CN109055552A - 检测Septin9基因启动子是否甲基化的方法及其专用成套试剂 - Google Patents

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CN109055552A CN201810965517.2A CN201810965517A CN109055552A CN 109055552 A CN109055552 A CN 109055552A CN 201810965517 A CN201810965517 A CN 201810965517A CN 109055552 A CN109055552 A CN 109055552A
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Abstract

本发明公开了一种检测Septin9基因启动子是否甲基化的方法及其专用成套试剂。成套试剂包括引物对septin9和探针SEPT9；引物对septin9由引物septin9 FP和引物septin9 RP组成；已甲基化的Septin9基因启动子中，引物对septin9的靶序列含有序列表的序列3所示的单链DNA分子；探针SEPT9为15‑25个核苷酸组成的单链DNA分子，与序列表的序列3中的部分区段相同。实验证明，采用本发明提供的成套试剂可以检测Septin9基因启动子是否甲基化，从而早期诊断结直肠癌，而且具有较高的灵敏度(达到5％)和特异性。本发明具有重要的应用价值。

Description

检测Septin9基因启动子是否甲基化的方法及其专用成套 试剂
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及检测Septin9基因启动子是否甲基化的方法及其专用成套试剂。
背景技术
结直肠癌包括结肠癌和直肠癌，是人类常见的下消化道恶性肿瘤，早期症状不明显，随着癌肿的增大而表现排便习惯改变、便血、腹泻、腹泻与便秘交替、局部腹痛等症状，晚期则表现贫血、体重减轻等全身症状。结直肠癌的早期诊断是获得高治愈率的基础，也能显著降低结直肠癌的死亡率。目前，对于结直肠癌的检测主要有直肠指检、大便隐血(FOBT)试验、内镜检查、钡剂灌肠等，而作为结直肠癌诊断金标准的肠镜是一种创伤性检测手段，检测过程繁琐痛苦且有出血感染风险，显然不适合作为筛查手段。因此，建立一种高效、准确、快速、低价的检测结直肠癌的方法，对早期结直肠癌的临床筛查工作至关重要。
Septin9基因是一类具有三磷酸鸟苷酶活性的保守基因家族成员之一，其与染色体分离、DNA修复、迁移和掉网等许多细胞功能有关。Septin9基因与恶性肿瘤等人类疾病密切相关，已成为现阶段肿瘤研究的热点。Septin9基因的启动子在结直肠癌组织中高度甲基化，是结直肠癌的重要分子特征，可用于结直肠癌的早期诊断。
发明内容
本发明的目的是检测Septin9基因启动子是否甲基化，从而早期诊断结直肠癌。
本发明首先保护一种成套试剂，可包括引物对septin9和探针SEPT9；所述引物对septin9可由引物septin9FP和引物septin9RP组成。
已甲基化的Septin9基因启动子中，所述引物对septin9的靶序列可含有特异DNA片段甲。所述特异DNA片段甲可为序列表的序列3所示的单链DNA分子(序列表中序列3中含有5个CpG位点)。
所述探针SEPT9可为15-25个核苷酸组成的单链DNA分子，与所述特异DNA片段甲中的部分区段相同。
未甲基化的Septin9基因启动子中，所述引物对septin9的靶序列可含有特异DNA片段乙。所述特异DNA片段乙可为序列表的序列4所示的单链DNA分子。
所述引物septin9FP可为如下a1)或a2)：
a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；
a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子。
所述引物septin9RP可为如下b1)或b2)：
b1)序列表中序列2所示的单链DNA分子；
b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子。
所述探针SEPT9可为如下c1)或c2)：
c1)序列表中序列6所示的单链DNA分子；
