CN114645094B - 一种子宫内膜癌的生物标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种子宫内膜癌的生物标志物及其应用，属于生物医药技术领域。所述生物标志物至少包括用于检测ZNF486基因至少一个靶区域内甲基化的核酸序列，其中，所述靶区域选自所述ZNF486基因的chr19：20167214‑20200488的全长区域或其中的部分区域。本发明还公开了上述子宫内膜癌的生物标志物在制备子宫内膜癌诊断产品中的应用。本发明经研究发现，ZNF486基因可以作为子宫内膜癌的生物标志物，对于提高子宫内膜癌高危人群的诊断率、实现早期干预治疗和降低病死率具有非常重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种子宫内膜癌的生物标志物及其应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
子宫内膜癌(Endometrial Carcinoma或Carcinoma of Endometrium,简称EC)是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一。随着人口平均寿命的增加以及生活习惯的改变，子宫内膜癌的发病呈持续上升和年轻化的趋势。如何在人群中筛选出子宫内膜癌前病变及早期子宫内膜癌，提高子宫内膜癌的筛查效率，实现子宫内膜癌的早发现、早诊断、早治疗，已势在必行。
绝大多数子宫内膜癌病人有绝经后阴道出血的临床表现，但是只有极少数绝经后阴道出血的病人被诊断为子宫内膜癌。目前临床上缺乏敏感性和特异性较高，并且可被患者和医生接受的子宫内膜癌筛查方法。现有的筛查方法主要有以下几种：(1)子宫颈巴氏涂片检查(Pap test)，对于子宫内膜癌的敏感性仅为40％-55％；(2)液基细胞学涂片，敏感性60％-65％；(3)经阴道超声检查，存在敏感性高、特异性差的特点；(4)子宫内膜活检或宫腔镜检查，为侵入性检查，对人体伤害较大，不适合用来作为子宫内膜癌的筛查；(5)子宫内膜脱落细胞学检查，样本处理制备过程繁琐，缺乏统一的判读标准，灵敏度、特异性也不高。因此，寻找新的无创、精确的子宫内膜癌筛查方法是当前临床上亟待解决的问题。
近年的研究显示表观遗传学修饰在癌症的发生、发展中起着重要作用。肿瘤抑制基因启动子区的DNA甲基化是癌前病变组织转化为恶性肿瘤细胞的重要分子机制，已在多种类型的肿瘤及癌前病变中得到证实。研究数据显示：异常的DNA甲基化发生在癌变过程的早期阶段，并且在肿瘤的发生和发展中起着关键作用。在其它癌症中，DNA甲基化被用作早期检测、治疗反应预测和癌症复发的生物标志物。此外，采用DNA甲基化检测作为肿瘤筛查手段，具有高敏感性和特异性的优势。但是目前缺乏针对子宫内膜癌甲基化基因检测的检测技术、方法和产品。因此，当前对用于子宫内膜癌检测的敏感性高和特异性高的甲基化基因标记物存在需求。
发明内容
本发明的目的之一，是提供一种子宫内膜癌的生物标志物。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种子宫内膜癌的生物标志物，所述生物标志物至少包括用于检测ZNF486基因至少一个靶区域内甲基化的核酸序列，其中，所述靶区域选自所述ZNF486基因的chr19：20167214-20200488的全长区域或其中的部分区域。
本发明的子宫内膜癌的生物标志物的原理是：
ZNF486，中文名称锌指蛋白486，是锌指蛋白家族KRAB型锌指蛋白亚群的一员，其编码基因位于人类第19号染色体上，对应于人类基因组GRCh38/hg38版本的chr19：20167214-20200488区域，可作为转录因子参与调控靶基因的转录。目前关于ZNF486功能的报道主要集中于前列腺癌、乳腺癌和骨髓瘤患者的预后相关，但在子宫内膜癌中尚无报道。
本发明经研究发现，以ZNF486基因作为靶点，通过检测该基因的甲基化来对子宫内膜癌进行诊断，其灵敏度和特异性均能达到95％以上，均较现有检测技术有所提高。因此，ZNF486基因可以作为子宫内膜癌的生物标志物，对于提高子宫内膜癌高危人群的诊断率、实现早期干预治疗和降低病死率具有非常重要的意义。
本发明的子宫内膜癌的生物标志物的有益效果是：
本发明经研究发现，ZNF486基因可以作为子宫内膜癌的生物标志物，对于提高子宫内膜癌高危人群的诊断率、实现早期干预治疗和降低病死率具有非常重要的意义。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述靶区域选自所述ZNF486基因的chr19：20167442-20167584区域。
采用上述进一步的有益效果是：本发明经过研究发现，ZNF486基因的chr19：20167442-20167584区域检测效果最好,敏感性和特异性分别为97％和96％,R0C曲线下面积为0.97。
进一步，所述生物标志物还包括用于检测CDO1基因和SORCS3基因中的每个基因的至少一个靶区域内甲基化的核酸序列，其中，所述靶区域分别选自所述CDO1基因的chr5：115815774-115817173全长区域或其中的部分区域，以及所述SORCS3基因的chr10：104639290-104642290的全长区域或其中的部分区域。
采用上述进一步的有益效果是：本发明经过研究发现，相较于以单独ZNF486基因作为子宫内膜癌诊断的甲基化检测靶基因，以ZNF486基因、CDO1基因和SORCS3基因联合或组合作为甲基化检测的靶基因，即综合考虑ZNF486基因、CDO1基因和SORCS3基因的甲基化检测结果，可以进一步提高子宫内膜癌诊断的灵敏度和特异性，灵敏性和特异性分别为100％和98％。
若待测样本仅以ZNF486为检测靶点，ZNF486为甲基化阳性则该样本判读为阳性，反之则为阴性。若以ZNF486、CDO1和SORCS3的组合作为检测靶点,ZNF486、CDO1、SORCS3中任2个基因甲基化阳性，则该样本检测结果判定为阳性，否则将样本判定为阴性。
若待测样本检测结果为阳性，提示受检者取样时患有子宫内膜癌的可能性较高，建议进行后续检查(分段诊刮或宫腔镜检查)进一步确认；若待测样本检测结果为阴性，提示受检者取样时患有子宫内膜癌的可能性较低,建议定期进行筛查。
