CN110846418A - 结直肠癌Septin9基因甲基化检测的引物组、探针组、试剂盒及用途 - Google Patents

结直肠癌Septin9基因甲基化检测的引物组、探针组、试剂盒及用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种结直肠癌Septin9基因甲基化检测的引物组、探针组、试剂盒及用途。所述引物组包括第一引物和第二引物，且所述第一引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二引物的序列如SEQ ID NO.2所示。所述探针组包括第一探针和第二探针，且所述第一探针的序列如SEQ ID NO.3所示，所述第二探针的序列如SEQ ID NO.4所示。所述试剂盒包括前述的引物组和探针组。本发明还提供了所述试剂盒于制备结直肠癌Septin9基因甲基化检测的产品中的用途。本方法具有简便快速、高准确性、高灵敏性的特点，而且采样方便，依从性好，能够降低患者的恐惧感，对结直肠癌的早期诊断及预后判断起重要作用。

Description

结直肠癌Septin9基因甲基化检测的引物组、探针组、试剂盒 及用途
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，特别是涉及到结直肠癌Septin9基因甲基化检测的引物组、探针组、试剂盒及在检测方法中的用途。
背景技术
结直肠癌是结肠癌和直肠癌的统称，也叫大肠癌，指的是来源于结肠和直肠黏膜的恶性肿瘤。作为最常见的恶性肿瘤之一，结直肠癌占癌症死亡率第二位。研究认为，5年生存率与诊断时疾病的严重程度具有明显的相关性，进展期患者的5年生存率不到10％，而早期诊断的结直肠癌患者的5年生存率则可达92％。结肠癌的演变过程需要5-15年或者更长的时间，这也就使通过早筛发现前期病变成为可能。通过开展早期筛查工作，不仅可以发现病人的早期病变，而且可以在疾病初期进行针对性的治疗，从而降低结直肠癌的死亡率，极大地改善患者的生存及预后。
结直肠癌的主流筛查方式是大便潜血试验(fecal occult blood test，FOBT)、粪便DNA测定和结肠镜检查(colonoscpy)。大便潜血试验是目前应用最为广泛的结直肠癌筛查方法，由于息肉和结肠直肠癌可能会导致出血，大便可以检查少量的血液，但是这个方法特异性低、敏感性差，在实际的临床应用中检验的假阳性率偏高。第二种粪便DNA测定就是提取粪便中脱落的肿瘤细胞，但是取样不便，取样后样本的提取过程繁复，干扰的因素过多，实验结果不稳定。第三种是结肠镜检查，它是目前结直肠癌早筛的“金标准”，但是使用结肠镜进行普查所面临的干扰因素比较多，诸如良好的肠道清洁准备、检查者的个人技能、检查时间和内镜技术的运用等均可影响到肿瘤的检出率。对患者而言较高的检查费用也是重要的原因之一，且有时患者为了避免产生尴尬的局面宁愿拒绝检查。有研究表明病人在结肠镜检查后会有明显的不舒适感和出现并发症(如肠穿孔)，会对患者的身体产生负担。基于上述原因，一些学者认为结肠镜检查不适合作为大规模人群的一种普查方法，只可作为高危人群普查的一种选择性手段。
最新研究发现，在大肠癌组织中SEPT9_V2的启动子区域高甲基化导致该基因表达缺失，表明该基因启动子甲基化与结直肠癌的发生和发展密切相关，使它成为结直肠癌特异的分子标记。检测结直肠癌SEPT9基因的甲基化状态，对结直肠癌的诊断、治疗、预后判断等方面具有重要意义。SEPT9甲基化检测不仅可以筛查出结直肠癌早期患者，大大提高患者的疗效和存活率，同时便于临床医生制定个体化治疗方案。
因此，有必要提供一种新的SEPT9甲基化检测方案来克服上述缺陷。
发明内容
本发明的主要目的就是针对以上现状，提供一种结直肠癌Septin9基因甲基化检测的引物组及探针组，以克服现有技术中的不足。
本发明的另一主要目的在于提供一种结直肠癌Septin9基因甲基化检测的试剂盒。
本发明的另一目的还在于提供前述试剂盒于制备结直肠癌Septin9基因甲基化检测的产品中的用途。
本发明的另一目的还在于提供一种结直肠癌Septin9基因甲基化检测的方法。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种结直肠癌Septin9基因甲基化检测的引物组，所述引物组包括第一引物和第二引物，且所述第一引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二引物的序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明实施例还提供了一种结直肠癌Septin9基因甲基化检测的探针组，所述探针组包括第一探针和第二探针，且所述第一探针的序列如SEQ ID NO.3所示，所述第二探针的序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明实施例还提供了一种结直肠癌Septin9基因甲基化检测的试剂盒，其包括至少一引物组和至少一探针组，其中一引物组为前述的引物组，一探针组为前述的探针组。
