽提RNA后逆转录，实时荧光定量法检测HoxC11的表达，结果显示HoxC11在肺腺癌组织中高表达。提示HoxC11可作为肺腺癌预诊断的分子标志物。本发明为肺腺癌的辅助诊断和预后预测提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

Description

HoxC11作为生物标志物在制备肺腺癌的预诊断试剂中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及HoxC11基因或蛋白在制备肺癌诊断、预后评估及治疗的应用，具体涉及HoxC11作为生物标志物在制备肺腺癌的预诊断试剂中的应用。
背景技术
肺癌是目前全球范围内发病率与致死率最高的恶性肿瘤，，每年的新发肺癌病例有160万，占所有恶性肿瘤的13％。肺癌被分为两大类，非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC),其中最常见的是非小细胞肺癌，约占80％左右。非小细胞主要包括肺腺癌、肺鳞癌和大细胞肺癌。近年来肺腺癌的比例很高，约占肺癌的50％。肺腺癌恶性程度较高，易复发、转移，绝大多数患者在确诊时已属相对晚期，失去了根治性手术的机会。早期诊断和及早治疗对肺腺癌者的疗效与预后至关重要。
同源异形盒基因是一类特殊的转录调节因子，属于发育相关基因，在进化上高度保守。近年来研究发现,同源异形盒基因异常表达与肿瘤的发生和发展密切相关。HOX基因是同源异形盒基因中的一种，不仅调控胚胎细胞的增殖和分化，而且在成人组织细胞中具有同样的调节作用。研究发现，原仅在胚胎组织表达，或在胚胎及正常成熟组织中应沉默的HOX基因在成熟组织中表达，通常引起肿瘤的发生，而一部分在正常成熟组织表达的HOX基因在相应的肿瘤中往往低表达或表达缺失。通过分析正常组织和癌组织中HOX基因的差异性表达可作为癌症的预诊断。目前，关于HoxC11基因或蛋白作为肺腺癌新的诊断标志及应用还末见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供HoxC11基因或蛋白在制备肺腺癌诊断、预后评估及应用。发明人研究发现，HoxC11蛋白在肺腺癌中的表达明显升高，维持了肿瘤细胞的快速增殖活性以及增强了侵袭转移能力，在肺腺癌的发生发展中发挥重要作用。因此，HoxC11基因或蛋白可作为肺腺癌新的诊断标志,HoxC11基因(SEQ ID NO：1)可用于肺腺癌的早期鉴别诊断、肺腺癌患者的预后评估分析及临床治疗。HoxC11蛋白是一个在物种进化过程中十分保守的蛋白质，它主要参与肿瘤的增殖、分化、侵袭、转移、凋亡等生理过程，在人体正常肺组织器官中表达普遍较低。最近我们利用实时荧光定量PCR技术检测到了HoxC11在肺腺癌中异常高表达上调。通过kaplan meier-plotter(www.kmplot.com)数据库中数据分析发现HoxC11的表达水平越高，患者的预后越差。
通过本发明发明人的研究表明，HoxC11基因或HoxC11蛋白可用于制备肺腺癌的预诊断试剂和试剂盒，制备肺腺癌的预诊断预后评估试剂或治疗药物等。
本发明还提供了检测肺腺癌的试剂盒，所述试剂盒中含有如下引物对：
用于实时荧光定量检测HoxC11基因表达的引物对：
正向引物：5’-GAGGCTGAGGAGGAGAACAC-3’(SEQ ID NO.2)；
反向引物：5’-CTTGTCGGTCCGTCAGGTT-3’(SEQ ID NO.3)；
内参基因Beta-actin特异性PCR引物对：
正向引物：5’-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3’(SEQ ID NO.4)；
反向引物：5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3’(SEQ ID NO.5)。
所述试剂盒中还包括：
从肺腺癌组织中抽提总RNA所用试剂；以总RNA为模版将HoxC11逆转录为cDNA的试剂；将cDNA进行实时荧光定量PCR的试剂。所述从肺腺癌组织中抽提总RNA所用试剂包括RNAiso Plus、三氯甲烷、异丙醇、体积百分比浓度为75％的乙醇、无核酶水；以总RNA为模版将HoxC11逆转录为cDNA的试剂包括逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶以及随机引物；将cDNA进行实时荧光定量PCR的试剂包括实时荧光定量SYBRGreen染料、无核酶水。
