CN116064792B - 一种用于结直肠癌诊断的多基因dna甲基化联合检测试剂盒及应用 - Google Patents

一种用于结直肠癌诊断的多基因dna甲基化联合检测试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医学检验技术领域，具体涉及一种基于荧光定量PCR技术的结直肠癌多基因甲基化联合检测试剂盒及其临床应用。本发明通过联合检测外周血单个核细胞中TRGV9、TRDJ3、TRDC、FAM174B、ZMIZ2基因甲基化水平，能够有效判断结直肠癌的发生情况。与焦磷酸测序等技术相比，本发明操作简便，大大降低检测成本，提高检测效率，可在基层医院开展，有望实现对结直肠癌进行高灵敏度、高特异性的筛查诊断，具有较高的临床使用和推广价值。

Description

一种用于结直肠癌诊断的多基因DNA甲基化联合检测试剂盒 及应用
技术领域
本发明属于基因工程技术技术领域，涉及一种基于结直肠癌TRGV9、TRDJ3、TRDC、FAM174B、ZMIZ2多基因DNA甲基化检测的诊断试剂盒、检测方法及其临床应用。
背景技术
2018年全球癌症统计数据显示，结直肠癌(CRC)在全球发病率排名第三，死亡率排名第二，估计新发病例约200万/年，死亡人数超过88万/年。研究人员普遍认为，提高CRC的诊断水平是进一步降低CRC发病率和死亡率的最有效策略。目前，根据CRC筛查指南，结肠镜检查和粪便免疫化学试验(FIT)已被推荐为CRC筛查的一线选择。然而，结肠镜检查的是侵入性操作、肠道准备繁琐、并发症较难避免且费用昂贵，患者依从性较差。FIT是一种非侵入性测试，可以提高参与率，但检测的敏感性较低。定期检测癌胚抗原(CEA)能够为CRC提供可靠的指征，特异性和敏感性仍不满足临床需求。因此，仍然亟需开发一种基于血液的用于CRC诊断的无创、准确的检测方法。
越来越多的证据表明，在表观遗传改变中，DNA甲基化的异常改变被认为是包括CRC在内的许多癌症类型发生和发展过程中的最主要现象，并且它们可以在早期肿瘤中癌症患者非侵入性基质中(如血清、血浆或外周血单个核细胞(PBMC)被检测到。而PBMC可从常规采集的血液中轻松获取，且能够提供与癌症进展相关的潜在生物分子(如DNA、RNA和蛋白质等)，从而识别肿瘤的存在。学者能够从PBMCs基因表达模式中进一步检测到这种信号，使得差异DNA甲基化位点的检测可作为癌症诊断的标志物也成为一个新的研究方向。
近年来已有文献报道包括CRC在内的不同类型癌症中鉴定癌症特异性DNA甲基化生物标志物的研究，但多停留在初期研究阶段，因此，进一步深入探索和开发便捷、特异有效、能够在临床推广应用的甲基化诊断试剂盒具有重要的临床意义。
发明内容
本发明针对早期结直肠癌诊断技术存在的侵入性、价格昂贵、准确性低等技术问题提出一种无创的技术方案，该方案基于TRGV9、TRDJ3、TRDC、FAM174B、ZMIZ2多基因DNA甲基化水平的结直肠癌诊断试剂盒，该试剂盒具有较高的检测灵敏度和特异度，以期实现准确、快捷的诊断早期结直肠癌。
为了达到上述目的，本发明是采用下述的技术方案实现的：
一种基于外周血单个核细胞DNA的结直肠癌诊断检测的引物和探针，所述检测引物和探针用于检测结直肠癌特异性DNA甲基化标志物，所述结直肠癌特异性标志物包括：TRGV9、TRDJ3、TRDC、FAM174B、ZMIZ2基因。检测引物用于扩增所述结直肠癌特异性标志物的一段序列。
TRGV9扩增区域序列：
5’-GAATGAAAGTTTCCTCCTGTATGGCCTCTGTCCTTCTCACACAAGTTGGAAGGCCTTAGCCGTGAACTGAGCCTTCAGTAGAGGTTAGAGACGCTGGGCTGTTTCAGAAGCAAGGCGTAGCGTTTTTTTTTTTTATTTCTTGTTGCTCAGACTGGAGTGCAATGGCACGATCTCGGCTCACCACAACCCCTGCCTCCTGG-3’。
TRDJ3扩增区域序列：
5’-TCTGGTTTTCTTCTCCTGCAGTGGTGAAATGTAATATGATGATGTGAAGCTCAGGTAGGGGATGTGAAAATTTTCAAATCAAACCCCAAGTCCTTAAAGCTTTGACAGTGAATAATGGCCCTACACAACTGTCATTCTCTTTTGCCTGGCTCTAGCCCAACGATCTTGATTTTTGGTGATGAGGCAGAGTAATTCACATGGTCTTTATGTTACATTGCACATGATGACTATATACTCCTGAAACTTATATCTGGATCCAGAGTCAGGAGAAATTATAAAACAAAAATAAGCAATGCAAAG-3’。
