CN114292911A - 用于肠癌早筛的组合物、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出了用于肠癌早筛的组合物、试剂盒及其应用，该组合物包含用于检测靶基因甲基化状态的试剂，所述靶基因为SFRP2。利用本发明提出的组合物可以高效准确的对肠癌进行检测，并利用肠癌检测结果进行临床治疗或科学研究。

Description

用于肠癌早筛的组合物、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及用于肠癌早筛的组合物、试剂盒及应用。

背景技术

结直肠癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，每年全世界将近有14万例新增病例和700000例死亡病例，其发病率呈明显的上升趋势，居全球恶性肿瘤第3位，已经成为威胁人类健康的重大疾病。由于结直肠癌患病初期没有明显的症状，大多发现症状时癌细胞已经扩散，治疗效果不明显。因此实现结直肠癌早筛能够有效的预防结直肠癌的病发率。目前结直肠癌相关的临床或实验室诊断方法有粪便隐血检测、肠镜检查等方法；其中肠镜检查具有较高的灵敏度和特异性，是结直肠癌最普遍的筛查金标准。然而，肠镜检查是一种创伤性检查，面临穿孔、出血等风险，要求操作者需要有丰富的临床经验；同时不同医生对肠镜结果的判断标准也有差异，该方法的推广性不强。因此需要探索出一种早发现、便捷、无创以及高灵敏度和特异性的肠癌筛查方法。

在高达90％的结直肠癌中，异常Wnt通路信号是结直肠癌发生发展中的一个早期事件。Suzuki等人发现了大肠癌中分泌型卷曲相关蛋白(SFRP)基因的启动子频繁高甲基化和基因沉默，其中人类染色体4q31.3处的SFRP2基因被认为是一个被大肠癌表观遗传CpG高甲基化失活的抑癌基因。SFRP2被分成三个大小可变的外显子，由两个内含子隔开，在其第一个外显子周围有密集的CpG岛。CpG岛与肿瘤细胞DNA甲基化密切相关。据报道，其在大肠癌标本中的表达受到从基因5'端区域延伸至第一外显子的CpG岛的超甲基化的抑制。在大肠癌中，SFRP2基因通常被鉴定为在正常结肠粘膜中未甲基化和表达，但在大肠癌中甲基化和沉默。

因此，检测粪便中SFRP2基因的甲基化为大肠癌的检测和研究提供了一种新的策略。

发明内容

本申请是基于发明人对以下问题的发现和认识作出的：

发明人发现，粪便DNA中SFRP2基因甲基化，从正常人群到增生性息肉到腺瘤患者，是显著增加的，表明粪便DNA中SFRP2基因甲基化是潜在的非侵入性的结直肠癌诊断标志物。

因此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种组合物。根据本发明的实施例，所述包含用于检测靶基因甲基化状态的试剂，所述靶基因为SFRP2。根据本发明的实施例，所述组合物可准确、高效的检测SFRP2基因甲基化状态。

根据本发明的实施例，上述组合物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述组合物包括引物组和探针组。

根据本发明的实施例，所述引物组包括：第一对引物和第二对引物，所述第一对引物为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示序列，所述第二对引物为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示序列。

所述SEQ ID NO:1具体序列为：5’-GTGATGGAGGAGGTTTAGTAA-3’。

所述SEQ ID NO:2具体序列为：5’-CCAATAAAACCTACTCCTCCCT-3’。

所述SEQ ID NO:3具体序列为：5’-TTTTACGGTATTGGGGAGTATATCG-3’。

所述SEQ ID NO:4具体序列为：5’-ACCGCCTCGACGAACTTC-3’。

根据本发明的实施例，所述探针组包括：第一探针和第二探针，其核酸序列如SEQID NO:5或6所示。

所述SEQ ID NO:5具体序列为：5’-CACCCAACACACAATAACAAACACA-3’。

所述SEQ ID NO:6具体序列为：5’-CGAATCTCCAACCACCGTT-3’。

根据本发明的实施例，所述探针组中的探针进一步携带荧光基团。

根据本发明的实施例，所述第一探针携带第一荧光基团，第二探针携带第二荧光基团，且第一、第二荧光基团不同。

根据本发明的实施例，所述探针5’端标记的荧光基团选自下列至少之一：FAM、ROX、VIC、CY5、CY3、HEX、5-TAMRA、TET和JOE，3’端包含一个非荧光淬灭基团(NFQ)和一个MGB(小沟结合物)部分。