总之，本发明从肺腺癌和正常肺组织样本中抽提RNA后逆转录，实时荧光定量法检测HoxC11的表达，结果显示HoxC11在肺腺癌组织中高表达。提示HoxC11可作为肺腺癌预诊断的分子标志物。本发明为肺腺癌的辅助诊断和预后预测提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。
附图说明
图1为实时荧光定量PCR技术验证HoxC11在肺腺癌和正常肺组织中的表达情况显示HoxC11在肺腺癌中的表达比正常肺组织中显著提高；
图2为肺腺癌中HoxC11的表达与肺腺癌患者预后的关系。肺腺癌中HoxC11的高表达与肺腺癌患者的不良预后相关，即HoxC11高表达患者的总生存时间要明显低于HoxC11低表达的患者；
图3为在肺腺癌细胞中导入HoxC11表达载体，可显著增加HoxC11在肺腺癌细胞中的表达。
图4为在肺腺癌细胞系中导入HoxC11的过表达载体促进HoxC11表达后，细胞增殖能力增高；
图5为在肺腺癌细胞中导入HoxC11过表达载体促进HoxC11表达后，细胞侵袭迁移能力增高。
具体实施方式
实施例1实时荧光定量PCR法检测证实HoxC11在肺腺癌中表达上调
1.材料与方法：
收集36对肺腺癌及癌旁正常对照组织，抽提总RNA，1μg RNA经逆转录成cDNA后，进行实时荧光定量PCR。HoxC11正向引物5’-GAGGCTGAGGAGGAGAACAC-3’(SEQ ID NO.2)和HoxC11反向引物5’-CTTGTCGGTCCGTCAGGTT-3’(SEQ ID NO.3)。
用于对照的内参基因Beta-actin正向引物5’-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3’(SEQID NO.4)和内参基因Beta-actin反向引物5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3’(SEQ IDNO.5)。实时荧光定量PCR反应体系如下：
实时荧光定量PCR反应步骤
反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根据CT值(threshold cycle values)、内参基因(Beta-actin)标化后，采用group t-test检验计算P值。
2.结果
HoxC11在正常对照组织中不表达或者表达很低，而在肺腺癌组织中高表达P<0.05(图1)。
实施例2 kaplan meier-plotter(www.kmplot.com)数据库中数据分析发现HoxC11在肺腺癌中的表达与患者预后相关。
结果
HoxC11高表达的肺腺癌患者总生存时间要明显低于HoxC11低表达的患者，预后较差。
实施例3构建过表达HoxC11载体使HoxC11过表达
1.材料方法
1.1试剂及试剂盒
HOXC11菌液ThermoCat.MHS6278-202755988
限制性内切酶Age I、NheI，T4DNA连接酶等购自TakaRa公司；
PLJM1-EGFP(8038bp) addgene
EcoliDH5α感受态细胞 Takara
TRIZOLTM Reagent(Invitrogen)；
质粒抽提试剂盒(#D6943-01，OMEGA)；
胶回收试剂盒(#M5212，OMEGA)；
逆转录试剂盒(#A3500，Promega)；
抗生素puromycin(Ameresc)。
1.2HoxC11(CDS)引物的设计
通过UCSC数据库找到HoxC11(CDS)序列，然后通过酶切保护碱基数据库设计引物
F:AGTCGCTAGC ATGTTTAACTCGGTCAACCTG(SEQ ID NO.6)NheI
R:CGGGTACCGGTAGCAGCAGAGGATTTCCCGAGA(SEQ ID NO.7)AgeI
引物说明：含酶切保护碱基(黄色标记)、酶切位点(单下划线)，增强子(双下划线)，调整读码框碱基(加粗)并含有目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因(红色)
1.3过表达HoxC11载体构建
把HoxC11菌液进行扩大培养抽提质粒，PCR方法扩增HoxC11，胶回收，用Age I、NheI双酶切PCR胶回收产物和PLJM1-EGFP质粒，按照3:1的物质量的比例混合，用T4连接酶，16℃连接过夜。转化E.coilDH5α感受态，挑选转化子，菌落PCR以及测序鉴定。再用Age I、NheI酶切构建好的PLJM1-EGFP-HoxC11质粒，2％的琼脂糖DNA凝胶电泳，以空白PLJM1-EGFP为空白对照，判断插入了目的片段的阳性克隆，阳性克隆测序验证后用于细胞内HoxC11的过表达。