TRDC扩增区域序列：
5’-GAATGAGTATTCACCTAAAGGCAGAAACATGTACCACCTACCTTCAGCAGATCCCTTTCCACCCTTTCCAGCAGATCTGGAAGGGATGGCACCCTTCCGGGACCCCAACACTGCCATCCTCAGAACCTCTGAGCCAGTTATGCAGTCCTTCTCAGACCCTCGATTCTTTAAGTGACAGAATGCATAGCATGAGCACCTGCCCTGATCTACCATCCAAGGGCCCATGCATTTACAAAAAACCAACTGGTGCAGAGAGATATTCAGCCTGACCTAGATTGTCCAGAGGATTGATTAATAAAA-3’
FAM174B扩增区域序列：
5’-TGCCTGTGTTTTGGTTTTTGTTGTTTTTGCCAGATAAAGTAACATTCAGTTTCCACATATTGGGATATCACTGGGAGACCATTATTCAGCCCACCACACACATCCCCAAATCTACCAGGTTAAATGGAGGTAGATTTTTAAGCTTCCCAAGTAGCTGGGACTACAGGCATGCACCACTATGTCTGGCTAATTATTTTTATTTTTTATACAGTTGGGGTCTTGCTACATTGCCCAGGCTGGTCTTGAACTTCTAGGCTCAAGCAAACCTCCTGCCTCTGCCTTCCAAAGTGCTGGGATTACCGGTATGAGTCACCACACTGAGCAAGGGAGAAGAATTTTAAGAGTCCCTATAATAACTCCACACCTCTCTAAAAACCGCACTGCTCGCCCCTCCCCACTCCCACAGGTTTTGGAGTTTCTGACTCCTGAAAGAGAATGAGTCACAGACAGTTCCCGTCAGAAAAGACTATGTCCCTCCCACCTCTCATTTAGTTCCCGTTTGTTTAGGATTCAAGTGTCTTGGGCAGTTAGATAGCTCCCCAGCCTACCCAGTTTCCCTCTTGCCTCCCCTCTACTACCCCCAGAAATGCTTGTGCAATAT-3’。
ZMIZ2扩增区域序列：
5’-AGAAAGAAAGAGAGAGAGAAAGGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAATTCTGACACATGCCACAACATGGATGGAAGTGAGGACACTGTGCTAACTAAAGTAAGACTGTCACAAAAAGACATATAATGTATGATTCCACTTATACGATGTCCTTAGAGTAGTCTAATTTAGAGACGAATAGTGAATGCCAAAGGCTAGGAGGAGGAAAGAATGGGGAGCTAGTGTTTACTGGGTATGGAGTTTCCATTTGAGAAGATGAAAAAGTCCTGGAGACGGTTGGTGGTTGCACAAGAATGTGAATGTACTTGGTGCCACAGAACTACACTTGGAAACAGTTAAGATGGTAAGTTTTACGTTATGTGTATTTTACCACAATTAAGAAAAATTAATTATGGGTAGTTGAGAGAATGTGGTCTTCCTCAACTTACGGTAGGAAAAGTCAAGAATAACTTAAAGGCTGATAATAGCATTTCAAAGATCGAAACTGATCAGAGAGGCTATTCCATCAGGCTAGACTAGCTCAATAGTGACTTTTTCCAGAAGGAGAACCACTGGGAAGAGAGAACTGAGCAGT-3’。
TRGV9基因检测引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述探针的两端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。
TRDJ3基因检测引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQID NO.4所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述探针的两端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。
