CN109609636A

CN109609636A - 一种肺腺癌差异性表达circRNA的检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN109609636A
Application number: CN201811635522.3A
Authority: CN
Inventors: 冯耘; 韩蕙泽; 时国朝; 周灵
Original assignee: Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
Current assignee: Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2019-04-12
Anticipated expiration: 2038-12-29
Also published as: CN109609636B

Abstract

本发明涉及一种肺腺癌差异性表达circRNA的检测试剂盒及其应用。本发明发现了circRNA hsa_circ_0001640在肺腺癌组织、癌旁组织中存在差异性表达，且差异性表达显著，可用作肺腺癌诊断标志物，并针对hsa_circ_0001640设计了相应的PCR引物，通过对样品进行实时荧光定量PCR，检测该样品中是否存在hsa_circ_0001640，即可对该样品所属个体是否患有肺腺癌进行初步判断，为临床诊断和预后提供参考。本发明还发现hsa_circ_0001640具有明显的抑癌作用，可以显著抑制肺腺癌细胞的增殖侵袭能力，有望基于此开发治疗肺癌的药物。

Description

一种肺腺癌差异性表达circRNA的检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于医药生物领域，具体涉及一种肺腺癌差异性表达circRNA的检测试剂盒及其应用。

背景技术

肺癌是目前世界上发病率及死亡率最高的恶性肿瘤，肺腺癌(lungadenocarcinoma，LAD)是肺癌中最为常见的病理类型之一，其患者以亚洲、女性、无吸烟史、发病年龄相对较早为较为常见的特点，且肿瘤生长速度较快，可能发生早期转移。此外，由于肺癌发展的多因素性和复杂性，许多患者的治疗效果与预后结果和临床分期并不相符。因此，寻找到有助于肺癌早期诊断及预后判断相关的分子标志物是目前亟需解决的重要问题。

目前对肺癌的筛查手段主要通过影像学检查，但影像学由于普及程度以及灵敏度的局限性，患者在发现肺癌时往往已经出现了病情的转移或进展，失去早期手术的机会。例如X线对于1cm以下的肺部结节的检出率不高；胸部CT可检测出0.5cm左右的肺部结节，但射线量较X线大大增加，不利于短期复查；PET-CT虽然对肺部肿瘤的敏感性更高，但价格昂贵，且在许多地区尚未普及。对于肺部肿瘤的明确诊断，肺穿刺活检或手术病理依旧是目前的金标准，但创伤性、风险高、价格昂贵，并且不利于复查。而目前常用的肺癌相关血清肿瘤标记物，如CEA、NSE、CYFRA21-1等，往往存在特异性差的缺点。

近年来，随着高通量测序技术在RNA检测中的普及，越来越多的circRNA被检出，并且在心血管疾病、神经系统疾病、感染性疾病、肿瘤疾病等多种疾病谱中均有涉及。circRNA由于其特殊的环状结构，序列高度保守，并且结构更加稳定，因此越来越多的研究认为，circRNA的这种特殊的结构性质，可以使它成为多种疾病的理想的生物标志，以及药物治疗研究的新靶点。在肺癌方面，circRNA_100876被证实在非小细胞肺癌中的表达上调，并且与淋巴结转移、肿瘤分期以及患者预后相关；has_circ_0013958被证实在肺腺癌中表达上调，并且与肺腺癌的TMN分期以及淋巴结转移有相关性，还可以抑制miR-134的表达，从而达到调控肿瘤细胞生长的作用；Wan L等人通过实验研究发现cir-ITCH可以通过与miR-7及miR-214相互结合发挥海绵作用，从而上调亲本基因ITCH的表达，ITCH的高表达可以有效地抑制Wnt/β-Catenin途径，最终抑制肺癌的发生发展。circRNA作为体系最大的RNA家族之一，有大量的circRNA在肺癌中的作用和意义尚处于未知阶段，在肺癌方面有很大的研究空间。

发明内容

本发明提供了一类用作肺腺癌诊断标志物的circRNA，该circRNA在肺腺癌组织中存在差异表达。

本发明利用高通量测序技术对收集的肺腺癌组织和癌旁组织标本进行分析，筛选出在肺腺癌组织中表达存在异常的37种circRNA，然后利用实时荧光定量PCR对筛选得到的9种circRNA分子进行验证和进一步筛选，从中得到了1种circRNA分子。

申请人发现，这1种circRNA在肺腺癌及癌旁组织中存在显著的差异性表达，因此可作为肺腺癌诊断标志物，用于判断受检个体是否有肺腺癌的发病风险。

申请人发现，这1种circRNA与肺腺癌患者的预后情况存在显著的相关性，因此可作为肺腺癌患者预后判断的生物标志。

本发明提供了circRNA作为标志物在制备用于肺腺癌诊断或预后的试剂盒中应用，所述circRNA其编码序列如SEQ ID No:6所示。

利用该试剂盒进行肺腺癌诊断时，如所述试剂盒检测出样品中所述circRNA的表达量与阴性对照相比具有显著差异，则诊断为患癌风险。所述样品优选为血清。

作为优选，所述试剂盒为逆转录实时荧光定量PCR试剂盒，利用该试剂盒进行肺腺癌诊断及病情监测的方法，可按一下步骤进行：

(1)提取样品中的circRNA，并将circRNA反转录为cDNA；

(2)以cDNA为模板，利用引物进行实时荧光定量PCR，检测相应circRNA的相对表达定量并与阴性对照进行比较，判断该circRNA是否存在差异性表达。

作为优选，采用2^-△△Ct法比较样品与阴性对照中circRNA的相对表达量，然后通过t检验比较两者的相对表达量是否存在显著差异(P<0.05)。若所述circRNA分子存在差异性表达，则将该样品所属个体诊断为患癌风险，或预后较差。

本发明还提供了一种用于诊断肺腺癌的引物，可用于扩增所述circRNA分子的编码序列，其中正向引物序列如SEQ ID No:3所示，反向引物序列如SEQ ID No:4所示。

