CN112852934B - 检测基因甲基化的引物、试剂和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了检测基因甲基化的引物、试剂和试剂盒，涉及甲基化检测技术领域，本发明公开的引物包括前互补区、第一错配区、中互补区、第二错配区以及后互补区。本发明公开的引物通过设置三个互补区和二个错配区，有效地提高了引物的特异性和灵敏度。

Description

检测基因甲基化的引物、试剂和试剂盒

技术领域

本发明涉及甲基化检测技术领域，具体而言，涉及检测基因甲基化的引物、试剂和试剂盒。

背景技术

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是常见的消化系统恶性肿瘤。据2018年全球癌症数据显示，全球死亡率最高的癌症依次为:肺癌(18.4％)、结肠直肠癌(9.2％)、胃癌(8.2％)、肝癌(8.2％)和乳腺癌(6.6％)，而中国癌症的发病率、死亡率位居全球第一，其中结直肠癌的发病率和死亡率均位居恶性肿瘤第四位，严重威胁着人类健康。

以往结直肠癌的高发年龄多在50岁以后，但近年来临床数据表明我国结直肠癌患者的高发年龄提前至45岁左右，较欧美等国家提前了12-18年。动物脂肪和蛋白质摄入过高，食物纤维摄入不足是直肠癌发生的高危因素，在美国，西方化的饮食习惯会增加结直肠癌的发病率，但由于直肠镜的筛查已经非常普及，其CRC发病率无明显增长趋势。而在中国，人们对直肠癌的筛查意识较低，且常规化体检中缺乏癌症早期筛查项目，使我国结直肠癌的发病率和死亡率一直呈上升趋势。

早期结直肠癌一般无明显症状，多数患者被确诊时已处于中晚期，严重影响其治疗或预后。结直肠腺瘤的癌变通常耗时10年左右，其中0/Ⅰ期结直肠癌的5年存活率高达90％，而Ⅳ期的5年存活率仅为5％-7％，因此，结直肠癌的早期治疗成功率很高，早期筛查对后续的治疗或预后具有重要意义。此外，肠癌的早期治疗还能降低其治疗费用，减轻患者负担。

目前结直肠癌筛查的常用手段包括便潜血检查，乙状结肠镜，直肠指检和结肠镜等。结肠镜可作为结直肠癌筛查的金标准，但该方法具有侵入性，且对操作者技术要求较高，因此限制了起在常规体检中的应用。粪便潜血检查作为非侵入式的检测手段，其灵敏度和特异性亟待提升。因此，需要一种特异性强且灵敏度高的无创检测方法，有利于结直肠患者的筛查，诊断与治疗。

结直肠癌的发生发展机制十分复杂，其癌变过程是多条信号通路和多种基因参与的结果。有研究表明，基因的异常甲基化是导致结直肠癌发生发展的重要原因之一，可作为结直肠癌的诊断依据。DNA甲基化是指DNA序列上特定的碱基在DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferase，DNMT)的催化作用下，以s-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)作为甲基供体，通过共价键结合的方式获得一个甲基基团的化学修饰过程，DNA甲基化常发生于CpG岛(CpG位点富集的区域)处。研究显示，SEPT9，NDRG4，VIM，BMP3，SPG20，SDC2等基因的甲基化可作为检测结直肠癌的分子标志物。

调查表明多数患者更愿意选择无创的检测手段进行结直肠癌的筛查，因此利用粪便检测结直肠癌具有得天独厚的优势。目前市面上已有利用粪便检测结直肠癌基因甲基化的试剂盒，证明DNA甲基化可作为结直肠癌诊断的一种有效途径。但这些试剂盒存在待改进之处。如粪便样本的收集、保存和核酸提取方法有待优化；试剂盒检测灵敏度和特异性无法达到接近结肠镜的有效诊断率；检测成本较高等缺陷。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测基因甲基化的引物、试剂和试剂盒。采用本发明提供的引物检测基因甲基化具有更高的灵敏度和特异性。