本发明实施例还提供了前述的试剂盒于制备结直肠癌Septin9基因甲基化检测的产品中的用途。
进一步地，应用所述产品进行结直肠癌Septin9基因甲基化检测的方法包括：
提供待检测的DNA样本；
使所述待检测的DNA样本与所述试剂盒的引物组、探针组及PCR扩增检测的常规组件混合，形成混合液；
采用PCR扩增技术，对所述混合液进行PCR扩增；
对PCR扩增产物进行检测，判断DNA样本的甲基化状态。
本发明实施例还提供了一种包含前述试剂盒的产品，所述产品应用于结直肠癌Septin9基因甲基化检测的方法，所述方法包括：
提供待检测的DNA样本；
使所述待检测的DNA样本与所述试剂盒的引物组、探针组及PCR扩增检测的常规组件混合，形成混合液；
采用PCR扩增技术，对所述混合液进行PCR扩增；
对PCR扩增产物进行检测，判断DNA样本的甲基化状态。
与现有技术相比，本发明的优点包括：
1)本发明提供了一种结直肠癌Septin9基因甲基化检测的引物组、探针组及检测方法，与常规的方法相比，本方法具有简便快速、高准确性、高灵敏性的特点，而且采样方便，依从性好，能够降低患者的恐惧感，对结直肠癌的早期诊断及预后判断起重要作用；
2)本发明的检测方法更为安全和高效，检测过程中无创伤。样品获得非常容易，而且不会对病人造成心理负担或后遗症，对结直肠癌的早期诊断、术后疗效评估及减少社会医疗负担等都有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中结直肠癌扩增SEPT9基因甲基化检测结果示意图。
图2是本发明实施例2中结直肠癌扩增SEPT9基因甲基化检测的阳性对照和阴性对照结果图。
图3是本发明实施例2中结直肠癌扩增SEPT9基因甲基化检测不同浓度梯度的阳性样品标准曲线图。
具体实施方式
为了解决上述传统结直肠癌早期筛查方法及甲基化检测方法中存在的操作繁琐、准确性低、敏感性差、采样过程中容易出现感染等问题，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，提供一种操作简单、准确性高、敏感性高且不会对患者造成心理和生理负担的检测方法，基于荧光PCR技术设计SEPT9基因甲基化检测的引物组、探针及检测方法。
下文将对本发明的技术方案作更为详尽的解释说明。但是，应当理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
本发明将根据具体事例做进一步的描述，但其仅为例证性的目的而不起到限制性作用。
在对实例描述前，有必要提供一些备注说明：
采用不同厂家、不同批次的试剂会造成实验结果的差异，属于正常现象。
在进行小规模实验时，为保证平行实验间的重复性，建议配置试剂后，充分混匀并分装，以保证每次实验试剂的均一性。
本发明实施例的一个方面提供了一种结直肠癌Septin9基因甲基化检测的引物组，所述引物组包括第一引物和第二引物，且所述第一引物的序列如SEQ ID NO.1所示(即正向引物，具体序列为5'-ACAGGGCGAGACTCCATC-3')，所述第二引物的序列如SEQ ID NO.2所示(即反向引物，具体序列为5'-CTTTCAGCAACCACCACC-3')。
经化学试剂-亚硫酸氢盐(BS)转化处理后，大量未甲基化C转化为T，DNA变为AT-rich，碱基多样性下降，基于此为了保证引物和探针的特异性，本案发明人对于引物的的长度、退火温度等做了不同的比较测试，能够帮助区分碱基改变到底是来源于BS处理还是碱基序列变异。而且在引物设计是注意到硫化导致模板的GC含量发生了变化，不同的的参数设计，可以筛选出更适合的Tm值和稳定的引物，做到高效、高保真、无偏好的扩增。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种结直肠癌Septin9基因甲基化检测的探针组，所述探针组包括第一探针和第二探针，且所述第一探针的序列如SEQ ID NO.3所示(即Septin9甲基化探针，具体序列为5'-AAAGATTCGTCGATAATCGA-3')，所述第二探针的序列如SEQ ID NO.4所示(即Septin9未甲基化探针，具体序列为5'-GTCAATGTTGAATTTGATAATTGA-3')。
进一步地，所述第一探针为针对亚硫酸氢盐转化的甲基化DNA的探针。
进一步地，所述第一探针和第二探针还包括荧光标记基团。