c2)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的单链DNA分子。
所述引物septin9RP自5′末端起第5位的核苷酸(C)具体可为具有C3Spacer修饰的C。
所述探针SEPT9的末端可具有荧光标记。
所述探针SEPT9的5′末端可具有6-FAM荧光标记。
所述探针SEPT9的3′末端可具有BHQ1荧光标记。
上述任一所述成套试剂还可包括SEPT9Blocker。所述SEPT9Blocker可为25-45个核苷酸组成的单链DNA分子，与序列表的序列4所示自5′末端起第20至39位所示的单链DNA分子互补。
SEPT9Blocker可以与序列表的序列4所示的单链DNA分子结合，达到封闭的作用，从而大大提高特异性。
所述SEPT9Blocker可为如下d1)或d2)：
d1)序列表中序列5所示的单链DNA分子；
d2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的单链DNA分子。
所述SEPT9Blocker的末端可具有修饰。
所述SEPT9Blocker的3′末端的核苷酸C具体可为具有C3Spacer修饰的C。
所述成套试剂还可包括阳性对照品和阴性对照品。
所述阴性对照品的制备方法可为：(1)将序列表中序列7所示的双链DNA分子插入PSBS1载体的多克隆位点之间，得到的质粒Raw-Seq；(2)取质粒Raw-Seq，进行重硫酸盐处理，得到Bis-Raw-Seq质粒；(3)用缓冲液溶解Bis-Raw-Seq质粒，得到阴性对照品。
所述阳性对照品的制备方法可为：(1)将序列表中序列8所示的双链DNA分子插入PSBS1载体的多克隆位点之间，得到Methyl-Seq质粒；(2)取Methyl-Seq质粒，进行重硫酸盐处理，得到Bis-Methyl-Seq质粒；(3)用缓冲液溶解Bis-Methyl-Seq质粒，得到阳性对照品。
上述任一所述缓冲液具体可为pH8.0、10mM Tris-HCl缓冲液。
上述任一所述Septin9基因的genebank号为NG_011683.1。
上述任一所述成套试剂中的所述引物对septin9也属于本发明的保护范围。
本发明还保护e1)或e2)。
e1)上述任一所述成套试剂的制备方法，可为将上述任一所述成套试剂中的所述引物septin9FP、所述引物septin9RP、所述探针SEPT9和所述SEPT9Blocker分别单独包装；
e2)上述任一所述引物对septin9的制备方法，为将上述任一所述引物对septin9中各个引物分别单独包装。
本发明还保护上述任一所述成套试剂或上述任一所述引物对septin9在制备产品中的应用；所述产品的功能可为如下f1)或f2)或f3)或f4)或f5)：
f1)检测Septin9基因启动子；
f2)检测待测者Septin9基因启动子是否甲基化；
f3)鉴定结直肠癌；
f4)鉴定待测者是否为或候选为结直肠癌患者；
f5)鉴定待测组织是否为或候选为结直肠癌组织。
本发明还保护含有上述任一所述成套试剂或上述任一所述引物对septin9的产品。所述产品的功能可为如下f1)或f2)或f3)或f4)或f5)：
f1)检测Septin9基因启动子；
f2)检测待测者Septin9基因启动子是否甲基化；
f3)鉴定结直肠癌；
f4)鉴定待测者是否为或候选为结直肠癌患者；
f5)鉴定待测组织是否为或候选为结直肠癌组织。
所述产品还包括具有如下g1)或g2)或g3)或g4)的数据处理和结论显示功能的装置：
g1)采用上述任一所述成套试剂对待测者的Bis-DNA进行荧光定量PCR，得到扩增曲线；如果扩增曲线呈现S型且Ct值≤39、则待测者的Septin9基因启动子发生了甲基化，否则待测者的Septin9基因启动子未发生甲基化；
g2)采用上述任一所述引物对septin9对待测者的Bis-DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物中含有中所述特异DNA片段甲、则待测者的Septin9基因启动子发生了甲基化，否则待测者的Septin9基因启动子未发生甲基化；
g3)采用上述任一所述成套试剂对待测者的Bis-DNA进行荧光定量PCR，得到扩增曲线，然后进行如下判断：如果扩增曲线呈现S型且Ct值≤39、则待测者为或候选为结直肠癌患者，否则待测者不为或候选不为结直肠癌患者。
