CN107805663A

CN107805663A - Lnc03729基因作为生物标志物在肺腺癌预诊断试剂中的应用

Info

Publication number: CN107805663A
Application number: CN201710905241.4A
Authority: CN
Inventors: 陶永光; 杨瑞
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2017-09-29
Filing date: 2017-09-29
Publication date: 2018-03-16
Anticipated expiration: 2037-09-29
Also published as: CN107805663B

Abstract

本发明公开了Lnc03729基因作为生物标志物可用于制备肺腺癌的诊断、预后评估及治疗指导标志物等。本发明从肺腺癌和正常肺组织样本中抽提RNA后逆转录，实时荧光定量PCR技术检测其中Lnc03729的表达，并外源性上调人肺腺癌细胞Lnc03729的表达，MTS及Transwell实验检测细胞增殖转移能力的变化情况。结果显示Lnc03729在肺腺癌组织中低表达，上调人肺腺癌细胞Lnc03729的表达后，细胞增殖转移能力均显著下调，提示Lnc03729可作为肺腺癌细胞恶性程度及患者预后评估的标志物。本发明为肺腺癌的辅助诊断、预后预测及治疗指导提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

Description

Lnc03729基因作为生物标志物在肺腺癌预诊断试剂中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及Lnc03729 基因在制备肺癌诊断、预后评估及治疗指导的应用，具体涉及Lnc03729作为生物标志物在制备肺腺癌的预诊断试剂中的应用。

背景技术

肺癌是全球范围最常见、死亡率最高的恶性肿瘤，我国肺癌形势同样相当严峻，2015年我国肺癌新发73.33万例，死亡61.02万例，是我国第一大恶性肿瘤。肺癌根据组织学类型可分为小细胞肺癌（SCLC）及非小细胞肺癌（NSCLC），后者可细分为肺腺癌、肺鳞癌和大细胞肺癌，其中肺腺癌占所有肺癌的50%以上，是主要的病理类型。多数肺腺癌起源于较小的支气管，为周围型肺癌，故患者早期多无明显的临床症状，但部分患者可出现早期的血行转移，且绝大多数患者在确诊时已属相对晚期，导致患者失去根治性手术的机会。因此，早期诊断和及早治疗对肺腺癌者的疗效与预后至关重要。

LncRNA长度超过200nt的非编码RNA（ncRNA），其不参与蛋白质的翻译，却可通过多种表观遗传调控机制发挥生物学作用，包括染色质重塑、细胞周期调控、剪接调控及RNA降解等，基于LncRNA广泛的生物学作用，其与恶性肿瘤的关系也逐步被人们所发现，多种长链非编码RNA被发现参与调控恶性肿瘤的发生发展：HOTAIR基因在乳腺癌、肺癌、结直肠癌、肝细胞癌及脑胶质瘤中表达明显上调，且可通过介导H3K27甲基化、上调HOXD10及PCDH等原癌基因的表达促进相关肿瘤细胞的增殖转移、及血管生成的能力；H19基因在肺癌、食管癌及前列腺癌组织中高表达，并可介导细胞EMT进程促进细胞侵袭转移；MALAT-1在乳腺癌、肺癌、结直肠癌及前列腺癌组织中高表达，其可作为肝细胞癌复发的独立危险因素，具有潜在的促癌作用；MEG3则在多种恶性肿瘤中表达下调，包括乳腺癌、肺癌、胃癌、结直肠癌及卵巢癌等，其在体内外可与P53基因相互作用，抑制细胞增殖能力，促进细胞凋亡，并可上调细胞化疗药物敏感性；另外LSINCT5、HULC、GAS5等LncRNA均与恶性肿瘤发生发展存在密切关系。我们的研究发现Lnc03729在肺腺癌中表达显著下调，且尚未有关于Lnc03729与恶性肿瘤关系的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供Lnc03729基因在肺腺癌诊断、预后评估及治疗指导方面的应用。发明人研究发现，Lnc03729在肺腺癌中低表达，且在体外可抑制肺腺癌细胞增殖及侵袭迁移的能力，是潜在的抑癌基因。因此，Lnc03729基因可成为肺腺癌诊断、预后评估及治疗指导的新标志物。