鉴于所述引物能够特异性扩增上述的circRNA分子的编码序列，因此本发明还提供了所述引物在制备用于诊断肺腺癌或判断肺腺癌预后的试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种诊断肺腺癌的试剂盒，包括所述引物，以及内参基因和阴性对照。

本发明中所述内参基因为β-actin。用于扩增该内参基因的引物，其正向引物的碱基序列如SEQ ID No:1所示，反向引物的碱基序列如SEQ ID No:2所示。

阴性对照为癌旁组织中提取的circRNA。

本发明还利用细胞实验验证了circRNA对肺腺癌细胞的抑制作用。

申请人发现，这1种circRNA具有明显的抑癌作用，可以明显抑制肺腺癌细胞的增殖侵袭能力。

本发明提供了circRNA或其促进剂在制备治疗肺腺癌的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明发现了由SEQ ID No:6所示序列编码的circRNA分子在肺腺癌组织、癌旁组织中存在差异性表达，且差异性表达显著，可用作肺腺癌诊断标志物，并针对circRNA分子设计了相应的PCR引物，通过对样品进行实时荧光定量PCR，检测该样品中是否存在本发明所述的差异性表达circRNA，即可对该样品所属个体是否患有肺腺癌进行初步判断，为临床诊断和预后提供参考。

本发明还发现hsa_circ_0001640具有明显的抑癌作用，可以明显抑制肺腺癌细胞的增殖侵袭能力，有望基于此开发治疗肺癌的药物。

附图说明

图1：circRNA差异性表达情况。

图2：差异性表达的circRNA数量。

图3：37例circRNA表达差异热图。

图4：9个初筛circRNA。

图5：circRNA反向引物。

图6：hsa_circ_0001640在大部分肺腺癌组织中呈现低表达。

图7：hsa_circ_0001640在肺腺癌及癌旁组织中的表达。

图8：肺腺癌及癌旁组织hsa_circ_0001640含量的ROC曲线图。

图9：hsa_circ_0001640与临床数据的关系。

图10：肺腺癌患者单因素及多因素生存分析数据。

图11：肺腺癌组织hsa_circ_0001640的表达水平与术后3年生存曲线。

图12：术后3年生存期与hsa_circ_0001640表达的线性关系。

图13：患者生存风险曲线。

图14：hsa_circ_0001640上调(左为A549，右为H1299)。

图15：CCK-8细胞增殖毒性实验(细胞处理48小时后，实验组与对照组的细胞活性状态出现明显差异，A549细胞系P值为0.0025，H1299细胞系P值为0.0013)。

图16：实验组与对照组细胞周期分布情况。

图17：克隆增殖实验。

图18：Tanswell侵袭实验。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

本实验通过高通量测序对肺腺癌组织中的circRNA进行测序分析，并筛选出合适的circRNA进行进一步的研究。利用qRT-PCR的技术对RNA进行定量测定，研究结果通过SPSS软件(Version 24)对数据进行统计分析。利用配对T检验的方法对circRNA在肺腺癌及癌旁组织中的表达进行差异比对。通过ANOVA、非参数检验、COX回归等统计学方法对circRNA的表达情况与临床数据之间的关系进行分析。本实验中P<0.05被视为具有统计学差异判定标准。之后通过细胞增殖实验、侵袭实验等体外实验方法对circRNA的功能进行进一步的验证。

1实验材料

1.1实验对象及组织标本

本实验选取了从2013年12月至2017年1月确诊的共90例肺腺癌患者作为研究对象，这些患者均经手术病理证实为原发性肺腺癌，收集这些患者的肺腺癌及癌旁组织90对作为实验标本，这些标本经手术切除后迅速存放在冻存管内，保存于-80℃的环境，患者及组织标本均来源于我院病理科。此次研究对象排除了转移性或复发性腺癌、合并其他恶性肿瘤、或术前经过放化疗处理的肺腺癌患者。

1.2实验细胞

A549细胞：购自于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；

H1299细胞：购自于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.3主要实验试剂和耗材

DMEM高糖培养基：Hyclone公司，美国；

胎牛血清(FBS)：Gibco公司，美国；

青霉素/链霉素抗生素溶液：GE公司，美国；

0.25％胰蛋白酶消化液：Gibco公司，美国；

10cm细胞培养皿：Corning公司，美国；

细胞培养板：Corning公司，美国；

Lipofectamine 2000转染试剂：life technologies公司，美国；

RNA提取试剂：天根生化科技(北京)有限公司，中国；

RNA提取试剂：TRIzol Reagent，Life technologies公司，美国；

反转录及qRT-PCR试剂盒：TAKARA公司，日本；

CCK-8：麦约尔公司，中国；

细胞周期检测试剂盒：碧云天生物技术有限公司，中国；

Transwell板：康宁公司，美国；

Basement Membrane Matrix：BD biosciences公司，美国。

1.4主要实验仪器

生物安全超净台：Thermo Fisher Scientific公司，美国；

超净台：Thermo Fisher Scientific公司，美国；

细胞培养箱：Thermo Fisher Scientific公司，美国；

实时荧光定量PCR仪：Applied Biosystems公司，美国；

实时荧光定量PCR仪：ROCH公司，美国；

分析性流式细胞仪：BD FACSCalibur公司，美国；

Eppendorf centrifuge 5415D离心机：Eppendorf公司，德国；

Eppendorf 5810R低温高速离心机：Eppendorf公司，德国；

Nikon TE300倒置显微镜：Nikon公司，日本；

Precision恒温水浴箱：Jouan公司，法国；

Milli Q超纯水系统：Millipore公司，美国；

Millipore Tank 30纯水系统：Millipore公司，美国；

-80℃超低温冰箱：Thermo Fisher Scientific公司，美国；

-20℃冰箱：Thermo Fisher Scientific公司，美国；

Nanodrop2000分光光度计：Thermo Fisher Scientific公司，美国；

Illumina HiSeqTM 2500测序仪：Illumina公司，美国。

2实验步骤

2.1组织RNA抽提

为保证标本质量，所有步骤均在冰上完成，所有实验耗材均为RNase-free：

1)在电子秤上称取肺腺癌或癌旁组织50-100mg加入至RNase-free的EP管中，在每管组织中加入TRIzol试剂1ml，用匀浆机将组织磨碎。

2)在室温下将组织静置5分钟，使组织充分裂解。

3)在每管组织中加入0.2ml氯仿，盖紧管盖后将EP管剧烈震荡15秒，再在室温下放置2-3分钟，以12000rpm的速度将组织在4℃条件下离心15分钟。离心后的混合液分为3层，最下层为红色的苯酚-氯仿层，第二层为中间层，最上层为无色的上清液，大约占总体积的50％，其中包含实验所需的RNA。