TRDC基因检测引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQID NO.7所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述探针的两端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。
FAM174B基因检测引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述探针的两端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。
ZMIZ2基因检测引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQID NO.13所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述探针的两端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。
进一步地，所述荧光报告基团/荧光淬灭基团选自FAM、VIC、HEX、ROX、NED、CY3、CY5等荧光报告基团/BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabyc1、Tamra等荧光淬灭基团，且试剂盒中TRGV9、TRDJ3、TRDC基因探针上的荧光报告基团和FAM174B、ZMIZ2基因探针上的荧光报告基团互不相同。
作为优选，TRGV9、TRDJ3、TRDC基因5'端荧光报告基团为FAM；FAM174B、ZMIZ2基因5'端荧光报告基团为CY5，β-actin5'端荧光报告基团为VIC，淬灭基团为BHQ1；
诊断模型如下：
△CT1＝CTVIC-CTFAM,
△CT2＝CTVIC-CTCY5，
Multi-PCR Score＝1/[1+exp(10.73266+11.57596*△CT1-15.31471*△CT2)]。
以VIC达到设定阈值表示DNA上样量在允许范围内，FAM、CY5结果可信。根据以上公式对检测结果进行判读，即Multi-PCR Score大于0.5，表明结果阴性；Multi-PCR Score小于0.5，表明结果阳性。
若VIC荧光通道的Ct值>35或无扩增，ΔCt为任何结果皆为无效，需要重新提取转化样本后检测。
本发明还提出一种结直肠癌诊断试剂盒，至少包括特异性识别TRGV9、TRDJ3、TRDC、FAM174B、ZMIZ2基因的检测试剂。
需要说明的是，所述结直肠癌检测试剂并不限定为液体形式。
所述试剂盒还包括β-actin基因的PCR扩增特异性引物和探针，所述β-actin基因检测引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，所述探针的两端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。
所述荧光报告基团/荧光淬灭基团选自FAM、VIC、HEX、ROX、NED、CY3、CY5等荧光报告基团/BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabyc1、Tamra等荧光淬灭基团，且试剂盒中TRGV9、TRDJ3、TRDC基因探针上的荧光报告基团和FAM174B、ZMIZ2基因探针上的荧光报告基团以及β-actin基因探针上的荧光报告基团互不相同。
进一步地，所述试剂盒还包括一下组分中的一种或几种：PCR反应液、引物、探针、ROX、阳性质控品、阴性质控品。所述PCR反应液包括热启动Taq酶、PCR缓冲液、MgCl2、dUTP、dNTPs，此类甲基化定量PCR常用试剂可经市场途径单独购买或自行配置。
进一步地，所述阳性质控品由β-actin基因甲基化的人基因组DNA配制而成。
进一步地，所述阴性质控品由β-actin基因非甲基化的人基因组DNA配制而成。
前述结直肠癌检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)分离并提取外周血单个核细胞；
(2)提取外周血单个核细胞基因组DNA；
(3)将所提取单个核细胞基因组DNA进行亚硫酸盐转化；
(4)采用前述结直肠癌检测试剂盒中的试剂对亚硫酸盐转化后的待测样本进行甲基化定量PCR检测；
(5)对检测结果进行分析。