更进一步，所述靶区域分别选自所述CDO1基因的chr5:115816267-115816390区域，以及所述SORCS3基因的chr10：104641229-104641324区域。
采用上述更进一步的有益效果是：本发明经过研究发现，CDO1基因的chr5:115816267-115816390区域检测效果最好，敏感性和特异性分别为94％和92％,R0C曲线下面积为0.94；SORCS3基因的chr10：104641229-104641324区域检测效果最好,敏感性和特异性分别为98％和95％,R0C曲线下面积为0.97。
本发明的目的之二，是提供上述子宫内膜癌的生物标志物在制备子宫内膜癌诊断产品中的应用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：上述子宫内膜癌的生物标志物在制备子宫内膜癌诊断产品中的应用。
本发明的应用的有益效果是：
上述子宫内膜癌的生物标志物，可以用于制备子宫内膜癌诊断产品，通过检测ZNF486基因的甲基化，能够方便、快捷、有效地检测子宫内膜癌。
可采取多种检测方法和相应的试剂检测靶区域的甲基化水平，检测方法包括但不限于如下方法：甲基化特异性PCR(MSP)、定量甲基化特异性PCR(qMSP)、飞行时间质谱分析(MassARRAY)、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述诊断产品包括试剂盒、制剂和芯片中的任意一种。
采用上述进一步的有益效果是：本发明的生物标志物可以用于制备各种类型的诊断产品，使用者可以根据实际情况进行灵活选择。
更进一步，所述试剂盒至少包括用于检测ZNF486基因的第一引物对和第一探针，所述第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示,所述第一探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；或者所述第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示,所述第一探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；或者所述第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示,所述第一探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；或者所述第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示,所述第一探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
采用上述更进一步的有益效果是：上述第一引物对和第一探针适用于采用甲基化特异性PCR检测ZNF486基因的甲基化，分别对应检测的靶区域为ZNF486基因的chr19：20167132-20167243、chr19：20167442-20167584、chr19：20167640-20167716和chr19：20167692-20167828。
更进一步，所述第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示,所述第一探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
采用上述更进一步的有益效果是：上述第一引物对和第一探针适用于采用甲基化特异性PCR检测ZNF486基因的甲基化，对应检测的靶区域为ZNF486基因的chr19：20167442-20167584。该区域检测效果最好,敏感性和特异性分别为97％和96％,R0C曲线下面积为0.97。
更进一步，所述试剂盒还包括用于检测CDO1基因的第二引物对和第二探针，以及用于检测SORCS3基因的第二引物对和第二探针的第三引物对和第三探针，其中，所述第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示,所述第二探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；或者所述第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示,所述第二探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；或者所述第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示,所述第二探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；或者所述第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示,所述第二探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；或者所述第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示,所述第二探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；或者所述第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示,所述第二探针的核苷酸序列如SEQID NO.30所示；或者所述第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示,所述第二探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示；