4)将离心管倾斜45°，用移液枪小心吸取上层清液，转移至新的EP管中，注意避免吸取到中间层及下层液体。

5)在每个新EP管中的液体中加入0.5ml异丙醇，然后将EP管放置在离心机中，以12000rpm的速度4℃离心10分钟，弃去上清液体。

6)用1ml的75％的乙醇溶液将每管离心出的RNA团块进行清洗，然后简单震荡，再将EP管放置在离心机中进行离心，离心速度7500rpm，离心环境4℃，离心时间5分钟。离心结束后弃去离心液。

7)将离心后的RNA放置在室温条件下进行5-10分钟的干燥过程，注意不要使RNA完全干燥。

8)将RNA溶解在20-50ul的RNase-free水中，轻轻吹打帮助溶解。再将EP管放置在55-60℃的环境中10-15分钟，使RNA充分溶解。

9)将RNA放置在-80℃冰箱内进行保存。

2.2 RNA纯度检测

为了评估抽提好的RNA浓度及质量，我们使用Nanodrop分光光度计对RNA样品在260nm、280nm及230nm波长处的吸光度进行测定，按照A260/A280以及A260/A230的值对RNA质量进行评估，当A260/A280的比值在1.7-2.1时认为RNA提取质量较好，比值偏低时，认为此RNA存在蛋白质污染，需用酚/氯仿进行此RNA的再次抽提；A260/A230比值应在2.0以上，若低于此比值，则说明该RNA存在变性缓冲液残留，需使用无水乙醇对此RNA进行沉淀及洗涤。然后根据公式RNA(ug/ml)＝A260*稀释倍数*40计算RNA的浓度，取1ug总RNA进行后续实验。

2.3高通量测序

1)选取3对肺腺癌及癌旁组织，对3对组织进行总RNA的抽提。

2)使用ribo-zero试剂盒对抽提出来的总RNA进行核糖体RNA消化处理，再在RNA溶液中加入RNase R，去除线性的RNA，以确保剩余的RNA均为环状RNA，再在RNA溶液中加入打断试剂，将circRNA的环状结构打断成为短片段结构。

3)以片段化的RNA链为模板，使用随机引物进行逆转录反应，合成一链cDNA，然后配制二链合成反应体系，将一链cDNA合成为二链cDNA，合成过程中以dUTP代替dTTP，并连接不同接头，通过UNG酶法消化含有dUTP的一条链，只保留连接链不同接头的cDNA一链。

4)利用纯化试剂盒，对cDNA进行纯化处理，再在纯化后的cDNA一链末端进行修复、加A尾、连接测序接头等处理。

5)对cDNA进行PCR扩增，最后使用Illumina HiSeqTM 2500测序仪对扩增后的cDNA进行测序。

2.4 RNA反转录

对90对肺腺癌及癌旁组织中的RNA进行反转录，实验过程使用Takara试剂盒RR047A，反应体系配置冰上进行：

1)去除基因组DNA：

配置10ul反应体系：5xgDNA Eraser Buffer 2ul+gDNA Reaser 1ul+总RNA1ug+RNaseFree dH₂O至10ul。

上机反应：42℃2分钟—4℃维持。

2)反转录反应：

配置20ul反应体系：步骤(1)中的反应液10ul+PrimeScript RT Enzyme Mix I1ul+RT Primer Mix 1ul+5xPrimeScript Buffer 2 4ul+RNase Free dH₂O 4ul。

上机反应：37℃15分钟—85℃5s—4℃维持。

附：反转录引物采用随机引物Oligo-dT，序列：TTTTTTTTTTTTTTTTTT(SEQ ID NO:5)。

2.5实时荧光定量qRT-PCR

实验过程使用Takara SYBR Green试剂盒(RR820A)。

1)将反转录后得到的cDNA溶液稀释10倍，冰上配置如下反应体系：

SYBR Premix Ex Taq II 10ul+PCR引物1.6ul(正向、反向各0.8ul，终浓度0.4μM)+ROX reference Dye 0.4ul+cDNA 2ul+dH2O 6ul。

2)上机反应：

(95℃30秒)*1循环—(95℃5秒—60℃34秒)*50循环—熔解曲线*1循环。

附：

1)qRT-PCR引物：以β-actin(ACTB)为内参，circRNA的引物采用反向的设计形式(引物由上海铂尚生物技术有限公司合成)。

2)RNA的相对表达量用2^-ΔCt表示。

3)引物序列：

ACTB-F:TTGTTACAGGAAGTCCCTTGCC(SEQ ID NO:1)；

ACTB-R:ATGCTATCACCTCCCCTGTGTG(SEQ ID NO:2)；

has_circ_0001640-F:GTGTAAAGTGACCCTCT(SEQ ID NO:3)；

has_circ_0001640-R:CTGCTGATTTTCTGCTA(SEQ ID NO:4)。

2.6细胞培养

1)选取A549及H1299两种人类肺癌细胞株作为此次实验的体外研究对象，细胞培养于10％胎牛血清(FBS)与1％抗生素的DMEM高糖培养基(37℃、5％CO₂)。