本发明是这样实现的：

一方面，本发明提供一种用于检测基因甲基化的引物，其具有依次连接的如下区域：前互补区、第一错配区、中互补区、第二错配区以及后互补区；

其中，所述前互补区、所述中互补区以及所述后互补区与模板序列互补且每个互补区均覆盖CpG位点；所述第一错配区和所述第二错配区与模板序列不互补且不形成发卡结构。

其中，前互补区靠近引物的5’端，后互补区靠近引物的3’端。

传统的甲基化检测引物设计原理是使引物覆盖上若干CpG位点，与非甲基化序列不匹配，以达到在非甲基化背景下特异地识别甲基化模板。但这种设计带来的后果是检测特异性较差，往往无法完全地区分甲基化序列与非甲基化序列。

为了提高引物的识别能力，提高特异性，本发明提供一种新的检测基因甲基化的引物。本发明的引物在传统ARMS引物的设计基础上引入一种新的CpG位点引物设计方式：本发明的引物具有3个互补区，分别是前互补区、中互补区和后互补区，各互补区都覆盖CpG位点，两个互补区之间有一个错配区，共2个错配区；错配区的序列不与模板序列互补且自身不形成发卡结构(结构参考图1)。

本发明提供的引物的特点如下：

引物5'端的前互补区可以保证引物准确地锚定到目标序列；第一错配区在扩增过程中会形成一个长凸起，这个凸起会影响后面碱基与模板序列的结合情况，第二错配区在扩增过程中会形成一个短凸起；利用两个错配区分割引物，使其具有3个互补区；当模板序列上与这三个互补区对应区域的CpG位点均发生甲基化时，该引物才能与模板序列结合。通过此设计，可以极大的提高检测体系对CpG甲基化位点的识别能力，这样可以将扩增循环数提升至45，扩大了低丰度甲基化位点的检测范围，从而提高检测特异性和灵敏度。对于常规甲基化检测引物，检测效果并不是非常理想，本发明提供的引物可以克服这个难题，达到理想效果，具有更高的特异性和灵敏度。

可选的，在一些实施方式中，所述第一错配区的长度为4-7nt。

可选的，在一些实施方式中，所述第二错配区的长度为1-5nt。

本发明的发明人发现，错配区的长度会明显影响引物扩增的特异性，将第一错配区长度控制在4-7nt，第二错配区控制在1-5nt时，能够明显提高引物的特异性和灵敏度。

可选的，在一些实施方式中，所述前互补区的长度为13-15nt。

本发明的发明人还发现，前互补区的长度会影响引物与目标序列的结合，将前互补区的长度控制在13-15nt可以保证引物准确地锚定到目标序列。太长或太短均不利于引物与目标序列的结合。

可选的，在一些实施方式中，所述中互补区的长度为7-11nt。

可选的，在一些实施方式中，所述后补区的长度为1-4nt。

本发明的发明人还发现，中互补区的长度和后补区的长度也会影响引物的特异性和灵敏度，将中互补区的长度控制在7-11nt，后互补区的长度控制在1-4nt，可以提高引物的特异性和灵敏度。

可选的，在一些实施方式中，前互补区与第一错配区的长度比例为(13-15):(4-7)，例如可以是：13:6、14:5、15:4、13:7、14:6或15:5等。

可选的，在一些实施方式中，前互补区与第一错配区的长度比例为14:5。

可选的，在一些实施方式中，中互补区与第二错配区的长度比例为(8-12):(1-5)，例如可以是：12:1、11:2、10:3、9:4、或8:5等。

可选的，在一些实施方式中，中互补区与第二错配区的长度比例为10:3。

可选的，在一些实施方式中，所述前互补区、所述中互补区以及所述后互补区中的每个互补区的5’端覆盖CpG位点。

可选的，在一些实施方式中，每个互补区的5’端的第一位碱基为C碱基。

需要说明的是，本发明提供的引物的具体碱基序列可以根据模板序列或目标序列的设计，在本发明公开了上述引物结构的基础上，得到符合本发明引物结构的具体序列是容易实现的。

可选的，在一些实施方式中，上述用于检测基因甲基化的引物如SEQ ID NO.1、4、7或10所示。

另一方面，本发明提供一种检测SDC2基因甲基化的引物组，其包括如下引物组合中的任意一种或多种：引物组合1、引物组合2和引物组合3；

其中，引物组合1包括：SEQ ID NO.1上游引物和SEQ ID NO.3所示的下游引物；

引物组合2包括：SEQ ID NO.4所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物；

引物组合3包括：SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.9所示的下游引物。

本发明提供的引物组可以基于荧光定量PCR，对SDC2基因20个甲基化位点进行检测，该引物组中的上游引物经过合理优化，有效地提高了其检测的灵敏度，可以准确检测低至2ng/μL背景下1％的甲基化，能够满足临床常规组织样本检测需求。对于样本可以耐受10ng的基因组DNA背景干扰。