本发明提供一种结直肠癌诊断方法，包括对样本中高甲基化基因(TRGV9、ZMIZ2、TRDC)及低甲基化基因(FAM174B、TRDJ3)的相对定量，并通过Multi-PCR Score判断结直肠癌的发生情况。
作为优选，外周血单个核细胞作为检测样本。
用于特异性识别TRGV9基因DNA甲基化的PCR探针引物预混液包括：0.1-1uM的探针、0.1-1uM的正向引物和0.1-1uM的反向引物；
用于特异性识别TRDJ3基因DNA甲基化的PCR探针引物预混液包括：0.1-1uM的探针、0.1-1uM的正向引物和0.1-1uM的反向引物；
用于特异性识别TRDC基因DNA甲基化的PCR探针引物预混液包括：0.1-1uM的探针、0.1-1uM的正向引物和0.1-1uM的反向引物；
用于特异性识别FAM174B基因DNA甲基化的PCR探针引物预混液包括：0.1-1uM的探针、0.1-1uM的正向引物和0.1-1uM的反向引物；
用于特异性识别ZMIZ2基因DNA甲基化的PCR探针引物预混液包括：0.1-1uM的探针、0.1-1uM的正向引物和0.1-1uM的反向引物。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
1.本发明所提供的检测试剂盒，检测标本类型为外周血，样本较易获得、无创，且患者依从性较好。
2.本发明所提供的检测试剂盒针对TRGV9、TRDJ3、TRDC、FAM174B、ZMIZ2基因设计特异性引物和探针，并选用β-actin作为内参基因，保证检测结果的灵敏度高、特异性好，所提供的检测试剂盒包含阴性质控品和阳性质控品，能够较大程度防止假阴性结果和假阳性结果的产生，在结直肠癌外周血PBMC甲基化的体外诊断领域具有较为广阔的应用前景。
3.与焦磷酸测序等技术相比，本发明所提供的检测试剂盒操作简便，大大降低检测成本，提高检测效率。PCR荧光检测是全封闭式操作，无需进行电泳、杂交等操作，能够有效防止污染。
4.本发明所提供的检测试剂盒适用于多种荧光定量PCR仪，能够在临床推广应用。
5.肿瘤早期进展过程中多存在甲基化的异常改变，利用本发明所提供的甲基化检测方法可实现结直肠癌的早期诊断，有效提高结直肠癌患者的五年生存率。
附图说明
图1为实施例1中TRGV9、TRDJ3、TRDC基因，FAM174B、ZMIZ2基因以及β-actin基因荧光定量检测结果示意图：其中，纵坐标表示荧光强度，横坐标表示荧光定量PCR扩增的循环数，FAM表示受试标本中TRGV9、TRDJ3、TRDC三个基因多重甲基化检测结果，CY5表示受试标本中FAM174B、TRDJ3两个基因多重甲基化检测结果，VIC表示受试标本中β-actin基因检测结果，
图2为实施例2中TRGV9、TRDJ3、TRDC、FAM174B、ZMIZ2基因联合诊断结直肠癌的ROC曲线。
图3为实施例2中TRGV9、TRDJ3、TRDC、FAM174B、ZMIZ2基因联合诊断早期结直肠癌的ROC曲线。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。
实施例1
1.试剂盒的制备及其使用方法
试剂盒包括以下组分：
PCR反应液、引物、探针、ROX、阳性质控品、阴性质控品。
(1)PCR反应液包括热启动Taq酶、PCR缓冲液、MgCl2、dUTP、dNTPs；
(2)引物包括甲基化基因TRGV9、TRDJ3、TRDC、FAM174B、ZMIZ2及内参基因β-actin的正向引物和反向引物；
(3)探针包括甲基化基因TRGV9、TRDJ3、TRDC、FAM174B、ZMIZ2及内参基因β-actin的检测探针。
本实施例中使用的结直肠癌外周血单个核细胞甲基化基因TRGV9、TRDJ3、TRDC、FAM174B、ZMIZ2以及内参基因β-actin的引物和探针的核苷酸序列可参见表1。
表1引物和探针的核苷酸序列表
注：X1、X2、X3为荧光报告基团，Y为荧光淬灭基团。在本发明的一种优选方式中，X1为FAM，X2为CY5，X3为VIC，Y为BHQ1。
(4)阴性质控品：由β-actin基因非甲基化的人基因组DNA配制而成。
(5)阳性质控品：由β-actin基因甲基化的人基因组DNA配制而成。
2.实验过程
2.1外周血单个核细胞的分离
采血前一晚空腹，采血当天使用EDTA-K2抗凝管采集受试者外周静脉血3ml，室温静置30min后进行如下操作：取一支15ml无菌离心管，加入3ml淋巴细胞分离液Histopaque-1077(Sigma)；用塑料吸管轻轻混匀外周血后，沿管壁呈45°将外周血轻柔、缓慢的加入淋巴细胞分离液上层；将离心管小心置于水平离心机中，室温450x g离心30分钟；小心吸取中间云雾状的白膜层细胞，置于另一离心管中，并加入10ml的PBS，450x g离心10分钟，以洗掉多余的Ficoll；弃上清，用1ml PBS吹打混匀后加入10ml的PBS，250x g离心10分钟；重复上述步骤再次洗涤细胞，弃上清后获得细胞沉淀。