所述第三引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35所示,所述第三探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示；或者所述第三引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38所示,所述第三探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示；或者所述第三引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41所示,所述第三探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示；或者所述第三引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44所示,所述第三探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示；或者所述第三引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.47所示,所述第三探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.48所示。
采用上述更进一步的有益效果是：上述第二引物对和第二探针适用于采用甲基化特异性PCR检测CDO1基因的甲基化，分别对应检测的靶区域为CDO1基因的chr5:115816784-115816983、chr5:115816777-115816890、chr5:115816627-115816801、chr5:115816267-115816390、chr5:115816170-115816288、chr5:115816133-115816243和chr5:115816079-115816156。
上述第三引物对和第三探针适用于采用甲基化特异性PCR检测SORCS3基因的甲基化，对应检测的靶区域为SORCS3基因的chr10：104640610-104640689、chr10：104641229-104641324、chr10：104641263-104641364、chr10：104641305-104641393和chr10：104641464-104641572。
更进一步，所述第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示,所述第二探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；所述第三引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.37和SEQ ID NO.38所示,所述第三探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示。
采用上述更进一步的有益效果是：采用上述更进一步的有益效果是：上述第二引物对和第二探针适用于采用甲基化特异性PCR检测CDO1基因的甲基化，对应检测的靶区域为CDO1基因的chr5:115816267-115816390。该区域检测效果最好,敏感性和特异性分别为94％和92％,R0C曲线下面积为0.94。
上述第三引物对和第三探针适用于采用甲基化特异性PCR检测SORCS3基因的甲基化，对应检测的靶区域为SORCS3基因的chr10：104641229-104641324。该区域检测效果最好,敏感性和特异性分别为98％和95％,R0C曲线下面积为0.97。
附图说明
图1为本发明的实验例1中，ZNF486基因chr19：20167442-20167584区域的ROC曲线图。
图2为本发明的实验例1中，SORCS3基因的chr10：104641229-104641324区域的ROC曲线图。
图3为本发明的实验例2中，CDO1基因的chr5:115816267-115816390区域的ROC曲线图。
图4为本发明的实验例3中，ZNF486基因chr19：20167442-20167584区域、CDO1基因的chr5:115816267-115816390区域和SORCS3基因的chr10：104641229-104641324区域的ROC曲线图。
具体实施方式
以下结合具体附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
本实施例提供的用于子宫内膜癌诊断的试剂盒，其包括含有用于检测第一靶基因甲基化的第一试剂和检测第二靶基因甲基化的第二试剂；其中，第一靶基因为ZNF486基因(chr19：20167214-20200488)，第二靶基因为CDO1基因(chr5：115804733-115816659)，第三靶基因为SORCS3基因(chr10：104641290-105265242)。
需要说明的是，无论是用何种方法检测上述ZNF486、CDO1、SORCS3基因任意一条链的全长或其中部分区域的甲基化用于子宫内膜癌的诊断，均属于本发明的保护范围。
第一试剂为适用于采用MSP法检测ZNF486基因甲基化的试剂，第一试剂检测的第一靶区域为选自chr19：20167109-20168208的部分区域。
第二试剂为适用于采用MSP法检测CDO1基因甲基化的试剂，第二试剂检测的第二靶区域为选自chr5：115815774-115817173的部分区域。
第三试剂为适用于采用MSP法检测SORCS3基因甲基化的试剂，第三试剂检测的第三靶区域为选自chr10：104639290-104642290的部分区域。
第一试剂包括第一引物对和第一探针,检测上述各种第一靶区域的第一引物对和第一探针的序列见表1。第二试剂包括第二引物对和第二探针,检测上述各种第二靶区域的第二引物对和第二探针的序列见表2。第三试剂包括第三引物对和第三探针,检测上述各种第三靶区域的第三引物对和第三探针的序列见表3。
表1检测ZNF486甲基化的第一引物对和第一探针的碱基序列
表2检测CDO1甲基化的第二引物对和第二探针的碱基序列
表3检测SORCS3甲基化的第三引物对和第三探针的碱基序列
其中，本实施例检测上述靶区域的所用检测试剂是本领域任何能够实现上述靶区域甲基化检测的试剂。另外，在其他的实施例中，试剂盒还包括如下组分：PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+离子等。
实施例2
本实施例提供的用于子宫内膜癌诊断的试剂盒，其包括含有用于检测第一靶基因甲基化的第一试剂和检测第二靶基因甲基化的第二试剂；其中，第一靶基因为ZNF486基因，第二靶基因为CDO1基因，第三靶基因为SORCS3基因。
第一试剂为适用于采用MSP法检测ZNF486基因的甲基化试剂，其检测的甲基化区域为chr19：20167442-20167584。