通过本发明发明人的研究表明，Lnc03729基因可作为生物标志物用于制备肺腺癌的预诊断试剂和试剂盒，制备肺腺癌的预诊断预后评估试剂或治疗药物等。

本发明还提供了检测肺腺癌的试剂盒，所述试剂盒中含有如下引物对：

用于实时荧光定量检测Lnc03729基因表达的引物对：

正向引物：5’- TTGGTGGATGCTGACCTTCA-3’（SEQ ID NO.1）；

反向引物：5’- ACCAGAAACCAGATGTAGCCA -3’（SEQ ID NO.2）；

内参基因β-Actin特异性PCR引物对：

正向引物：5’-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3’（SEQ ID NO.3）；

反向引物：5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3’（SEQ ID NO.4）。

所述试剂盒中还包括：

从肺腺癌组织中抽提总RNA所用试剂；以总RNA为模版将Lnc03729逆转录为cDNA的试剂；将cDNA进行实时荧光定量PCR的试剂。所述从肺腺癌组织中抽提总RNA所用试剂包括RNAiso Plus、三氯甲烷、异丙醇、体积百分比浓度为75%的乙醇、无核酶水；以总RNA为模版将Lnc03729逆转录为cDNA的试剂包括逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶以及随机引物；将cDNA进行实时荧光定量PCR的试剂包括实时荧光定量SYBR Green染料、无核酶水。

总之，本发明从肺腺癌和正常肺组织样本中抽提RNA后逆转录，实时荧光定量法检测Lnc03729的表达，结果显示Lnc03729在肺腺癌组织中低表达，提示Lnc03729可成为肺腺癌的预诊断分子标志物，进而指导临床工作的开展。

附图说明

图1为实时荧光定量PCR技术检测Lnc03729在肺腺癌及癌旁组织中的表达情况，结果显示肺腺癌中Lnc03729的表达相比正常肺组织中显著下降；

图2为在肺腺癌细胞H358及A549中转染Lnc03729全长表达载体，使H358及A549细胞Lnc03729外源性过表达；

图3为过表达H358及A549细胞Lnc03729后，细胞增殖能力显著下降；

图4为过表达H358及A549细胞Lnc03729后，细胞侵袭迁移能力显著下降。

具体实施方式

实施例1实时荧光定量PCR法检测Lnc03729在肺腺癌中的低表达：

1. 材料与方法

1.1材料

RNA提取试剂Trizol（# 9109，Takara）；

逆转录试剂盒（#A3500，Promega）；

SYBR® Premix Ex Taq™荧光染料（#RR420A，Takara）；

无核酶水（#10977023，Invitrogen）。

1.2方法

收集24对肺腺癌及癌旁组织，抽提总RNA，取1μg行逆转录得到cDNA模板，实时荧光定量PCR技术检测两种组织中Lnc03729表达水平。Lnc03729基因正向引物：5’-TTGGTGGATGCTGACCTTCA -3’；反向引物：5’- ACCAGAAACCAGATGTAGCCA -3’；内参基因β-Actin正向引物：5’-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3’；反向引物：5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3’。实时荧光定量PCR反应体系如下：SYBR® Premix Ex Taq™（2×）10μL、PCR Primer (1μM) 5μl、cDNA模板 (1μg/ml) 5μl，总体积20μl

实时荧光定量PCR反应步骤：

(1) 94℃ 5min

(2) 95℃ 10sec

(3) 58℃ 30sec

(4) 72℃ 20sec

(5) Plate read

(6) 82℃ 30sec

(7) Plate read

(8) Go to step 2 for more 39 times

(9) Perform melting curve from 55.0℃ to 95.0℃ , read every 0.2℃ , holdfor 1 sec

反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根据CT值(threshold cycle values)、内参基因(β-Actin)标化后，采用group t-test检验计算P值。