g4)采用上述任一所述引物对septin9对待测者的Bis-DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物中含有所述特异DNA片段甲、则待测者为或候选为结直肠癌患者，否则待测者不为或候选不为结直肠癌患者。
g5)采用上述任一所述成套试剂对待测组织的Bis-DNA进行荧光定量PCR，得到扩增曲线，然后进行如下判断：如果扩增曲线呈现S型且Ct值≤39、则待测组织为或候选为结直肠癌组织，否则待测组织不为或候选不为结直肠癌组织。
g6)采用上述任一所述引物对septin9对待测组织的Bis-DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物中含有所述特异DNA片段甲、则待测组织为或候选为结直肠癌组织，否则待测组织不为或候选不为结直肠癌组织。
本发明还保护(A1)或(A2)或(A3)或(A4)或(A5)或(A6)。
(A1)检测待测者Septin9基因启动子是否甲基化的方法，可为采用上述任一所述成套试剂对待测者的Bis-DNA进行荧光定量PCR，得到扩增曲线，然后进行如下判断：如果扩增曲线呈现S型且Ct值≤39、则待测者的Septin9基因启动子发生了甲基化，否则待测者的Septin9基因启动子未发生甲基化。
(A2)检测待测者Septin9基因启动子是否甲基化的方法，为采用上述任一所述引物对septin9对待测者的Bis-DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物中含有所述特异DNA片段甲、则待测者的Septin9基因启动子发生了甲基化，否则待测者的Septin9基因启动子未发生甲基化。
(A3)鉴定待测者是否为或候选为结直肠癌患者，为采用上述任一所述成套试剂对待测者的Bis-DNA进行荧光定量PCR，得到扩增曲线，然后进行如下判断：如果扩增曲线呈现S型且Ct值≤39、则待测者为或候选为结直肠癌患者，否则待测者不为或候选不为结直肠癌患者。
(A4)鉴定待测者是否为或候选为结直肠癌患者，为采用上述任一所述引物对septin9对待测者的Bis-DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物中含有所述特异DNA片段甲、则待测者为或候选为结直肠癌患者，否则待测者不为或候选不为结直肠癌患者。
(A5)鉴定待测组织是否为或候选为结直肠癌组织，为采用上述任一所述成套试剂对待测组织的Bis-DNA进行荧光定量PCR，得到扩增曲线，然后进行如下判断：如果扩增曲线呈现S型且Ct值≤39、则待测组织为或候选为结直肠癌组织，否则待测组织不为或候选不为结直肠癌组织。
(A6)鉴定待测组织是否为或候选为结直肠癌组织，为采用上述任一所述引物对septin9对待测组织的Bis-DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物中含有所述特异DNA片段甲、则待测组织为或候选为结直肠癌组织，否则待测组织不为或候选不为结直肠癌组织。
上述任一所述待测者的Bis-DNA是采用重硫酸盐处理待测者基因组DNA获得的。所述待测者基因组DNA可为待测者血浆游离基因组DNA或待测者组织(如石蜡包埋切片)的基因组DNA。
上述任一所述待测组织的Bis-DNA是采用重硫酸盐处理待测组织基因组DNA获得的。所述待测组织为新鲜切取的待测组织或石蜡包埋切片保存的待测组织。
上述任一所述重硫酸盐处理具体可为采用Epitect Bisulfite Kit处理。EpitectBisulfite Kit具体可为QIAGEN公司的产品，货号为59124。
上文中，采用上述任一所述成套试剂进行荧光定量PCR的反应体系可包括引物septin9FP、引物septin9RP、探针SEPT9、SEPT9Blocker和模板。
上文中，采用上述任一所述成套试剂进行荧光定量PCR的反应体系具体可为20μL，由10μL 2×KAPAProbeMix、0.6μL引物septin9FP水溶液(浓度可为10μM)、0.6μL引物septin9RP水溶液(浓度可为10μM)、0.2μL探针SEPT9水溶液(浓度为10μM)、2μLSEPT9Blocker水溶液(浓度可为10μM)、1μL模板和5.6μL去离子水组成。2×KAPAProbeMix具体可为Kapa Biosystems公司的产品，货号为KK4710。