2.2外周血单个核细胞DNA提取
按照天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)标准操作流程：向上述细胞沉淀中加入200ul缓冲液GA，振荡至彻底悬浮，加入20ul Proteinase K溶液，混匀；加入200ul缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min；加人200ul无水乙醇，充分振荡混匀15sec；将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，离心(12,000rpm，30s)，弃废液；向吸附柱CB3中加入500ul缓冲液GD，离心(12,000rpm，30s)，弃废液；向吸附柱CB3中加入600ul漂洗液PW，离心(12,000rpm，30s)，弃废液；重复上述操作步骤；将吸附柱CB3放回收集管中，离心(12,000rpm，2min)，弃废液；CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200ul洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，离心(12,000rpm，2min)，将溶液收集到离心管中。并通过NanoDrop ND-1000(Thermo Scientific)分光光度计测量浓度。
2.3亚硫酸氢盐转化
按制造商说明书要求使用Zymo Research的要求对上述提取获得的DNA样品进行亚硫酸氢盐转化。具体操作步骤可参考如下说明：向上述提取好的1000ng DNA样本中加入130μL CT Conversion Reagent(现用现配，操作过程注意避光)，涡旋混匀，根据98℃，10min；64℃，2.5h；4℃，∞的反应条件进行转化；向吸附柱中加入600μL M-BindingBuffer，随后加入转化后的样本，混匀，离心(10000rpm，30s)，弃废液；向吸附柱中加入100μL M-Wash Buffer，离心(10000rpm，30s)，弃废液；向吸附柱中加入200μL M-DesμLphonation Buffer，室温静置20min，离心(10000rpm，1min)，弃废液；向吸附柱中加入200μL M-Wash Buffer，离心(10000rpm，1min)，弃废液；向吸附柱中加入200μL M-Wash Buffer，离心(10000rpm，1min)，弃废液；将吸附柱转移至新的收集管中，，加入20μL M-ElutionBuffer,室温静置5min，离心(10000rpm，1min)，获得亚硫酸盐转化后的DNA样本。
样本处理后应尽快进行检测，-20℃保存时间一般不超过4个月，如需更长时间的保存请将样本置于-70℃，避免反复冻融。
2.4 PCR反应的体系和反应条件
所述PCR扩增反应体系的终浓度组成为：1xPCR反应液；0.1-1uM TRGV9基因甲基化引物、0.1-1uM TRDJ3基因甲基化引物、0.1-1uM TRDC基因甲基化引物、0.1-1uM FAM174B基因甲基化引物、0.1-1uM ZMIZ2基因甲基化引物、0.1-1uMβ-actin引物；0.1-1uM TRGV9Taqman水解探针、0.1-1uM TRDJ3 Taqman水解探针、0.1-1uM TRDC Taqman水解探针、0.1-1uM FAM174B Taqman水解探针、0.1-1uM ZMIZ2 Taqman水解探针、0.1-1uMβ-actin Taqman水解探针；ROX Low Reference Dye(50X)。
2.4.1试剂准备
按照表2中提供的试剂配制待用。
表2反应液配置(样本检测/阴性质控/阳性质控)
2.4.2加样
向PCR扩增管中加入1μL待测核酸样品/阴性质控品/阳性质控品/无模板对照，终体积为10μL/管，盖紧管盖，瞬时低速离心，等待上机。
注：待测样本、阴性质控品、阳性质控品、无模板对照均设置三个复孔进行检测。
2.4.3 PCR扩增
PCR扩增的程序如表3所示。
表3荧光通道选择及扩增循环参数设定
注：选ROX校正，淬灭基团选None.
