CN108676878B - 检测ndrg4基因甲基化位点的产品在制备结直肠癌早期检测的产品的用途 - Google Patents

检测ndrg4基因甲基化位点的产品在制备结直肠癌早期检测的产品的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于NDRG4基因甲基化序列的结直肠癌早期检测方法，通过检测NDRG4基因启动子区的一段甲基化序列是否发生甲基化，辅助诊断早期结直肠癌；检测方法为从组织、粪便样本中提取DNA，经亚硫酸氢盐处理后，进行实时定量PCR测定，通过计算目标基因NDRG4与内参基因B2M的扩增Ct比差值是否在判定临界值内，判断甲基化水平；这样的检测方式无创，可用于早期结直肠癌的辅助诊断。

Description

检测NDRG4基因甲基化位点的产品在制备结直肠癌早期检测 的产品的用途
技术领域
本发明涉及生物技术及疾病检测领域，特别是一种检测NDRG4基因甲基化位点的产品在制备结直肠癌早期检测的产品的用途。
背景技术
结直肠癌(Colorectal Cancer，CRC)是全球第四大男性常见癌症，是全球第三大女性常见癌症，在发达国家的发病率最高。CRC影响约5％的美国人群，在癌症相关死亡率中排名第二。近年来，随着我国人民生活水平的提高，生活习惯与饮食结构的改变，环境污染日益严重，我国结直肠癌的发病率不断增加。国家癌症早诊早治项目专家委员会2013年的研究报告指出，我国40岁以上的高危人群患进展期腺瘤和早期肠癌的比率为6％。据2015年《中国肿瘤登记年报》统计，结直肠癌的发病率近年来仍在增长。目前我国每年新增结直肠癌确诊病例44万，每年死亡患者多达23万人。
结直肠癌主要包括结肠癌与直肠癌两大类，其发展是一个渐进过程：增生>小腺瘤>大腺瘤>重度非典型增生>早期腺癌>晚期腺瘤。大多数肠癌形成之前以息肉(异常突起)或腺瘤(腺上皮良性肿瘤)的形式在发病部位缓慢发展多年，在此期间患者无任何不适。随着时间的推移，部分腺瘤可转变为癌症。在癌变过程中，肿瘤细胞侵入肠壁，与血管或淋巴管融合，通过吸收患者养分迅速扩增。后期，癌细胞通过淋巴管侵入附近的淋巴结或身体的其它器官，形成癌扩散。结直肠癌在早期并没有明显症状，通常发展至晚期才有明显症状显现，如腹痛，便血等。
结直肠癌的生存率依赖于诊断时的病理分期。如果在早期阶段(局限于肠壁)被诊断，患者的5年生存率能达到90％；如果在发生淋巴结转移阶段被诊断，患者的5年生存率下降到65％；如果在远端转移阶段被诊断，患者的5年生存率则只有9％。
目前，结直肠癌的筛查方法主要有结肠镜检查与粪便潜血试验。纤维结肠镜是迄今为止最准确的结直肠癌筛查方法，肠镜加病理活检被认为是结直肠癌筛查和诊断的金标准。在美国和欧洲的有些国家，纤维结肠镜被广泛应用于结直肠癌的筛查，50岁以上的人每10年被要求做一次肠镜，但因肠镜的侵入性和肠道准备时的不适以及可能会出现并发症，有超过半数的美国人不愿意接收肠镜检查，使得实际进行结肠镜检查的病人很低。粪便潜血试验是唯一被应用于结直肠癌大系列人群筛查且得到循证医学证实可有效降低死亡率的方法。其以粪便中血红蛋白为检测靶标，相对其他方法，能做到无创检测，不需要肠道准备，取材方便，检测费用相对便宜。但粪便潜血试验也存在很多弊端，如肿瘤伴随的出血症状可能出现暂停或肿瘤早期无出血症状而造成漏检，影响对肿瘤尤其是早期病变的检测灵敏度。
此外，我国大多数患者缺乏癌症早期筛查的意识，由于疾病早期症状不明显，发现明显症状后才到医院进行检查，至被确诊为结直肠癌时，癌细胞已经扩散，错失最佳的治疗时间。中晚期患者所需治疗费用高、疗效差、五年生存率低。如果能够在早期发现结直肠癌，不仅治疗费用低，还可达到预防甚至治愈的目的，因此亟待开发更好的结直肠癌筛查方法。
基因启动子区CpG岛的超甲基化与基因的沉默相关，可能使抑癌基因失活。文献报道(Melotte et al.(2009))NDRG4(N-Myc Downstream-Regulated Gene 4)是结直肠癌的一种抑癌基因，其表达往往通过启动子区的甲基化而失活。若能够寻找到与结直肠癌发生相关的甲基化位点，就可以用于早期结直肠癌的辅助诊断。
普通人每天数以百万计的细胞从结肠壁脱落进入到排泄系统，包括肠道肿瘤形成过程中的细胞。进入排泄系统后的细胞中含有相应的DNA，其中含有和肿瘤密切相关的遗传信息，反映结直肠癌或肿瘤的形成过程。早期肠癌细胞中有些基因发生甲基化转变，是肠癌的预兆，这些细胞会自然脱落到肠道中，与粪便一起排出。通过检测这些DNA标记物，就可以发现结直肠癌或肿瘤等在肠壁的存在。因此，从粪便中提取DNA进行肿瘤相关基因检测，可以实现非侵入性、无创无痛、方便家中采样，无需前往医院，无需饮食或用药限制。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供检测NDRG4基因甲基化位点的产品在制备结直肠癌早期检测的产品的用途，通过检测NDRG4基因启动子区的一段CpG岛是否发生甲基化，辅助诊断早期结直肠癌；检测方法为从组织、粪便样本中提取DNA，经亚硫酸氢盐处理后，进行实时定量PCR测定，通过计算目标基因NDRG4(FAM信号)的扩增Ct值与内参基因B2M(JOE信号)的扩增Ct值的差值(△Ct)，并根据△Ct是否在临界值内，判断样本是否发生NDRG4基因的甲基化，而用于早期结直肠癌的辅助诊断，这样的检测方式无创。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
检测NDRG4基因甲基化位点的产品在制备结直肠癌早期检测的产品的用途，NDRG4基因的甲基化序列如下：
TGAGAAGTmCGGmCGGGGGmCGmCGGATmCGACmCGGGGTGTCCCCCAGGCTCmCGmCGTmCGmCGGTCCCmCGCTmCGCCCTCCmCGCCmCGCCCACmCGGGCACCCCAGCmCGmCGCAGAAGGmCGGAAGCCAmCGmCGmCGAGGGACmCGmCGGTCmCGTCmCGGGACTAGCCCCAGGCCmCGGCACmCGCCCmCGmCGGGCmCGAGmCGCCCACACCmCGCCAAACCCAmCGmCGGGCAmCGCCCCmCGmCGGmCGCACmCGCCCCCAGCC；
mCG表示CpG岛的C发生了甲基化修饰；
使用方法包括如下步骤：
步骤一，从生物样本中提取基因组DNA；
步骤二，设计NDRG4基因的甲基化序列的引物和探针；
步骤三，将提取的基因组DNA经过转化液处理，得到的序列如下所示：
SEQ ID NO.1:TGAGAAGTCGGCGGGGGCGCGGATCGATCGGGGTGTTTTTTAGGTTTCGCGTCGCGGTTTTCGTTCGTTTTTTCGTTCGTTTATCGGGTATTTTAGTCGCGTAGAAGGCGGAAGTTACGCGCGAGGGATCGCGGTTCGTTCGGGATTAGTTTTAGGTTCGGTATCGTTTCGCGGGTCGAGCGTTTATATTCGTTAAATTTACGCGGGTACGTTTTCGCGGCGTATCGTTTTTAGTT；
步骤四，将转化液处理后的DNA进行定量PCR检测；
步骤五，结果判定：
自动设置基线，手动设置阈值线，根据实际情况调节阈值线至FAM和JOE扩增曲线升起的拐点处，且目标基因FAM信号的阈值线需超过正常阴性对照的最高点处设定的阈值线；
根据待测样本的定量PCR检测信号，达到设定阈值线所需的循环次数，得到Ct值；
若△Ct＝NDRG4目标基因FAM信号的Ct值-B2M内参基因JOE信号的Ct值≤临界值，则该样本为发生甲基化样本，判断为结直肠癌早期诊断阳性；
若△Ct＝NDRG4目标基因FAM信号的Ct值-B2M内参基因JOE信号的Ct值>临界值，则该样本为未发生甲基化样本，判断为结直肠癌早期诊断阴性；
临界值为NDRG4基因检测体系检测浓度为5ng/μL的1％比例甲基化参考品对应的△Ct值。
检测NDRG4基因甲基化位点的产品在制备结直肠癌早期检测的产品的用途，
NDRG4基因的甲基化序列如下：
TGAGAAGTmCGGmCGGGGGmCGmCGGATmCGACmCGGGGTGTCCCCCAGGCTCmCGmCGTmCGmCGGTCCCmCGCTmCGCCCTCCmCGCCmCGCCCACmCGGGCACCCCAGCmCGmCGCAGAAGGmCGGAAGCCAmCGmCGmCGAGGGACmCGmCGGTCmCGTCmCGGGACTAGCCCCAGGCCmCGGCACmCGCCCmCGmCGGGCmCGAGmCGCCCACACCmCGCCAAACCCAmCGmCGGGCAmCGCCCCmCGmCGGmCGCACmCGCCCCCAGCC；
mCG表示CpG岛的C发生了甲基化修饰；
使用方法包括如下步骤：
步骤一，从生物样本中提取基因组DNA；
步骤二，设计NDRG4基因甲基化序列的引物，探针，阳性质控和阴性质控；
内部质控，以B2M基因作为内参基因，碱基序列为NCBI数据库中基因序列编号为NG_012920.1第3886到4010位，对应的序列CG以外序列中C转换成T；针对这段转换的序列设计内控引物和内控探针，并对内控的上下游引物进行筛选，使非模版体系NTC没有明显的扩增曲线，若样本有明显的扩增曲线，则判断为正常。
步骤三，将提取的基因组DNA经过转化液处理，得到的序列如下所示：
SEQ ID NO.1:TGAGAAGTCGGCGGGGGCGCGGATCGATCGGGGTGTTTTTTAGGTTTCGCGTCGCGGTTTTCGTTCGTTTTTTCGTTCGTTTATCGGGTATTTTAGTCGCGTAGAAGGCGGAAGTTACGCGCGAGGGATCGCGGTTCGTTCGGGATTAGTTTTAGGTTCGGTATCGTTTCGCGGGTCGAGCGTTTATATTCGTTAAATTTACGCGGGTACGTTTTCGCGGCGTATCGTTTTTAGTT；
步骤四，将转化液处理后的DNA进行定量PCR检测；