可选的，在一些实施方式中，所述引物组合1还包括如SEQ ID NO.2所示的特异性探针1；

可选的，在一些实施方式中，所述引物组合2还包括如SEQ ID NO.5所示的特异性探针2；

可选的，在一些实施方式中，所述引物组合3还包括如SEQ ID NO.8所示的特异性探针3；

可选的，在一些实施方式中，所述特异性探针1、所述特异性探针2和所述特异性探针3各自的两端分别带有荧光报告基团和荧光淬灭基团；

可选的，在一些实施方式中，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、ROX、CY3或CY5中的任意一种；

可选的，在一些实施方式中，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2或NFQ中的任意一种；

可选的，在一些实施方式中，所述特异性探针1、所述特异性探针2和所述特异性探针3各自还连接有MGB修饰基团，所述MGB修饰基团与所述荧光淬灭基团连接。

MGB修饰基团本身不产生荧光，因此可以大大降低本底信号的强度，同时该特异性探针上还连接有MGB修饰基团，可以将该探针的Tm值提高10℃左右，因此同样的Tm值，MGB探针可以比普通Taqman探针设计的更短，使得探针在退火过程中能优先于模板结合，特异性更强。

可选的，在一些实施方式中，特异性探针的荧光报告基团为FAM，特异性探针的荧光淬灭基团均为NFQ(Non-Fluorescent Quencher)。NFQ基团本身不产生荧光，因此可以大大降低本底信号的强度。

另一方面，本发明还提供一种检测SDC2基因甲基化的方法，其包括：将如上所述的引物组与待测样本的核酸模板置于PCR反应体系中进行PCR扩增。

可选的，在一些实施方式中，待检测样本的核酸模板为从粪便中提取的基因组DNA。

另一方面，本发明还提供一种检测SDC2基因甲基化的试剂或试剂盒，其包括如上任一项所述的引物组。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明提供的引物的结构示意图；

图2为实施例4中，具有不同长度的前互补区和第一错配区的引物的检测性能的结果；A-扩增效率检测结果，B-特异性检测结果。

图3为实施例4中，具有不同长度的中互补区和第二错配区的引物的检测性能的结果；A-扩增效率检测结果，B-特异性检测结果。

图4为实施例4中，具有不同长度的后互补区的引物的检测性能的结果；A-扩增效率检测结果，B-特异性检测结果。

图5为实施例8中，不同引物组的检测性能的结果；A-扩增效率检测结果，B-特异性检测结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供用于检测SDC2基因启动子区甲基化热点区域的引物组合，其为如下表1引物组中的任意一者：

表1

其中，上述引物组中的上游引物包括从5’端-3’端，包括：前互补区、第一错配区、中互补区、第二错配区以及后互补区；下划线处为错配区，该错配区与模板序列不互补且自身不形成发卡结构，错配区的两侧为互补区，共3个互补区，从5’端往3’端分别是：前互补区、中互补区和后互补区；各互补区与模板序列的对应区域互补，且每个互补区的5’端覆盖CpG位点(斜体大号字体位置)，本实施例中，每个互补区的5’端的第一位碱基为C。

