CN112501298B - 一种甲基化无创早期检测卵巢癌的组合物及试剂盒 - Google Patents
一种甲基化无创早期检测卵巢癌的组合物及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种甲基化无创早期检测卵巢癌的组合物及试剂盒,组合物包括目标基因检测引物和内参基因检测引物,目标基因为CDH13、FOXD3、ZNF671、HOXA11、FBXO32和OPCML。针对上述基因的检测引物不仅包括基因的启动子区域,还包括基因的编码区域,且组合中选择多基因甲基化区域联合检测,形成功能间的互补,显著提升对卵巢癌检出的灵敏度,但对正常及卵巢良性肿瘤具有很高特异性。含有检测组合物的试剂盒通过分子表观遗传手段,利用甲基化检测技术能够对卵巢癌可能的患者提早检出,提早进行预防治疗。
Description
技术领域
本发明涉及核酸体外诊断领域,尤其涉及将特定的基因甲基化标志物应用于卵巢癌早期检测及其辅助诊断。
背景技术
在我国,卵巢癌发病率居妇科恶性肿瘤第三位,约占所有女性生殖道肿瘤的23%,呈逐年上升的趋势。我国每年死于卵巢癌的女性约为2.5万,居妇科恶性肿瘤之首。由于卵巢深居盆腔,体积小,缺乏典型症状,难以早期发现,确诊时60%-70%已属晚期,其5年生存率20%-30%,卵巢癌患者手术中发现肿瘤局限于卵巢的仅占不足30%,大多数已扩散到盆腹腔器官。而I期卵巢癌5年生存率可高达90%,但是早期诊断非常困难,所以早期诊断是一大难题。
目前,监测卵巢癌的治疗和复发主要有经阴道超声(TVUS)、CA-125血液测试、CT(学名contrast-enhanced computed tomography)、磁共振成像(MRI)、组织病理学检查等。TVUS利用超声波回声传输影像学图像,可以帮助识别卵巢潜在的增生,并确定它们是实体增生还是囊肿(囊肿是非癌变的、充满液体的囊)。如果发现了坚实的肿块,医生可能会要求进行活检,以确定肿块的良恶性。B超快捷、经济、无创、可重复,是首选检查方法。但较小的卵巢肿块的形态、内部结构以及与周围组织的关系往往显示不清,不易测出直径<1cm的实性肿瘤。
CA-125血液测试是测量血液中CA-125蛋白的含量。许多卵巢癌患者会出现血液中CA-125水平升高的现象。并非每位卵巢癌患者的血液中CA-125水平都有所升高。根据卵巢癌研究基金联盟(OCRFA)的数据,大约80%的晚期卵巢癌患者CA-125水平较高,而50%的患者在发病初期CA-125水平较高。另外,其他一些疾病如:盆腔炎和子宫内膜异位症患者也会出现血液中CA-125水平升高的现象。
CT扫描通过特殊x射线对腹部进行扫描。计算机对结果进行处理,生成横断面图像,使医生能够看到腹腔和骨盆的各个部分。CT检查可对盆腔肿瘤进行定位和定性,并可了解肝、肺及腹膜后淋巴结有无转移,盆腔淋巴结造影可判断卵巢肿瘤有无淋巴道转移。但卵巢原发性肿瘤和转移瘤在CT上的表现无显著差异。诊断卵巢癌时,无论有无原发性病灶,均应与转移瘤鉴别,进行全面细致的排查。
MRI软组织分辨率高,能够多平面成像,无创。在观察子宫内膜病变侵犯肌层的深度、宫颈肿瘤与膀胱或直肠的界限方面非常占优势,在卵巢癌盆腔病变的诊断和鉴别诊断中具有重要作用。但MRI的成本也较CT高,有宫内节育器的患者,也要取出后才能做MRI。
经腹或后穹窿穿刺抽取腹水进行细胞学检查,有助于卵巢恶性肿瘤诊断。活检结果是卵巢癌最终诊断的一个重要因素。对于最后的组织病理学虽然是金标准,但是那时候的卵巢癌大部分已是中晚期,达不到早期诊断的目的。
非侵入性且成本低是癌症早期筛查的理想特征。然而,对于卵巢癌,目前在临床上还没有有效的早期筛查方法。DNA甲基化是表观遗传学的一种修饰方式,研究报告,DNA甲基化能影响正常哺乳细胞的基因表达和沉默;同时,在人类肿瘤研究中发现,DNA甲基化通常能导致肿瘤抑制基因启动子区域的CpG岛变化。肿瘤抑制基因启动子区域的高甲基化或者低甲基化都可能导致细胞转化,而使DNA甲基化状态成为肿瘤检测的潜在标志物。