步骤五，结果判定：先判断样本是否符合要求，若阳性质控体系的目标基因NDRG4对应的FAM信号有明显的扩增曲线，内部质控B2M基因对应的JOE有明显的扩增曲线的Ct值的差值，即△Ct≤临界值，则符合要求，检测结果正确，该样本为甲基化样本，判断为结直肠癌早期诊断阳性；
若阴性质控体系的FAM无扩增曲线，JOE有明显的扩增曲线且JOE信号的Ct值的差值，即△Ct＞临界值，则符合要求，检测结果正确，该样本为未甲基化样本，判断为结直肠癌早期诊断阴性；
临界值为NDRG4基因检测体系检测浓度为5ng/μL的1％比例甲基化参考品对应的△Ct值。
前述的检测NDRG4基因甲基化位点的产品在制备结直肠癌早期检测的产品的用途，阈值为9。
前述的检测NDRG4基因甲基化位点的产品在制备结直肠癌早期检测的产品的用途，
从组织样本中提取基因组DNA的具体步骤包括如下内容：
采用TaKaRa MiniBEST FFPE DNA Extraction Kit从FFPE样本中提取基因组DNA；
具体步骤如下：
用灭菌手术刀刮取30mg的石蜡切片组织，去除多余的石蜡；
将石蜡切片组织放入1.5mL的离心管中，加入500μL Buffer DP，混匀后于80℃水浴1分钟，趁热涡旋震荡10秒，加入180μLBuffer GL，涡旋震荡；
然后12000rpm室温离心1分钟，溶液形成两层，上层油相，下层水相，向下层水相中加入20μL Proteinase K，20mg/mL和10μL RNase，10mg/mL，吸打混匀，然后56℃水浴1小时；
将处理后的样品90℃水浴30分钟，冷却至室温；
将处理的样品加入200μL Buffer GB和200μL 100％乙醇，涡旋震荡10秒；
然后12000rpm室温离心1分钟，溶液形成两层，上层油相，下层水相；
将Spin Column安置于Collection Tube上，将样品的下层水相溶液移至SpinColumn中，然后12000rpm室温离心2分钟，弃滤液；
将500μL的Buffer WA加至Spin Column中，12000rpm室温离心1分钟，弃滤液；
将500μL的Buffer WB加至Spin Column中，12000rpm室温离心1分钟，弃滤液；
将500μL的Buffer WB加至Spin Column中，12000rpm室温离心1分钟，弃滤液；将500μL的Buffer WB加至Spin Column中，12000rpm室温离心1分钟，弃滤液；
将Spin Column安置于Collection Tube上，12000rpm室温离心2分钟；
将Spin Column安置于新的1.5mL离心管上，在Spin Column膜的中央处加入50-100μL灭菌水或者Elution Buffer，室温静置5分钟；
12000rpm室温离心2分钟，洗脱DNA；
将离心得到的DNA溶液用Nanodrop检测浓度及纯度；
将检测合格的DNA保存于-20℃冰箱，备用。
前述的检测NDRG4基因甲基化位点的产品在制备结直肠癌早期检测的产品的用途，
从粪便样本中提取基因组DNA的具体步骤包括如下内容：
取粪便样本4-6g加入裂解液40mL，涡旋振荡，充分混匀后50℃孵育16小时；
孵育结束后5000rpm离心10min，离心前注意称重平衡，离心结束后，小心地取出离心管，勿剧烈晃动；
移取9mL上清液于新的50mL离心管中，再分别加入1mL提取辅佐液、60μL磁珠液和10mL异丙醇，旋涡振荡10sec，65℃孵育20min，孵育期间每隔5min上下颠倒混匀一次；
孵育结束后，将50mL离心管放在磁力架上，静置3min，待磁珠充分吸附在管壁上，弃废液；
将离心管从磁力架中取出，加入12mL洗涤液，涡旋振荡直至磁珠从管壁上脱落，静置3min，再次放入磁力架中，静置3min，待磁珠充分吸附在管壁上，弃废液；
加15mL80％乙醇溶液，涡旋振荡直至磁珠从管壁上脱落，静置3min，再放入磁力架中，静置3min，待磁珠充分吸附在管壁上，弃废液；
加15mL80％乙醇溶液，涡旋振荡直至磁珠从管壁上脱落，静置3min，再放入磁力架中，静置3min，待磁珠充分吸附在管壁上，弃废液；
用移液器吸尽底部残余液体，开盖，将离心管65℃中孵育5min，待磁珠干燥后取出，加入1.5mL预热的洗脱液I，用1000μL移液器将磁珠从管壁上吹洗下来，反复抽吸，连同磁珠一起转移至2mL离心管中，闭合离心管盖65℃孵育5min；
13000rpm离心3min，移取600μL上清液至新的1.5mL离心管，加入600μL柱结合液，充分混匀；
转移600μL混合液至DNA纯化柱中，13000rpm离心1min，弃废液；
将剩余混合液重复上一步操作，再次13000rpm离心2min；
向DNA纯化柱中加入600μL的90％乙醇溶液，13000rpm离心1min，弃废液；
重复上一步骤2次；
13000rpm离心3min，将DNA纯化柱放入新的1.5mL离心管，打开离心管盖65℃孵育5min，烘干；
向DNA纯化柱中间位置悬空滴加100μL预热的洗脱液II，闭合盖子65℃孵育5min，13000rpm离心2min，得洗脱后的DNA溶液，2～8℃保存备用，若长期保存需保存在-25～-15℃。
前述的检测NDRG4基因甲基化位点的产品在制备结直肠癌早期检测的产品的用途，
步骤二，设计NDRG4基因的甲基化序列的引物和探针；
NDRG4引物包括：NDRG4正向引物，NDRG4反向引物；
NDRG4正向引物包括：
SEQ ID NO.2：TAGTCGCGTAGAAGGCGGAA；
SEQ ID NO.3：GCGTAGAAGGCGGAAGTTAC；
SEQ ID NO.4：GCGGTTCGTTCGGGATTAG；
NDRG4反向引物包括：
SEQ ID NO.5：CGCGAAACGATACCGAACCT；
SEQ ID NO.6：GCGAAACGATACCGAACCTA；
SEQ ID NO.7：ACCCGCGTAAATTTAACGAATA；
NDRG4探针包括：
SEQ ID NO.8：CGAACCGCGATCCCTCGCGCG；
SEQ ID NO.9：CGAACCGCGATCCCTCGCGC；
SEQ ID NO.10：ACGCTCGACCCGCGAAACGA；
前述的检测NDRG4基因甲基化位点的产品在制备结直肠癌早期检测的产品的用途，
NDRG4正向引物为SEQ ID NO.2，NDRG4的反向引物为SEQ ID NO.5，NDRG4探针为SEQ ID NO.8。
前述的检测NDRG4基因甲基化位点的产品在制备结直肠癌早期检测的产品的用途，
NDRG4的阳性质控品为含有SEQ ID NO.11的核苷酸序列；
SEQ ID NO.11：
GTTAGTTTGGTCGGGTGTTTTTAAAAATAAAGCGAGGAGGGAAGGTATAGATAGATTTTGAAAATATTCGGGTTATATACGTCGCGATTTATAGTTTTTTTTTAGCGTTGGAGTGGAGACGGCGTTCGTAGCGTTTTGCGCGGGTGAGGTTCGCGTAGTTGTTGGGGAAGAGTTTATTTGTTAGGTTGCGTTGGGTTAGCGTAGTAAGTGGGGTTGGTCGTTATTTCGTTGTATTCGGTCGCGTTTCGGGTTTCGTGCGTTTTCGTTTTAG；
NDRG4的阴性质控品为含有SEQ ID NO.12的核苷酸序列；
SEQ ID NO.12：
GTTAGTTTGGTTGGGTGTTTTTAAAAATAAAGTGAGGAGGGAAGGTATAGATAGATTTTGAAAATATTTGGGTTATATATGTTGTGATTTATAGTTTTTTTTTAGTGTTGGAGTGGAGATGGTGTTTGTAGTGTTTTGTGTGGGTGAGGTTTGTGTAGTTGTTGGGGAAGAGTTTATTTGTTAGGTTGTGTTGGGTTAGTGTAGTAAGTGGGGTTGGTTGTTATTTTGTTGTATTTGGTTGTGTTTTGGGTTTTGTGTGTTTTTGTTTTAG；
内部质控正向引物为SEQ ID NO.13：TTGTGGATTTTATTATTAYGAAATGG；
内部质控反向引物为SEQ ID NO.14：AAACTACATCTACCTTAAACCCAACC；
内部质控探针为核苷酸序列SEQ ID NO.15：GTATTTTATTTATGGTTATTTTAGAGGGT；
内部质控品含有SEQ ID NO.16：
AGAAAAGATTTGTGGATTTTATTATTACGAAATGGCGGTATTTTATTTATGGTTATTTTAGAGGGTAGGTTTTTTTAATGGGTTTGTTTGTTATGTTTAACGTTTTTGGTTGGGTTTAAGGTAGATGTAGTTTAAATTTTTATTAAAATTGTCGAG。
前述的检测NDRG4基因甲基化位点的产品在制备结直肠癌早期检测的产品的用途，
步骤三，将提取的基因组DNA经过转化液处理，得到的序列如下所示：
SEQ ID NO.1:TGAGAAGTCGGCGGGGGCGCGGATCGATCGGGGTGTTTTTTAGGTTTCGCGTCGCGGTTTTCGTTCGTTTTTTCGTTCGTTTATCGGGTATTTTAGTCGCGTAGAAGGCGGAAGTTACGCGCGAGGGATCGCGGTTCGTTCGGGATTAGTTTTAGGTTCGGTATCGTTTCGCGGGTCGAGCGTTTATATTCGTTAAATTTACGCGGGTACGTTTTCGCGGCGTATCGTTTTTAGTT；
具体包括如下步骤：
将提取的基因组DNA从冰箱取出解冻，稀释DNA浓度至20ng/μL；取40μL稀释后的DNA溶液加入到1.5mL离心管中，然后加入4μL 3M的NaOH溶液，42℃孵育20min；
加入400μL亚硫酸氢盐转化液，混匀，50℃避光孵育16小时；