本发明是双标分析配合使用，即两种甲基化敏感TaqMan探针和甲基化不敏感PCR引物同时存在。可灵敏定量亚硫酸氢盐转化后DNA中的甲基化DNA，以检测DNA甲基化状态的微小变化。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种结直肠癌Septin9基因甲基化检测的试剂盒，其包括至少一引物组和至少一探针组，其中一引物组为前述的引物组，一探针组为前述的探针组。
进一步地，所述的试剂盒还包括PCR扩增检测的常规组件，所述PCR扩增检测的常规组件包括PCR反应用缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液(dNTPs)、DNA聚合酶等。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述试剂盒于制备结直肠癌Septin9基因甲基化检测的产品中的用途。
进一步地，应用所述产品进行结直肠癌Septin9基因甲基化检测的方法包括：
提供待检测的DNA样本；
使所述待检测的DNA样本与所述试剂盒的引物组、探针组及PCR扩增检测的常规组件混合，形成混合液；
采用PCR扩增技术，对所述混合液进行PCR扩增；
对PCR扩增产物进行检测，判断DNA样本的甲基化状态。
进一步地，所述方法还包括：通过PCR仪检测到的荧光信号与扩增的PCR产物的关系，从而得到待检测的DNA样本的甲基化状态。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种包含前述试剂盒的产品，所述产品应用于结直肠癌Septin9基因甲基化检测的方法，所述方法包括：
提供待检测的DNA样本；
使所述待检测的DNA样本与所述试剂盒的引物组、探针组及PCR扩增检测的常规组件混合，形成混合液；
采用PCR扩增技术，对所述混合液进行PCR扩增；
对PCR扩增产物进行检测，判断DNA样本的甲基化状态。
进一步地，所述方法还包括：通过PCR仪检测到的荧光信号与扩增的PCR产物的关系，从而得到待检测的DNA样本的甲基化状态。
本发明在甲基化特异性检测中，可根据目标序列的甲基化状态，只有针对亚硫酸氢盐转化的甲基化DNA的TaqMan探针或针对未甲基化DNA的TaqMan探针才能与目标序列杂交。两种探针都有不同的荧光团标记，根据基因甲基化与未甲基化不同的序列，不同的探针会与DNA序列进行杂交。在PCR的延伸阶段，Taq DNA聚合酶的5'外切酶活性可将荧光基团和淬灭基团分离，荧光团就在PCR扩增过程中释放出来。通过PCR仪检测到的荧光信号与扩增的PCR产物成正比，从而推断出待测样品的甲基化状态。
本发明还提供阴性对照和阳性对照，即经亚硫酸氢盐处理的完全未甲基化的人类基因组DNA和经亚硫酸氢盐处理的完全甲基化的人类基因组DNA均稀释至10ng/μL，在PCR扩增过程中作为模板加入到反应体系中，以检测整个反应的准确性。本发明还提供未经亚硫酸氢盐处理的完全未甲基化的人类基因组DNA，为了检测整个扩增体系的有效性。
其中，在一些更为具体的实施案例之中，所述用于结直肠癌相关基因Septin9甲基化检测的方法包括如下步骤：
1、使用商品化试剂盒提取待测样本DNA，采用重亚硫酸盐对DNA进行转化处理，转化后的DNA可以作为作为PCR的模板；
2、将扩增混合物分装到PCR反应管底部并分别加入待测DNA、阴性对照及阴性对照，所述扩增混合物包括MethyLight Master缓冲液、Septin9引物混合液、HotStarTaq DNA聚合酶、dNTP和RNase-Free水，所述样本DNA不超过100ng/μL；
3、将PCR反应管转移到PCR仪上进行PCR扩增，扩增条件如下：
第一阶段：95℃，10分钟，1个循环；
第二阶段：95℃，15秒，58℃30秒，10个循环；
第三阶段：95℃，15秒，56℃30秒，35个循环；
信号收集：第三阶段56℃时收集信号。
4、根据PCR的荧光信号来确定待检测样本的甲基化状态，通过样品与对照DNA扩增状态的对比，可以确保扩增体系的有效性。
以下结合附图及若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明，但其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限。并且本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
一、使用天根血液基因组试剂盒提取结直肠癌患者的DNA，步骤如下：
1.依次加入相应的提取试剂；
2.在核酸洗脱步骤中，在纯化柱中加入100μl 56℃温育的缓冲液TE，室温静置1分钟，12000rpm离心30秒。洗脱下来的DNA使用NanoDrop One检测，OD260/OD280在1.8-2.0范围内即满足要求；
3.采用重亚硫酸盐对DNA进行转化处理，转化后的DNA可以作为PCR的模板；
二、PCR扩增