2. 结果

肺腺癌组织中Lnc03729表达水平显著低于癌旁组织，见图1。

实施例2构建稳定过表达Lnc03729的H358及A549肺腺癌细胞系：

1. 材料与方法

1.1材料

人肺腺癌细胞H358、A549及人胚肾细胞293T（ATCC）；

DMEM培养基、1640培养基、DMEM/F12培养基、胎牛血清及胰蛋白酶（Gibco）

过表达Lnc03729载体（山东维真生物）；

慢病毒包装载体Gag-Pol、REV、VSV-G（addgene）；

EcoliDH5α感受态细胞（#D9057，Takara）；

质粒抽提试剂盒（#D6943-01，OMEGA）；

转染脂质体Lipofectamine® RNAiMAX Reagent（#13778150，Thermo FisherScientific）；

嘌呤霉素puromycin（Amresco）；

阳离子聚合物Polybrene（#28728-55-4，Sigma）；

RNA提取试剂Trizol（# 9109，Takara）；

逆转录试剂盒（#A3500，Promega）；

SYBR® Premix Ex Taq™荧光染料（#RR420A，Takara）；

无核酶水（#10977023，Invitrogen）。

1.2方法

1.2.1慢病毒包装

在293T中对过表达Lnc03729载体进行慢病毒包装：将生长状态良好的293T细胞以2×10⁵个细胞/孔接种于6孔板中，置于37℃，5%CO₂，相对湿度100%的生化培养箱中，DMEM＋10%胎牛血清培养。待培养细胞生长至70-80%融合度时，将抽提好的1μg 过表达Lnc03729载体及空白载体分别与0.75μg Gag-Pol、0.3μg REV及0.45μg VSV-G载体混合于1.5ml EP管中，加入500μl无血清DMEM混匀，静置5分钟后加入10μl转染脂质体，充分混匀，同时293T细胞用PBS洗3次后更换1ml无血清DMEM培养，静置20分钟后将上述混合液均匀滴入293T细胞中，7h后更换DMEM＋10%胎牛血清培养基培养，于24h及72h收集病毒悬液，0.45μm过滤器过滤。

1.2.2慢病毒感染

将生长状态良好的H358及A549细胞以2×10⁵个细胞/孔接种于6孔板中，将过滤好的病毒悬液与1640＋10%胎牛血清培养基1:1混合培养H358细胞，将病毒悬液与DMEM/F12＋10%胎牛血清培养基1:1混合培养A549细胞，同时加入2μl阳离子聚合物polybrene，连续感染3天后，嘌呤霉素筛选细胞，至荧光较强且生长状态良好。

2. 结果

转入Lnc03729全长载体的H358及A549细胞相比转入空白载体的相应细胞Lnc03729表达显著上调，见图2。

实施例3上调肺腺癌细胞H358及A549中Lnc03729的表达后细胞增殖能力下降：

1. 材料与方法

1.1材料

细胞计数板（#145-0011，Bio-Rad）；

MTS（# G3580，promega）。

1.2方法

MTS检测细胞增殖能力

将生长状态良好的过表达Lnc03729 H358及A549细胞及相应Vector对照细胞以2000个细胞/孔接种于96孔板中，设置5个平行孔，待细胞贴壁后弃去旧培养基，将MTS试剂与1640＋10%胎牛血清（A549使用DMEM/F12＋10%胎牛血清）培养基按1:9均匀混合，以100 μl/孔加入到相应待检测细胞孔中，37℃孵育1 h，检测490 nm处吸光度。同样，在24 h、48 h、72 h检测细胞490 nm吸光度，以24 h、48 h、72 h细胞490 nm吸光度与0 h吸光度的比值表示细胞相对增殖能力。