加入550μL柱结合液，混匀，然后将溶液转移至DNA纯化柱，13000rpm离心90秒，弃废液后，再次离心3分钟，弃废液；
加入600μL 90％乙醇至DNA纯化柱，13000rpm离心90秒，弃废液后，再次离心15秒；
加入300μL脱硫液，常温放置30分钟，13000rpm离心90秒，弃废液；
加入600μL 90％乙醇，13000rpm离心90秒，弃废液，重复此步骤1次，再次离心3分钟；
将DNA纯化柱放入新的1.5mL离心管中，加入40μL洗脱液，50℃孵育30分钟，13000rpm离心90秒，得转化后的DNA溶液，于-20℃保存备用。
前述的检测NDRG4基因甲基化位点的产品在制备结直肠癌早期检测的产品的用途，
步骤四，将转化液处理后的DNA进行定量PCR检测；
配制对待测样本DNA检测反应体系，PCR反应体系中组分如下：
10×PCR缓冲液：5～10μL
MgCl2：2.0～5.0mmol
dNTP：0.2～0.8mmol
各条引物：0.1～1.0μmol
各条探针：0.1～1.0μmol
Fast master Premix：5～10μL
样品DNA模板：2μL
其余用超纯水补足总体积：20μL；
实时荧光PCR扩增反应条件为：
第一阶段：95℃5min，1个循环；
第二阶段：95℃20s，60℃40s，15个循环；
第三阶段:95℃20s，58℃20s，30个循环；
第三阶段:30个循环中58℃时，收集荧光信号。
本发明的有益之处在于：
本发明利用分子标记物检测疾病的方法，灵敏度高，可以准确检出低至0.01ng/μL的基因组DNA，适用于粪便样本中脱落的细胞即浓度很低的样本也能准确检出；特异性强，对于高至500ng的粪便样本DNA也能够准确检出，因此，可以减少稀释样本的过程。
本发明从组织、粪便样本中提取DNA，这样的检测方式无创，不会给病人带来痛苦。
本发明设计的引物和探针能与待测位点互补，具有高灵敏度和高特异性。
本发明的检测方法用亚硫酸氢盐处理DNA片段，以便将DNA样品中的胞嘧啶转换为尿嘧啶，而5’甲基胞嘧啶不变，可实现对甲基化位点的检测。
本发明通过实时定量PCR测定，通过计算NDRG4目标基因(FAM信号)Ct值与B2M内参基因(JOE信号)Ct值的差值(△Ct)；若△Ct≤临界值为甲基化样本，若△Ct>临界值为未甲基化样本。此检测方法具有高通量和高敏感性的优点，无需在PCR后电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差；
本发明设置阳性质控品和阴性质控品。若阳性质控品检测呈阳性结果，说明检测体系没有问题，不会出现假阴性结果；若阴性质控品检测呈阴性结果，说明检测体系没有问题，不会出现假阳性结果；这样的设计使得检测严谨，有效避免漏检、错检的可能。
附图说明
图1是本发明检测方法的一种实施例的流程图；
图2是本发明NDRG4启动子区甲基化CpG位点的发现、验证与检测流程；
图3是本发明NDRG4启动子区序列(2000bp)的CpG岛预测图；
图4是本发明NDRG4基因启动子区5个扩增子的位置示意图；
图5为本发明NDRG4基因启动子区不同引物探针组合对比扩增曲线；
图6为本发明NDRG4基因甲基化检测体系灵敏度扩增曲线；
图7为本发明NDRG4基因甲基化阳性样本扩增曲线；
图8为本发明NDRG4基因甲基化阴性样本扩增曲线。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
实验一，NDRG4启动子区甲基化CpG岛的发现
NDRG4启动子区甲基化CpG岛的发现过程如图2所示。
1.样本收集
收集了191例经肠镜病理确定的不同病程的临床样本，包括50例结直肠癌组织样本与49例配对的临近正常组织，46例进展期腺瘤组织样本与46例配对的临近正常组织；样本信息如表1所示。
表1组织样本分类：
2.样本提取
采用TaKaRa MiniBEST FFPE DNA Extraction Kit(货号：9782)从FFPE样本中提取基因组DNA。具体步骤如下：
(1)用灭菌手术刀刮取30mg的石蜡切片组织，尽量去除多余的石蜡。
(2)将石蜡切片组织放入1.5mL的离心管中，加入500μL Buffer DP，混匀后于80℃水浴1分钟，趁热涡旋震荡10秒，加入180μLBuffer GL，涡旋震荡。
(3)然后12000rpm室温离心1分钟，溶液形成两层(上层油相，下层水相)，向下层水相中加入20μL Proteinase K(20mg/mL)和10μL RNase(10mg/mL)，吸打混匀。注意不要破坏分层，然后56℃水浴1小时。
(4)将步骤(3)处理后的样品90℃水浴30分钟，冷却至室温。
(5)向步骤(4)处理的样品加入200μL Buffer GB和200μL 100％乙醇，涡旋震荡10秒。
(6)然后12000rpm室温离心1分钟，溶液形成2层(上层油相，下层水相)。
(7)将Spin Column安置于Collection Tube上，将步骤(6)样品的下层水相溶液移至Spin Column中。注意不要取到上层油相溶液，然后12000rpm室温离心2分钟，弃滤液。
(8)将500μL的Buffer WA加至Spin Column中，12000rpm室温离心1分钟，弃滤液。
(9)将500μL的Buffer WB加至Spin Column中，12000rpm室温离心1分钟，弃滤液。
(10)重复步骤(9)。
(11)将Spin Column安置于Collection Tube上，12000rpm室温离心2分钟。
(12)将Spin Column安置于新的1.5mL离心管上，在Spin Column膜的中央处加入50-100μL灭菌水或者Elution Buffer，室温静置5分钟。
(13)12000rpm室温离心2分钟，洗脱DNA。
(14)将离心得到的DNA溶液用Nanodrop检测浓度及纯度。
(15)将检测合格的DNA保存于-20℃冰箱，备用。
3.NDRG4启动子区预测及引物设计
(1)NDRG4基因启动区CpG岛的预测
下载NDRG4基因转录起始位点前2000bp的DNA序列，见序列20。用MethPrimer软件预测CpG岛，预测结果如附图2。由附图2可见，CpG岛集中在转录起始位点前879bp的序列。
(2)转录起始位点前1000bp序列扩增的引物设计
针对1000bp的DNA序列设计5对引物。扩增子序列及引物见序列17-32。扩增子相对位置如附图3。将5对引物等浓度(2μM)混合，配置成引物Mix，-20℃保存备用。
SEQ ID NO.17NDRG4启动子区序列(2000bp)
TTAAGTCATGCGTCTGGCACTATATTAAGCATTTTCTTTATATTCTGTTATTTAATCTTTACAGGAATCCTGAGGTCAGCATCATCCCAATTTCACAGAGTATGACATGACGTCTCAGAGAGGGTAAGCAGCTTGCCAAACATTCCACAGCCAGGAAGCTGTAGGACCAGCCTGTGCTCCTAAGGACTGGCTCCTGGCTGCTATATATAGAACTAAGCCTGGTGGAGGTGTCAGAAATAGAGGTTCACTTCTGTCATCACCGACCTCCCTCCACACCTTTGCAAAGGAGGAAACTGAGAGGCAGGGATTTCCGCAGAGCAAGGAACCCAAATTGCTGCCTCCTGTGATTTATACACTGCACCCCAAGCTGTAGGGGTAACCCAAGGACAAAGCTGTAACCCAAGCGGGAACATATGCCCCATCTGGGGCCACCAAAATCTTACCAGCTTCCTCAGCTGGTGGATCGGTTAATTCACGGCCACAGCCCCCTGGAGCTGGGGGAAAGGAAAACCAGGGCGTCTCCGCAAACCAGCCCAGAGAGAGGTCTGCGGAAGGGCCCGGAAGCCTGCAGGCCCCTCTGCACCCCCAACCCCACCGCCATCCTGGACCTCCAAGATGACCTGGTCCAACAGAGTCCTGCATGGAAAAGACTGGAACCCAGGGAGGAGCAGAGCCCCGCCCAAGGTCACCGGCCGAGCCTGAATAGAACCCGGTTCTCCAGGAGCCCTGTCTTTAGCTGTCTTGTCCAAATAAAATTTTTCAGGCCATCAGATTTCCGTACTCCCTGGAGTGGGACTTCATCTGGGACCAAAGGAGGGCTGGTGAGGGGAGTGGCAGGAGGGAGGAGTGCCTCGGGGCCCCGAGCAGGATGAGCCTGAGGAAGAGACGGGTCCCCATGTTCCCTTTCCCGCTCAGATAATGGAGGTGAATTGAGGGGAGCAGAGACCTCCCCACCTTCAGGGTGGGACCCTGAGGGACCAGGACACCTTTGCTAGGGGATGTCCCTCCTCACTCCTGCACAAGTTCCTCAAGGACACCCTCGGGCTCCGAAAACGGGGGGAGGGGGACGACGCCCCAGAGGCCCCTGAGCCCCTGGTTCTTCCCGACCCTAAGGGCTTTTCTCCCTCGGTTCCCAGGCGGCGACGGCGGGTAGCGCGAAGCAGCAGGCGCAGGGGCGCTGGGATGGGGATGTCTCTGCAGGTCTAAGGTTCCCCTTGGGAGTCTAAACAAAGACTACGGCAGCGCCGTCCCCTCCCCCGGGAACCCGACGCCGCGCGGCCACAGGGGGCCTGGAGGGGCGGGCAGGGCCTCGCAGCGCACCCAGCACAGTCCGCGCGGCGGAGCGGGTGAGAAGTCGGCGGGGGCGCGGATCGACCGGGGTGTCCCCCAGGCTCCGCGTCGCGGTCCCCGCTCGCCCTCCCGCCCGCCCACCGGGCACCCCAGCCGCGCAGAAGGCGGAAGCCACGCGCGAGGGACCGCGGTCCGTCCGGGACTAGCCCCAGGCCCGGCACCGCCCCGCGGGCCGAGCGCCCACACCCGCCAAACCCACGCGGGCACGCCCCCGCGGCGCACCGCCCCCAGCCCGGCCTCCGCCCCTGCAGCCGCGGGCACGCGGAGGGGCTCCTGGCTGCCCGCACCTGCACCCGCGCGTCGGCGGCGCCGAAGCCCCGCTCCCCGCCTGCGCGTCTGTCTCGTCCGCATCTCCGCGGTGAGTCGGCGGCGCCCTCGCCCCTGAGCCCAGGGCCAGCTTCTCTCGCCGCCGCGGCTGCTGCGCGCGTCCCCGCCCAGCCCAGCCCAGCCCCGAGCACGACCCCAGCCCCACGCACGACCCTAGCCCCGCGAGTCCCGCACCGACTCGCTCCCGCCCCATTTCGCCTCCGCGGGGGCGGCGCCCCCTCCTCCCCGCGGCTCCCGCTCTCCTTCCTCGCCTTCCCGGCCGCGCTGGGGACCCCCAGCCGCCGTCCGCGACCCCCCACCGCGACGCCCGGAGGCGGCGGGGT；