1.取出MethyLight Master Mix和Septin9引物与探针置于冰上自然融解，混匀，离心；
2.PCR扩增体系如下：
2x Master Mix 25μl
5x primer–probe mix 10μl
DNA模板 10μl
无RNA酶水 5μl
总体积 50μl
注：2x Master Mix中包含PCR缓冲液、DNA聚合酶和dNTP、5x引物-探针混合物中按照等比例加入SEPT9正向引物、SEPT9反向引物、Septin9检测探针；
3.PCR程序如下：
Figure BDA0002319294180000071
三、结果分析
只有针对亚硫酸氢盐转化的甲基化DNA的TaqMan探针或针对未甲基化DNA的TaqMan探针才能与目标序列杂交。两种探针都有不同的荧光团标记，如果探针与DNA杂交，荧光团会在PCR过程中释放出来。在PCR的延伸阶段，Taq DNA聚合酶的5'外切酶活性可将荧光基团和淬灭基团分离。通过PCR仪可检测到荧光量与扩增的PCR产物成正比。从机器采集到的不同荧光信号通过数据分析就可以直观的得知待测样品的甲基化状态。结果如图1所示，可以看出该患者存在SEPT9甲基化，同时加入的对照品没有产生扩增条带，说明扩增体系的有效性。
实施例2
一、使用天根血液基因组提取阳性对照和阴性对照的DNA，步骤如下：
1.依次加入相应的提取试剂；
2.在核酸洗脱步骤中，在纯化柱中加入100μl 56℃温育的缓冲液TE，室温静置1分钟，12000rpm离心30秒。洗脱下来的DNA使用NanoDrop One检测，OD260/OD280在1.8-2.0范围内即满足要求；
3.采用重亚硫酸盐对DNA进行转化处理，转化后的DNA可以作为PCR的模板；
二、PCR扩增
1.取出MethyLight Master Mix和Septin9引物与探针置于冰上自然融解，混匀，离心；
2.PCR扩增体系如下：
2x Master Mix 25μl
5x primer–probe mix 10μl
DNA模板 10μl
无RNA酶水 5μl
总体积 50μl
注：2x Master Mix中包含PCR缓冲液、DNA聚合酶和dNTP、5x引物-探针混合物中按照等比例加入SEPT9正向引物、SEPT9反向引物、Septin9检测探针；
3.PCR程序如下：
Figure BDA0002319294180000081
三、结果分析
只有针对亚硫酸氢盐转化的甲基化DNA的TaqMan探针或针对未甲基化DNA的TaqMan探针才能与目标序列杂交。两种探针都有不同的荧光团标记，如果探针与DNA杂交，荧光团会在PCR过程中释放出来。在PCR的延伸阶段，Taq DNA聚合酶的5'外切酶活性可将荧光基团和淬灭基团分离。通过PCR仪可检测到荧光量与扩增的PCR产物成正比。从机器采集到的不同荧光信号通过数据分析就可以直观的得知待测样品的甲基化状态。结果如图2所示，可以看出阳性对照有扩增曲线，同时加入的阴性对照没有产生扩增，说明扩增体系的有效性。
结直肠癌扩增SEPT9基因甲基化检测不同浓度梯度的阳性样品标准曲线图如图3所示。
实施例3
一、提取9例经结肠镜检查确定是结直肠癌患者的DNA(生物样本来自苏州绘真医学检验所)，同样使用试剂盒A(北京优博兰Septin9甲基化检测试剂盒)和试剂盒B(北京博尔诚Septin9基因甲基化检测试剂盒)对上述样品进行检测，最后采用重亚硫酸盐对DNA进行转化处理，转化后的DNA可以作为PCR的模板；
二、PCR扩增
1.取出MethyLight Master Mix和Septin9引物与探针置于冰上自然融解，混匀，离心；
2.PCR扩增体系如下：
2x Master Mix 25μl
5x primer–probe mix 10μl
DNA模板 10μl
无RNA酶水 5μl
总体积 50μl
注：2x Master Mix中包含PCR缓冲液、DNA聚合酶和dNTP、5x引物-探针混合物中按照等比例加入SEPT9正向引物、SEPT9反向引物、Septin9检测探针；
3.PCR程序如下：
Figure BDA0002319294180000091
Figure BDA0002319294180000101
三、SEPT9基因甲基化的结果统计如下：
本发明的检测方法优于优于试剂盒A和试剂盒B，并且这些患者经结肠镜检测证实是结肠癌，本发明与结肠镜结果一致。
序号 本发明 试剂盒A 试剂盒B
患者(9) 9/9 6/9 7/9
检出率 100％ 67％ 78％
综上所述，藉由上述技术方案，本发明的结直肠癌Septin9基因甲基化检测的引物组、探针组及检测方法，与常规的方法相比，本方法具有简便快速、高准确性、高灵敏性的特点，而且采样方便，依从性好，能够降低患者的恐惧感，对结直肠癌的早期诊断及预后判断起重要作用。