第一试剂包括如下第一引物对和第一探针：
正向引物:gtagttagttttataatttgcgttcgg(SEQ ID NO 4)；
反向引物:caaaccaaaacacgatcactacg(SEQ ID NO 5)；
探针:aaacaaaacgccccgaaaccgactatca(SEQ ID NO 6)
第二试剂为适用于采用MSP法检测CDO1基因的甲基化试剂，其检测的甲基化区域为chr5:115816267-115816390。
第二试剂包括如下第二引物对和第二探针：
正向引物:agatcgaagtgttgaagttacgg(SEQ ID NO 22)；
反向引物:aaatcgctctcgtaaacttccat(SEQ ID NO 23)；
探针:tacacctcctctacattaacctcatcgccg(SEQ ID NO 24)o
第三试剂为适用于采用MSP法检测SORCS3基因的甲基化试剂，其检测的甲基化区域为chr10：104641229-104641324。
第三试剂包括如下第三引物对和第三探针：
正向引物:cgttcgttcgttcgtcgg(SEQ ID NO 37)；
反向引物:ctacgactaccgcgactcg(SEQ ID NO 38)；
探针:accgaatatataacgcccgccgaaatacga(SEQ ID NO 39)o
实施例3
本实施例采用实施例1或2的试剂盒进行子宫内膜癌诊断的方法，其包括如下步骤：
(1)DNA提取和转化:提取患者子宫内膜细胞或组织中的DNA,对获得的DNA进行亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐转化处理，具体操作步骤参照试剂盒说明书；
(2)MSP检测:对经步骤(1)提取并转化后获得的DNA,采用MSP方法对ZNF486或其与CDO1的组合的甲基化敏感位点进行检测，ACTIN作为内参基因，其中ACTIN的引物和探针如SEQ ID NO 49-SEQ ID NO 51所示：
正向引物:tggtgatggaggaggtttagtaagt(SEQ ID NO 49)；
反向引物:aaccaataaaacctactcctcccttaa(SEQ ID NO 50)；
探针:accaccacccaacacacaataacaaacaca(SEQ ID NO 51)。
优化的PCR条件见表4。
ZNF486的4个甲基化特异性引物和探针检测组合(表1)、CDO1的7个甲基化特异性引物和探针检测组合(表2)、SORCS3的5个甲基化特异性引物和探针检测组合(表3)中的任何一个组合均可作为检测组合，优化的PCR体系见表4。以ZNF486、CDO1、SORCS3的组合的甲基化敏感区域作为检测靶点时，特异性引物和探针参照实施例2中该区域对应的碱基序列,优化的PCR体系见表5。
表4 MSP反应条件
表5以ZNF486的甲基化区域作为检测靶点时的MSP反应体系
表6以ZNF486、CDO1和SORCS3的组合作为检测靶点时的MSP反应体系
| 试剂组分 | 规格 | 体积(μl) |
| HSTaq酶 | 5U/μl | 0.1 |
| dNTP | 各2.5mM | 1.6 |
| 缓冲液 | 10X | 2 |
| ZNF486上游引物 | 100μM | 0.4 |
| ZNF486下游引物 | 100μM | 0.4 |
| CDO1上游引物 | 100μM | 0.4 |
| CDO1下游引物 | 100μM | 0.4 |
| SORCS3上游引物 | 100μM | 0.4 |
| SORCS3下游引物 | 100μM | 0.4 |
| ACTIN上游引物 | 100μM | 0.4 |
| ACTIN下游引物 | 100μM | 0.4 |
| ZNF486探针 | 100μM | 0.1 |
| CDO1探针 | 100μM | 0.1 |
| SORCS3探针 | 100μM | 0.1 |
| ACTIN探针 | 100μM | 0.1 |
| 待测样本DNA | - | 1-4 |
| ddH2O | - | 补充至20μl |
(3)质量控制:在每次检测时对阴性对照和阳性对照进行同步检测，阴性对照要无明显指数增长期,Ct值为Undet/NoCt或Ct>40,阳性对照要有明显的指数增长期，且Ct值满足20≤Ct≤32。除阴性对照、阳性对照以外，内参基因Ct值需满足15≤Ct≤35；若Ct值<15,则表明加入的样本DNA过量，需减少DNA加入量后重新检测；若Ct值>35,则表明加入的样本DNA含有PCR抑制剂或DNA加入量过少，需重新制备DNA或增加DNA上样量再进行检测。阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效,须重新进行检测；
(4)结果判定:根据样本检测的ΔCt值来进行区分，通过阳性判断值确定待测样本的ΔCt值阈值，3个基因的ΔCt值分别为，ΔCt(ZNF486)＝Ct(ZNF486)-Ct(ACTIN)，ΔCt(CDO1)＝Ct(CDO1)-Ct(ACTIN)，ΔCt(SORCS3)＝Ct(SORCS3)-Ct(ACTIN)；待测样本ZNF486基因ΔCt值若满足ΔCt(ZNF486)≤9，则该样本为ZNF486甲基化阳性；若ΔCt(ZNF486)>9,则该样本为ZNF486甲基化阴性。待测样本CDO1基因ΔCt值若满足ΔCt(CDO1)≤12，则该样本为CDO1甲基化阳性；若ΔCt(CDO1)>12,则该样本为CDO1甲基化阴性。待测样本SORCS3基因ΔCt值若满足ΔCt(SORCS3)≤10，则该样本为SORCS3甲基化阳性；若ΔCt(SORCS3)>10,则该样本为CDO1甲基化阴性。若待测样本仅以ZNF486为检测靶点，ZNF486为甲基化阳性则该样本判读为阳性，反之则为阴性。若以ZNF486、CDO1、SORCS3的组合作为检测靶点,ZNF486、CDO1和SORCS3中任2个基因甲基化阳性，则该样本检测结果判定为阳性，否则将样本判定为阴性。
若待测样本检测结果为阳性，提示受检者取样时患有子宫内膜癌的可能性较高，建议进行后续检查(分段诊刮或宫腔镜检查)进一步确认；若待测样本检测结果为阴性，提示受检者取样时患有子宫内膜癌的可能性较低,建议定期进行筛查。
实验例1
