CN111363823A - 一种鉴别肺腺癌circ_0065214的特异性引物及其试剂盒及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴别肺腺癌circ_0065214的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物对应的接头序列为：AATGGCGGCTACCCACTGC；所述特异性引物为：F：CTCAGCTCGCTGCTCATGTC；R：GGGGCACCCACATACCACT。本发明还公开了包含所述特异性引物的试剂盒和用途。本发明首次提出了针对肺腺癌circ_0065214的特异性引物以及试剂盒，具有特异性强，灵敏度高的特点。批量检测效率高，且可广泛应用于临床肺腺癌的检测，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴别肺腺癌circ_0065214的特异性引物及其试剂盒及其用途。
背景技术
肺癌是我国乃至全世界最常见的恶性肿瘤之一。近年来，虽然手术方式、化疗药物及靶向治疗方案的不断更新，肺癌仍位居世界肿瘤相关性死亡原因的首位，是威胁人类健康的重大问题。肺癌根据其病理类型可分为小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC，约占15％)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC，约占85％)，其中肺腺癌(LAD)是NSCLC最主要的病理类型。
临床研究表明，I期肺腺癌患者的5年生存率达60％～90％，而IIIB和IV患者5年生存率仅为5％～20％，故肺腺癌的早期诊断是改善其预后的关键。目前临床上用于LAD早期诊断的检查方法有很多，如胸部CT、支气管镜、肿瘤标记物等，但这些方法由于敏感性、特异性、有创、辐射等因素并不理想。因此，寻找新的肺腺癌诊断标记物，并对其作用机制的研究是提高肺癌患者生存率和治愈率的关键。
近些年得益于分子生物学技术的不断发展，ENCODE计划研究结果表明人类基因组中只有＜5％的基因编码蛋白质，提示基因组中非编码区域也可能参与调控复杂的生物学过程。后续研究证实，这类基因的产物-非编码RNA(noncoding RNA，ncRNA)的异常表达参与人类多种疾病的发生发展，特别是与恶性肿瘤的发生、发展以及转移密切相关。随着研究的完善，非编码RNA应用于肿瘤诊断和治疗的临床试验也逐步开展。
环状RNA(circular RNA，circRNA)作为ncRNA家族的一重要成员，是一类不具有5’末端帽子和3’末端poly A尾巴结构，呈共价闭合环状结构的非编码RNA分子，能较高程度耐受核糖核酸外切酶(RNase)降解，故比lncRNA或mRNAs等线性RNAs分子更稳定。
文献报道肿瘤细胞来源的circRNA分子可通过外泌体分泌至组织间隙及肿瘤患者体液中，如血浆、尿液等，受外泌体脂质分子的保护，体液标本中的circRNA稳定存在，半衰期长，可作为肿瘤诊断、预后的分子标志物，是目前RNA研究的热点。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的之一在于通过前期预实验结果提示在肺腺癌患者组织标本和肺腺癌细胞系中circ_0065214表达升高，可作为肺腺癌诊断的分子标记物，而提供一种鉴别肺腺癌circ_0065214的特异性引物。
本发明的目的之二在于提供一种鉴别肺腺癌circ_0065214的特异性引物的试剂盒。
本发明的目的之三在于提供一种鉴别肺腺癌circ_0065214的特异性引物试剂盒用途。
为了实现本发明的目的之一，所采用的技术方案是：
一种鉴别肺腺癌circ_0065214的特异性引物，其中，所述特异性引物对应的接头序列为：
AATGGCGGCTACCCACTGC(接头序列)；
所述特异性引物为：
F：CTCAGCTCGCTGCTCATGTC(Forward primer)；
R：GGGGCACCCACATACCACT(Reverse primer)。
为了实现本发明的目的之二，所采用技术方案是：
一种鉴别肺腺癌circ_0065214的特异性引物的试剂盒，其中，所述试剂盒中包含有所述鉴别肺腺癌circ_0065214的特异性引物以及PCR反应预混液；
所述特异性引物为：
F：CTCAGCTCGCTGCTCATGTC(Forward primer)；
R：GGGGCACCCACATACCACT(Reverse primer)。
在本发明的一个优选实施例中，所述PCR反应预混液包括SYBR PremixEx Taq II、ddH2O或ROX Reference Dye II中的任意一种或多种。
为了实现本发明的目的之三，所采用技术方案是：
一种鉴别肺腺癌circ_0065214的特异性引物试剂盒的用途，其中，所述用途为作为肺腺癌的肿瘤诊断、预后的分子标志物。
本发明的有益效果在于：
本发明首次提出了针对肺腺癌circ_0065214的特异性引物以及试剂盒，具有特异性强，灵敏度高的特点。批量检测效率高，且可广泛应用于临床肺腺癌的检测，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1的引物溶解曲线。
图2为本发明对比例1的引物溶解曲线。
图3为本发明对比例2的引物溶解曲线。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但这些实施例不得用于解释对本发明的限制。
实施例1
使用本发明的引物检测肺腺癌circ_0065214
1材料与方法
1.1样本来源
收集2019年1月1日到2019年12月31日湖州市中心医院胸外科就诊的配对I期肺腺癌手术标本(癌和癌旁组织)6例，编号样本1-6，进行检测。收集肺腺癌细胞系，进行检测(A549、H1299、SPCA1、PC9、H1975)。
1.2标本采集和RNA的提取与反转录
组织标本：手术切除标本放置RNA保护液中(购于Invitrogen)，4℃运送至实验室，-70℃保存备用。用RNA提取试剂盒(购于天根公司)提取样本中的总RNA，针对RNA先反转录成cDNA，-20℃保存备用。
肺腺癌细胞系：肺腺癌细胞系培养至融合度70-80％，用RNA提取试剂盒(购于天根公司)提取样本中的总RNA，针对RNA先反转录成cDNA，-20℃保存备用。
1.3合成PCR扩增引物