2)观察细胞培养至90％融合度后进行传代培养及后续实验，其中P3-P10代的生长分裂活跃期的细胞为实验首选细胞。

3)在整个培养过程中，为减少污染及干扰因素，所有步骤均在无菌的条件下进行，实验人员需对细胞生长状况进行定期的观察记录，并对培养基进行及时更换。

2.7细胞复苏

1)细胞复苏过程在超净台上进行操作，超净台在使用前经过常规消毒以及30分钟以上的紫外线照射灭菌处理。

2)细胞冻存管在实验前保存于液氮，取出后需迅速放入37℃水浴锅中进行速融，速融过程可以对冻存管进行快速摇动以加速冻存液融化过程，之后放置于超净台内备用，放置前注意用75％酒精消毒冻存管外部。

3)细胞培养基在使用前放置于37℃水浴中预热，之后慢慢滴加5-10ml培养基于15ml冻存管内，同时加入融化后的细胞冻存液，混匀后放置于离心机上，设置离心速度为1000rpm，离心时间5分钟。

4)离心结束后弃去上清液，在离心管中加入新鲜培养基对离心管内的细胞进行混悬沉淀，将混悬后的细胞接种于10cm培养皿，摇匀后放入CO₂培养箱中进行培养。

2.8细胞传代

1)超净台用紫外灯照射灭菌30分钟以上，照射结束后开启超净台风机去除紫外线产生的臭氧。

2)开启倒置显微镜，将细胞放置在倒置显微镜下，观察细胞形态及愈合度，用37℃水浴将培养基及0.25％胰蛋白酶预热30分钟以上备用，将细胞培养皿放置进超净台，放置前注意需使用75％酒精消毒培养皿外部。

3)然后弃去细胞培养基，并对残余培养基用PBS进行进一步的清除，培养基清除完成后，在细胞培养皿中加入1ml 0.25％胰蛋白酶，对细胞进行消化处理。

4)然后将培养基放置于培养箱中，在37℃温度条件下对细胞进行1分钟孵育，孵育完成后，将细胞放置于倒置显微镜下，观察经胰蛋白酶消化后细胞的形态变化。

5)当观察到细胞出现形态变圆、胞外基质减少、细胞间距增宽等现象时，在培养皿中加入2ml完全培养基对培养皿中的胰蛋白酶进行中和，使胰蛋白酶的消化作用停止。

6)收集经消化处理的细胞至离心管中，放置在离心机上，调整离心机参数为1000rpm，离心时间5分钟。

7)离心结束后，将离心管内的上清液弃去，再将新鲜的培养基加入离心后的细胞中，轻轻吹打混匀后形成细胞悬液，然后将细胞悬液转移至培养皿中，并放入培养箱中进行细胞培养，培养箱环境温度设置为37℃，CO₂浓度为5％。

2.9细胞冻存

1)将DMSO和胎牛血清按照1:9的比例混合进行冻存液配置，准备后续实验使用。

2)定期观察细胞生长状况，当观察到细胞融合度达到90％后，将含EDTA的0.25％胰蛋白酶加入细胞中，对细胞进行消化处理。

3)在25℃的温度条件下将消化后的细胞进行离心，离心参数设置为：1000rpm，5分钟。

4)离心结束后，在离心后的细胞中加入预先配置好的冻存液，轻轻吹打数次配置成细胞重悬液，注意控制重悬液细胞浓度为1x10⁶个/ml。

5)按每管1ml的量将细胞重悬液分装到各个冻存管中，先后以4℃(20分钟)，-20℃(1小时)，-80℃(4小时以上)的条件进行冻存，然后将冻存管放置于液氮中储存，或使用冻存盒存放冻存管(注意冻存盒在使用前需加入异丙醇，且需要将盒内温度与室温平衡)，然后将冻存盒放置于-80℃冰箱存储过夜，之后再存放入液氮中。

2.10细胞RNA抽提

1)按照每管1ml的量在细胞中加入裂解液MZ，进行5分钟初步裂解，将初步裂解后的细胞转移至新EP管中(本实验所使用EP管均为RNase-free)，将EP管放置于涡旋震荡仪上，振荡30秒进行混匀处理。

2)将细胞与裂解液混匀后，将EP管放置在室温环境中，静置5分钟，使核酸与蛋白质完全分离。

3)然后将初步裂解的细胞放置在离心机上进行离心处理，离心过程在室温条件下进行，转速设置为12000rpm，离心时间设置为10分钟，将离心后得到的上清液转移至新的EP管中。

4)再在裂解液中加入氯仿，每个EP管加入200ul，盖紧管盖后，再次利用涡旋震荡仪，对管内液体进行15秒的振荡混匀，然后将EP管放置在室温环境中进行5分钟孵育。

5)静置结束后，用离心机对EP管进行离心处理，设置离心机参数：离心速度12000rpm，离心时间15分钟，离心温度室温即可。离心处理结束后，可以看见EP管中液体分为上、中、下三层，上层无色水相，包含实验所需的RNA，下层为有机物相，呈黄色。然后吸取上层水相清液，转移至新的EP管中，吸取过程中注意避免吸取到中层及下层物质。

6)根据各EP管内液体体积，向各管内分别加入1/3体积的无水乙醇，轻轻吹打混匀后，用移液器将混合液吸取并转移至吸附柱中，放置在室温条件下静置2分钟，然后将吸附柱放置在离心机上，以12000rpm的速度离心30秒，离心结束后将吸附柱弃去，保留离心后的液体。

7)在每管离心液中加入液体量2/3体积的无水乙醇并混匀，用移液器吸取混合液体，将混合液转移至新的吸附柱，将吸附柱放置在室温环境中。静置2分钟后放置离心机中离心30秒，转速12000rpm，弃去离心后的流出液，保留吸附柱。