DNA甲基化主要发生在基因的启动子区域,通常与抑癌基因的表达失活紧密相关。目前应用于基因甲基化检测的方法主要有:甲基化特异性PCR(Methylation-specificPCR,MSP)、亚硫酸氢盐测序法(Bisμlfite sequencing PCR,BSP)和高分辨率熔解曲线法(High Resolution Melting,HRM)等。甲基化特异性PCR主要依靠引物与目标模板的结合以进行PCR扩增来检测甲基化位点;亚硫酸氢盐测序法依靠测序引物进行PCR扩增,在此基础上进行后续测序以实现对甲基化位点的检测;高分辨率溶解曲线法主要通过样本中的CG含量的变化导致的溶解温度的变化以此对甲基化与非甲基化情况进行区分。每种方法都有各自的特点,BSP法结果准确性较高,易于直观进行判读,但灵敏度较低,操作相对更为繁琐成本高;HRM法灵敏度相对较低,同时结果分析略复杂;PCR法检测灵敏度高,对样本的要求相对较低,同时检测时长较短、成本较低,结果易于判读。
随着对肿瘤研究的深入,逐渐发现在癌症的诊断和治疗过程中组织活检技术有一定的局限性。主要表现为:肿瘤具有异质性;某些患者因各种原因很难获取组织;接受穿刺活检时,也有加速肿瘤转移的风险;组织活检的滞后性对患者的治疗也是不利的。因此对于癌症的诊断和检测技术有更高的要求。
液态活检技术的出现,解决了上述的问题,也提前了癌症的诊断时间。液态活检是一种技术,更是一种临床解决方案。液态活检的优势就在于能通过非侵入性取样降低活检的危害,而且有效延长患者生存期,性价比高。相对组织较易获得,且对患者无创。但血浆中肿瘤循环DNA的量较少,且易发生降解。因此,检测血浆中基因的甲基化难度相对较大,不仅样本的前处理过程极其重要,包括血浆的获取和bis-DNA的得到,而且对于后续的扩增反应体系同样重要,关系到检测的灵敏度以及特异性。因此,对于此类检测试剂盒的开发需要具备两个方面的要求:样本前处理的稳定型以及检测体系的灵敏度和特异性。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中无创检查的上述问题,提供一种灵敏度和特异性高的早期检测卵巢癌的组合物,以及提供含该组合物的试剂盒。
本发明技术方案详述如下:
一种甲基化无创早期检测卵巢癌的组合物,包括目标基因检测引物和内参基因检测引物,目标基因检测引物的具体核苷酸序列如下:
CDH13基因检测引物:SEQ ID NO:1~2;
FOXD3基因检测引物:SEQ ID NO:3~4;
ZNF671基因检测引物:SEQ ID NO:5~6;
HOXA11基因检测引物:SEQ ID NO:7~8;
FBXO32基因检测引物:SEQ ID NO:9~10;
OPCML基因检测引物:SEQ ID NO:11~12。
Opioid binding protein/cell adhesion molecule-like(OPCML)基因是一种质膜蛋白,起着阿片受体功能。研究表明OPCML基因在上皮性卵巢癌、脑癌、非小细胞癌、膀胱癌、胆管癌、原发性鼻咽癌、食管癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、乳腺和宫颈癌中都存在表观遗传的失活情况,表明OPCML在许多癌肿中都有着肿瘤抑制作用,OPCML甲基化以及表达量降低被认为与存活率低有关联性。同时,有研究发现,OPCML在人上皮性卵巢癌中的表观沉默现象超过80%。
Cadherin 13,H-cadherin(heart)(CDH13),与肿瘤细胞增值以及血管生成均有关系,文献表明CDH13基因在许多癌种中均会发生超甲基化,其中包括卵巢癌。Chmelarova等人研究发现CDH13启动子甲基化在卵巢癌中的发生概率高于在正常组织中的发生概率。2019年Ivana Baranova等人在研究中指出由CDH13、HNF1B、PCDH17以及GATA4四基因组成的联合甲基化检测在对高级别浆液性卵巢癌的早期诊断灵敏度能达到85.7%,在晚期中达到89.4%,特异性为100%。另外,研究还发现CDH13在遗传型和散发型卵巢癌中均有发生甲基化的情况。
FOXD3基因,作为叉头基因家族中的一员,在发育、细胞维持等活动中扮演重要作用,同时其与其它转录因子相互作用而影响肿瘤的发生发展。研究显示FOXD3在多种不同癌症中作为肿瘤抑制因子。Yan等人海岸FOXD3在非小细胞肺癌中能抑制肿瘤生长;Li等人揭示了FOXD3能够抑制结直肠癌的发生。在2019年,Luo等人研究发现FOXD3在卵巢癌组织样本中甲基化水平高于正常卵巢组织样本,同时FOXD3在卵巢癌组织样本中表达降低;表明FOXD3有望成为人卵巢癌的标志物。