SDC2基因启动子甲基化热点区域的碱基序列如下所示，下划线为甲基化热点位点，斜体阴影部分为甲基化热点区域(依次是SDC2-1热点区域(第1-77位)、SDC2-2热点区域(第277-347位)和SDC2-3热点区域(第583-673位))：AACGTAGGAGTTTTGGTTTGTCGGTGAGTAGAGTCGGCGTAGTTATAGCGCGGAGTCGCGGCGTTTATTGGTTTTCGGAGTTGTTAATCGGCGTGTAATTTTGTAGGAATTTTTTTCGGGTTTATTTGGGAGTTATATTGTCGTTTTTTTTTTTTAGTCGTTTAGGGGAGTTCGGAGAAGTAGGTTTAGGAGGGAGGGAGTTAGAGGAAAAGAAGAGGAGGAGAAGGAGGAGGATTCGGGGAGGGAGGCGCGGCGCGGGAGGAGGAGGGGCGTAGTCGCGGAGTTAGTGGTTTCGTTTGGACGCGTTGTTTTTTAGATATTTTCGGAGTTTTAGTCGCGCGGATCGCGCGTTTTCGTCGTTTTGTTTTTAAATTTTTGTCGTAGTTTTTTTTTAAGTTAGCGAATTTATTTTTTAAAATTAGAAATTGAATTTCGGTACGGGAAAGGAGTTCGCGGAGGAGTAAAATTATAGTAGAGTAAGAAGAGTTTTAGAGAGTAGTTTTTTCGGAGTATTAATTTCGTGTCGGGAGTGTAGAAATTAATAAGTGAGAGGGCGTCGCGTTTTCGGGGCGTAGTTGCGGGCGGCGGGAGTAGGCGTAGGAGGAGGAAGCGAGCGTTTTCGAGTTTCGAGTTCGAGTTTTCGAGTTTGAGTCGTAATCGTTGCGGTATTTTGTTTCGGATTCGTGTGCGCGGGTTGCGTCGAGCGTTGGGTAGGAGGTTTCGTTTTGTTTTGGTTGTAAGTAGCGGTTGGGAGTAGTCGGTTTTTGGGGAATATGCGGCGCGCGTGGATTTTGTTTATTTTGGGTTTGGTGGTTTGCGTGTCGGCGGAGTCGGTGAGTGGGTTAGGCGGAGGATGCGCGCGTCGTTTAGGGTGTTTGAAGTTACGAGAGGAGTTCGTAGGGAATAGGGGAGCGTTATTTGGGGAATTTTTAGTTTTTAAGTATATATCGGAGATTCGTTGGGATAAATGCGTTCGTTCGGTTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGAAAAGCGTTGTTCGTTGGCGTTATTTCGCGGTTCGCGGGAATGGGGGTATCGAGAATTGCGGTTTGGTTTAGTCGTAGAG。

实施例2

本实施例提供采用实施例1中任意一者引物组检测SDC2基因甲基化的方法，包括如下步骤：

1.粪便样本的提取

利用试剂盒提取粪便中的人源的DNA，所用到的人源DNA的提取是用商业化试剂盒NanoMagBio磁珠法粪便基因组提取试剂盒，货号NMG1202-100。所述粪便样本为经临床肠镜检测以及病例筛查确定为结直肠癌的患者粪便样本。其具体流程可参照商业试剂盒的说明书进行。

按照NanoMagBio磁珠法粪便基因组提取试剂盒标准操作流程：

(1)使用保存液按照3ml保存液/1g粪便的比例混合重悬，12000rpm 1min取200ul上清。加入450ul裂解液10ul蛋白酶K，70℃金属浴裂解10min；

(2)裂解结束，12000rpm、2min；取上清(尽量避免取到上层油状物，液态粪便可省去此步操作)；

(3)向离心管加入150ul除杂剂，充分混匀，4℃冰浴5min；

(4)将离心管12000rpm离心2min，取400μL上层清液至一新离心管中；

(5)向离心管中加入500ul结合液和20μL磁珠(磁珠使用前需充分混匀)，振荡混匀1min，室温静置10min，每3min混匀一次；

(6)将离心管置于磁力架上，静置1min，期间颠倒磁力架5～6次，使管盖上的磁珠被磁力架吸附，用移液器吸去管盖和管中的液体；

(7)取下离心管，加入500μL洗涤液Ⅰ，将离心管充分振荡混匀1min后，期间颠倒磁力架5～6次，使管盖上的磁珠被磁力架吸附，置于磁力架上，静置30s，磁珠完全吸附后，吸弃上清；

(8)取下离心管，加入600μL洗涤液II，将离心管充分振荡混匀1min后，期间颠倒磁力架5～6次，使管盖上的磁珠被磁力架吸附，置于磁力架上，静置30s，磁珠完全吸附后，吸弃上清；