8)在离心后的吸附柱中加入500ul MRD去蛋白液(含无水乙醇)，放置在室温条件下静置2分钟，然后将吸附柱以12000rpm的速度离心30秒，将离心液弃掉。

9)再在吸附柱中加入600ul漂洗液RW(含无水乙醇)，放置在室温环境下，将吸附柱静置2分钟，再次以12000rpm的转速将吸附柱离心30秒，弃去离心液，然后重复此步骤一次。

10)转移离心后的吸附柱至新的2ml EP管中，将吸附柱放置在离心机中进行再次离心，以去除残余的漂洗液，离心速度：12000rpm，离心时间：1分钟，环境温度：室温。

11)给吸附柱更换新的EP管，用移液枪吸取15ul DEPC水加入吸附柱中，然后将吸附柱放置在室温环境中静置2分钟，再以12000rpm的离心速度将吸附柱离心2分钟，离心后保留离心液，内含最终所需的RNA，弃去吸附柱。

12)收集新EP管中的离心液，保存在-80℃冰箱，或进行后续RNA纯度检测、反转录、qRT-PCR等实验步骤(具体方法同组织内RNA测定)。

2.11质粒抽提

1)使用DH5alpha菌进行质粒抽提，摇菌至过夜，注意设置摇菌环境温度为37℃，速度250rp。摇菌结束后吸取细菌液5ml，加入离心管中，将离心管放置在离心机上，以12000rpm的速度离心10分钟，弃去上清液。

2)用RNase处理P1溶液后，将P1溶液加入离心好的细菌中，将离心管放置在使用涡旋震荡仪上，将细菌重悬。

3)再在细菌悬液中加入相同体积的P2溶液，缓慢翻转离心管，来回颠倒数次，以充分裂解菌体。

4)再将350ul P5溶液加入裂解后的细菌悬液，随即将离心管翻转数次充分混匀，可见白色絮状物出现，将离心管放置在离心机上，设置离心速度为12000rpm离心2分钟。

5)吸取细菌裂解液离心后得到的上清液(注意避免吸取下层沉淀)，由CP3吸附柱吸附后放置进新的EP管中，将EP管放置在离心机上，设置离心条件为12000rpm，离心30秒，弃去EP管中废液，转移CP3吸附柱至新的EP管中。

6)吸取300ul PWT漂洗液加至CP3吸附柱，放置在离心机上，以12000rpm的速度将吸附柱离心30秒，将离心出来的液体弃去，将吸附柱放置在新的EP管中。

7)再次以12000rpm的转速将CP3吸附柱进行1分钟的离心处理，从而将吸附柱上残余的漂洗液充分离心出来，弃去离心液，并给CP3吸附柱更换新的EP管。

8)吸取50ul洗脱缓冲液，加至吸附柱的中间部位，将吸附柱放置在离心机上，设置离心速度为12000rpm，对吸附柱进行30秒的离心处理，然后将吸附柱弃去，保留EP管中的离心液(内含质粒)。

2.12慢病毒包装

1)在6孔细胞培养板上接种肺癌细胞，注意挑选状态良好的细胞，并使细胞均匀分布，定期观察细胞融合度，当融合度达到80％左右时，可使用该细胞进行后续试验。

2)将2μg表达质粒、1.5μg psPAX2以及1.5μg pMD2.G先后加入500ul无血清培养基中，进行溶解稀释，再在500ul无血清培养基中加入5μl lipofectamine 2000进行稀释溶解，将稀释后的两种溶液均放置在室温条件下，进行5分钟静置孵育，然后将含有质粒及含有脂质体的两种溶液混合均匀，将混合液体继续放置在室温条件下，进行静置孵育，20分钟后，从事先准备好的6孔细胞培养板中抽取1ml无血清培养基，加入到1ml含有质粒与脂质体的混合溶液中进行转染。

3)在转染过程进行至4小时后，将转染液弃去，将肺癌细胞重新加入到完全培养基中，继续培养。

4)转染过程进行24小时后，将转染后的肺癌细胞放置于荧光显微镜下，观察细胞的转染效率，转染效率达到70％以上较好。

5)在转染过程进行到48小时及72小时后，分别收取肺癌细胞的培养基上清，然后进行后续实验。

6)将收取的培养基上清液放置在离心机上进行离心，离心速度设置为3000rpm，离心时间20分钟，再将离心好的上清液通过0.45μm滤膜进行过滤，将过滤出的细胞沉淀弃去，保留过滤后的上清液，放置于-80℃冰箱进行保存。

2.13 CCK-8细胞增殖毒性实验

1)肺癌细胞在经过质粒转染48小时后，准备96孔板，在96孔板中加入细胞1×10⁴个/孔，加入培养基100ul/孔，然后将板放置于培养箱中进行细胞培养。

2)在细胞培养24小时后，对每孔的细胞进行CCK-8处理，加入CCK-8溶液10ul/孔，滴加时注意动作轻柔，避免形成气泡，之后将培养板放置于培养箱中进行孵育，孵育时间为4小时。

3)孵育结束后，将培养板取出，用酶标仪测定每孔细胞在450nm处的吸光度。

4)继续孵育细胞至24小时、48小时、72小时及96小时，用相同的方法分别测定各个时间点细胞的吸光度，根据吸光度值绘制出标准曲线。

2.14细胞周期检测

细胞经Vector或has-circ-0001640转染48小时后，对细胞进行细胞周期检测，检测过程可以使用细胞周期检测试剂盒进行操作。

1)将转染后的肺癌细胞用含有EDTA的0.25％的胰酶进行消化，消化时间不宜过长，然后吸取肺癌细胞转移至流式细胞管中进行下一步操作。将细胞放置在离心机上，以1000rpm的速度离心5分钟，然后再将经预冷处理过的PBS加入离心好的肺癌细胞中，轻轻吹打混匀，将肺癌细胞重悬，再将细胞悬液放置在离心机上按照上述条件重复离心一次，离心结束后弃去上清液体。