SEQ ID NO.18 Amplicon1的DNA序列(5’>3’)
AGGCCCCTGAGCCCCTGGTTCTTCCCGACCCTAAGGGCTTTTCTCCCTCGGTTCCCAGGCGGCGACGGCGGGTAGCGCGAAGCAGCAGGCGCAGGGGCGCTGGGATGGGGATGTCTCTGCAGGTCTAAGGTTCCCCTTGGGAGTCTAAACAAAGACTACGGCAGCGCCGTCCCCTCCCCCGGGAACCCGACGCCGCGCGGCCACAGGGGGCCTGGAGGG；
SEQ ID NO.19 Amplicon2的DNA序列(5’>3’)
GGATGGGGATGTCTCTGCAGGTCTAAGGTTCCCCTTGGGAGTCTAAACAAAGACTACGGCAGCGCCGTCCCCTCCCCCGGGAACCCGACGCCGCGCGGCCACAGGGGGCCTGGAGGGGCGGGCAGGGCCTCGCAGCGCACCCAGCACAGTCCGCGCGGCGGAGCGGGTGAGAAGTCGGCGGGGGCGCGGATCGACCGGGGTGTCCCCCAGGCTCCGCG；
SEQ ID NO.20 Ampicon3的DNA序列(5’>3’)
GCGGAGCGGGTGAGAAGTCGGCGGGGGCGCGGATCGACCGGGGTGTCCCCCAGGCTCCGCGTCGCGGTCCCCGCTCGCCCTCCCGCCCGCCCACCGGGCACCCCAGCCGCGCAGAAGGCGGAAGCCACGCGCGAGGGACCGCGGTCCGTCCGGGACTAGCCCCAGGCCCGGCACCGCCCCGCGGGCCGAGCGCCCACACCCGCCAAACCCACGCGGGCACGCCCCCGCGGCGCACCGCCCCCAGCCCGGCCTCCGCCCCTGCAGCCGCGGGCACGCGGAGGGGCTCCTGGCTGCCCG；
SEQ ID NO.21 Amplicon4的DNA序列(5’>3’)
GTCCGTCCGGGACTAGCCCCAGGCCCGGCACCGCCCCGCGGGCCGAGCGCCCACACCCGCCAAACCCACGCGGGCACGCCCCCGCGGCGCACCGCCCCCAGCCCGGCCTCCGCCCCTGCAGCCGCGGGCACGCGGAGGGGCTCCTGGCTGCCCGCACCTGCACCCGCGCGTCGGCGGCGCCGAAGCCCCGCTCCCCGCCTGCG；
SEQ ID NO.22 Amplicon5的DNA序列(5’>3’)
GCGGCGCCCTCGCCCCTGAGCCCAGGGCCAGCTTCTCTCGCCGCCGCGGCTGCTGCGCGCGTCCCCGCCCAGCCCAGCCCAGCCCCGAGCACGACCCCAGCCCCACGCACGACCCTAGCCCCGCGAGTCCCGCACCGACTCGCTCCCGCCCCATTTCGCCTCCGCGGGGGCGGCGCCCCCTCCTCCCCGCGGCTCCCGCTCTCCTTCCTCGCCTTCCCGGCCGCGCTGGGGACCCCCAGCCGCCG；
SEQ ID NO.23扩增子1正向引物(5’>3’)
AGGTTTTTGAGTTTTTGGTTTTTTT；
SEQ ID NO.24扩增子1反向引物(5’>3’)
CCCTCCAAACCCCCTATAAC；
SEQ ID NO.25扩增子2正向引物(5’>3’)
GGATGGGGATGTTTTTGTAG；
SEQ ID NO.26扩增子2反向引物(5’>3’)
RGRGAAACCTAAAAAACACC；
SEQ ID NO.27扩增子3正向引物(5’>3’)
GYGGAGYGGGTGAGAAGT；
SEQ ID NO.28扩增子3反向引物(5’>3’)
CRAACAACCAAAAACCCCTC；
SEQ ID NO.29扩增子4正向引物(5’>3’)
GTTYGTTYGGGATTAGTTTTAGG；
SEQ ID NO.30扩增子4反向引物(5’>3’)
CRCAAACRAAAAACRAAAC；
SEQ ID NO.31扩增子5正向引物(5’>3’)
GYGGYGTTTTYGTTTTTG；
SEQ ID NO.32扩增子5反向引物(5’>3’)
CRACRACTAAAAATCCCCAA。
4.亚硫酸氢盐处理；
(1)将提取的基因组DNA从冰箱取出解冻，稀释DNA浓度至20ng/μL。取40μL稀释后的DNA溶液加入到1.5mL离心管中，然后加入4μL 3M的NaOH溶液，42℃孵育20min。
(2)加入400μL转化液，混匀，50℃避光孵育16小时。
(3)加入550μL柱结合液，混匀，然后将溶液转移至DNA纯化柱，13000rpm离心90秒，弃废液后，再次离心3分钟，弃废液。
(4)加入600μL 90％乙醇至DNA纯化柱，13000rpm离心90秒，弃废液后，再次离心15秒。
(5)加入300μL脱硫液(0.3M NaOH的90％乙醇溶液)，常温放置30分钟，13000rpm离心90秒，弃废液。
(6)加入600μL 90％乙醇，13000rpm离心90秒，弃废液，重复此步骤1次，再次离心3分钟。
(7)将DNA纯化柱放入新的1.5mL离心管中，加入40μL洗脱液，50℃孵育30分钟，13000rpm离心90秒，得转化后的DNA溶液，于-20℃保存备用。
5.文库制备与上机测序
(1)多重PCR扩增
按照如下体系和反应条件进行PCR扩增。多重PCR反应采用QIAGEN Multiplex PCRKit(货号：206143)进行。具体步骤如下：
a)将2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix、引物Mix从-20℃取出，室温解冻。准备好亚硫酸氢盐处理后的DNA、RNase-free Water。使用前，将2×QIAGEN Multiplex PCRMaster Mix和引物Mix旋涡混匀。
b)按如下体系配制Master Mix，旋涡短暂混匀。
序号 组分 体积(μL)/反应 终浓度
1 2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix 25 1×
2 10×primer mix(2μM each) 5 0.2μM
3 RNase-free Water 10
4 亚硫酸氢盐处理后的DNA 10
总体积 50
c)向每个PCR管中加入40μL Master Mix，然后加入10μL亚硫酸氢盐处理后的DNA。
d)旋涡混匀PCR管，然后按照如下条件进行PCR扩增。
e)电泳检测PCR产物
配制1％的琼脂糖凝胶电泳，将5μL的PCR产物与2μL 6×Loading Buffer(厂家：TaKaRa，货号：9156)混合，上样进行电泳检测，DNA marker为DL2000DNA Marker(厂家：TaKaRa，货号：3427Q)，120V电泳40分钟。
如电泳检测有非特异性扩增，需将剩余45μL的PCR产物电泳后切胶回收(厂家：QIAGEN，货号：28704)，具体操作按试剂盒说明书进行。
(2)PCR产物纯化与定量
a)采用QIAGEN的MinElute PCR Purification Kit进行PCR产物纯化(货号：28004)，按照试剂盒说明书进行。
b)采用QubitTMdsDNA BR Assay Kit试剂盒(货号：Q32850)进行纯化后产物的定量。
(3)接头连接
a)采用NEB的Quick Ligation Module(货号：E6056L)进行接头连接。
按照如下体系配制Master Mix。
序号 组分 体积(μL)/反应
1 NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer(5×) 10
2 Adapter 5
3 Quick T4DNA Ligase 5
4 RNase-free Water 10
5 纯化后的PCR产物 20
总体积 50
b)将PCR管旋涡混匀，短暂离心后，按照如下条件进行PCR反应。
步骤 温度 时间 循环数
Step1 20℃ 15min 1
Step2 4℃ Hold 1
(4)连接产物纯化
提前将Agencourt AMPure XP beads(厂家：BECKMAN COULTER，货号：A63882)从4℃冰箱放置到室温平衡。
a)将PCR管于280g 20℃离心1分钟，使连接产物收集到管底。
b)将移液器量程调至50μL，将连接产物全部转移到新的96孔板中。
c)将AMPure XP磁珠旋涡混匀30秒，确保磁珠均匀分散。
d)向96孔板的每个样本孔中加入56μL AMPure XP磁珠。