(9)重复步骤8；

(10)步骤9吸弃上清后，打开管盖，室温干燥3min至乙醇挥发完全；

(11)取下离心管，加入50～100μL洗脱液，振荡混匀使磁珠完全浸没在洗脱液中，再置于65℃孵育10min，期间混匀2次；

(12)将离心管短离心，置于磁力架上，静置30s，待磁珠完全吸附，用移液器将液体转移至一新离心管中(切勿吸到磁珠)，所得溶液即为提取的核酸样品；

(13)该样品可以直接用于下游实验，若要长时间保存，请置于-20℃冰箱。

2重亚硫酸盐转化

对获得的粪便DNA进行甲基化处理。

DNA甲基化处理采用商业化试剂盒为QIAGEN EpiTect Bisulfite，货号：59104。在进行甲基化处理过程中，重亚硫酸盐能够将所有未发生甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不发生改变。具体来说，经过处理后，SDC2基因序列中没有发生甲基化的C变为U，后续在进行荧光定量PCR反应过程中，引物探针特异性地捕获结合发生甲基化的C位点发出荧光，而未发生甲基化的SDC2基因无法与引物探针结合，不发出荧光。

其中，利用甲基化试剂盒处理过程如下：

Qiagen试剂盒转化流程：

(1)每管Bisulfite mix中加入800μl的无RNA酶水，涡旋混匀直至完全溶解，耗时5min；若室温下溶解不彻底，可于60℃加热后再涡旋混匀；

(2)在200ul PCR管中按下表比例加入反应液；

(3)室温下混匀反应液，DNA protect Buffer由绿变蓝表明混合充分且pH值适宜；

(4)在普通PCR仪上进行反应，耗时约5h；(若PCR仪最大允许体积无法达到140μl，将其设置为最大反应体积即可，如100μl)，程序如下：

步骤	时间	孵育温度
			变性	5min	95℃
孵育	25min	60℃
			变性	5min	95℃
孵育	85min	60℃
			变性	5min	95℃
孵育	175min	60℃
				∞	20℃

(5)将PCR管放入仪器中开始反应，可放置过夜，注意使用带有热盖的PCR仪；

(6)转化完成后，简单离心后将其转入干净的1.5ml EP管中；

(7)Buffer BL和Carrier RNA Solution的混合液现配现用，将560μl混合液加入每管样品中，涡旋混匀后简单离心；

(8)准备相应数量的离心柱和收集管，将混合液转移到安装好的离心管中；

(9)以离心机的最大转速离心1min，除去废液后将离心柱装回收集管；

(10)每管中加入500μl的Buffer BW，继续以最大转速离心1min，去除废液；

(11)再加入500μl的Buffer BD，室温孵育15min；(若Buffer BD中有白色沉淀，避免将其转移至混合液中；Buffer BD取完后立即密封，以防氧化)；

(12)以最大转速离心1min，除去废液后将离心柱装回收集管；

(13)加入500μl的Buffer BW，以最大转速离心1分钟后去除废液；

(14)重复步骤13；

(15)将柱子转移至新的2ml离心管中，以最大速度离心1min，去除废液，可多离心几遍保证废液除尽；

(16)推荐：将开盖的离心柱置于洁净的1.5ml离心管，在56℃下孵育5min；

(17)将离心柱置于洁净的1.5ml离心管，取20μl Buffer EB置于滤膜中央，15000g或12000rpm转速下离心1min；为增加纯化DNA的产量，可再次加入或分批加入20μl的BufferEB溶液。获得DNA核酸模板。

3荧光定量PCR检测

将经过重亚硫酸盐转化后的DNA进行荧光定量PCR(qPCR)，其中qPCR的体系和程序分别如下所示：

2*PCR buffer	12.5μL
		SDC2-F(100mM)	0.05μL
SDC2-R(100mM)	0.05μL
		SDC2-P(100mM)	0.04μL
ACTB-F(100mM)	0.01μL
		ACTB-R(100mM)	0.01μL
ACTB-P(100mM)	0.025μL
		Hs Taq	0.2μL
ROX	0.4μL
		DNase/RNase-Free Distilled water	6.715μL
DNA模板	5μL
		总体积	25μL