收集华中科技大学同济医学院附属同济医院已知病理信息的子宫内膜癌和子宫内膜良性疾病各100例，子宫切除手术前采集患者的子宫内膜脱落细胞，通过DNA提取、重亚硫酸盐转化、MSP检测与分析(见实施例3)，选用实施例1中的针对ZNF486的特异性引物和探针组合进行检测,检测结果如表7所示。
表7 ZNF486的不同引物探针组合对子宫内膜脱落细胞的检测结果
结果表明,ZNF486基因的2个引物探针组合检测子宫内膜癌的敏感性和特异性均大于90％,表明这2个组合区分对子宫内膜癌的检出效果较好，其中ZNF486基因的chr19：20167442-20167584区域检测效果最好,敏感性和特异性分别为97％和96％,R0C曲线下面积为0.97(图1)。
同一批样本，选用实施例1中的针对SORCS3的特异性引物和探针组合进行检测,检测结果如表8所示。
表8 SORCS3的不同引物探针组合对子宫内膜脱落细胞的检测结果
结果表明,SORCS3基因的2个引物探针组合检测子宫内膜癌的敏感性和特异性均大于90％,表明这2个组合区分对子宫内膜癌的检出效果较好，其中SORCS3基因的chr10：104641229-104641324区域检测效果最好,敏感性和特异性分别为98％和95％,R0C曲线下面积为0.97(图2)。
实验例2
实验例1表明ZNF486的4个甲基化区域均可用于子宫内膜癌的早期检测，其中chr19：20167442-20167584区域检测效果最好，敏感性和特异性分别为97％和96％，R0C曲线下面积为0.97。
进一步地，本实验例将ZNF486与BHLHE22、CDO1、CELF4和SORCS3以及其组合进行比较分析。
收集华中科技大学同济医学院附属同济医院子宫内膜癌和子宫内膜良性疾病各65例，通过DNA提取、重亚硫酸盐转化、MSP检测与分析(见实施例3)，选用ZNF486最佳区域chr19：20167442-20167584的特异性引物和探针组合进行检测(见实施例1)，并反复优化确定BHLHE22，CDO1和CELF4的最佳引物和探针，其中CDO1的引物探针序列SEQ ID NO 22-SEQID NO 24所示，SORCS3的引物探针序列SEQ ID NO 37-SEQ ID NO 39所示，BHLHE22和CELF4基因的引物探针序列如下：
BHLHE22正向引物:gtctataaaaccgcctaactccga(SEQ ID NO 52)；
BHLHE22逆向引物:gtgtatttcgcgttttatggttt(SEQ ID NO 53)；
BHLHE22探针:accgaaacgacgacgacgacaacga(SEQ ID NO 54)；
CELF4正向引物:tttcgttagttatcgggggatta(SEQ ID NO 55)；
CELF4逆向引物:aaccacctaccaaaataaaac(SEQ ID NO 56)；
CELF4探针:aaataaaaatccccgtcccgaac(SEQ ID NO 57)o
检测结果如表9所示，对这些基因及其组合的检测灵敏度和特异性的AUC也进行了分析。
表9 ZNF486、BHLHE22、CDO1和CELF4对子宫内膜脱落细胞样本的检测结果比较
结果表明，ZNF486检测子宫内膜癌组织样本的敏感性和特异性分别为97％和97％,BHLHE22，CDO1、CELF4和SORCS3分别进行检测时，CDO1的效果最好，敏感性和特异性分别为94％和92％，R0C曲线下面积为0.94(图3)，BHLHE22、CDO1和CELF4任意两个基因组合以及三个基因的组合的敏感性最高达94％，特异性最高达95％，ZNF486的AUC也优于BHLHE22，CDO1和CELF4及其组合(表9)，综合表明，单用ZNF486的检测效果优于BHLHE22、CDO1和CELF4及其组合。
实验例3
本实验例在ZNF486的基础上结合CDO1、SORCS3基因作为甲基化检测的靶基因，比较ZNF486结合CDO1、SORCS3基因的检测效果，采用ZNF486最佳检测区域(chr19：20167442-20167584)的特异性引物和探针(见实施例1)，CDO1的引物探针序列SEQ ID NO 22-SEQ IDNO 24所示，SORCS3的引物探针序列SEQ ID NO 37-SEQ ID NO 39所示。
收集来自华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科门诊的300个子宫内膜脱落细胞样本进行验证，其中45个样本经病理诊断为子宫内膜癌，其余255个为正常样本，通过DNA提取、重亚硫酸盐转化、MSP检测与分析(见实施例3)，检测结果如表10所示。
表10 ZNF486、CDO1和SORCS3组合检测子宫内膜脱落细胞样本的结果
结果表明，ZNF486结合CDO1、SORCS3时检测效果最好，敏感性和特异性分别为100％和98％，AUC为0.99(图4)。
综上，本发明实施例的试剂盒或试剂具有如下优点：
1.目前子宫内膜癌临床诊断主要依靠诊断性刮宫，取样过程中患者较痛苦，且取样有创伤，可能导致患者子宫穿孔、大出血、刮宫不全导致漏诊、漏刮及宫腔粘连、感染等。本发明可以只需使用一次性子宫内膜细胞采集器进行子宫内膜脱落细胞的取样，无需麻醉、创伤小、操作简便、患者依从性好，普通门诊即可进行采样；
2.传统的诊断方法不易检测出早期的子宫内膜癌，而DNA甲基化是癌症发生中的早期事件且具有一定的稳定性，可以作为子宫内膜癌诊断的生物标志，本发明提供了一种基于DNA甲基化的子宫内膜癌早期筛查方法，能准确快速判断受试者是否罹患子宫内膜癌,通过诊断或早期诊断可明显改善患者的预后状况；
3.现有技术需要至少两个分子标志才能取得较好的检测效果，且部分分子标志不能同时用于子宫内膜组织和子宫颈抹片细胞的检测，本发明仅需一个分子标志即可用于各种常规子宫内膜样本的检测,并且能达到较高的灵敏性和特异性，三个分子标志联用时效果更好；
4.现有技术仅公开了用于子宫内膜癌早期筛查的一组分子标志，未提供具体的引物和探针序列，临床使用操作难度较大，本发明解决了上述问题，提供了一套完善的检测方法，即一管式子宫内膜癌检测试剂盒，包括引物、探针、DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+离子等，方便快捷，可用于临床的大批量样本检测；
