CN113943810B - 子宫内膜癌检测的试剂及试剂盒 - Google Patents

子宫内膜癌检测的试剂及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本申请提供一种子宫内膜癌检测的试剂及试剂盒，通过对RAX基因CpG岛DNA甲基化水平的检测，实现子宫内膜癌诊断或辅助诊断，具有良好的灵敏性和特异性，且对I/II型子宫内膜癌均能有效检出，此外，该检测试剂在子宫内膜脱落细胞样本和血浆样本中亦能被检出，为子宫内膜癌的无创检测提供了新思路。

Description

子宫内膜癌检测的试剂及试剂盒
技术领域
本申请涉及生物医药技术领域，具体涉及一种子宫内膜癌的诊断的试剂及试剂盒。
背景技术
子宫内膜癌(endometrial cancer)，又称子宫体癌，是中国女性最常见的三大妇科恶性肿瘤之一，在我国部分发达城市，其发病率居妇科恶性肿瘤的首位。随着营养结构的改善、生活习惯的改变和预期寿命的增加，子宫内膜癌的发病率可能会进一步增加，变成严重的公共卫生问题。
子宫内膜癌分为I型和II型，I型主要在高雌激素状态下在子宫内膜增生的基础上发展导致子宫内膜癌，为雌激素相关型。此型占多数，发病年龄相对年轻，多在绝经前，高分化，多为内膜样腺癌和黏液性腺癌，子宫肌层浸润较浅，常表达雌激素受体、孕激素受体，临床病理分期多为I和II期；II型多表现为子宫内膜萎缩，与雌激素关系不大，占小部分，发病年龄相对较大，多发生在绝经后，多为低分化，主要指子宫内膜乳头状浆液性腺癌，还包括透明细胞癌、未分化癌和鳞状细胞癌。在中国，子宫内膜癌患者的五年相对生存率总体上在55％左右。生存率大小与癌症分期有关，FIGO分期I-II期的患者五年生存率在74％-91％之间，III期在57％-66％之间，IV期在20％-26％之间，因此，早诊早治是提高生存率的关键。
目前子宫内膜癌的主要检测方法包括肿瘤标志物检查(CA125、CA19-9、CEA、CP2或HE4)、影像学检查(经腹或经阴道超声、MRI、CT、PET-CT)、细胞学检查、分段诊断性刮宫等。肿瘤标志物检测的灵敏性和特异性均不理想，影像学检查对早期癌变的灵敏性欠佳，细胞学检查存在取材、制片、阅片水平参差不齐，取材和制片的手法影响阅片结果，患者的身体状况(激素水平、炎症、节育环、内膜增生等)影响细胞形态，造成假阳性的缺点，分段诊断性刮宫有创并且容易引起并发症(出血、子宫穿孔、宫腔感染、宫腔粘连)，因此开发灵敏性和特异性均较高且取材微创/无创的子宫内膜癌检测方法意义重大。
发明内容
本申请提供一种子宫内膜癌的检测试剂及试剂盒，可以用于子宫内膜癌检测或辅助诊断，具有良好的灵敏性和特异性。
本申请提供一种子宫内膜癌检测的试剂，所述试剂包括：能够特异性检测DNA样本中靶核苷酸序列中的至少一个CpG二核苷酸位点甲基化水平的检测试剂，所述靶核苷酸序列源自RAX基因CpG岛的全长或部分区域，其中所述部分区域至少包括一个CpG二核苷酸位点。
可选的，所述RAX基因CpG岛的核苷酸序列包括SEQ ID NO.22及SEQ ID NO.23所示核苷酸序列中的至少一种。
可选的，所述部分区域的核苷酸序列包括SEQ ID NO.24至SEQ ID NO.29所示核苷酸序列中的至少一种。
可选的，所述试剂包括能检测所述靶核苷酸甲基化水平的特异性引物对。
可选的，所述引物对包括如下引物对中的任一组：
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的组合；
SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的组合；
SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的组合；
SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11的组合；
SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14的组合；和/或
SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17的组合。
可选的，所述试剂还包括能检测所述靶核苷酸甲基化水平的特异性探针，所述特异性探针选自：SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15和/或SEQ ID NO.18中的至少一种。
可选的，所述试剂包括：
能差异修饰所述DNA样本中的甲基化位点和非甲基化位点的反应试剂；以及，能通过甲基化检测方法确定所述靶核苷酸中的特定CpG二核苷酸位点中的胞嘧啶的甲基化水平的检测试剂。