ACTB基因检测所用的引物探针序列如下：

ACTB-F:GTGTTTAAGATAGTGTTGTGGGTG；

ACTB-R:CCTACTTAATACACACTCCAAAACCACTTTA；

ACTB-P:VIC-TGATAAGGTTATGAGGTTGGTG-MGB。

结果判读：

ACTB基因CT值≤36，甲基化SDC2基因CT值≤38时，判断样本为阳性；

ACTB基因CT值≤36，甲基化SDC2基因CT值＞38时，判断样本为阴性性；

ACTB基因CT值＜36或无CT值时，判定为样本不合格。

实施例3

参考品设置

取SDC2基因非甲基化人类基因组DNA、SDC2基因甲基化人类基因组DNA配制成甲基化DNA，比例分别为0％、1％、2.5％、5％、10％的起始量分别为10ng、5ng、2ng、1ng的DNA样本为待测样本(见表2)，按照实施例2的qPCR检测步骤进行检测，结果见表7(组合1、组合3和组合5)。

表2

从检测结果可知，引物组SDC2-1、SDC2-2和SDC2-3均能稳定检出1ng/μL基因组背景下低至1％的甲基化DNA。

实施例4

以SDC2-1热点区域为模板序列，设计不同长度的上游引物，比较其检测效果。

(1)前互补区及第一错配区具有不同长度和长度比对扩增效率和特异性的影响。

固定中互补区、第二错配区及后互补区长度，设置一系列长度的前互补区及第一错配区的上游引物，见下表3。

表3

将表4中的上游引物分别与表1中的SDC2-P1和SDC2-R1组合，形成不同的引物组，并进行使用以上引物组合对实施例3中的参考品进行检测，以评估不同引物的扩增效率和特异性；结果见图2。可以看出，当前互补区长度为14bp，第一错配区长度为5bp时，引物组的扩增效率及特异性最优。

(2)中互补区与第二错配区具有不同长度和长度比对扩增效率和特异性的影响。

固定前互补区、第一错配区及后互补区长度，设置一系列长度的中互补区与第二错配区的上游引物，见下表4。

表4

将表4中的上游引物分别与表1中的SDC2-P1和SDC2-R1组合，形成不同的引物组，并使用以上引物组合对实施例3中的参考品进行检测，以评估不同引物的扩增效率和特异性；结果见图3。可以看出，结果显示，中互补区长度为10bp，第二错配区长度为3bp时，引物组的扩增效率及特异性最优。

(3)后互补区具有不同长度对扩增效率和特异性的影响。

固定前互补区、第一错配区、中互补区与第二错配区，设置一系列长度的后，见下表5。

表5

将表6中的上游引物分别与表1中的SDC2-P1和SDC2-R1组合，形成不同的引物组，并使用以上引物组合对实施例3中的参考品进行检测，以评估不同引物的扩增效率和特异性；结果见图4。可以看出，当后互补区长度为2bp时，引物组的扩增效率及特异性最优。

实施例5

实施例1的引物组与常规甲基化引物的性能比较。

在SDC2基因启动子区域选取3’端热点区域SDC2-1、SDC2-2、SDC2-3作为研究对象，分别以实施例1的引物组以及常规甲基化检测引物设计方式设计的引物组进行检测，以比较二者的检测性能。