上文中，采用上述任一所述成套试剂进行荧光定量PCR的反应条件具体可为：95℃预变性3min；95℃5s，56℃30sec，55个循环；40℃5sec。荧光信号于每次56℃退火过程中采集。
实验证明，采用本发明提供的成套试剂可以检测Septin9基因启动子是否甲基化，从而早期诊断结直肠癌，而且具有较高的灵敏度(达到5％)和特异性。本发明可以为患病个体分子遗传学诊断、结直肠癌高发区人群普查、筛查结直肠癌家属中的发病高危人群以及进行相应的遗传咨询参考，具有重要的应用价值。
附图说明
图1为特异性实验中肺癌患者的Bis-DNA的扩增曲线。
图2为特异性实验中结直肠癌患者1的Bis-DNA的扩增曲线。
图3为特异性实验中结直肠癌患者2的Bis-DNA的扩增曲线。
图4为特异性实验中阳性对照品的Bis-DNA的扩增曲线。
图5为特异性实验中阴性对照品的Bis-DNA的扩增曲线。
图6为灵敏度实验中DNA8的扩增曲线。
图7为灵敏度实验中DNA7的扩增曲线。
图8为灵敏度实验中DNA6的扩增曲线。
图9为灵敏度实验中DNA5的扩增曲线。
图10为灵敏度实验中DNA4的扩增曲线。
图11为灵敏度实验中DNA3的扩增曲线。
图12为灵敏度实验中DNA2的扩增曲线。
图13为灵敏度实验中DNA1的扩增曲线。
图14为灵敏度实验中无核酸酶水的扩增曲线。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的健康人、结直肠癌患者和肺癌患者均知情同意。
Epitect Bisulfite Kit为QIAGEN公司的产品，货号为59124。2×KAPAProbeMix为Kapa Biosystems公司的产品，货号为KK4710。
实施例1、用于检测Septin9基因启动子是否甲基化的试剂盒的制备
一、用于检测Septin9基因启动子是否甲基化的成套试剂的制备
用于检测Septin9基因(genebank号为：NG_011683.1)启动子是否甲基化的成套试剂由引物对septin9、探针SEPT9和SEPT9Blocker组成。探针SEPT9和SEPT9Blocker均为单链DNA分子。
引物对septin9由引物septin9FP：5′-AAATAATCCCATCCAACTA-3′(序列表中序列1)和引物septin9RP：5′-GATTC*GTTGTTTATTAGTTATTATGT-3′(C*为C具有C3Spacer修饰)(序列表中序列2)组成。
引物对septin9扩增已甲基化的Septin9基因启动子的靶序列为：5′-AAATAATCCCATCCAACTACGCGTTAACCGCGAAATCCGACATAATAACTAATAAACAACGAATC-3′(下划线为CpG位点，共5个)(序列表中序列3)。引物对septin9扩增未甲基化的Septin9基因启动子的靶序列(即野生型靶序列)为：5′-AAATAATCCCATCCAGCTACACATTAACCACAAAATCCAACATAATAACTAATAAACAACGAATC-3′(序列表中序列4)。
SEPT9Blocker为：5′-gttattatgttggattttgtggttaatgtgtagc*-3′(c*为c具有C3Spacer修饰)(序列表中序列5)。
探针SEPT9为：5′-6-FAM-ttaaccgcgaaatccgac-BHQ1-3′(序列表中序列6)。探针SEPT9的5′末端具有6-FAM荧光标记，3′末端具有BHQ1荧光标记。
由华大基因合成引物septin9FP、引物septin9RP、探针SEPT9和SEPT9Blocker。
二、用于检测Septin9基因启动子是否甲基化的试剂盒的制备
用于检测Septin9基因启动子是否甲基化的试剂盒为将用于检测Septin9基因启动子是否甲基化的成套试剂、阴性对照品和阳性对照品组装在一起得到的产品(引物septin9FP、引物septin9RP、探针SEPT9、SEPT9Blocker、阴性对照品和阳性对照品均为独立包装)。