5.现有技术灵敏性和特异性最高分别能达到91.8％和95.5％,本发明利用单个标志物ZNF486灵敏性和特异性均能达到95％以上，ZNF486、CDO1和SORCS3联合使用灵敏性和特异性分别为100％和98％，效果突出。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉凯德维斯生物技术有限公司
<120> 一种子宫内膜癌的生物标志物及其应用
<160> 48
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttagagacgt tgggttggaa atcg 24
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgacctaaaa ctccaaatac aacgaaaa 28
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgccaaaccc gaaaaccgtc ctctttact 29
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtagttagtt ttataatttg cgttcgg 27
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caaaccaaaa cacgatcact acg 23
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaacaaaacg ccccgaaacc gactatca 28
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgcgggaatt acgagaaggt t 21
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaccaaaact cttccgaatc gta 23
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgcaccccga atcaaaattc tcccctaa 28
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tttacgattc ggaagagttt tggtt 25
<210> 11
<211> 22
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<400> 11
tcaaataatc cgccaacctt cg 22
<210> 12
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<400> 12
tactaaaatt acaaacgtca accaccgcgc 30
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tttgtttacg ttttagcgtc gc 22
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aacacgactc acgcgcac 18
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ccccgacttc cccgaactcc gc 22
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggagagattg cgcggagttt a 21
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ccctacgaac acgactcacg 20
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
acatccccga cttccccgaa ctcc 24
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gtgcgcgtga gtcgtgtt 18
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cgcgatacac acacaaatca aattc 25
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aattcatcct cccgaacccc ttttaaacgc 30
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
agatcgaagt gttgaagtta cgg 23
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
aaatcgctct cgtaaacttc cat 23
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tacacctcct ctacattaac ctcatcgccg 30
<210> 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tggaagttta cgagagcgat tt 22
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ttcctcctca aacgaaacga at 22
<210> 27
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
aacgccgcct aacattaaaa ctacaacgc 29
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
agttcgatta gtataggtga gcg 23
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ccgaaccaat cactttaaac tacg 24
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ccattcctcc tcaaacgaaa cgaataaacg 30