针对SDC2-1区域的对比：

组合1：表1中的SDC2-1引物组：

SDC2-aF1:CGTAGGAGTTTTGGGAGTCCGGTGAGTAGCAACG；

SDC2-P1:FAM-CGTAGTTATAGCGCGGA-MGB；

SDC2-R1:CGAAAACCAATAAACGCCGCG。

组合2：常规甲基化引物：

SDC2-bF2:CGTAGGAGTTTTGGTTTGTCGGTGAGTAGAGTC；

SDC2-P1:FAM-CGTAGTTATAGCGCGGA-MGB；

SDC2-R1:CGAAAACCAATAAACGCCGCG。

针对SDC2-2区域的对比：

组合3：表1中的SDC2-2引物组：

SDC2-aF2:CGCGGAGTTAGTAACCCCGTTTAACCG；

SDC2-P2:FAM-CGTTGTTTTTTAGATATTTTCG-MGB；

SDC2-R2:GCGATCCGCGCGACT。

组合4：常规甲基化引物组：

SDC2-bF2:CGCGGAGTTAGTGGTTTCGTTTGGAC；

SDC2-P2:FAM-CGTTGTTTTTTAGATATTTTCG-MGB；

SDC2-R2:GCGATCCGCGCGACT。

针对SDC2-3区域的对比：

组合5：表1中的SDC2-3引物组：

SDC2-aF3:CGGCGGGAGCGTTCGTAGGAGGAGGGGCCG；

SDC2-P3:FAM-AGCGTTTTCGAGTTTCGA-MGB；

SDC2-R3:CAAAATACCGCAACGATTACG

组合6：常规甲基化引物：

SDC2-bF3:CGGCGGGAGTAGGCGTAGGAGGAGGAAGC；

SDC2-P3:FAM-AGCGTTTTCGAGTTTCGA-MGB；

SDC2-R3:CAAAATACCGCAACGATTACG。

以不同甲基化DNA比例，不同起始量DNA样本为模板进行检测，以分析组合1-6的引物组的扩增效率和特异性，结果见下表6。

表6

由以上实验结果可看出，实施例1中表1的引物组(组合1、组合3、组合5)，无论是在扩增效率还是特异性上，均要优于使用常规设计思路所设计的甲基化引物组合(组合2、组合4、组合6)。

实施例6

SDC2基因启动子区的三个甲基化热点区域的诊断性能评价。

本实施例中通过对来自50例健康人以及50例结直肠癌患者粪便样本进行甲基化检测，以评估实施例1中的引物组(SDC2-1、SDC2-2和SDC2-3)的诊断性能。样本处理和检测方法参考实施例2进行；结果见下表7。

表7

SDC2基因启动子区的三个甲基化热点区域的诊断性能评价结果如下表8。

表8

	SDC2-1热点区域	SDC2-2热点区域	SDC2-3热点区域
				灵敏度	98.00％(49/50)	74.00％(37/50)	92.00％(46/50)
特异性	100.00％(50/50)	84.00％(42/50)	88.00％(44/50)
				符合率	99.00％(99/100)	79.00％(79/100)	90.00％(90/100)

由以上数据可知，在SDC2基因启动子的热点区域1有着良好的诊断性能，在正常人以及结直肠癌患者的粪便DNA中表现出良好的区分能力。即采用SDC2-1引物组具有更为准确的诊断结果。

实施例7

本实施例提供用于检测SFRP2基因甲基化热点区域的引物组，其包括如下引物：

SFRP2-F1:TGAACGGTGGCTGGCTCGGCGAGGGACCCCG(SEQ ID NO.10)；

SFRP2-R:GAACTTCGTTTTCCCTCG(SEQ ID NO.11)；

SFRP2-P:5’-FAM-CGAGGCGGCCTCGGGC-MGB-3’(SEQ ID NO.12)。

SFRP2基因甲基化热点区域的碱基序列如下：

CGTTTCTACAACGACGAAACCCTTCCTAGGCACTCACTCCAACAGAATAACAAGCCCATTTTATTAGTATTTCGTTTTCCATGTAAAGTTCTGCTCATACGAATATATTTATAATTCTGATTTTTTTACGGCATTGGGGAGCACACCGACAGGCTGCTGAACGGTGGCTGGAGATTCGAGGGAAAACGAAGTTCGCCGAGGCGGCCTCGGGCGGGCAGGTCCCGGGCTCCATCACAGGGCACACGCGGCTACCAGGGAC。

实施例8

以实施例7的引物组以及常规甲基化检测引物设计方式设计的引物组进行检测，比较二者的检测性能。

组合7：实施例7的引物组：

SFRP2-F1:TGAACGGTGGCTGGCTCGGCGAGGGACCCCG；

SFRP2-R:GAACTTCGTTTTCCCTCG；

SFRP2-P:5’-FAM-CGAGGCGGCCTCGGGC-MGB-3’。

组合8：常规甲基化检测引物：

SFRP2-F2:TGAACGGTGGCTGGAGATTCGAGGGAAAACG；

SFRP2-R:GAACTTCGTTTTCCCTCG；

SFRP2-P:5’-FAM-CGAGGCGGCCTCGGGC-MGB-3’。

使用上述两种引物组检测SFRP2甲基化参考品，分析二者的扩增效率和特异性，结果见图5。

检测结果显示，使用实施例7的引物组，无论是在扩增效率还是特异性上，均要优于常规设计的甲基化引物。

综上结果，可以看出，使用本发明提供的甲基化检测引物，不仅可以应用于SDC2基因的甲基化检测，也可以应用于其他基因的甲基化检测，具有广阔的应用场景，能够取得较高的扩增效率、灵敏度和特异性的效果；此外，值得注意的是，采用本发明实施例1提供的SDC2-1引物组进行甲基化检测时，并用检测结果对结直肠癌诊断，具有更为准确的诊断结果。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉友芝友医疗科技股份有限公司