阴性对照品的制备方法为：(1)将序列表中序列7所示的双链DNA分子插入PSBS1载体的多克隆位点之间，得到的质粒Raw-Seq；(2)取质粒Raw-Seq，采用EpitectBisulfiteKit进行重硫酸盐处理，得到Bis-Raw-Seq质粒；(3)将Bis-Raw-Seq质粒溶于pH8.0、10mMTris-HCl缓冲液，得到含3×105copies/μL Bis-Raw-Seq质粒的Tris-HCl缓冲液，即阴性对照品。
阳性对照品的制备方法为：(1)将序列表中序列8所示的双链DNA分子插入PSBS1载体的多克隆位点之间，得到Methyl-Seq质粒；(2)取Methyl-Seq质粒，采用EpitectBisulfite Kit进行重硫酸盐处理，得到Bis-Methyl-Seq质粒；(3)将Bis-Methyl-Seq质粒溶于pH8.0，10mM Tris-HCl缓冲液，得到含3×105copies/μL Bis-Methyl-Seq质粒的Tris-HCl缓冲液，即阳性对照品。
实施例2、采用实施例1制备的试剂盒检测待测者的Septin9基因启动子是否发生甲基化
待测者为健康人、结直肠癌患者1(结直肠癌Ⅲ期且伴有肝转移)和结直肠癌患者2。
一、待测者的Bis-DNA的获得
1、分别提取各个待测者的基因组DNA。具体为：提取健康人的血浆游离基因组DNA；提取结直肠癌患者1或结直肠癌患者2的结直肠癌组织的石蜡包埋切片的基因组DNA。
2、分别取各个待测者的基因组DNA，采用Epitect Bisulfite Kit进行重硫酸盐处理，得到各个待测者的Bis-DNA。
二、配制反应体系
反应体系为20μL，由10μL 2×KAPAProbeMix、0.6μL引物septin9FP水溶液(浓度为10μM)、0.6μL引物septin9RP水溶液(浓度为10μM)、0.2μL探针SEPT9水溶液(浓度为10μM)、2μL SEPT9Blocker水溶液(浓度为10μM)、1μL模板(待测者的Bis-DNA(含1.7ng待测者的Bis-DNA)、阴性对照品或阳性对照品)和5.6μL去离子水组成。
三、实时定量PCR检测
取步骤二配制的反应体系，置于实时荧光PCR仪上进行实时定量PCR检测，得到扩增曲线。反应条件：95℃预变性3min；95℃5s，56℃30sec，55个循环；40℃5sec。荧光信号于每次56℃退火过程中采集。
四、结果判定
如果以某待测者的Bis-DNA为模板得到的扩增曲线呈现S型曲线且Ct值≤39，则该待测者的Septin9基因启动子发生了甲基化；否则该待测者的Septin9基因启动子未发生甲基化。
实验结果见表1。结果表明，以健康人的Bis-DNA为模板，得到的扩增曲线不呈现S型，判定为Septin9基因启动子未发生甲基化，与预期结果完全一致；以阴性对照品为模板，得到的扩增曲线呈现S型且Ct值＞39，判定为未发生甲基化，与预期结果完全一致；以结直肠癌患者1的Bis-DNA或结直肠癌患者2的Bis-DNA为模板，得到的扩增曲线呈现S型且Ct值＜39，判定为Septin9基因启动子发生了甲基化，与预期结果完全一致；以阳性对照品为模板，得到的扩增曲线呈现S型且Ct值＜39，判定为发生了甲基化，与预期结果完全一致。
上述结果表明，采用实施例1制备的试剂盒可以检测待测者的Septin9基因启动子是否发生甲基化。
表1
实施例3、检测实施例1制备的试剂盒的特异性
待测者为结直肠癌患者1(结直肠癌Ⅲ期且伴有肝转移)、结直肠癌患者2、肺癌患者。
一、待测者的Bis-DNA的获得
1、分别提取各个待测者的基因组DNA。具体为：提取肺癌患者的血浆游离基因组DNA；提取结直肠癌患者1或结直肠癌患者2的结直肠癌组织的石蜡包埋切片的基因组DNA。
2、分别取各个待测者的基因组DNA，采用Epitect Bisulfite Kit进行重硫酸盐处理，得到各个待测者的Bis-DNA。
二、配制反应体系
反应体系为20μL，由10μL 2×KAPAProbeMix、0.6μL引物septin9FP水溶液(浓度为10μM)、0.6μL引物septin9RP水溶液(浓度为10μM)、0.2μL探针SEPT9水溶液(浓度为10μM)、2μL SEPT9Blocker水溶液(浓度为10μM)、1μL模板(待测者的Bis-DNA(含1.7ng待测者的Bis-DNA)、阴性对照品或阳性对照品)和5.6μL去离子水组成。
三、实时定量PCR检测