Hox genes 11(HOX11),是苗勒管发育中起重要作用的因素之一,在子宫内膜癌和卵巢癌中起调节作用。Heidi等人研究发现在卵巢癌患者中HOXA11基因的超甲基化,同时在HOXA甲基化与卵巢癌患者中低生存率具有紧密联系。
F-box protein 32(FBXO32)是F-box蛋白家族中的一员,是组成泛素蛋白连接聚合体四个亚单元之一,报告称FBXO32在肌肉萎缩中具有重要作用;同时FBXO32被认为是调节细胞生存一种转化生长因子,在一些癌种中会发生表观遗传学的沉默。新的研究发现FBXO32是一种新的凋亡调节因子,跟促生存信号负相关。Jian-Liang Chou等人研究发现,FBXO32在卵巢癌中有超甲基化的现象,FBXO32可能是一个肿瘤抑制因子,其甲基化情况可能有预测卵巢癌生存率的作用。
Zinc Finger Protein 671(ZNF671),ZNF671的超甲基化在多种癌症中均有发生,如透明肾癌、尿路上皮癌;在卵巢癌中,ZNF671的甲基化导致其表达沉默。2019年,ShokoMase等人研究发现ZNF671有肿瘤抑制作用,其DNA甲基化导致的基因表达沉默余癌症的进展想关联,而这与浆液性卵巢癌的早期复发相关。
上述6个基因每个均与多种癌症相关,发明人在研究中发现,以组织样本为对象,这6种基因的DNA甲基化水平在卵巢癌中比正常细胞或卵巢良性肿瘤中明显升高,并且多个基因在不同组织病理类型的卵巢癌患者中甲基化区域形成互补,可以最大限度覆盖卵巢癌患者的检测,用来作为辅助卵巢癌的早期诊断。通过检测患者血液中游离DNA中的CDH13、FOXD3、ZNF671、HOXA11、FBXO32和OPCML基因甲基化区域,实现早期诊断的目的。
上述目标基因检测引物均为针对目标基因转化后的非甲基化特异性引物,能够对目标基因的甲基化状态进行检测。上述引物中,在正向和反向引物分布较少的CG位点甚至不含CG位点,这样能精准捕获转化后的序列,而减少与转化之前的模板序列结合,提高检测的特异性,为之后探针进行的甲基化区域检测提供基础,增强探针检出的灵敏度。
上述引物基因之间的扩增相互之间不产生干扰,一管中多个基因的扩增效率与其单重扩增效率一致,也就是说,上述各引物,在多重反应体系中基因的扩增效率没有受到抑制,因此,检测体系可以设置为一管对四个基因进行检测,包括三个目标基因和一个内参基因,此时需要将四个基因通过不同的荧光通道以Ct值的形式体现出来。
上述引物再结合准确病理信息的临床样本经过ROC曲线确定合理的阳性判断值,能提高反应体系筛选的准确性和卵巢癌早期检测的可靠性,最大限度地避免假阳性和假阴性结果的出现,使得检测性能整体得到提升。
优选的,上述组合物中,目标基因和内参基因还对应有检测探针,具体核苷酸序列如下:
CDH13基因检测探针:SEQ ID NO:13;
FOXD3基因检测探针:SEQ ID NO:14;
ZNF671基因检测探针:SEQ ID NO:15;
HOXA11基因检测探针:SEQ ID NO:16;
FBXO32基因检测探针:SEQ ID NO:17;
OPCML基因检测探针:SEQ ID NO:18。
上述目标基因检测探针,均为MGB探针,探针与甲基化模板和探针与非甲基化模板的结合自由能ΔG相差20kcal mol-1以上,并且在探针中引入MGB修饰,缩短探针的序列,提高探针对模板序列的识别,引入MGB的同时,加入锁核酸的修饰,进一步增强探针与甲基化模板的结合效率,更有利于甲基化位点的识别,进一步提高检测的特异性和灵敏度。
优选的,上述组合物中,目标基因的检测探针进行荧光标记和MGB标记,具体如下所示:
CDH13基因检测探针:序列5’端标记FAM,3’端标记MGB;
FOXD3基因检测探针:序列5’端标ROX,3’端标记MGB;
ZNF671基因检测探针:序列5’端标记CY5,3’端标记MGB;
HOXA11基因检测探针:序列5’端标记FAM,3’端标记MGB;
FBXO32基因检测探针:序列5’端标记ROX,3’端标记MGB;
OPCML基因检测探针:序列5’端标记CY5,3’端标记MGB;
上述不同荧光通道标记的MGB探针,不同荧光标记的目标基因检测探针可放在一管中反应,能够保证样本中4个不同目标基因的扩增效率最佳,荧光曲线为标准的S型扩增曲线,与各基因单重扩增相比荧光曲线保持一致的趋势。
优选的,上述组合物中,所述内参基因为GAPDH,其检测引物和探针的具体核苷酸序列如下:
内参基因检测引物:SEQ ID NO:19~20,
内参基因检测探针:SEQ ID NO:21,序列5’端标记VIC,3’端标记BHQ1。