2)固定细胞：在每根流式管中加入乙醇溶液1ml，注意乙醇溶液需经过预冷处理，然后吹打混匀细胞，使离心后的细胞在乙醇溶液中重悬，重悬过程注意操作轻柔，然后将细胞放置在4℃环境中，进行2小时以上的固定处理，一般固定过程需要过夜。之后将固定过的细胞按照1000rpm的速度进行5分钟的离心，离心结束后弃去上清液体，再将离心后的细胞加入经预冷处理的1ml PBS中进行重悬，再按照上述条件将细胞重复一次离心以及重悬过程。

3)配制PI染色液：需要使用当天进行配制，配制方法为将碘化丙啶染色原液、RNA酶加入染色液，配制体积根据实验需求进行调整。

4)细胞染色：在流式管中加入配置好的碘化丙啶染色液，每管500ul，轻轻吹打细胞，将细胞在溶液中重悬，避免细胞聚集形成团块，然后将细胞放置在37℃环境中，孵育30分钟。

5)上机检测：将染色好的肺癌细胞放置在流式细胞仪上，利用仪器检测分析细胞中碘化丙啶的含量，然后再通过流式分析软件modifit，对肺癌细胞的周期分布情况进行分析。

2.15克隆形成实验

1)肺癌细胞经质粒转染48小时后，经胰蛋白酶消化后进行细胞计数，准备新的六孔板，并在六孔板的每孔中加入转染后的细胞500个，再在六孔板的每个孔中加入培养基2ml，然后将六孔板放置在温度条件为37℃、CO₂浓度为5％的条件下进行细胞培养，注意培养液需隔日更换一次。

2)在细胞培养1周后去除其中的培养基，再用1×PBS将培养皿清洗2次，用甲醇固定细胞，固定时间为15分钟，固定结束后弃去固定液，之后进入细胞染色阶段，染色试剂为0.1％结晶紫溶液，对细胞进行染色固定，固定温度室温即可，固定时间为30分钟。固定结束后，用1×PBS清洗培养皿3次，晾干后用于细胞计数及拍照记录。

2.16细胞侵袭性检测

1)准备6孔细胞培养板，在培养板的每孔中按照一定的密度接种肺癌细胞。

2)将Matrigel胶用无血清的RPMI 1640培养基进行稀释，稀释比例5:1，然后将经稀释后的Matrigel胶加入培养板，每孔80ul，放置于37℃环境，经1-2小时后可见胶体形成，再将培养板放置于超净台内，进行紫外线照射灭菌，灭菌时间为1小时；用alpha-MEM无血清培养基将Matrigel进行5倍的稀释处理，之后再transwell培养板中加入稀释后的Matrigel胶，加入量为每孔80ul，然后将培养板放置在37℃的环境中，静置时间为2小时，静置结束后将培养板放置在超净台上，用紫外线照射培养板灭菌处理1小时。

3)将肺癌细胞用转染试剂进行24h转染，转染后将细胞用胰酶进行消化，消化后，在细胞中加入完全培养基进行重悬，然后将细胞悬液放置在离心机上进行离心处理，弃去上清液，用无血清培养基将离心后的细胞重悬，重悬后细胞密度控制在1X10⁶个/ml。

4)进入细胞侵袭阶段，将完全培养基作为下层培养液，在培养板的每个孔内加入500ul，再在培养板孔内放入transwell小室，然后在小室中加入细胞悬液，每个小室中100ul，再将培养板放置在培养箱内进行24小时孵育。

5)培养结束后，将细胞用4％多聚甲醛固定液进行固定，固定时间为15分钟，固定结束后清除小室底部内侧的细胞及胶体，将内侧膜用PBS进行清洗，然后用结晶紫对细胞进行染色，染色时间10分钟，再用PBS对细胞进行3次清洗。

6)将染色好的细胞放置在正置显微镜上观察，选用20x物镜，随机选取镜下的5个不同视野，并对各个小室内的细胞分别进行计数统计，算出平均值，再用同样的方法统计出小室外侧底部的细胞数量，将两侧细胞数量进行对比，评估肿瘤细胞的侵袭能力。

3实验结果

3.1 circRNA在肺腺癌及癌旁组织中的表达情况

本实验通过高通量测序技术，在3对肺腺癌及癌旁组织中进行circRNA的测序检测，共检测到超过18000个circRNA。我们利用RNA-seq数据分析比较这3组组织中circRNA表达水平的差异性，对差异的判断我们选取了两个判断标准：一是计算FoldChange，即计算肺腺癌及癌旁组织中每个Unigene表达情况之间的差异倍数；二是对每个Unigene的表达情况进行P值的计算，再采用错误检出率(false discovery rate,FDR)的方法对P值进行多重假设检验校正。FoldChange>2或P<0.05视为有意义，统计结果以log₂FoldChange的散点图形式表示(图1)。发现在3组组织中分别有420、727和655个circRNA在肺腺癌和癌旁组织中的表达存在明显差异(图2)，3组交集的circRNA有37个，其中有24个circRNA在肺腺癌组织中表达下调，13个circRNA在肺腺癌组织中呈现出表达上调的状态(图3)。我们将这37个circRNA与circBase数据库的数据进行比对，发现其中25个为目前已知的circRNA，12个为新发现的circRNA。

3.2 hsa_circ_0001640在肺腺癌中的表达出现明显下调

我们利用对筛选出的37个circRNA中9个已知的circRNA(图4)进行初步引物设计，并通过实时荧光定量(qRT-PCR)的熔解曲线方式对引物的特异性加以验证。由于circRNA特殊的环状结构，其3’端与5’端相互衔接，因此引物设计需采用反向设计的方法，达到扩增剪接位点的目的(图5)。熔解曲线呈现独立单峰形态时提示引物的特异性较好。我们发现其中名为hsa_circ_0001640的circRNA可以找到特异性较好的引物，另外8个circRNA由于无法找到特异性较好的引物从后续实验中剔除，考虑是由于这8个circRNA在组织中的表达含量较低的原因。hsa_circ_0001640来源于EPB41L2基因，位于6号染色体上，长度为719bp，属于正义circRNA，在高通量测序中的检测结果显示，hsa_circ_0001640在肺腺癌组织中的表达较癌旁组织中下降，提示hsa_circ_0001640具有抑癌基因作用的可能。为了进一步验证hsa_circ_0001640在肺腺癌中的作用，我们运用qRT-PCR的方法对hsa_circ_0001640在90对肺腺癌及癌旁组织中的表达水平进行验证，实验中使用ACTB作为内参对照。