e)用移液器轻轻吹打10次，混匀。
f)室温静止孵育5分钟。
g)将96孔板放置到96孔磁力板上，静止2分钟，直至上清液澄清。
h)保持96孔板放置在96孔磁力板上，用移液器移去上清液。
i)保持96孔板放置在96孔磁力板上，加入200μL新鲜配置的80％乙醇到每个样本孔中，孵育30秒，然后小心移去上清(第一次洗涤)。
j)保持96孔板放置在96孔磁力板上，加入200μL新鲜配置的80％乙醇到每个样本孔中，孵育30秒，然后小心移去上清，用带有小枪头的移液器(10μL)移去剩余的乙醇(第二次洗涤)。
k)保持96孔板在磁力板上，让磁珠自然干燥10分钟。
l)将96孔板从磁力板上移走，加27.5μL的10mM Tris(pH 8.5)到每个样本孔中。
用移液器轻轻吹打10次，直到磁珠完全混匀。然后室温静止孵育2分钟。
m)将96孔板放在磁力板上，静止2分钟，直到上清液澄清。
n)用移液器小心吸取25μL上清液到新的PCR管中，-20℃保存备用。
(5)PCR扩增
a)采用NEB的UltraTMIIMaster Mix(货号：M0544)进行PCR扩增。按照如下体系配制PCR反应Mix，然后加入5μL纯化后的连接产物。
b)将PCR管旋涡混匀，短暂离心后，按照如下条件进行PCR扩增。
(6)PCR产物纯化
与步骤5同，在此不再赘述。
(7)文库质控；
采用QubitTMdsDNA BR Assay Kit试剂盒(货号：Q32850)进行文库定量检测，Agilent 2100 Bioanalyzer Instruments进行文库片段大小检测。
(8)文库合并与上机测序
将文库等摩尔浓度混合后，上机测序；采用Illumina HiSeq2500进行测序，读长PE125。
6.数据分析与处理
按照Index对数据进行拆分，采用SHRiMP V2.04进行reads比对，根据比对结果分析存在的甲基化CpG位点。发现有39个CpG位点在结直肠癌组织样本与临近正常组织样本、进展期腺瘤组织样本与临近正常组织样本中的甲基化频率存在显著差异(P<0.05)。由此推断，该甲基化序列可以用于早期结直肠癌的辅助诊断。
结直肠癌组织样本、进展期腺瘤组织样本和临近正常组织样本中NDRG4启动子区甲基化频率见表2，甲基化频率指CpG岛甲基化的样本数/样本总数。
表2-1结直肠癌组织样本与临近正常组织样本中不同CpG位点的甲基化频率：
表2-2进展期腺瘤组织样本与临近正常组织样本中不同CpG位点的甲基化频率：
由上表得出：
NDRG4基因的甲基化序列如下：
TGAGAAGTmCGGmCGGGGGmCGmCGGATmCGACmCGGGGTGTCCCCCAGGCTCmCGmCGTmCGmCGGTCCCmCGCTmCGCCCTCCmCGCCmCGCCCACmCGGGCACCCCAGCmCGmCGCAGAAGGmCGGAAGCCAmCGmCGmCGAGGGACmCGmCGGTCmCGTCmCGGGACTAGCCCCAGGCCmCGGCACmCGCCCmCGmCGGGCmCGAGmCGCCCACACCmCGCCAAACCCAmCGmCGGGCAmCGCCCCmCGmCGGmCGCACmCGCCCCCAGCC
备注：mCG表示CpG岛的C发生了甲基化修饰。
在正常组织中，该段序列的CpG岛没有发生甲基化修饰，其序列如下：
TGAGAAGTCGGCGGGGGCGCGGATCGACCGGGGTGTCCCCCAGGCTCCGCGTCGCGGTCCCCGCTCGCCCTCCCGCCCGCCCACCGGGCACCCCAGCCGCGCAGAAGGCGGAAGCCACGCGCGAGGGACCGCGGTCCGTCCGGGACTAGCCCCAGGCCCGGCACCGCCCCGCGGGCCGAGCGCCCACACCCGCCAAACCCACGCGGGCACGCCCCCGCGGCGCACCGCCCCCAGCC
提示，甲基化CpG位点可能是一种早期结直肠癌辅助诊断的分子标志物；于是，对这39个甲基化位点所在序列设计MSP引物与探针，进行qPCR验证与测试。
实验二、组织样本中NDRG4启动子区甲基化CpG甲基化位点的qPCR验证
针对NDRG4基因的甲基化CpG位点设计4对MSP(Methylation-Specific PCR)引物和探针。对实验一中的组织样本进行qPCR验证，以B2M基因作为内参基因，比较在不同临界值下、不同引物和探针检测结直肠癌和进展期腺瘤组织样本。
1.组织样本中DNA提取
采用TaKaRa MiniBEST FFPE DNA Extraction Kit(货号：9782)从FFPE样本中提取基因组DNA。具体步骤如下：
(1)用灭菌手术刀刮取30mg的石蜡切片组织，尽量去除多余的石蜡。
(2)将石蜡切片组织放入1.5mL的离心管中，加入500μL Buffer DP，混匀后于80℃水浴1分钟，趁热涡旋震荡10秒，加入180μLBuffer GL，涡旋震荡。
(3)然后12000rpm室温离心1分钟，溶液形成两层(上层油相，下层水相)，向下层水相中加入20μL Proteinase K(20mg/mL)和10μL RNase(10mg/mL)，吸打混匀。注意不要破坏分层，然后56℃水浴1小时。
(4)将步骤(3)处理后的样品90℃水浴30分钟，冷却至室温。
(5)向步骤(4)处理的样品加入200μL Buffer GB和200μL 100％乙醇，涡旋震荡10秒。
(6)然后12000rpm室温离心1分钟，溶液形成2层(上层油相，下层水相)。
(7)将Spin Column安置于Collection Tube上，将步骤(6)样品的下层水相溶液移至Spin Column中。注意不要取到上层油相溶液，然后12000rpm室温离心2分钟，弃滤液。
(8)将500μL的Buffer WA加至Spin Column中，12000rpm室温离心1分钟，弃滤液。
(9)将500μL的Buffer WB加至Spin Column中，12000rpm室温离心1分钟，弃滤液。
(10)重复步骤(9)。
(11)将Spin Column安置于Collection Tube上，12000rpm室温离心2分钟。
(12)将Spin Column安置于新的1.5mL离心管上，在Spin Column膜的中央处加入50-100μL灭菌水或者Elution Buffer，室温静置5分钟。
(13)12000rpm室温离心2分钟，洗脱DNA。
(14)将离心得到的DNA溶液用Nanodrop检测浓度及纯度。
(15)将检测合格的DNA保存于-20℃冰箱，备用。
2.亚硫酸氢盐处理
(1)将提取的基因组DNA从冰箱取出解冻，稀释DNA浓度至20ng/μL。取40μL稀释后的DNA溶液加入到1.5mL离心管中，然后加入4μL 3M的NaOH溶液，42℃孵育20min。
(2)加入400μL转化液，混匀，50℃避光孵育16小时。
(3)加入550μL柱结合液，混匀，然后将溶液转移至DNA纯化柱，13000rpm离心90秒，弃废液后，再次离心3分钟，弃废液。
(4)加入600μL 90％乙醇至DNA纯化柱，13000rpm离心90秒，弃废液后，再次离心15秒。
(5)加入300μL脱硫液(0.3M NaOH的90％乙醇溶液)，常温放置30分钟，13000rpm离心90秒，弃废液。
(6)加入600μL 90％乙醇，13000rpm离心90秒，弃废液，重复此步骤1次，再次离心3分钟。
(7)将DNA纯化柱放入新的1.5mL离心管中，加入40μL洗脱液，50℃孵育30分钟，13000rpm离心90秒，得转化后的DNA溶液，于-20℃保存备用。
3.qPCR反应
(1)按下表配制qPCR反应液
序号 组分 体积/浓度
1 10×PCR缓冲液 5～10μL
2 MgCl<sub>2</sub> 2.0～5.0mmol
3 dNTP 0.2～0.8mmol
4 各条引物 0.1～1.0μmol
5 各条探针 0.1～1.0μmol
6 Fast master Premix 5～10μL
7 样品DNA模板 2μL
8 超纯水 补足20μL
(2)按下表设置qPCR反应程序，然后进行qPCR反应。
备注：第三阶段:30个循环中58℃时，收集荧光信号。
收集荧光信号，选择对应荧光基团的荧光检测模式，自动设置基线，手动设置阈值线，根据实际情况调节阈值线至FAM和JOE扩增曲线升起的拐点处，且目标基因FAM信号的阈值线需超过正常阴性对照的最高点处设定阈值线。
4.qPCR结果分析
数据处理：自动设置基线，手动设置阈值线值线，所述阈值值线为刚好超过正常阴性对照的最高点的值，根据实际情况调节Threshold至FAM和JOE扩增曲线升起的拐点处，得到Ct值，计算△Ct值。
结果判定：首先内部质控B2M基因对应的JOE有明显的扩增曲线且JOE信号的Ct值小于25，则符合要求；阳性质控体系的目标基因NDRG4对应的FAM信号有明显的扩增曲线，内部质控B2M基因对应的JOE有明显的扩增曲线的Ct值的差值，即△Ct≤临界值，则符合要求，检测结果正确。
阴性质控体系的FAM无扩增曲线，JOE有明显的扩增曲线且JOE信号的Ct值的差值，即△Ct＞临界值，则符合要求，检测结果正确。
样本判定：△Ct＝NDRG4目标基因FAM信号的Ct值-B2M内参基因JOE信号的Ct值，若△Ct≤临界值为发生甲基化样本；△Ct＞临界值为未发生甲基化样本。
以△Ct值为检验变量，病理结果为状态变量，用ROC曲线对△Ct值进行分析，综合三种组合检测结果，使用临界值对应的△Ct值为9分析甲基化水平与结直肠癌及进展期腺瘤相关性的性能结果分析见表3，通过对比，引物探针组合1的性能指标较优。
表3组织样本临界值为9时检测结直肠癌和进展期腺瘤的灵敏度与特异性
实验三，粪便样本中NDRG4启动子区甲基化CpG岛的qPCR测试；
人体生物样本包括：组织、细胞、血液、分泌物和排泄物，其中排泄物包括粪便。粪便样本作为一种优选，基于无侵入性和低廉方便考虑，优选粪便样本。为了验证粪便样本能够精确的实现结直肠癌早期检测，进行了如下测试。