设置完毕，保存文件，运行反应程序。
2.4.4 PCR结果分析
反应结束后自动保存结果,使用仪器配套软件自动分析结果,
首先进行无模板对照的扩增曲线分析，FAM、CY5、VIC通道无明显扩增信号，表明实验无污染，可以继续分析。
阴性质控品应无明显扩增曲线变化或Ct值应≥35，阳性质控品的Ct值应≤10。质控品满足上述条件时，表明实验有效，可继续分析。
2.4.5检测结果判读
以VIC达到设定阈值(即CT值<35),表示DNA上样量在允许范围内，FAM、CY5结果可信。根据如下公式对检测结果进行判读，即Multi-PCR Score大于0.5，表明结果阴性；Multi-PCR Score小于0.5，表明结果阳性。
△CT1＝CTVIC-CTFAM,
△CT2＝CTVIC-CTCY5
Multi-PCR Score＝1/[1+exp(10.73266+11.57596*△CT1-15.31471*△CT2)]。
3.准确性检验
本实施例提供试剂盒的检测准确性的检验，通过实施例1提供的试剂盒和实验方法对94例临床样本进行实验检测，检测结果如表4所示。
表4 94例临床样本检测结果
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将检测的94例临床样本与结直肠癌检测金标准方法(结直肠镜联合病理检测)的检测结果进行对比分析，病理诊断正常的样本48例，结直肠癌样本46例。采用实施例1提供的实施方法进行检测，具体比较结果见表5。
表5结直肠癌甲基化检测技术对结直肠癌患者及健康对照者样本的检测结果对比
4.健康对照者与结直肠癌患者的受试者工作特征曲线
本实施例提供健康对照者与结直肠癌患者的受试者工作特征曲线(ROC曲线)。通过实施例1提供的试剂盒和实验方法对健康对照者和结直肠癌患者进行实验检测。结果如图2所示，本实验例提供结直肠癌DNA甲基化检测技术可以明显区分健康对照者和结直肠癌患者，曲线下面积(AUC)为0.971。
5.健康对照者与早期结直肠癌患者的受试者工作特征曲线
通过实施例1提供的试剂盒和实验方法对健康对照者和早期结直肠癌患者进行实验检测。
如图3所示，本实验例提供结直肠癌DNA甲基化检测技术可以明显区分健康对照者和早期结直肠癌患者，曲线下面积(AUC)为0.994。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (5)

1.检测外周血单个核细胞中TRGV9、TRDJ3、TRDC、FAM174B和ZMIZ2基因甲基化状态的物质在制备结直肠癌诊断试剂盒中的应用。
2.一种用于结直肠癌诊断的多基因DNA甲基化联合检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测TRGV9、TRDJ3、TRDC、FAM174B和ZMIZ2基因甲基化的引物对和基因特异的水解探针，
所述TRGV9基因检测正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
TRDJ3基因检测正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
TRDC基因检测正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
FAM174B基因检测正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
ZMIZ2基因检测正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
3.根据权利要求2所述用于结直肠癌诊断的多基因DNA甲基化联合检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括β-actin基因的PCR扩增特异性引物和探针，所述β-actin基因检测正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
4.根据权利要求2所述用于结直肠癌诊断的多基因DNA甲基化联合检测试剂盒，其特征在于，特异性识别TRGV9、TRDJ3、TRDC、FAM174B、ZMIZ2基因甲基化的探针5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；TRGV9、TRDJ3、TRDC基因探针5’端的荧光报告基团为FAM，FAM174B、ZMIZ2基因探针5’端的荧光报告基团为CY5，β-actin基因探针5’端的荧光报告基团为VIC，TRGV9、TRDJ3、TRDC、FAM174B、ZMIZ2及β-actin基因3’端荧光淬灭基团均为BHQ1。
5.根据权利要求4所述用于结直肠癌诊断的多基因DNA甲基化联合检测试剂盒，其特征在于，
试剂盒中的阴性质控品由β-actin基因非甲基化的人基因组DNA配制而成；阳性质控品由β-actin基因甲基化的人基因组DNA配制而成；阴性质控品无明显扩增曲线变化或Ct值≥35，阳性质控品的Ct值≤10，为有效实验；
还包括一个诊断模型，诊断模型公式如下：
△CT1= CTVIC-CTFAM,
△CT2= CTVIC-CTCY5，
Multi-PCR Score=1/[1+exp(10.73266+11.57596*△CT1- 15.31471*△CT2)]；
Multi-PCR Score大于0.5，结果为阴性；
Multi-PCR Score小于0.5，结果为阳性；
若VIC荧光通道的Ct值>35或无扩增，ΔCt为任何结果皆为无效，需要重新提取转化样本后检测。
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