一种甲基化无创卵巢癌早期检测试剂盒,包括以上任一所述的组合物,以及PCR反应液,所述PCR反应液每一人份由浓度1U/μL的DNA Taq聚合酶0.5μL、浓度25mM的dNTPs 3μL、浓度1.5mM的Mg2+4μL、10×DNA聚合酶buffer 5μL和纯化水补足25μL组成。Taq聚合酶以及与dNTPs、Mg2+、10×DNA聚合酶buffer之间的配比直接关系到引物和探针的组合的扩增效率。
本发明还提供了一种上述检测试剂盒的使用方法,包括样本处理和PCR扩增两个步骤,其中,样本处理方法如下:
(1)样品选用外周血或者分离得到的血浆,进行游离DNA提取;
(2)提取的血浆游离DNA进行重亚硫酸盐转化,使DNA中未发生甲基化的5’胞嘧啶转化为尿嘧啶,而发生甲基化的5’胞嘧啶不发生改变,最后得到Bis-DNA。转化过程中要保证DNA的转化效率以及最后的Bis-DNA的转化得率。
上述方法中,血浆游离DNA提取优选使用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法大体积游离核酸提取试剂盒(DP710),同时进行DNA质量监控。重亚硫酸盐转化则优选使用天根生化科技(北京)有限公司的DNA重亚硫酸盐转化试剂盒(DP215)。
优选的,上述使用方法中,所述PCR扩增时的PCR体系包括转化后的bis-DNA和100-300nM检测引物,100-300nM检测探针,1U DNA Taq聚合酶,1-5mM的MgCl2;PCR反应条件为:96℃预变性5min;94℃变性15s,60℃退火延伸35s,45个循环;25℃保持10min。该PCR反应体系是专门针对重亚硫酸盐转化之后的bis-DNA扩增,且包含多重引物探针,因此PCR反应液的选择尤其重要,体系中每一个基因引物探针的扩增效率需与其对应的单重扩增时类似,确保体系中的引物或者探针之间不相互干扰,充分发挥每一组引物探针的扩增效果。需要对不同的DNA Taq聚合酶以及与其他组分之间的配比进行筛选验证,确保整个多重扩增体系扩增效率最佳。
优选的,上述使用方法中,PCR扩增后,通过ROC曲线对阳性判断值进行确定,CDH13、FOXD3、ZNF671、HOXA11、FBXO32和OPCML基因中任一两个基因或以上发生甲基化,即卵巢癌的发生为高风险。
以下为本发明各引物和探针序列:Artificial sequence
Based on Homo sapiens
注:F表示正向引物,R表示反向引物,FP表示探针。本表格中,所展示的探针序列已经进行了荧光标记和淬灭标记。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明检测引物针对基因CDH13、FOXD3、ZNF671、HOXA11、FBXO32和OPCML甲基化的位点设计,不仅包括基因的启动子区域,还包括基因的编码区域,由于卵巢癌种类多样性,选择多基因甲基化区域联合检测,形成功能间的互补,显著提升对卵巢癌检出的灵敏度,但对正常及卵巢良性肿瘤具有很高特异性。该检测组合物通过分子表观遗传手段,利用甲基化检测技术对卵巢癌可能的患者提早检出,提早进行预防治疗。
本发明试剂盒主要采用多基因多通道荧光检测手段,通过特异性引物探针与甲基化序列准确识别,以及优化的特殊的甲基化DNA Taq聚合酶,对CDH13、FOXD3、ZNF671、HOXA11、FBXO32和OPCML基因甲基化位点精确检测。对比于仅用PCR特异性引物进行检测的方法,加上特异性探针对甲基化模板序列可以进行双重识别,可以显著提高检测的灵敏度、准确性。
本发明采用这种技术进行多重多通道荧光多基因的甲基化检测,涉及到的检测样本相对容易获取、无创性、检测方法操作简单、判读直观、8个小时内出结果,通用的荧光定量PCR仪器均能满足检测需求,整套实验流程采用一站式全封闭形式,不需要像多重巢式PCR方法那样进行琼脂糖凝胶电泳再拍照分析,操作更简便,也避免了交叉污染的可能。
因本发明检测高灵敏性,对低浓度模板有更好的检测效率,且所选目标基因相互补短,引物探针特异性好,扩增效率高,对于早期卵巢癌的检测非常灵敏。本试剂盒检测的高灵敏性适用于早期卵巢癌的检测。
附图说明
图1为靶基因与内参基因的PCR荧光检测结果示例图。