用实验二的粪便样本和四对引物和探针进行qPCR测试，以B2M基因作为内参基因，比较在不同的临界值下检测的性能。
1.粪便样本的DNA提取
50例结直肠癌病人、46例进展期腺瘤病人和30例健康人的信息见表4、表5。
表4结直肠癌样本与临近正常组织样本、进展期腺瘤样本与临近正常组织样本信息
表5 30例健康人信息
根据如下步骤进行提取：
(1)取粪便样本(4-6g)加入裂解液40mL，涡旋振荡，充分混匀后50℃孵育16小时。
(2)孵育结束后5000rpm离心10min，离心前注意称重平衡，离心结束后，小心地取出离心管，勿剧烈晃动。
(3)移取9mL上清液于新的50mL离心管中，再分别加入1mL提取辅佐液、60μL磁珠液和10mL异丙醇，旋涡振荡10sec，65℃孵育20min，孵育期间每隔5min上下颠倒混匀一次。
(4)孵育结束后，将50mL离心管放在磁力架上，静置3min，待磁珠充分吸附在管壁上，弃废液。
(5)将离心管从磁力架中取出，加入12mL洗涤液，涡旋振荡直至磁珠从管壁上脱落，静置3min，再次放入磁力架中，静置3min，待磁珠充分吸附在管壁上，弃废液。
(6)加15mL80％乙醇溶液，涡旋振荡直至磁珠从管壁上脱落，静置3min，再放入磁力架中，静置3min，待磁珠充分吸附在管壁上，弃废液。
(7)重复上一步骤1次。
(8)用移液器吸尽底部残余液体，开盖，将离心管65℃中孵育5min，待磁珠干燥后取出，加入1.5mL预热的洗脱液I，用1000μL移液器将磁珠从管壁上吹洗下来，反复抽吸，连同磁珠一起转移至2mL离心管中，闭合离心管盖65℃孵育5min。
(9)13000rpm离心3min，移取600μL上清液至新的1.5mL离心管，加入600μL柱结合液，充分混匀。
(10)转移600μL混合液至DNA纯化柱中，13000rpm离心1min，弃废液。
(11)将剩余混合液重复上一步操作，再次13000rpm离心2min。
(12)向DNA纯化柱中加入600μL的90％乙醇溶液，13000rpm离心1min，弃废液。
(13)重复上一步骤2次。
(14)13000rpm离心3min，将DNA纯化柱放入新的1.5mL离心管，打开离心管盖65℃孵育5min，烘干。
(15)向DNA纯化柱中间位置悬空滴加100μL预热的洗脱液II，闭合盖子65℃孵育5min，13000rpm离心2min，得洗脱后的DNA溶液，2～8℃保存备用，若长期保存需保存在-25～-15℃。
2.亚硫酸氢盐处理
(1)将提取的基因组DNA从冰箱取出解冻，稀释DNA浓度至20ng/μL。取40μL稀释后的DNA溶液加入到1.5mL离心管中，然后加入4μL 3M的NaOH溶液，42℃孵育20min。
(2)加入400μL转化液，混匀，50℃避光孵育16小时。
(3)加入550μL柱结合液，混匀，然后将溶液转移至DNA纯化柱，13000rpm离心90秒，弃废液后，再次离心3分钟，弃废液。
(4)加入600μL 90％乙醇至DNA纯化柱，13000rpm离心90秒，弃废液后，再次离心15秒。
(5)加入300μL脱硫液(0.3M NaOH的90％乙醇溶液)，常温放置30分钟，13000rpm离心90秒，弃废液。
(6)加入600μL 90％乙醇，13000rpm离心90秒，弃废液，重复此步骤1次，再次离心3分钟。
(7)将DNA纯化柱放入新的1.5mL离心管中，加入40μL洗脱液，50℃孵育30分钟，13000rpm离心90秒，得转化后的DNA溶液，于-20℃保存备用。
3.qPCR反应
(1)按下表配制qPCR反应液
(2)按下表设置qPCR反应程序，然后进行qPCR反应。
备注：第三阶段:30个循环中58℃时，收集荧光信号。
收集荧光信号，选择对应荧光基团的荧光检测模式，自动设置基线，手动设置阈值线，根据实际情况调节阈值线至FAM和JOE扩增曲线升起的拐点处，且目标基因FAM信号的阈值线需超过正常阴性对照的最高点处设定阈值线。
4.qPCR结果分析
数据处理：自动设置基线，手动设置阈值线值线，所述阈值值线为刚好超过正常阴性对照的最高点的值，根据实际情况调节Threshold至FAM和JOE扩增曲线升起的拐点处，得到Ct值，计算△Ct值。
结果判定：首先内部质控B2M基因对应的JOE有明显的扩增曲线且JOE信号的Ct值小于25，则符合要求；阳性质控体系的目标基因NDRG4对应的FAM信号有明显的扩增曲线，内部质控B2M基因对应的JOE有明显的扩增曲线的Ct值的差值，即△Ct≤临界值，则符合要求，检测结果正确。
阴性质控体系的FAM无扩增曲线，JOE有明显的扩增曲线且JOE信号的Ct值的差值，即△Ct＞临界值，则符合要求，检测结果正确。
样本判定：△Ct＝NDRG4目标基因FAM信号的Ct值-B2M内参基因JOE信号的Ct值，若△Ct≤临界值为发生甲基化样本；△Ct＞临界值为未发生甲基化样本。
以△Ct值为检验变量，病理结果为状态变量，用ROC曲线对△Ct值进行分析，综合三种组合检测结果，使用临界值对应的△Ct值为9分析甲基化水平与结直肠癌及进展期腺瘤相关性的性能结果分析见表6，通过对比，引物探针组合1的性能指标较优。
表6粪便样本临界值为9时检测结直肠癌与进展期腺瘤的灵敏度与特异性
备注：
引物探针组合1：正向引物SEQ ID NO.2+反向引物SEQ ID NO.5+探针SEQ ID NO.8
引物探针组合2：正向引物SEQ ID NO.3+反向引物SEQ ID NO.6+探针SEQ ID NO.9
引物探针组合3：正向引物SEQ ID NO.4+反向引物SEQ ID NO.7+探针SEQ IDNO.10
灵敏度为甲基化检测阳性(真阳性)的样本/总的阳性样本。特异性为甲基化检测阴性(真阴性)的样本/总的阴性样本。
普通人每天数以百万计的细胞从结肠壁脱落进入到排泄系统，包括肠道肿瘤形成过程中的细胞。进入排泄系统后的细胞中含有相应的DNA，其中含有和肿瘤密切相关的遗传信息，反映结直肠癌或肿瘤的形成过程。早期肠癌细胞中有些基因发生甲基化转变，是肠癌的预兆，这些细胞会自然脱落到肠道中，与粪便一起排出。通过检测这些DNA标记物，就可以发现结直肠癌或肿瘤等在肠壁的存在。因此，从粪便中提取DNA进行肿瘤相关基因检测，可以实现非侵入性、无创无痛、方便家中采样，无需前往医院，无需饮食或用药限制。
由上文的三个实施例可以得出检测NDRG4基因甲基化位点的产品在制备结直肠癌早期检测的产品的用途，NDRG4基因的甲基化序列如下：
TGAGAAGTmCGGmCGGGGGmCGmCGGATmCGACmCGGGGTGTCCCCCAGGCTCmCGmCGTmCGmCGGTCCCmCGCTmCGCCCTCCmCGCCmCGCCCACmCGGGCACCCCAGCmCGmCGCAGAAGGmCGGAAGCCAmCGmCGmCGAGGGACmCGmCGGTCmCGTCmCGGGACTAGCCCCAGGCCmCGGCACmCGCCCmCGmCGGGCmCGAGmCGCCCACACCmCGCCAAACCCAmCGmCGGGCAmCGCCCCmCGmCGGmCGCACmCGCCCCCAGCC
mCG表示CpG岛的C发生了甲基化修饰；
使用方法包括如下步骤：
步骤一，从生物样本中提取基因组DNA；
人体生物样本包括：组织、细胞、血液、分泌物和排泄物。
实施例一、采用TaKaRa MiniBEST FFPE DNA Extraction Kit从FFPE样本中提取基因组DNA
具体步骤如下：
用灭菌手术刀刮取30mg的石蜡切片组织，去除多余的石蜡；
将石蜡切片组织放入1.5mL的离心管中，加入500μL Buffer DP，混匀后于80℃水浴1分钟，趁热涡旋震荡10秒，加入180μLBuffer GL，涡旋震荡；
然后12000rpm室温离心1分钟，溶液形成两层，上层油相，下层水相，向下层水相中加入20μL Proteinase K，20mg/mL和10μL RNase，10mg/mL，吸打混匀，然后56℃水浴1小时，将处理后的样品90℃水浴30分钟，冷却至室温；
将处理的样品加入200μL Buffer GB和200μL 100％乙醇，涡旋震荡10秒。
然后12000rpm室温离心1分钟，溶液形成两层，上层油相，下层水相；
将Spin Column安置于Collection Tube上，将样品的下层水相溶液移至SpinColumn中，然后12000rpm室温离心2分钟，弃滤液。
将500μL的Buffer WA加至Spin Column中，12000rpm室温离心1分钟，弃滤液；
将500μL的Buffer WB加至Spin Column中，12000rpm室温离心1分钟，弃滤液；
重复上一步，将500μL的Buffer WB加至Spin Column中，12000rpm室温离心1分钟，弃滤液。
将Spin Column安置于Collection Tube上，12000rpm室温离心2分钟；
将Spin Column安置于新的1.5mL离心管上，在Spin Column膜的中央处加入50-100μL灭菌水或者Elution Buffer，室温静置5分钟；
12000rpm室温离心2分钟，洗脱DNA；
将离心得到的DNA溶液用Nanodrop检测浓度及纯度；
将检测合格的DNA保存于-20℃冰箱，备用。
实施例二、从粪便样本中提取基因组DNA
取粪便样本(4-6g)加入裂解液40mL，涡旋振荡，充分混匀后50℃孵育16小时；
孵育结束后5000rpm离心10min，离心前注意称重平衡，离心结束后，小心地取出离心管，勿剧烈晃动；
移取9mL上清液于新的50mL离心管中，再分别加入1mL提取辅佐液、60μL磁珠液和10mL异丙醇，旋涡振荡10秒，65℃孵育20min，孵育期间每隔5min上下颠倒混匀一次；
孵育结束后，将50mL离心管放在磁力架上，静置3min，待磁珠充分吸附在管壁上，弃废液；
将离心管从磁力架中取出，加入12mL洗涤液，涡旋振荡直至磁珠从管壁上脱落，静置3min，再次放入磁力架中，静置3min，待磁珠充分吸附在管壁上，弃废液；