1.4细胞培养与转染
肺腺癌细胞系A549购自ATCC，细胞培养所用DEM/F12培基和胎牛血清，及消化细胞所用的胰蛋白酶均为美国Gibco公司产品。
将生长状态良好的肺癌细胞系A549按2×105个细胞/孔接种于6孔板中，将6孔板置于37℃，5％CO2培养箱中，待培养细胞生长至70-80％密度即可开始HoxC11表达载体的转染；转染过程如下：
在无菌EP管中加入3μl的lipofectamine 2000于100μl无血清培养基中混匀静置5min；
将构建的HoxC11表达载体加入100μl无血清培养基中；然后与上述包含lipofectamine的100μl无血清培养基温和混匀，室温静置20分钟，使DNA与脂质体形成复合体；
用D-Hank's液洗涤细胞3次；
将上述混合物中加入800μl无血清培养基(无抗生素)，温和混匀后加入6孔板中的1个孔；
将6孔板置于CO2培养箱中，37℃培养6小时，然后弃上清，加入完全培养基继续培养48小时。
1.5实时定量PCR检测HoxC11表达载体过表达的效果：
将HoxC11表达载体转染后的肺腺癌细胞抽提总RNA，1μg RNA经逆转录成cDNA，HoxC11正向引物5’-GAGGCTGAGGAGGAGAACAC-3’(SEQ ID NO.8)和HoxC11反向引物5’-CTTGTCGGTCCGTCAGGTT-3’(SEQ ID NO.9)。
用于对照的内参基因Beta-actin正向引物5’-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3’(SEQID NO.4)和内参基因Beta-actin反向引物5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3’(SEQ IDNO.5)。实时荧光定量PCR反应体系如下：
实时荧光定量PCR反应步骤：
反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根据CT值(threshold cycle values)、内参基因(Beta-actin)标化后，采用group t-test检验计算P值。
2.结果
HoxC11表达载体转染肺腺癌细胞A549后，均可显著上调肺癌细胞中HoxC11的表达水平(图3)。
实施例4 HoxC11表达载体促进HoxC11表达后，细胞增殖能力增高。
1.材料方法
1.1平板集落形成实验(colony-forming assay)是用来考察单个细胞增殖能力的有效方法。
转染HoxC11表达载体或对照载体的稳定肺癌细胞系制作细胞悬液，以细胞密度(500个/孔)接种于6孔板的孔中,平行3孔。
置于37℃，5％CO2，培养箱中培养，静置2～3周。
染色：当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去培养液，用PBS或D-Hanks液小心浸洗2～3次，加甲醇5ml固定15分钟，0.1％结晶紫或Giemsa染色液染色30分钟，流水缓缓洗去染液，空气干燥。
计数：通过ImageJ软件计算克隆数。取3个皿的克隆平均值。
1.2细胞周期实验利用细胞内DNA能够与荧光染料(PI)结合的特性，是反应细胞增殖情况的一种实验方法。
将转染HoxC11表达载体或对照载体的稳定肺癌细胞系接种于6cm培养皿，融合度为40％。37℃，5％CO2培养。
待细胞贴壁后，用血清饥饿法进行同步化处理24h后加有血清培基继续培养。收集不同时间处理的全部细胞，进行细胞周期的检测。
70％乙醇进行固定细胞
细胞染色：500g，5min离心收集细胞，用预冷的PBS洗涤细胞两次，加入200ulPBS+20ul RNase(100ug/ml)混匀，室温避光放置5min,后加10ul PI(50ug/ml)混匀，室温避光放置30min
流式分析：BD FACSDivaTM流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞。结果用细胞周期拟合软件Flow Jo分析
1.3 MTS是一种间接的方法测定细胞的增殖活力
细胞种板：用胰酶将转染HoxC11表达载体或对照载体的稳定肺癌细胞系消化，培基终止消化。用血球计数板计数，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul细胞悬液(设置5个复孔),使待测细胞调密度1000/well,置于5％CO2，37℃培养箱中培养。