<120> 检测基因甲基化的引物、试剂和试剂盒

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgtaggagtt ttgggagtcc ggtgagtagc aacg 34

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgtagttata gcgcgga 17

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgaaaaccaa taaacgccgc g 21

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgcggagtta gtaaccccgt ttaaccg 27

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgttgttttt tagatatttt cg 22

<210> 6

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcgatccgcg cgact 15

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cggcgggagc gttcgtagga ggaggggccg 30

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agcgttttcg agtttcga 18

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

caaaataccg caacgattac g 21

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tgaacggtgg ctggctcggc gagggacccc g 31

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gaacttcgtt ttccctcg 18

<210> 12

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cgaggcggcc tcgggc 16

Claims (15)

1.一种用于检测基因甲基化的引物，其特征在于，其具有依次连接的如下区域：前互补区、第一错配区、中互补区、第二错配区以及后互补区；

其中，所述前互补区、所述中互补区以及所述后互补区与模板序列互补且每个互补区均覆盖CpG位点；所述第一错配区和所述第二错配区与模板序列不互补且不形成发卡结构；所述第一错配区的长度为4-7nt；所述第二错配区的长度为1-5nt；所述前互补区的长度为13-15nt；所述中互补区的长度为7-11 nt；所述后互补区的长度为1-4 nt。

2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述前互补区、所述中互补区以及所述后互补区中的每个互补区的5’端覆盖CpG位点。

3.根据权利要求2所述的引物，其特征在于，所述前互补区、所述中互补区以及所述后互补区中的每个互补区的5’端的第一位碱基为C。

4.一种检测SDC2基因甲基化的引物组，其特征在于，其包括如下引物组合中的任意一种或多种：引物组合1、引物组合2和引物组合3；

其中，引物组合1包括：SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.3所示的下游引物；

引物组合2包括：SEQ ID NO.4所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物；

引物组合3包括：SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.9所示的下游引物。

5.根据权利要求4所述的引物组，其特征在于，所述引物组合1还包括如SEQ ID NO.2所示的特异性探针1。

6.根据权利要求4所述的引物组，其特征在于，所述引物组合2还包括如SEQ ID NO.5所示的特异性探针2。

7.根据权利要求4所述的引物组，其特征在于，所述引物组合3还包括如SEQ ID NO.8所示的特异性探针3。

8.根据权利要求5~7任一项所述的引物组，其特征在于，所述特异性探针1、所述特异性探针2或所述特异性探针3各自的两端分别带有荧光报告基团和荧光淬灭基团。

9.根据权利要求8所述的引物组，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、ROX、CY3或CY5中的任意一种。

10.根据权利要求8所述的引物组，其特征在于，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2或NFQ中的任意一种。

11.根据权利要求8所述的引物组，其特征在于，所述特异性探针1、所述特异性探针2或所述特异性探针3各自还连接有MGB修饰基团，所述MGB修饰基团与所述荧光淬灭基团连接。

12.一种检测SDC2基因甲基化的方法，其特征在于，其包括：将权利要求4~11任一项所述的引物组与待测样本的核酸模板置于PCR反应体系中进行PCR扩增；所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，在所述PCR反应体系中，当存在特异性探针时；上游引物、下游引物以及特异性探针的浓度比为0.1μM-0.5μM：0.1μM-0.5μM：0.1μM-0.2μM。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其特征在于，进行PCR扩增的条件如下：36-38℃、9-11 min；94-96℃、4-6 min；94-96℃、4-6 s，58-63℃、59-61 s，44-46个循环。

15.一种检测SDC2基因甲基化的试剂或试剂盒，其特征在于，其包括权利要求4~11任一项所述的引物组。

Images