图2为实施例中甲基化检测试剂盒检测136例样本所得ROC曲线。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案,下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
检测卵巢癌相关基因CDH13、FOXD3、ZNF671、HOXA11、FBXO32和OPCML甲基化试剂盒的检测试验。
试剂盒组分如下表:
选取已知明确病理信息结果的86例卵巢癌样本:50例鉴定为高级别浆液性癌、13例低级别浆液性癌、12例透明细胞癌、11例粘液性癌;50例为卵巢良性肿瘤样本。
1、使用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法大体积游离核酸提取试剂盒(DP710),对上述136例卵巢癌和卵巢良性肿瘤样本进行血浆游离DNA的提取,同时进行DNA质量监控。
2、采用天根生化科技(北京)有限公司的DNA重亚硫酸盐转化试剂盒(DP215)对提取好的DNA进行重亚硫酸盐转化,DNA中未甲基化的胞嘧啶(C)转变为尿嘧啶(U),而甲基化的胞嘧啶(C)不变,得到转化后的bis-DNA。此试剂盒的转化效率能够达到99%,高于市场上多数重亚硫酸盐转化试剂盒。
3、配制PCR反应液和引物探针混合液;
PCR反应液(25μl/人份)
组分 | 一人份加入量(μL) |
DNA聚合酶(1U/μl) | 0.5 |
dNTPs(25mM) | 3 |
Mg<sup>2+</sup>(1.5mM) | 4 |
10×DNA聚合酶buffer | 5 |
纯化水 | 补足至25μl |
引物探针混合液1(10μl/人份)
组分 | 一人份加入量(μl) |
CDH13基因-F(100μM) | 0.2 |
CDH13基因-R(100μM) | 0.2 |
CDH13基因-FP(100μM) | 0.1 |
FOXD3基因-F(100μM) | 0.25 |
FOXD3基因-R(100μM) | 0.25 |
FOXD3基因-FP(100μM) | 0.15 |
ZNF671基因-F(100μM) | 0.3 |
ZNF671基因-R(100μM) | 0.2 |
ZNF671基因-FP(100μM) | 0.15 |
内参基因-F(100μM) | 0.05 |
内参基因-R(100μM) | 0.05 |
内参基因-FP(100μM) | 0.05 |
纯化水 | 补足至10μl |
引物探针混合液2(10μl/人份)
组分 | 一人份加入量(μl) |
HOXA11基因-F(100μM) | 0.2 |
HOXA11基因-R(100μM) | 0.2 |
HOXA11基因-FP(100μM) | 0.1 |
FBXO32基因-F(100μM) | 0.25 |
FBXO32基因-R(100μM) | 0.25 |
FBXO32基因-FP(100μM) | 0.15 |
OPCML基因-F(100μM) | 0.3 |
OPCML基因-R(100μM) | 0.2 |
OPCML基因-FP(100μM) | 0.15 |
内参基因-F(100μM) | 0.05 |
内参基因-R(100μM) | 0.05 |
内参基因-FP(100μM) | 0.05 |
纯化水 | 补足至10μl |
4、加样:向上述配制的体系中分别加入5μl阴、阳性质控品和转化好的Bis-DNA临床样本。进行PCR反应,条件为:96℃预变性5min;94℃变性15s,60退火延伸35s,45个循环。
5、扩增程序如下:
step1:96℃预变性5min;
step2:94℃变性15s,60℃退火延伸35s,45个循环;
step3:25℃,10min;
信号收集,60℃收集FAM、VIC、ROX以及CY5信号。
6、结果判读
(1)内标通道有S型扩增曲线且Ct值≤38为结果有效;
(2)六基因分别的阳性判断值为:CDH13 Ct值≤40.5、FOXD3 Ct值≤41.7、ZNF671Ct值≤41.0、HOXA11 Ct值≤41.6、FBXO32 Ct值≤40.4和OPCML Ct值≤41.0;
(3)当六基因中至少有两个基因为阳性时,样本为阳性。
7、检测结果分析
利用上述试剂盒反应体系检测共136例样本,其中包括卵巢癌样本86例,卵巢良性肿瘤样本50例。检测结果如下表。
表.136例样本的检测结果