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
cgtagtttaa agtgattggt tcgg 24
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cccgcgacta accaacga 18
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
aaaacgaacg acgaacgcaa cgc 23
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
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<400> 34
tttggtcggg agtcggtcg 19
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaactacgca cgaaaaccaa acg 23
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ccctaaactc tactcgccgc tccctaac 28
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cgttcgttcg ttcgtcgg 18
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<212> DNA
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ctacgactac cgcgactcg 19
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accgaatata taacgcccgc cgaaatacga 30
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<212> DNA
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gcgtcggatt cgtatttcgg 20
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<212> DNA
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cctccatccc gctacgacta ccgc 24
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tcgagtcgcg gtagtcgta 19
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<400> 44
aaccccgtcc gaacaaacg 19
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
tcggcggttt cggtttcg 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
ccaacacgac gactctccg 19
<210> 48
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
cgccaactcc tccgaccact aactaac 27
Claims (5)
1.一种用于子宫内膜癌诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测ZNF486基因的靶区域甲基化的试剂，所述ZNF486基因的靶区域对应于人类基因组GRCh38/hg38版本的chr19：20167442-20167584的区域。
2.根据权利要求1所述的用于子宫内膜癌诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于检测CDO1基因和SORCS3基因的靶区域甲基化的试剂，所述CDO1基因的靶区域对应于人类基因组GRCh38/hg38版本的chr5：115816267-115816390的区域，以及所述SORCS3基因的靶区域对应于人类基因组GRCh38/hg38版本的chr10：104641229-104641324的区域。
3.根据权利要求1所述的用于子宫内膜癌诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测ZNF486基因的第一引物对和第一探针，所述第一引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5所示,所述第一探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
4.根据权利要求3所述的用于子宫内膜癌诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于检测CDO1基因的第二引物对和第二探针，以及用于检测SORCS3基因的第三引物对和第三探针，其中，所述第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示,所述第二探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；所述第三引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.37和SEQ ID NO.38所示,所述第三探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示。
5.权利要求1-4任一项所述的用于子宫内膜癌诊断的试剂盒在制备子宫内膜癌诊断产品中的应用。
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| GR01 | Patent grant | ||
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