检测：选取时间点：0,24,48,72，96小时。0小时是指待细胞贴壁后(12h)加入MTS(promega)试剂检测。每孔加MTS溶液与培基以1:5的比例混合液100μl，设置5个孔为空白对照，生化培养箱内孵育1小时。在酶标仪490nm波长处测定各孔的吸光值。
2.结果
肺腺癌细胞系中导入HoxC11的过表达载体促进HoxC11表达后，细胞增殖能力增高(图4)。
实施例5 HoxC11表达载体促进HoxC11表达后，细胞侵袭迁移能力增高。
1.材料方法
1.1材料与试剂
transwell 小室 BD公司，货号：353097
transwell 专用24孔板 BD公司，货号：353504
Growth Factor Reduced Matrigel Matrix(BD公司，货号：356230)
10％胎牛血清(Invitrogen公司)
DMEM-F12培养基(GIBCOBRL公司)
无水乙醇
0.1％的结晶紫
1.2包被基底膜：用50mg/LMatrigel 1:6(1:5-1:8)稀释液包被Transwell(FALCON)室底部膜的上室面，培养箱风干。细胞在5％的FBS的培养基中培养24h后，消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗3遍，用含2％培养基重悬，调整细胞密度至1×10^6/ml,取细胞悬液200μl加入Transwell小室。24孔板下室加入600μl含10％FBS培养基，放入37℃，培养箱培养细胞48h。
用1XPBS洗涤小室2次，无水乙醇固定15min，0.1％的结晶紫染色30min后镜下进行细胞计数。随机视野计数法:每张封片于40×光镜下计数膜背面侵袭的细胞数，随机计数中间和四周共5个视野，求出其平均值，重复3次。
1.3不铺胶的实验步骤：
制备细胞悬液：将对数生长期的细胞消化，离心，用PBS洗2遍，再用含0.2％小牛血清白蛋白的无血清培养基重悬，调整细胞密度至5×10^4个/ml。
接种细胞：在上室中加入200μl细胞悬液。下室中加入600μl含10％胎牛血清的培养基。置于37℃、5％CO 2培养箱孵育24h。
用1XPBS洗涤小室2次，无水乙醇固定15min，0.1％的结晶紫染色30min后镜下进行细胞计数。随机视野计数法:每张封片于40×光镜下计数膜背面侵袭的细胞数，随机计数中间和四周共5个视野，求出其平均值，重复3次。
2.结果
肺腺癌细胞系中导入HoxC11的过表达载体促进HoxC11表达后，细胞侵袭和迁移能力增高(图5)。

Claims (7)

1.HoxC11作为生物标志物在制备肺腺癌的预诊断试剂中的应用。
2.HoxC11作为生物标志物在制备肺腺癌的预诊断试剂盒中的应用。
3.HoxC11作为生物标志物在制备肺腺癌的预诊断预后评估试剂或治疗药物中的应用。
4.如权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，所述HoxC11是指HoxC11基因或HoxC11蛋白。
5.检测肺腺癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有如下引物对：
用于实时荧光定量检测HoxC11基因表达的引物对：
正向引物：5’-GAGGCTGAGGAGGAGAACAC-3’；
反向引物：5’-CTTGTCGGTCCGTCAGGTT-3’；
内参基因Beta-actin特异性PCR引物对：
正向引物：5’-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3’；
反向引物：5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3’。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：
从肺腺癌组织中抽提总RNA所用试剂；以总RNA为模版将HoxC11逆转录为cDNA的试剂；将cDNA进行实时荧光定量PCR的试剂。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述从肺腺癌组织中抽提总RNA所用试剂包括RNAiso Plus、三氯甲烷、异丙醇、体积百分比浓度为75％的乙醇、无核酶水；以总RNA为模版将HoxC11逆转录为cDNA的试剂包括逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶以及随机引物；将cDNA进行实时荧光定量PCR的试剂包括实时荧光定量SYBR Green染料、无核酶水。
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