取步骤二配制的反应体系，置于实时荧光PCR仪上进行实时定量PCR检测，得到扩增曲线。反应条件：95℃预变性3min；95℃5s，56℃30sec，55个循环；40℃5sec。荧光信号于每次56℃退火过程中采集。
四、结果判定
如果以某待测者的Bis-DNA为模板得到的扩增曲线呈现S型曲线且Ct值≤39，则该待测者的Septin9基因启动子发生了甲基化；否则该待测者的Septin9基因启动子未发生甲基化。
实验结果见表2。结果表明，以肺癌患者的Bis-DNA为模板，得到的扩增曲线呈现S型且Ct值＞39(见图1)，判定为Septin9基因启动子未发生甲基化；以阴性对照品为模板，得到的扩增曲线呈现S型且Ct值＞39(见图5)，判定为未发生甲基化；以结直肠癌患者1的Bis-DNA或结直肠癌患者2的Bis-DNA为模板，得到的扩增曲线呈现S型且Ct值＜39(见图2和图3)，判定为Septin9基因启动子发生了甲基化；以阳性对照品为模板，得到的扩增曲线呈现S型且Ct值＜39(见图4)，判定为发生了甲基化。因此，实施例1制备的试剂盒具有特异性。
表2
模板 扩增曲线是否呈现S型 Ct值
阳性对照品 是 33.52
阴性对照品 是 39.18
结直肠癌患者1的Bis-DNA 是 36.97
结直肠癌患者2的Bis-DNA 是 34.74
肺癌患者的Bis-DNA 是 39.38
实施例4、检测实施例1制备的试剂盒的灵敏度
一、模板的获得
1、Bis-Raw-Seq质粒的获得
(1)将序列表中序列7所示的双链DNA分子插入PSBS1载体的多克隆位点之间，得到的质粒Raw-Seq；
(2)取质粒Raw-Seq，采用Epitect Bisulfite Kit进行重硫酸盐处理，得到Bis-Raw-Seq质粒。
2、Bis-Methyl-Seq质粒的获得
(1)将序列表中序列8所示的双链DNA分子插入PSBS1载体的多克隆位点之间，得到的质粒Raw-Seq；
(2)取Methyl-Seq质粒，采用Epitect Bisulfite Kit进行重硫酸盐处理，得到Bis-Methyl-Seq质粒。
3、模板的获得
将Bis-Raw-Seq质粒和Bis-Methyl-Seq质粒按照不同比例混合(表3所示)，得到具有不同突变频率的模板。
表3
二、配制反应体系
反应体系为20μL，由10μL 2×KAPAProbeMix、0.6μL引物septin9FP水溶液(浓度为10μM)、0.6μL引物septin9RP水溶液(浓度为10μM)、0.2μL探针SEPT9水溶液(浓度为10μM)、2μL SEPT9Blocker水溶液(浓度为10μM)、1μL模板和5.6μL去离子水组成。
三、实时定量PCR检测
取步骤二配制的反应体系，置于实时荧光PCR仪上进行实时定量PCR检测，得到扩增曲线。反应条件：95℃预变性3min；95℃5s，56℃30sec，55个循环；40℃5sec。荧光信号于每次56℃退火过程中采集。
四、结果判定
如果扩增曲线呈现S型曲线且Ct值≤39，则相应的模板中发生了甲基化；否则相应的模板中未发生甲基化。
按照步骤二至四的步骤，将模板替换为无核酸酶水，其它步骤均不变，作为空白对照。
实验结果见表4。实验结果表明，以DNA3、DNA4、DNA5、DNA6、DNA7或DNA8为模板，得到的扩增曲线呈现S型曲线且Ct值≤39(依次见图11、图10、图9、图8、图7和图6)，判定为发生了甲基化；以无核酸酶水为模板，得到的扩增曲线不呈现S型(见图14)，判定为未发生甲基化；以DNA1或DNA2为模板，得到的扩增曲线呈现S型且Ct值＞39(依次见图13和图12)，判定为未发生甲基化。因此，实施例1制备的试剂盒具有较高的灵敏度，灵敏度达到5％。
表4
模板 突变频率 扩增曲线是否呈现S型 Ct值
无核酸酶水 - 否 无
DNA1 0％ 是 39.90
DNA2 1％ 是 39.50
DNA3 5％ 是 38.85
DNA4 10％ 是 37.97
DNA5 20％ 是 37.29
DNA6 50％ 是 35.64
DNA7 80％ 是 35.30
DNA8 100％ 是 34.57
注：“-”表示不存在。
<110> 北京迈基诺基因科技股份有限公司
<120> 检测Septin9基因启动子是否甲基化的方法及其专用成套试剂
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
aaataatccc atccaacta 19