验证结果显示，在肺腺癌组织中，hsa_circ_0001640的表达定量较癌旁组织中明显下降(P＝0.00086)，与测序结果一致(图6和图7)，提示低表达的hsa_circ_0001640可能具有促进肿瘤发展的作用。受试者工作特征(Receiver operating characteristic，ROC)曲线分析结果提示，hsa_circ_0001640在肺腺癌中的表达具有较高的敏感性和特异性(AUC＝0.7802，95％CI：0.7148至0.8457)，可能具有诊断学价值(图8)。

3.3 hsa_circ_0001640与肺腺癌患者的临床特征

结合患者的临床数据，我们发现has_circ_0001640在肺腺癌组织中的含量与患者的临床分期、淋巴结转移、以及患者术后3年生存情况及复发转移情况之间存在明显的相关性，然而与患者的性别、年龄、吸烟史、T分期、肿瘤大小以及CEA、CYFRA21-1等指标之间无明显相关性(图9)。本实验研究的患者临床分期分布在IA期至IIIB期，均为术后分期，其中，I期与II期患者肺腺癌组织中的has_circ_0001640含量之间无明显差异(P＝0.438)，但I期及II期患者均与III期患者肺腺癌组织中的has_circ_0001640含量之间存在明显差异(P分别为0.003及0.004)，在III期患者中，has_circ_0001640的含量存在明显下调，提示has_circ_0001640在中晚期肺腺癌患者中的下降更加明显。在淋巴结转移方面，数据显示，has_circ_0001640与N的分期之间存在明显相关性(N3组无数据，P＝0.015)，且分期越晚，has_circ_0001640含量越低，提示has_circ_0001640与淋巴结转移呈负相关。但其中N0期与N1期之间has_circ_0001640的含量未见到明显的差异性表达(P＝0.685)，N0与N2期、N1期与N2期的表达水平则存在明显的差异(P分别为0.008与0.037)，提示has_circ_0001640对判断是否存在纵膈或隆突下淋巴结侵犯较为敏感。

之后我们对肺腺癌患者的术后3年的预后情况进行统计，包括生存期和转移复发情况等，术后至今满足3年时间的患者共计54人，其中生存人数28人，死亡人数18人，失访人数8人。术后3年的生存情况显示，术后3年内死亡的患者的相较于术后生存期超过3年的患者，肺腺癌组织中has_circ_0001640的表达水平明显下降(P＝0.023)，但对各组临床分期中的3年生存期分别进行统计，我们发现has_circ_0001640的表达水平在各个期别中并无明显差异。在术后3年内出现肺癌复发或转移、且目前存活的患者共计10人，3年内病情平稳的患者有20人。我们发现3年内出现肺癌复发或转移情况的患者相较于3年内肺癌情况稳定的患者，肺腺癌组织中has_circ_0001640的表达水平也出现明显下降(P＝0.025)，并且这个现象也存在于I期的肺腺癌患者中(P＝0.029)，但在III期患者中的差异不明显(P＝0.386)，II期患者由于数量较少，无法进行单独统计。因此我们可以得出结论，肺腺癌组织中has_circ_0001640的表达水平与患者的术后3年预后情况存在明显的负相关性，has_circ_0001640的含量越低，患者在术后3年内发生复发转移或死亡的可能性越大。

3.4 has_circ_0001640与患者术后□存期的单因素及多因素分析

我们选取所有肺腺癌组织RNA定量的中位数作为分界点，将术后3年的患者分为2组，即RNA高表达组和RNA低表达组，然后对患者的3年生存期进行了Kaplan-Merier单因素生存分析和COX多因素生存分析(图10)，其中高表达组的患者共计19人，低表达组的患者共计27人。单因素分析的结果显示，患者的术后3年生存期与性别、临床分期、T分期、N分期以及RNA表达的高低均有相关性，与吸烟史、肿瘤大小以及CEA、CYFRA21-1等肿瘤标志物之间的相关性不明显。患者的术后3年平均生存期为879天，其中男性的术后3年生存期较女性平均减少180天左右，生存期的长短与临床分期、T分期及N分期均呈现明显的负相关性。患者术后3年生存期与肿瘤大小之间未见明显相关性(P＝0.058)，但由于肿瘤直径在7cm以上的患者仅有1人，存在抽样误差的可能，当我们仅对7cm以下的肿瘤进行分组统计时，发现患者的3年生存期与肿瘤大小也存在负相关性(P＝0.033)。

hsa_circ_0001640高表达组的生存期较低表达组明显延长(P＝0.004)，其中超过94％的高表达组的患者生存期可以达到710天以上，而RNA低表达组仅有52％的患者的生存期可以达到685天(图11)，并且患者的术后生存期与hsa_circ_0001640的表达情况之间存在线性的正相关性(图12，P＝0.0353)。根据单因素的分析结果，我们选取了患者的性别、临床分期、T分期、N分期及RNA表达高低等指标对患者的生存期进行COX多因素回归分析。结果显示，患者的术后3年生存期与临床分期以及hsa_circ_0001640表达高低有关(P值分别为0.000186及0.034)，与患者的性别、T分期及N分期之间未见到明显的相关性，其中患者的临床分期是患者术后3年生存期的危险因素，hsa_circ_0001640是患者术后3年生存期的保护因素。随着术后时间的推移，肺腺癌患者的累计生存风险逐渐增加，但hsa_circ_0001640的高表达可以使生存风险的累计程度大大降低(P＝0.00007，图13)。