加15mL 80％乙醇溶液，涡旋振荡直至磁珠从管壁上脱落，静置3min，再放入磁力架中，静置3min，待磁珠充分吸附在管壁上，弃废液；
加15mL 80％乙醇溶液，涡旋振荡直至磁珠从管壁上脱落，静置3min，再放入磁力架中，静置3min，待磁珠充分吸附在管壁上，弃废液；
用移液器吸尽底部残余液体，开盖，将离心管65℃中孵育5min，待磁珠干燥后取出，加入1.5mL预热的洗脱液I，用1000μL移液器将磁珠从管壁上吹洗下来，反复抽吸，连同磁珠一起转移至2mL离心管中，闭合离心管盖65℃孵育5min；
13000rpm离心3min，移取600μL上清液至新的1.5mL离心管，加入600μL柱结合液，充分混匀；
转移600μL混合液至DNA纯化柱中，13000rpm离心1min，弃废液；
将剩余混合液重复上一步骤。再次13000rpm离心2min；
向DNA纯化柱中加入600μL的90％乙醇溶液，13000rpm离心1min，弃废液；
向DNA纯化柱中加入600μL的90％乙醇溶液，13000rpm离心1min，弃废液；
向DNA纯化柱中加入600μL的90％乙醇溶液，13000rpm离心1min，弃废液；
13000rpm离心3min，将DNA纯化柱放入新的1.5mL离心管，打开离心管盖65℃孵育5min，烘干；
向DNA纯化柱中间位置悬空滴加100μL预热的洗脱液II，闭合盖子65℃孵育5min，13000rpm离心2min，得洗脱后的DNA溶液，2～8℃保存备用，若长期保存需保存在-25～-15℃。
步骤二，设计NDRG4基因的甲基化序列的引物和探针；
NDRG4引物包括：NDRG4正向引物，NDRG4反向引物；
NDRG4正向引物包括：
TAGTCGCGTAGAAGGCGGAA(SEQ ID NO.2)
GCGTAGAAGGCGGAAGTTAC(SEQ ID NO.3)
GCGGTTCGTTCGGGATTAG(SEQ ID NO.4)
NDRG4反向引物包括：
CGCGAAACGATACCGAACCT(SEQ ID NO.5)
GCGAAACGATACCGAACCTA(SEQ ID NO.6)
ACCCGCGTAAATTTAACGAATA(SEQ ID NO.7)
NDRG4探针包括：
CGAACCGCGATCCCTCGCGCG(SEQ ID NO.8)
CGAACCGCGATCCCTCGCGC(SEQ ID NO.9)
ACGCTCGACCCGCGAAACGA(SEQ ID NO.10)
步骤三，将提取的基因组DNA经过转化液处理，得到的序列如下所示：
SEQ ID NO.1:TGAGAAGTCGGCGGGGGCGCGGATCGATCGGGGTGTTTTTTAGGTTTCGCGTCGCGGTTTTCGTTCGTTTTTTCGTTCGTTTATCGGGTATTTTAGTCGCGTAGAAGGCGGAAGTTACGCGCGAGGGATCGCGGTTCGTTCGGGATTAGTTTTAGGTTCGGTATCGTTTCGCGGGTCGAGCGTTTATATTCGTTAAATTTACGCGGGTACGTTTTCGCGGCGTATCGTTTTTAGTT；
具体包括如下步骤：
将提取的基因组DNA从冰箱取出解冻，稀释DNA浓度至20ng/μL。取40μL稀释后的DNA溶液加入到1.5mL离心管中，然后加入4μL 3M的NaOH溶液，42℃孵育20min。
加入400μL亚硫酸氢盐转化液，混匀，50℃避光孵育16小时。
加入550μL柱结合液，混匀，然后将溶液转移至DNA纯化柱，13000rpm离心90秒，弃废液后，再次离心3分钟，弃废液。
加入600μL 90％乙醇至DNA纯化柱，13000rpm离心90秒，弃废液后，再次离心15秒。
加入300μL脱硫液(0.3M NaOH的90％乙醇溶液)，常温放置30分钟，13000rpm离心90秒，弃废液。
加入600μL 90％乙醇，13000rpm离心90秒，弃废液，重复此步骤1次，再次离心3分钟。
将DNA纯化柱放入新的1.5mL离心管中，加入40μL洗脱液，50℃孵育30分钟，13000rpm离心90秒，得转化后的DNA溶液，于-20℃保存备用。
步骤四，将转化液处理后的DNA进行定量PCR检测；
(1)按下表配制qPCR反应液
序号 组分 体积/浓度
1 10×PCR缓冲液 5～10μL
2 MgCl<sub>2</sub> 2.0～5.0mmol
3 dNTP 0.2～0.8mmol
4 各条引物 0.1～1.0μmol
5 各条探针 0.1～1.0μmol
6 Fast master Premix 5～10μL
7 样品DNA模板 2μL
8 超纯水 补足20μL
(2)按下表设置qPCR反应程序，然后进行qPCR反应。
备注：第三阶段:30个循环中58℃时，收集荧光信号。
收集荧光信号，选择对应荧光基团的荧光检测模式，自动设置基线，手动设置阈值线，根据实际情况调节阈值线至FAM和JOE扩增曲线升起的拐点处，且目标基因FAM信号的阈值线需超过正常阴性对照的最高点处设定阈值线。
(3)qPCR结果分析
数据处理：自动设置基线，手动设置阈值线值线，所述阈值值线为刚好超过正常阴性对照的最高点的值，根据实际情况调节Threshold至FAM和JOE扩增曲线升起的拐点处，得到Ct值，计算△Ct值。
步骤五，计算目标基因NDRG4与内参基因B2M的扩增Ct值的差值；
计算公式：△Ct＝CtNDRG4-CtB2M，△Ct≤9，则判定样本发生甲基化，判断为结直肠癌早期诊断阳性；若△Ct＞9，则判定样本未发生甲基化，判断为结直肠癌早期诊断阴性；作为一种实施例，可以采用ABI7500实时荧光定量PCR仪，得出待测样品的荧光定量PCR扩增曲线，从图中可以看出Ct值。
本发明通过检测NDRG4基因启动子区的一段甲基化序列是否发生甲基化，辅助诊断早期结直肠癌，诊断精度高；本发明从组织、粪便样本中提取DNA；这样的检测方式无创，不会给病人带来痛苦；本发明设计的引物和探针能与待测位点互补，具有高灵敏度和高特异性；本发明的检测方法用亚硫酸氢盐处理DNA片段，可以实现对甲基化C的检测；本发明通过实时定量PCR测定，计算目标基因NDRG4与内参基因B2M的扩增Ct的差值，通过判断扩增Ct比差值是否在判定临界值内，判定目标基因有无发生甲基化，这样的检测具有高通量和高敏感性的优点，无需在PCR后电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.检测NDRG4基因甲基化位点的产品在制备结直肠癌早期检测的产品的用途，其特征在于，
NDRG4基因的甲基化序列如下：
TGAGAAGTmCGGmCGGGGGmCGmCGGATmCGACmCGGGGTGTCCCCCAGGCTCmCGmCGTmCGmCGGTCCCmCGCTmCGCCCTCCmCGCCmCGCCCACmCGGGCACCCCAGCmCGmCGCAGAAGGmCGGAAGCCAmCGmCGmCGAGGGACmCGmCGGTCmCGTCmCGGGACTAGCCCCAGGCCmCGGCACmCGCCCmCGmCGGGCmCGAGmCGCCCACACCmCGCCAAACCCAmCGmCGGGCAmCGCCCCmCGmCGGmCGCACmCGCCCCCAGCC；
mCG表示CpG岛的C发生了甲基化修饰；
使用方法包括如下步骤：
步骤一，从生物样本中提取基因组DNA；
步骤二，设计NDRG4基因甲基化序列的引物，探针，阳性质控和阴性质控；
NDRG4引物包括：NDRG4正向引物，NDRG4反向引物；
所述NDRG4正向引物包括：
SEQ ID NO.2：TAGTCGCGTAGAAGGCGGAA；
SEQ ID NO.3：GCGTAGAAGGCGGAAGTTAC；
SEQ ID NO.4：GCGGTTCGTTCGGGATTAG；
所述NDRG4反向引物包括：
SEQ ID NO.5：CGCGAAACGATACCGAACCT；
SEQ ID NO.6：GCGAAACGATACCGAACCTA；
SEQ ID NO.7：ACCCGCGTAAATTTAACGAATA；
NDRG4探针包括：
SEQ ID NO.8：CGAACCGCGATCCCTCGCGCG；
SEQ ID NO.9：CGAACCGCGATCCCTCGCGC；
SEQ ID NO.10：ACGCTCGACCCGCGAAACGA；
内部质控，以B2M基因作为内参基因，碱基序列为NCBI数据库中基因序列编号为NG_012920.1第3886到4010位，对应的序列CG以外序列中C转换成T；针对这段转换的序列设计内控引物和内控探针，并对内控的上下游引物进行筛选，使非模版体系NTC没有明显的扩增曲线，若样本有明显的扩增曲线，则判断为正常；
NDRG4的阳性质控品为含有SEQ ID NO.11的核苷酸序列；
SEQ ID NO.11：
GTTAGTTTGGTCGGGTGTTTTTAAAAATAAAGCGAGGAGGGAAGGTATAGATAGATTTTGAAAATATTCGGGTTATATACGTCGCGATTTATAGTTTTTTTTTAGCGTTGGAGTGGAGACGGCGTTCGTAGCGTTTTGCGCGGGTGAGGTTCGCGTAGTTGTTGGGGAAGAGTTTATTTGTTAGGTTGCGTTGGGTTAGCGTAGTAAGTGGGGTTGGTCGTTATTTCGTTGTATTCGGTCGCGTTTCGGGTTTCGTGCGTTTTCGTTTTAG；
NDRG4的阴性质控品为含有SEQ ID NO.12的核苷酸序列；
SEQ ID NO.12：
GTTAGTTTGGTTGGGTGTTTTTAAAAATAAAGTGAGGAGGGAAGGTATAGATAGATTTTGAAAATATTTGGGTTATATATGTTGTGATTTATAGTTTTTTTTTAGTGTTGGAGTGGAGATGGTGTTTGTAGTGTTTTGTGTGGGTGAGGTTTGTGTAGTTGTTGGGGAAGAGTTTATTTGTTAGGTTGTGTTGGGTTAGTGTAGTAAGTGGGGTTGGTTGTTATTTTGTTGTATTTGGTTGTGTTTTGGGTTTTGTGTGTTTTTGTTTTAG；