在本发明的第二方面，本发明提出了试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断结直肠癌，所述试剂包含权利要求1～4任一项所述的组合物。根据本发明的实施例，所述试剂盒可准确、高效的检测SFRP2基因甲基化状态，用于临床诊断或科学研究。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种PCR方法，其特征在于，对待测样品进行PCR扩增，其中，所述PCR扩增中的所用引物组和探针组如第一方面所限定的，所述待测样品含有靶标核酸，所述靶标核酸为SFRP2基因。根据本发明实施例的PCR方法可以准确检测SFRP2基因甲基化状态。

根据本发明的实施例，所述PCR扩增试剂盒的反应程序为：95℃、5min，1个循环；95℃、15s，60℃、40s，48个循环；25℃、10s，1个循环。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种确定SFRP2基因甲基化状态的方法，所述方法包括：1)获取待测样品的基因组DNA，其中，所述待测样品含有靶标核酸，所述靶标核酸为SFRP2基因；2)对所述基因组DNA进行甲基化转化处理，以便获得转化产物，其中，所述转化产物的胞嘧啶转化为尿嘧啶；3)利用权利要求1所述的组合物对所述转化产物进行qPCR检测；4)基于qPCR荧光信号，确定所述待测样品中是否含有甲基化的SFRP2基因。根据本发明实施例，利用所述方法可准确、高效的确定SFRP2基因甲基化状态，从而判断待测样本的来源。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，检测到所述第一荧光基团发出荧光信号，是待测样品中含有甲基化的SFRP2基因的指示。

根据本发明的实施例，进一步根据所述荧光信号的强弱，确定待测样品中甲基化的SFRP2基因含量。

在本发明的第五方面，本发明提出了一种判断待测样本来源的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：1)利用第四方面所述的方法确定SFRP2基因的甲基化状态；以及2)基于qPCR技术，各自独立地检测第一荧光基团、第二荧光基团通道的Ct值；3)基于所述第一荧光基团、第二荧光基团通道的Ct值，各自独立地获取所述第一荧光基团通道和/或所述第二荧光基团通道的ΔCt值，其中，所述ΔCt＝利用所述第二探针获得的Ct值-利用所述第一探针获得的Ct值；4)基于所述ΔCt和Ct值，判断所述待测样本是否来源于肠癌患者。根据本发明的实施例，所述方法可准确、高效的确定SFRP2基因甲基化状态，从而判断待测样本的来源。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述肠癌为结肠癌和/或直肠癌。

根据本发明的实施例，所述第一荧光基团通道的ΔCt值不大于8时，是待测样本为阳性的指示；所述第一荧光基团通道的ΔCt值大于8时，是待测样本为阴性的指示；所述第二荧光基团通道的Ct值大于38.5时，是质控失败的指示。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是根据本发明实施例的内参基因ACTB检测的荧光定量扩增曲线图，其中，阳性质控品对照为人甲基化全基因组DNA，阴性质控品对照为人非甲基化全基因组DNA，空白对照为：无核酸酶水，其中，Cycle表示循环数，Sample1表示样品1；

图2是根据本发明实施例的SFRP2基因甲基化水平的荧光定量扩增曲线图，其中，Cycle表示循环数，Sample1表示样品1；以及

图3是根据本发明实施例的SFRP2基因检测结直肠癌的ROC曲线图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本发明的一个方面，本发明提供了一种用于检测靶基因甲基化状态的组合物，包含用于检测SFRP2基因的试剂。本文中所提到的组合物不要求必须两种或者以上的物质以混合接触的形式存在，所提到的组合物是指在使用时在同一环境下应用。

本文中所提及的SFRP2基因的甲基化修饰与癌症的发生发展密切相关，在正常组织和患癌组织中表现出显著的差异。本发明将SFRP2基因作为生物标志物用于制备或筛选结直肠癌早期诊断试剂，所述试剂可用于临床诊断或科学研究。

在至少一些实施方案中，所述组合物包括引物组和探针组。文中所提供到的“引物”是指具有游离3’羟基的短的核酸序列，所述核酸序列可与互补模板形成碱基对并充当模板链复制的起点。在适当的缓冲液和温度条件下，引物可在不同的核苷三磷酸和聚合试剂(如DNA聚合酶或者逆转录酶)存在的情况下启动DNA的合成。