3.5 hsa_circ_0001640可以明显抑制肺腺癌细胞的增殖侵袭能力

为了进一步验证hsa_circ_0001640在肺腺癌细胞增殖生长中的作用，我们选用了A549和H1299两种人类非小细胞肺癌细胞株进行体外验证。我们将高表达hsa_circ_0001640的质粒(完整序列如SEQ ID NO:7所示)在两种细胞系中进行转染后培养，然后将经过hsa_circ_0001640表达上调处理的细胞株(Lenti-hsa_circ_0001640)作为实验组，未经上调处理的细胞株(Lenti-Vector)作为对照组(图14)。我们用CCK-8试剂对各个细胞组进行了增殖毒性实验，对细胞的增殖能力进行了初步的验证，实验结果显示，在两种细胞系中，经过hsa_circ_0001640表达上调处理后的细胞株在培养48小时后的活性较对照组明显下降，且时间越长，实验组与对照组的差异性越大(图15)。

为了解释这种现象，我们对两种细胞系的细胞周期进行了检测分析，发现在Lenti-hsa_circ_0001640组中，停留在G1期的细胞比例明显增加，S期和G2期的细胞比例减少(图16)，提示hsa_circ_0001640对肺癌细胞的分裂增殖具有抑制作用，hsa_circ_0001640表达越高，肿瘤细胞越难以进入分裂增殖期。之后我们对两种细胞系的细胞进行了克隆增殖实验，以便于进一步观察hsa_circ_0001640在细胞增殖方面中的作用，结果显示，进过1周的克隆增殖后，相较于对照组，实验组中细胞的克隆数量明显偏低(图17)。在肿瘤细胞的侵袭能力方面，我们进行了transwell侵袭实验，经过24小时的体外培养，实验结果显示，在hsa_circ_0001640表达上调的实验组中，两种细胞系肿瘤细胞的侵袭能力都受到了明显的抑制(图18)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海交通大学医学院附属瑞金医院

<120> 一种肺腺癌差异性表达circRNA的检测试剂盒及其应用

<130> /

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Ordo artificialis.)

<400> 1

ttgttacagg aagtcccttg cc 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Ordo artificialis.)

<400> 2

atgctatcac ctcccctgtg tg 22

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Ordo artificialis.)

<400> 3

gtgtaaagtg accctct 17

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Ordo artificialis.)

<400> 4

ctgctgattt tctgcta 17

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Ordo artificialis.)

<400> 5

tttttttttt tttttttt 18

<210> 6

<211> 719

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens.)

<400> 6

cataagctgt ggccatgact actgaagtag gctctgtgtc tgaagtgaag aaggactcta 60

gccagttagg aacagatgca accaaggaaa aacctaaaga agtagcagaa aatcagcaga 120

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<210> 7

<211> 6680

<212> DNA

<213> 人工序列(Ordo artificialis.)

<220>

<221> misc_feature

<222> (454)..(454)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 7

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tccagaagaa cagagacagg ctaagggtga tgctgaagaa atggctcaga agaaacaaga 2640

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cttcgtatag catacattat acgaagttat aagtagcttg gcgtaatcat ggtcatagct 4020

gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat 4080

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gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt 4320

atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc 4380

caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga 4440

gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata 4500

ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 4560

cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcaat gctcacgctg 4620

taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 4680

cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag 4740

acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt 4800

aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt 4860

atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg 4920

atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac 4980

gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca 5040

gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac 5100

ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac 5160

ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt 5220

tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt 5280

accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt 5340

atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc 5400

cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa 5460

tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg 5520

tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt 5580

gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc 5640

agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt 5700

aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg 5760

gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaac acgggataat accgcgccac atagcagaac 5820

tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc 5880

gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt 5940

tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg 6000

aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag 6060

catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa 6120

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tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcact ctaggcaaaa tagcaccctc 6240

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aaaaagaaaa cctattaaaa aaacaccact cgacacggca ccagctcaat cagtcacagt 6360

gtaaaaaagg gccaagtgca gagcgagtat atataggact aaaaaatgac gtaacggtta 6420

aagtccacaa aaaacaccca gaaaaccgca cgcgaaccta cgcccagaaa cgaaagccaa 6480

aaaacccaca acttcctcaa atcgtcactt ccgttttccc acgttacgta acttcccatt 6540

ttaagaaaac tacaattccc aacacataca agttactccg ccctaaaacc tacgtcaccc 6600

gccccgttcc cacgccccgc gccacgtcac aaactccacc ccctcattat catattggct 6660

tcaatccaaa ataaggtata 6680

Claims

1.circRNA作为生物标志物在制备用于诊断肺腺癌的试剂盒中的应用，其特征在于，所述circRNA其编码序列如SEQ ID No:6所示。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于，如所述试剂盒检测出样品中所述circRNA的表达量与阴性对照相比具有显著差异，则诊断为有患癌风险。

3.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述试剂盒为逆转录实时荧光定量PCR试剂盒。

4.一种用于诊断肺腺癌的引物，其特征在于，正向引物为SEQ ID No:3所示核苷酸，反向引物为如SEQ ID No:4所示核苷酸。

5.如权利要求4所述引物在制备用于诊断肺腺癌的试剂盒中的应用。

6.一种用于诊断肺腺癌的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求4所述引物，以及内参基因和阴性对照。

7.如权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述内参基因为β-actin。

8.circRNA作为生物标志物在制备用于判断肺腺癌预后的试剂盒中的应用，其特征在于，所述circRNA其编码序列如SEQ ID No:6所示。

9.如权利要求8所述应用，其特征在于，如所述试剂盒检测出样品中所述circRNA的表达量与阴性对照相比具有显著差异，则判断为预后不良，反之则判断为预后良好。

10.circRNA或其促进剂在制备治疗肺腺癌的药物中的应用。