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
gattcgttgt ttattagtta ttatgt 26
<210> 3
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
aaataatccc atccaactac gcgttaaccg cgaaatccga cataataact aataaacaac 60
gaatc 65
<210> 4
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
aaataatccc atccagctac acattaacca caaaatccaa cataataact aataaacaac 60
gaatc 65
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
gttattatgt tggattttgt ggttaatgtg tagc 34
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 6
ttaaccgcga aatccgac 18
<210> 7
<211> 291
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 7
aggggttttg ttttttttta gtgtattttt gttttttttt agtgtatttt tgttttgtgt 60
taggtttatt tgtagggttt tttttagtat gtttgtggtt gtagtagtta gtttagtatt 120
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<210> 8
<211> 291
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 8
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tggttggtgg gtagcgggtc gcgcggaggg tagcggcgag gaagcgtttt cggcggggtt 240
cgggttttgc gcgttggttg gggcgtcgcg ttcgcgtttt tgtagtgtag a 291

Claims (10)

1.成套试剂，包括引物对septin9和探针SEPT9；
所述引物对septin9由引物septin9 FP和引物septin9 RP组成；
已甲基化的Septin9基因启动子中，所述引物对septin9的靶序列含有特异DNA片段甲；所述特异DNA片段甲为序列表的序列3所示的单链DNA分子；
所述探针SEPT9为15-25个核苷酸组成的单链DNA分子，与所述特异DNA片段甲中的部分区段相同。
2.如权利要求1所述的成套试剂，其特征在于：
所述引物septin9 FP为如下a1)或a2)：
a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；
a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物septin9 RP为如下b1)或b2)：
b1)序列表中序列2所示的单链DNA分子；
b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；
所述探针SEPT9为如下c1)或c2)：
c1)序列表中序列6所示的单链DNA分子；
c2)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的单链DNA分子。
3.如权利要求1或2所述的成套试剂，其特征在于：所述成套试剂还包括SEPT9Blocker；所述SEPT9 Blocker为25-45个核苷酸组成的单链DNA分子，与序列表的序列4所示自5′末端起第20至39位所示的单链DNA分子互补。
4.如权利要求3所述的成套试剂，其特征在于：所述SEPT9 Blocker为如下d1)或d2)：
d1)序列表中序列5所示的单链DNA分子；