术语“探针”是指多核苷酸的片段，例如RNA或者DNA，能够特异性结合特定基因的mRNA或互补DNA(cDNA)，并且具有几个至数百个碱基对的长度。由于探针是标记的，因此探针可用于检查要结合的靶mRNA或者cDNA的存在与否或者表达水平。

在一些实施方案中，所述引物组包括：第一对引物和第二对引物，所述第一对引物为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示序列，所述第二对引物为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示序列。

在一些实施方案中，所述探针组包括：第一探针和第二探针，其核酸序列如SEQ IDNO:5或6所示。

所提到的序列中的至少一对是指某一相同基因(即本文提到的SFRP2基因)的任意正向引物和任意反向引物作为一对引物。需要说明的是，用于同一基因的引物和探针在组合使用时，可以将某一相同基因的任意正向引物和位于该正向引物后的反向引物，以及位于正、反向引物间的探针均可以组合使用，即可以实现结直肠癌相关基因的扩增和检测。本领域技术人员可以根据本文提供的序列，将序列比对到基因组上，选择引物和探针的组合进行使用。

这些引物组和探针是针对相关基因SFRP2甲基化修饰后的序列进行设计，能够特异性地识别被甲基化修饰的序列；而以β-actin基因作为内参，内参基因的扩增不会受到甲基化修饰的影响，因此能够对样本中的模板数进行定量；通过计算目的基因Ct值与内参基因Ct值的差值，能够实现对样本的甲基化程度进行判定，从而可以用于帮助检测结直肠癌。

在一些具体实施例中，所述探针组中的探针进一步携带荧光基团，所述第一探针携带第一荧光基团，第二探针携带第二荧光基团，且第一、第二荧光基团不同，所述荧光基团选自下列至少之一：FAM、ROX、VIC、CY5、CY3、HEX、5-TAMRA、TET和JOE。所提到的探针的5’端可以连接FAM、VIC荧光基团，3’端可以连接MGB等淬灭基团。所用到的荧光基团和淬灭基团可以为本领域常用的基团。

在本发明的一个方面，本发明提出了试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断结直肠癌，所述试剂包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示序列。

在本发明的一个方面，本发明提出了一种试剂盒，所述试剂盒包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示序列。

在本发明的一个方面，本发明提出了一种PCR方法，对待测样品进行PCR扩增，其中，所述PCR扩增中的所用引物组和探针组如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示序列，其中，所述第一探针携带第一荧光基团，第二探针携带第二荧光基团，且第一、第二荧光基团不同，所述荧光基团选自下列至少之一：FAM、ROX、VIC、CY5、CY3、HEX、5-TAMRA、TET和JOE。所述待测样品含有靶标核酸，所述靶标核酸为SFRP2基因；所述PCR扩增的反应程序为：95℃、5min，1个循环；95℃、15s，60℃、40s，48个循环；25℃、10s，1个循环。

在本发明的一个方面，本发明提出了一种确定SFRP2基因甲基化状态的方法，所述方法包括：1)获取待测样品的基因组DNA，其中，所述待测样品含有靶标核酸，所述靶标核酸为SFRP2基因；2)对所述基因组DNA进行甲基化转化处理，以便获得转化产物，其中，所述转化产物的胞嘧啶转化为尿嘧啶；3)利用所述的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示序列或所述的试剂盒对所述转化产物进行qPCR检测，所述qPCR检测条件如所述PCR方法所限定的；4)基于qPCR荧光信号，确定所述待测样品中是否含有甲基化的SFRP2基因；当检测到所述第一荧光基团发出荧光信号，是待测样品中含有甲基化的SFRP2基因的指示；并进一步根据所述荧光信号的强弱，确定待测样品中甲基化的SFRP2基因含量。

在本发明的一个方面，本发明提出了一种判断待测样本来源的方法，包括：1)利用所述的PCR方法方法确定SFRP2基因的甲基化状态；以及2)基于qPCR技术，各自独立地检测第一荧光基团、第二荧光基团通道的Ct值；3)基于所述第一荧光基团、第二荧光基团通道的Ct值，各自独立地获取所述第一荧光基团通道和/或所述第二荧光基团通道的ΔCt值，其中，所述ΔCt＝利用所述第二探针获得的Ct值-利用所述第一探针获得的Ct值；4)基于所述ΔCt和Ct值，判断所述待测样本是否来源于肠癌患者。