2结果

上调肺腺癌细胞H358及A549中Lnc03729的表达后，细胞相对增殖能力显著降低，见图3。

实施例4上调肺腺癌细胞H358及A549中Lnc03729的表达后细胞侵袭迁移能力下降：

1. 材料与方法

1.1 材料

Transwell小室（#353097，BD）；

Transwell专用24孔板（#353504，BD）；

Growth Factor Reduced Matrigel Matrix （#356230，BD）；

小牛血清（#16010-159，Gibco）；

无水乙醇；

细胞计数板（#145-0011，Bio-Rad）；

0.1%的结晶紫。

1.2 方法

1.2.1 Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力

培养生长状态良好的过表达Lnc03729 H358及A549细胞及相应Vector对照细胞于10cm培养皿中，将50mg/L Matrigel胶与无血清1640培养基（A549使用无血清DMEM/F12培养基）1:8稀释，包被Transwell小室底的上室面，37℃自然风干，风干后吸出残余液体，配制1640＋1%小牛血清培养基及DMEM/F12＋1%小牛血清培养基，胰蛋白酶消化细胞并重悬，PBS洗细胞3次，1640＋1%小牛血清培养基（A549使用DMEM/F12＋1%小牛血清培养基）重悬细胞并进行细胞计数，以1×10⁵个细胞/孔接种至铺胶的Transwell小室中，总体积200μl，下小室加入800μl 1640＋10%胎牛血清培养基（A549使用DMEM/F12＋10%胎牛血清培养基），置于生化培养箱中37℃，5%CO₂培养48h。棉签擦去上室面未穿过的细胞，PBS洗细胞3次，无水乙醇固定细胞10min，0.1%结晶紫染色30min，PBS洗细胞3次，光镜下细胞计数，200×光镜下观察膜背面侵袭的细胞数，随机统计从中间和四周5个视野的总数，重复3次，再求其平均值及标准差。

1.2.2 Transwell迁移实验检测细胞迁移能力

同Transwell侵袭实验消化重悬细胞，以5×10⁴个细胞/孔接种至未铺胶的Transwell小室中，生化培养箱中37℃，5%CO₂培养24h，培养条件、后续处理及结果统计同Transwell侵袭实验。

2. 结果

上调肺腺癌细胞H358及A549中Lnc03729的表达后，细胞侵袭及迁移能力均显著降低，见图4。

SEQUENCE LISTING

<110> 中南大学

<120> Lnc03729基因作为生物标志物在肺腺癌预诊断试剂中的应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ttggtggatg ctgaccttca 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

accagaaacc agatgtagcc a 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

caccattggc aatgagcggt tc 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

aggtctttgc ggatgtccac gt 22

Claims

1.Lnc03729基因作为生物标志物在制备肺腺癌的预诊断试剂中的应用。

2.Lnc03729基因作为生物标志物在制备肺腺癌的预诊断试剂盒中的应用。

3.Lnc03729基因作为生物标志物在制备肺腺癌的预后评估试剂或治疗药物中的应用。

4.如权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，所述Lnc03729基因包括RNA。

5.检测肺腺癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有如下引物对：

用于实时荧光定量检测Lnc03729基因表达的引物对：

正向引物：5’-TTGGTGGATGCTGACCTTCA-3’；

反向引物：5’-ACCAGAAACCAGATGTAGCCA-3’；

内参基因β-Actin特异性PCR引物对：

正向引物：5’-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3’；

反向引物：5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3’。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：从肺腺癌组织中抽提总RNA所用试剂；以总RNA为模版将Lnc03729逆转录为cDNA的试剂；将cDNA进行实时荧光定量PCR的试剂。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述从肺腺癌组织中抽提总RNA所用试剂包括RNAiso Plus、三氯甲烷、异丙醇、体积百分比浓度为75％的乙醇、无核酶水；以总RNA为模版将Lnc03729逆转录为cDNA的试剂包括逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶以及随机引物；将cDNA进行实时荧光定量PCR的试剂包括实时荧光定量SYBR Green染料、无核酶水。