d2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的单链DNA分子。
5.权利要求1至4任一所述成套试剂中的所述引物对septin9。
6.e1)或e2)：
e1)权利要求1至4任一所述成套试剂的制备方法，为将权利要求1至4任一所述成套试剂中的所述引物septin9 FP、所述引物septin9 RP、所述探针SEPT9和所述SEPT9 Blocker分别单独包装；
e2)权利要求5所述引物对septin9的制备方法，为将权利要求5所述引物对septin9中各个引物分别单独包装。
7.权利要求1至4任一所述成套试剂或权利要求5所述引物对septin9在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下f1)或f2)或f3)或f4)或f5)：
f1)检测Septin9基因启动子；
f2)检测待测者Septin9基因启动子是否甲基化；
f3)鉴定结直肠癌；
f4)鉴定待测者是否为或候选为结直肠癌患者；
f5)鉴定待测组织是否为或候选为结直肠癌组织。
8.含有权利要求1至4任一所述成套试剂或权利要求5所述引物对septin9的产品；所述产品的功能为如下f1)或f2)或f3)或f4)或f5)：
f1)检测Septin9基因启动子；
f2)检测待测者Septin9基因启动子是否甲基化；
f3)鉴定结直肠癌；
f4)鉴定待测者是否为或候选为结直肠癌患者；
f5)鉴定待测组织是否为或候选为结直肠癌组织。
9.(A1)或(A2)或(A3)或(A4)或(A5)或(A6)：
(A1)检测待测者Septin9基因启动子是否甲基化的方法，为采用权利要求1至4任一所述成套试剂对待测者的Bis-DNA进行荧光定量PCR，得到扩增曲线，然后进行如下判断：如果扩增曲线呈现S型且Ct值≤39、则待测者的Septin9基因启动子发生了甲基化，否则待测者的Septin9基因启动子未发生甲基化；
(A2)检测待测者Septin9基因启动子是否甲基化的方法，为采用权利要求5所述引物对septin9对待测者的Bis-DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物中含有权利要求1中所述特异DNA片段甲、则待测者的Septin9基因启动子发生了甲基化，否则待测者的Septin9基因启动子未发生甲基化；
(A3)鉴定待测者是否为或候选为结直肠癌患者，为采用权利要求1至4任一所述成套试剂对待测者的Bis-DNA进行荧光定量PCR，得到扩增曲线，然后进行如下判断：如果扩增曲线呈现S型且Ct值≤39、则待测者为或候选为结直肠癌患者，否则待测者不为或候选不为结直肠癌患者；
(A4)鉴定待测者是否为或候选为结直肠癌患者，为采用权利要求5所述引物对septin9对待测者的Bis-DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物中含有权利要求1中所述特异DNA片段甲、则待测者为或候选为结直肠癌患者，否则待测者不为或候选不为结直肠癌患者；
(A5)鉴定待测组织是否为或候选为结直肠癌组织，为采用权利要求1至4任一所述成套试剂对待测组织的Bis-DNA进行荧光定量PCR，得到扩增曲线，然后进行如下判断：如果扩增曲线呈现S型且Ct值≤39、则待测组织为或候选为结直肠癌组织，否则待测组织不为或候选不为结直肠癌组织；
(A6)鉴定待测组织是否为或候选为结直肠癌组织，为采用权利要求5所述引物对septin9对待测组织的Bis-DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物中含有权利要求1中所述特异DNA片段甲、则待测组织为或候选为结直肠癌组织，否则待测组织不为或候选不为结直肠癌组织；
所述待测者的Bis-DNA是采用重硫酸盐处理待测者基因组DNA获得的；
所述待测组织的Bis-DNA是采用重硫酸盐处理待测组织基因组DNA获得的。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述待测者基因组DNA为待测者血浆游离基因组DNA或待测者组织的基因组DNA；
所述待测组织为新鲜切取或石蜡包埋切片保存的待测组织。
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