在一些具体实施例中，所述肠癌为结肠癌和/或直肠癌。

在一些具体实施例中，所述第一荧光基团通道的ΔCt值不大于8时，是待测样本为阳性的指示；所述第一荧光基团通道的ΔCt值大于8时，是待测样本为阴性的指示；所述第二荧光基团通道的Ct值大于38.5时，是质控失败的指示。

所述结直肠癌早期诊断试剂可以通过荧光定量PCR(qPCR)技术，对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析粪便中SFRP2基因甲基化水平，达到早发现、便捷、无创以及高灵敏度和特异性地筛查诊断结直肠癌及癌前病变的目的。通过检测SFRP2基因甲基化能有效判断待测样本是否为结直肠癌患者。

下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。

实施例1试剂盒的制备及使用

本发明的试剂盒中，包括SFRP2基因检测引物及探针、β-actin基因检测引物及探针，具体核苷酸序列如表1所示，具体实验操作如下：

表1：

1、粪便样本DNA提取

粪便样本的提取采用货号为51604的QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit，可确保从粪便样本中获得高产量的DNA，且能够高效去除粪便样本中的PCR抑制剂，适用于下游的检测，具体操作流程如下：

1、向样本中加入1ml InhibitEX Buffer，涡旋1min至样本充分均质，16000g离心1min；

2、取25μL蛋白酶K至新的离心管，并吸取600μL前一步上清至蛋白酶K管，加入600μL Buffer AL并涡旋15s，置于70℃孵育10min；

3、加入600μL乙醇，并涡旋混匀，分三次QIAamp spin column，每次在16000g离心1min；

4、小心向柱上加入500μL Buffer AW1，在16000g离心1min，除去收集管内液体；

5、向柱上加入500μL Buffer AW2，在16000g离心3min，除去收集管内液体；

6、继续在16000g离心3min，将QIAamp spin column移至新的1.5ml离心管，加入200μL Buffer ATE，室温放置1min，并在16000g离心1min，获得DNA，用于后续操作。

2、亚硫酸盐转化DNA

将实施例1中提取获得的DNA使用Zymo Research公司生产的货号为D5005的商业化EZ DNA Methylation Kit试剂盒进行亚硫酸盐转化，以进一步降低甲基化转化过程中宿主DNA的损失率，提高低拷贝宿主DNA甲基化的检测灵敏度，具体的亚硫酸盐转化方法可包括如下步骤：

上述提取好的20μL DNA样本中加入130μL CT Conversion Reagent(现配现用)，涡旋混匀后按照(98℃，10min；64℃，2.5h)的条件进行转化反应；

(2)吸附柱中加入600μL M-Binding Buffer，然后再将转化的样本加入体系中，颠倒数次混匀，10000rpm离心30s，吸除下层溶液；

(3)向吸附柱中加入100μL M-Wash Buffer，10000rpm离心1min，吸除下层溶液；

(4)向吸附柱中200μL M-Desulphonation Buffer，室温放置20min，然后10000rpm离心1min，吸除下层溶液；

(5)向吸附柱内加入200μL M-Wash Buffer，10000rpm离心1min，吸除下层溶液；

(6)重复上述步骤；将吸附柱转移到新的收集管，加15μL MElution Buffer，室温放置5min后，在10000rpm离心1min。

(7)获得亚硫酸盐转化后的DNA，用于后续检测。

此处说明的是，根据“亚硫酸氢盐能够将所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变”的原理，对由粪便中提取的宿主DNA进行甲基化处理。