内部质控正向引物为SEQ ID NO.13：TTGTGGATTTTATTATTAYGAAATGG；
内部质控反向引物为SEQ ID NO.14：AAACTACATCTACCTTAAACCCAACC；
内部质控探针为核苷酸序列SEQ ID NO.15：GTATTTTATTTATGGTTATTTTAGAGGGT；
内部质控品含有SEQ ID NO.16：
AGAAAAGATTTGTGGATTTTATTATTACGAAATGGCGGTATTTTATTTATGGTTATTTTAGAGGGTAGGTTTTTTTAATGGGTTTGTTTGTTATGTTTAACGTTTTTGGTTGGGTTTAAGGTAGATGTAGTTTAAATTTTTATTAAAATTGTCGAG；
步骤三，将提取的基因组DNA经过转化液处理，得到的序列如下所示：
SEQ ID NO.1:TGAGAAGTCGGCGGGGGCGCGGATCGATCGGGGTGTTTTTTAGGTTTCGCGTCGCGGTTTTCGTTCGTTTTTTCGTTCGTTTATCGGGTATTTTAGTCGCGTAGAAGGCGGAAGTTACGCGCGAGGGATCGCGGTTCGTTCGGGATTAGTTTTAGGTTCGGTATCGTTTCGCGGGTCGAGCGTTTATATTCGTTAAATTTACGCGGGTACGTTTTCGCGGCGTATCGTTTTTAGTT；
步骤四，将转化液处理后的DNA进行定量PCR检测；
步骤五，先判断样本是否符合要求，若阳性质控体系的目标基因NDRG4对应的FAM信号有明显的扩增曲线，内部质控B2M基因对应的JOE有明显的扩增曲线的Ct值的差值，即△Ct≤临界值，则符合要求，检测结果正确，该样本为甲基化样本，判断为结直肠癌早期诊断阳性；
若阴性质控体系的FAM无扩增曲线，JOE有明显的扩增曲线且JOE信号的Ct值的差值，即△Ct＞临界值，则符合要求，检测结果正确，该样本为未甲基化样本，判断为结直肠癌早期诊断阴性；
所述临界值为NDRG4基因检测体系检测浓度为5ng/μL的1％比例甲基化参考品对应的△Ct值。
2.根据权利要求1所述的检测NDRG4基因甲基化位点的产品在制备结直肠癌早期检测的产品的用途，其特征在于，所述临界值为9。
3.根据权利要求1所述的检测NDRG4基因甲基化位点的产品在制备结直肠癌早期检测的产品的用途，其特征在于，
步骤一，从组织样本中提取基因组DNA：
采用TaKaRa MiniBEST FFPE DNA Extraction Kit从FFPE样本中提取基因组DNA；
具体步骤如下：
用灭菌手术刀刮取30mg的石蜡切片组织，去除多余的石蜡；
将石蜡切片组织放入1.5mL的离心管中，加入500μL Buffer DP，混匀后于80℃水浴1分钟，趁热涡旋震荡10秒，加入180μLBuffer GL，涡旋震荡；
然后12000rpm室温离心1分钟，溶液形成两层，上层油相，下层水相，向下层水相中加入20μL Proteinase K，20mg/mL和10μL RNase，10mg/mL，吸打混匀，然后56℃水浴1小时；
将处理后的样品90℃水浴30分钟，冷却至室温；
将处理的样品加入200μL Buffer GB和200μL 100％乙醇，涡旋震荡10秒；
然后12000rpm室温离心1分钟，溶液形成两层，上层油相，下层水相；
将Spin Column安置于Collection Tube上，将样品的下层水相溶液移至Spin Column中，然后12000rpm室温离心2分钟，弃滤液；
将500μL的Buffer WA加至Spin Column中，12000rpm室温离心1分钟，弃滤液；
将500μL的Buffer WB加至Spin Column中，12000rpm室温离心1分钟，弃滤液；
将500μL的Buffer WB加至Spin Column中，12000rpm室温离心1分钟，弃滤液，将500μL的Buffer WB加至Spin Column中，12000rpm室温离心1分钟，弃滤液；
将Spin Column安置于Collection Tube上，12000rpm室温离心2分钟；
将Spin Column安置于新的1.5mL离心管上，在Spin Column膜的中央处加入50-100μL灭菌水或者Elution Buffer，室温静置5分钟；
12000rpm室温离心2分钟，洗脱DNA；
将离心得到的DNA溶液用Nanodrop检测浓度及纯度；
将检测合格的DNA保存于-20℃冰箱，备用。
4.根据权利要求1所述的检测NDRG4基因甲基化位点的产品在制备结直肠癌早期检测的产品的用途，其特征在于，
步骤一，从粪便样本中提取基因组DNA的具体步骤包括如下内容；
取粪便样本4-6g加入裂解液40mL，涡旋振荡，充分混匀后50℃孵育16小时；
孵育结束后5000rpm离心10min，离心前注意称重平衡，离心结束后，小心地取出离心管，勿剧烈晃动；
移取9mL上清液于新的50mL离心管中，再分别加入1mL提取辅佐液、60μL磁珠液和10mL异丙醇，旋涡振荡10sec，65℃孵育20min，孵育期间每隔5min上下颠倒混匀一次；
孵育结束后，将50mL离心管放在磁力架上，静置3min，待磁珠充分吸附在管壁上，弃废液；
将离心管从磁力架中取出，加入12mL洗涤液，涡旋振荡直至磁珠从管壁上脱落，静置3min，再次放入磁力架中，静置3min，待磁珠充分吸附在管壁上，弃废液；
加15mL80％乙醇溶液，涡旋振荡直至磁珠从管壁上脱落，静置3min，再放入磁力架中，静置3min，待磁珠充分吸附在管壁上，弃废液；
加15mL80％乙醇溶液，涡旋振荡直至磁珠从管壁上脱落，静置3min，再放入磁力架中，静置3min，待磁珠充分吸附在管壁上，弃废液；
用移液器吸尽底部残余液体，开盖，将离心管65℃中孵育5min，待磁珠干燥后取出，加入1.5mL预热的洗脱液I，用1000μL移液器将磁珠从管壁上吹洗下来，反复抽吸，连同磁珠一起转移至2mL离心管中，闭合离心管盖65℃孵育5min；
13000rpm离心3min，移取600μL上清液至新的1.5mL离心管，加入600μL柱结合液，充分混匀；
转移600μL混合液至DNA纯化柱中，13000rpm离心1min，弃废液；
将剩余混合液重复上一步操作；再次13000rpm离心2min；
向DNA纯化柱中加入600μL的90％乙醇溶液，13000rpm离心1min，弃废液；
重复上一步骤2次；
13000rpm离心3min，将DNA纯化柱放入新的1.5mL离心管，打开离心管盖65℃孵育5min，烘干；
向DNA纯化柱中间位置悬空滴加100μL预热的洗脱液II，闭合盖子65℃孵育5min，13000rpm离心2min，得洗脱后的DNA溶液，2～8℃保存备用，若长期保存需保存在-25～-15℃。
5.根据权利要求1所述的检测NDRG4基因甲基化位点的产品在制备结直肠癌早期检测的产品的用途，其特征在于，
所述NDRG4正向引物为SEQ ID NO.2，NDRG4的反向引物为SEQ ID NO.5，所述NDRG4探针为SEQ ID NO.8。
6.根据权利要求1所述的检测NDRG4基因甲基化位点的产品在制备结直肠癌早期检测的产品的用途，其特征在于，
步骤三，将提取的基因组DNA经过亚硫酸氢盐转化液处理，得到的序列如下所示：
SEQ ID NO.1:TGAGAAGTCGGCGGGGGCGCGGATCGATCGGGGTGTTTTTTAGGTTTCGCGTCGCGGTTTTCGTTCGTTTTTTCGTTCGTTTATCGGGTATTTTAGTCGCGTAGAAGGCGGAAGTTACGCGCGAGGGATCGCGGTTCGTTCGGGATTAGTTTTAGGTTCGGTATCGTTTCGCGGGTCGAGCGTTTATATTCGTTAAATTTACGCGGGTACGTTTTCGCGGCGTATCGTTTTTAGTT；
具体包括如下步骤：
将提取的基因组DNA从冰箱取出解冻，稀释DNA浓度至20ng/μL，取40μL稀释后的DNA溶液加入到1.5mL离心管中，然后加入4μL 3M的NaOH溶液，42℃孵育20min；
加入400μL亚硫酸氢盐转化液，混匀，50℃避光孵育16小时；
加入550μL柱结合液，混匀，然后将溶液转移至DNA纯化柱，13000rpm离心90秒，弃废液后，再次离心3分钟，弃废液；
加入600μL 90％乙醇至DNA纯化柱，13000rpm离心90秒，弃废液后，再次离心15秒；
加入300μL脱硫液，常温放置30分钟，13000rpm离心90秒，弃废液；
加入600μL 90％乙醇，13000rpm离心90秒，弃废液，重复此步骤1次，再次离心3分钟；
将DNA纯化柱放入新的1.5mL离心管中，加入40μL洗脱液，50℃孵育30分钟，13000rpm离心90秒，得转化后的DNA溶液，于-20℃保存备用。
7.根据权利要求1所述的检测NDRG4基因甲基化位点的产品在制备结直肠癌早期检测的产品的用途，其特征在于，
步骤四，将转化液处理后的DNA进行定量PCR检测；
配制对待测样本DNA检测反应体系，PCR反应体系中组分如下：
10×PCR缓冲液：5～10μL
MgCl2：2.0～5.0mmol
dNTP：0.2～0.8mmol
各条引物：0.1～1.0μmol
各条探针：0.1～1.0μmol
Fast master Premix：5～10μL
样品DNA模板：2μL
其余用超纯水补足总体积：20μL；
实时荧光PCR扩增反应条件为：
第一阶段：95℃5min，1个循环；
第二阶段：95℃20s，60℃40s，15个循环；
第三阶段:95℃20s，58℃20s，30个循环；
第三阶段:30个循环中58℃时，收集荧光信号。
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