对比临床病理结果,使用本甲基化检测试剂盒得到的联合ROC曲线面积为0.939(参见图2),整体特异性为94.0%,整体灵敏度为88.4%。其中,对高级别浆液性卵巢癌、低级别浆液性卵巢癌、透明细胞卵巢癌和粘液性卵巢癌的检出率分别为92.0%、84.6%、83.3%和81.8%;对良性的阴性检出率为94%。从以上结果可以看出,本试剂盒能较好区别卵巢癌良恶性样本,同时对低级别浆液性卵巢癌、透明细胞卵巢癌和粘液性卵巢癌均有一定程度的检出率。
本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述,以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离该发明构思的前提下,所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进,均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京起源聚禾生物科技有限公司
<120> 一种甲基化无创早期检测卵巢癌的组合物及试剂盒
<130>
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
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<213> Artificial sequence
<220>
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accaccctat tactataacc aaatt 25
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<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 21
tttggtggtt ggtttagaaa aagggttttg a 31
Claims (4)
1.一种甲基化无创早期检测卵巢癌的组合物,其特征在于,包括目标基因检测引物和内参基因检测引物,目标基因检测引物的具体核苷酸序列如下:
CDH13基因检测引物:SEQ ID NO:1~2;
FOXD3基因检测引物:SEQ ID NO:3~4;
ZNF671基因检测引物:SEQ ID NO:5~6;
HOXA11基因检测引物:SEQ ID NO:7~8;
FBXO32基因检测引物:SEQ ID NO:9~10;
OPCML基因检测引物:SEQ ID NO:11~12;
目标基因和内参基因还对应有检测探针,具体核苷酸序列如下:
CDH13基因检测探针:SEQ ID NO:13;
FOXD3基因检测探针:SEQ ID NO:14;
ZNF671基因检测探针:SEQ ID NO:15;
HOXA11基因检测探针:SEQ ID NO:16;
FBXO32基因检测探针:SEQ ID NO:17;
OPCML基因检测探针:SEQ ID NO:18。
2.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,目标基因的检测探针进行荧光标记和MGB标记,具体如下所示:
CDH13基因检测探针:序列5’端标记FAM,3’端标记MGB;
FOXD3基因检测探针:序列5’端标ROX,3’端标记MGB;
ZNF671基因检测探针:序列5’端标记CY5,3’端标记MGB;
HOXA11基因检测探针:序列5’端标记FAM,3’端标记MGB;
FBXO32基因检测探针:序列5’端标记ROX,3’端标记MGB;
OPCML基因检测探针:序列5’端标记CY5,3’端标记MGB。
3.根据权利要求1或2所述的组合物,其特征在于,所述内参基因为GAPDH,其检测引物和探针的具体核苷酸序列如下:
内参基因检测引物:SEQ ID NO:19~20,
内参基因检测探针:SEQ ID NO:21,序列5’端标记VIC,3’端标记BHQ1。
4.一种甲基化无创卵巢癌早期检测试剂盒,其特征在于,包括权利要求1-3任一所述的组合物,以及PCR反应液,所述PCR反应液每一人份由浓度1U/μL的DNA Taq聚合酶0.5μL、浓度25mM的dNTPs 3μL、浓度1.5mM的Mg2+4μL、10×DNA聚合酶buffer 5μL和纯化水补足25μL组成。
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