利用生物信息学知识和BNCI等相关生物信息学软件，对circrnadb数据库中所能检索到circ_0065214的核酸序列，由发明人自行设计出针对circ_0065214接头序列的特异性PCR引物(见表1)，由Invitrogen公司合成。
表1引物序列及扩增的目的片段长度：
注：Forward primer代表上游引物，Reverse primer代表下游引物；
1.4准备混合PCR引物工作液
(1)合成的每个PCR引物用ddH2O配制成100μmol/L的储存液；
1.5 PCR扩增反应：
(1)PCR反应体系：PCR扩增反应体系为20μl，PCR反应预混液(包括SYBR Premix ExTaq II、ddH2O、ROX Reference Dye II)19μl，样本反转录产物(cDNA)1μl，终体积为20μl；
(2)PCR反应程序：95℃30s→95℃5s、60℃34s(40个循环)→68℃45s→4℃hold。
对比例1
对比例1为针对circ_0065214的核酸序列的平行对比例。
2.1样本来源同1.1。
2.2标本采集和RNA的提取与反转录同1.2。
2.3合成PCR扩增引物：
利用生物信息学知识和BNCI等相关生物信息学软件，对circrnadb数据库中所能检索到circ_0065214的核酸序列由发明人自行设计出针对circ_0065214接头序列的特异性PCR引物(见表2)，由Invitrogen公司合成。
表2引物序列及扩增的目的片段长度：
注：Forward primer代表上游引物，Reverse primer代表下游引物；
2.4准备混合PCR引物工作液同1.4
2.5 PCR扩增反应同1.4。
对比例2
3.1样本来源同1.1。
3.2标本采集和RNA的提取与反转录同1.2。
3.3合成PCR扩增引物
利用生物信息学知识和BNCI等相关生物信息学软件，对circrnadb数据库中所能检索到circ_0049637的核酸序列由发明人自行设计出针对circ_0049637接头序列的特异性PCR引物(见表3)，由Invitrogen公司合成。
表3引物序列及扩增的目的片段长度：
注：Forward primer代表上游引物，Reverse primer代表下游引物；
3.4准备混合PCR引物工作液同1.4
3.5 PCR扩增反应同1.4
4结果
4.1引物的溶解曲线见图1-3。
4.2肺腺癌患者组织标本中检测circRNA水平见表4：
表4
4.3肺腺癌细胞系中检测circRNA水平见表5
表5
相比于对比例1，实施例1中引物溶解曲线为单峰，说明引物特异性好，而对比例1中引物溶解曲线为双峰，说明PCR引物体系中存在二聚体，或发夹结构，导致非特异性产物出现。对比例2为肺腺癌中另一circRNA，在组织样本和细胞系样本检测过程中Ct值偏高，提示该circRNA在肺腺癌中表达水平低，不能作为肺腺癌诊断分子标记物。
综上所述，可见本发明所提供的针对肺腺癌circ_0065214的特异性引物以及试剂盒，具有特异性强，灵敏度高的特点。批量检测效率高，且可广泛应用于临床肺腺癌的检测，具有广阔的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 施雪霏
<120> 一种鉴别肺腺癌circ_0065214的特异性引物及其试剂盒及其用途
<130> 20200420
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Claims (4)
1.一种鉴别肺腺癌circ_0065214的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物对应的接头序列为：
AATGGCGGCTACCCACTGC；
所述特异性引物为：
F：CTCAGCTCGCTGCTCATGTC；
R：GGGGCACCCACATACCACT。
2.如权利要求1所述的一种鉴别肺腺癌circ_0065214的特异性引物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含有所述鉴别肺腺癌circ_0065214的特异性引物以及PCR反应预混液；
所述特异性引物为：
F：CTCAGCTCGCTGCTCATGTC；
R：GGGGCACCCACATACCACT。
3.如权利要求2所述的一种鉴别肺腺癌circ_0065214的特异性引物的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应预混液包括SYBR Premix Ex Taq II、ddH2O或ROX Reference Dye II中的任意一种或多种。
4.如权利要求2或3所述的一种鉴别肺腺癌circ_0065214的特异性引物试剂盒的用途，其特征在于，所述用途为作为肺腺癌的肿瘤诊断、预后的分子标志物。
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2020
- 2020-04-23 CN CN202010325886.2A patent/CN111363823A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109609636A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-04-12 | 上海交通大学医学院附属瑞金医院 | 一种肺腺癌差异性表达circRNA的检测试剂盒及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| YONGGANG ZHU等: "Identification of potential circular RNA biomarkers in lung adenocarcinoma: A bioinformatics analysis and retrospective clinical study" * |
| 高鹏骥等: "环状 RNA 在肝细胞癌中的差异表达研究" * |
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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Application publication date: 20200703 |
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