3、qMSP检测

利用上述试剂中的引物及探针(表1)对上述亚硫酸盐转化后的DNA进行甲基化定量PCR。

检测SFRP2/β-actin基因的qMSP体系如表2所示：

表2：

成分	添加量(μL)
		用于检测基因的PCR探针引物预混液	2.5
2*PCR buffer	17.5
		亚硫酸盐转化后的DNA模板量	15
合计	35

qMSP程序如表3所示：

表3：

两种基因β-actin、SFRP2荧光定量扩增曲线分别如图1和图2所示，扩增效果良好，可用于后续实验。

实施例2本发明试剂盒结直肠癌检测性能

1、粪便样本的DNA提取

临床收集70例样本，其中40例为肠镜及病理检查确诊为肠癌的患者的粪便样本，30例为肠镜检查确诊为正常的患者的粪便样本。对所得粪便样本进行DNA提取。

具体的提取方法可包括如下步骤：

根据实施例1中的提取方法实施。

2、亚硫酸盐转化

根据实施例1中的亚硫酸盐转化方法实施。

3、qMSP检测

采用实施例1中的试剂对上述亚硫酸盐转化后的DNA进行甲基化定量PCR。

4、结果判读

检测结果判定标准为：内参基因符合要求(内参≤38.5)，且其中目的基因满足扩增曲线正常呈指数增长且ΔCt≤8时，计为阳性；ΔCt>8则计为阴性。

利用SFRP2单独作为生物标志物，对共70例样本进行诊断和分析。

检测结果分别如图3，以SFRP2作为生物标志物时，其检测结直肠癌的灵敏度为90％，特异性为93.33％，估计ROC(receiver-operating characteristic)曲线下面积AUC(AUC越大，表示诊断能力越高)，受试者曲线下面积为0.91。

注：

灵敏度(真阳性率，sensitivity)＝真阳性人数/(真阳性人数+假阴性人数)*100％。

指正确判断病人的程度，即实际有病而被正确诊断的百分比。

特异性(真阴性率，specificity)＝真阴性人数/(真阴性人数+假阳性人数)*100％。

指正确判断非病人的程度，即实际无病而被正确诊断为无病的百分比。

由上述结果可得：利用SFRP2基因作为生物标志物进行检测可以明显提高早期肠癌的检出率。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海锐翌生物科技有限公司

<120> 用于肠癌早筛的组合物、试剂盒及其应用

<130> SI4210136

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1

<400> 1

gtgatggagg aggtttagta a 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 2

<400> 2

ccaataaaac ctactcctcc ct 22

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 3

<400> 3

ttttacggta ttggggagta tatcg 25

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 4

<400> 4

accgcctcga cgaacttc 18

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5

<400> 5

cacccaacac acaataacaa acaca 25

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 6

<400> 6

cgaatctcca accaccgtt 19

Claims (7)

1.一种用于检测SFRP2基因甲基化的试剂盒，其特征在于，以粪便、组织或细胞为待测样本，包含用于检测靶基因甲基化状态的试剂，所述靶基因为SFRP2。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，包括引物组和探针组。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组包括：第一对引物和第二对引物，所述第一对引物为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示序列。所述第二对引物为SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4所示序列。所述探针组包括：第一探针和第二探针，其核酸序列如SEQ IDNO:5或6所示。

4.根据权利要求1～3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述探针组中的探针进一步携带荧光基团；

任选地，所述第一探针携带第一荧光基团，第二探针携带第二荧光基团，且第一、第二荧光基团不同；

任选地，所述荧光基团选自下列至少之一：FAM、ROX、VIC、CY5、CY3、HEX、5-TAMRA、TET和JOE。

5.一种确定SFRP2基因甲基化状态的方法，所述方法包括：

1)获取待测样品的基因组DNA，其中，所述待测样品含有靶标核酸，所述靶标核酸为SFRP2基因；

2)对所述基因组DNA进行甲基化转化处理，以便获得转化产物，其中，所述转化产物的胞嘧啶转化为尿嘧啶；

3)利用权利要求1所述的试剂盒对所述转化产物进行qPCR检测；

4)基于qPCR荧光信号，确定所述待测样品中是否含有甲基化的SFRP2基因；

任选地，检测到所述第二荧光基团发出荧光信号，是待测样品中含有甲基化的SFRP2基因的指示；

任选地，进一步根据所述荧光信号的强弱，确定待测样品中甲基化的SFRP2基因含量。

6.一种判断待测样本来源的方法，其特征在于，包括：

1)利用权利要求5所述的方法确定SFRP2基因的甲基化状态；

2)基于qPCR技术，各自独立地检测第一荧光基团、第二荧光基团通道的Ct值；

3)基于所述第一荧光基团、第二荧光基团通道的Ct值，各自独立地获取所述第一荧光基团通道和/或所述第二荧光基团通道的ΔCt值，其中，所述ΔCt＝利用所述第二探针获得的Ct值-利用所述第一探针获得的Ct值；

4)基于所述ΔCt和Ct值，判断所述待测样本是否来源于肠癌患者；

任选地，所述肠癌为结肠癌和/或直肠癌。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，

所述第一荧光基团通道的ΔCt值不大于8时，是待测样本为阳性的指示；

所述第一荧光基团通道的ΔCt值大于8时，是待测样本为阴性的指示；

所述第二荧光基团通道的Ct值大于38.5时，是质控失败的指示。

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