本发明的各方面、实施例、特征及实例应视为在所有方面为说明性的且不打算限制本发明，本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下，所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。
在本发明案中标题及章节的使用不意味着限制本发明；每一章节可应用于本发明的任何方面、实施例或特征。
在本发明案通篇中，在将组合物描述为具有、包含或包括特定组份之处或者在将过程描述为具有、包含或包括特定过程步骤之处，预期本发明教示的组合物也基本上由所叙述组份组成或由所叙述组份组成，且本发明教示的过程也基本上由所叙述过程步骤组成或由所叙述过程步骤组组成。
应理解，各步骤的次序或执行特定动作的次序并非十分重要，只要本发明教示保持可操作即可。此外，可同时进行两个或两个以上步骤或动作。
尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。
Figure BDA0002319294180000131
序列表
<110> 苏州璞瑞卓越生物科技有限公司
<120> 结直肠癌Septin9基因甲基化检测的引物组、探针组、试剂盒及用途
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
acagggcgag actccatc 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
ctttcagcaa ccaccacc 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 3
aaagattcgt cgataatcga 20
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 4
gtcaatgttg aatttgataa ttga 24

Claims (10)

1.一种结直肠癌Septin9基因甲基化检测的引物组，其特征在于，所述引物组包括第一引物和第二引物，且所述第一引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二引物的序列如SEQID NO.2所示。
2.一种结直肠癌Septin9基因甲基化检测的探针组，其特征在于，所述探针组包括第一探针和第二探针，且所述第一探针的序列如SEQ ID NO.3所示，所述第二探针的序列如SEQID NO.4所示。
3.根据权利要求2所述的探针组，其特征在于：所述第一探针为针对亚硫酸氢盐转化的甲基化DNA的探针。
4.根据权利要求2所述的探针组，其特征在于：所述第一探针和第二探针还包括荧光标记基团。
5.一种结直肠癌Septin9基因甲基化检测的试剂盒，其特征在于包括至少一引物组和至少一探针组，其中一引物组为权利要求1所述的引物组，一探针组为权利要求2所述的探针组。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于还包括PCR扩增检测的常规组件；优选的，所述PCR扩增检测的常规组件包括PCR反应用缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸混合液和DNA聚合酶。
7.权利要求5-6中任一项所述的试剂盒于制备结直肠癌Septin9基因甲基化检测的产品中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，应用所述产品进行结直肠癌Septin9基因甲基化检测的方法包括：
提供待检测的DNA样本；
使所述待检测的DNA样本与所述试剂盒的引物组、探针组及PCR扩增检测的常规组件混合，形成混合液；
采用PCR扩增技术，对所述混合液进行PCR扩增；
对PCR扩增产物进行检测，判断DNA样本的甲基化状态。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述方法还包括：通过PCR仪检测到的荧光信号与扩增的PCR产物的关系，从而得到待检测的DNA样本的甲基化状态。
10.一种包含权利要求5-6中任一项所述的试剂盒的产品，所述产品应用于结直肠癌Septin9基因甲基化检测的方法，所述方法包括：
提供待检测的DNA样本；
使所述待检测的DNA样本与所述试剂盒的引物组、探针组及PCR扩增检测的常规组件混合，形成混合液；
采用PCR扩增技术，对所述混合液进行PCR扩增；
对PCR扩增产物进行检测，判断DNA样本的甲基化状态；
优选的，所述方法还包括：通过PCR仪检测到的荧光信号与扩增的PCR产物的关系，从而得到待检测的DNA样本的甲基化状态。
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