可选的，所述反应试剂包括重亚硫酸盐或其衍生物；和/或，所述检测试剂包括内参基因以及所述内参基因对应的引物对和探针；和/或，所述甲基化检测方法包括：甲基化特异性PCR方法、亚硫酸氢盐测序法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法和甲基化敏感性限制性内切酶法。
可选的，所述DNA样本来自哺乳动物的离体生物学样本，所述哺乳动物的离体生物学样本来自血液、子宫内膜组织及子宫内膜的细胞样本中的至少一种。
相应的，本申请还提供一种用于子宫内膜癌检测的试剂盒，包括以上所述的试剂。
有益效果：
本申请提供一种子宫内膜癌的检测和诊断的试剂及试剂盒，通过将RAX基因作为目标基因，检测RAX基因中CpG二核苷酸位点是否发生甲基化，用于子宫内膜癌检测或辅助诊断，具有良好的灵敏性和特异性，且对I/II型子宫内膜癌以及各个时期的子宫内膜癌均能有效检出，此外，该检测试剂在子宫内膜脱落细胞样本和血浆样本中亦能被检出，为子宫内膜癌的无创检测提供了新思路。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本申请实施例1～实施例6对应的子宫内膜脱落细胞癌症样本和正常样本的ROC曲线。
图2为本申请实施例1～实施例6对应的子宫内膜癌血浆样本和正常样本的ROC曲线。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。需说明的是，以下实施例的描述顺序不作为对实施例优选顺序的限定。另外，在本申请的描述中，术语“包括”是指“包括但不限于”。
首先，本申请提供了一种用于子宫内膜癌检测的试剂。所述试剂包括：能够特异性检测DNA样本中靶核苷酸序列中的至少一个CpG(胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤)二核苷酸位点甲基化水平的检测试剂，所述靶核苷酸序列源自RAX基因CpG岛的全长或部分区域，其中所述部分区域至少包括一个CpG二核苷酸位点。
发明人在研究过程中发现，RAX基因CpG岛的甲基化水平与子宫内膜癌相关，检测RAX基因CpG岛区域甲基化的增加可以对子宫内膜癌进行诊断或辅助诊断。
术语“DNA甲基化水平”与一般理解相同，指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代表定性的概念，又代表定量的概念。举例来说，如果核酸序列内的胞嘧啶(C)残基为甲基化的，则可将其称为“高甲基化的”或具有“增加的甲基化”在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平，如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较，在一些情况下，可计算出样本中标记物的甲基化比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100，然后再进行比较，在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。
术语“CpG岛”是指DNA上的一个区域，此区域富含大量的用磷酸酯键相连的胞嘧啶和鸟嘌呤，其主要位于基因的启动子和外显子区域，是富含CpG二核苷酸的区域，长度在200-3000bp之间，G和C的总含量超过50％，针对本实施例，RAX的CpG岛包括如下序列(5’-3’)：
CGGCCAGCTCCTCGCGGCTGTACACGTCCGGGTAGTGGGACTTCTCGAACGCGCGCTCCAGCTCATGCAGCTGGTACGTGGTGAAAGTCGTGCGGTTCCGCCGATGCTTTTTCTTGGGCTGTTCCTCCTCTGACAGTTTCGCTTCGCCGGTGGCTGGCCCGACGGGCAGCCCTGGGCTCGGCCGTGCCTCCCCGGGCTCCTTGGGGCAGTAGGGTCGAGGGGCTGGGGCGACGAGGCCCGGGAGGGTCAGATGCACTCCCCAAAACACCCTTGGGCCGACCCCGCCTCGCTGTGGGCACTGGCCAGCCCGCCTGCGGGCTCCGAGATGGCCCGGGGAGGTCCGTGGTGAGGGCGGCGATGGGTCCTAAGCTTTCTCTGAATGCAAATTGGAAGCTCCCGCCATAGACGGTCCCCAACCCCGCGCCCAGTTGCCTTAATAAAAGTTAAGGAAGGGGCGCTCTCGTCTGGCCAACTCCTAAGCTCGGGCGCCCGAACGGCCTCGCACAGCCAGGGGTGCGCACTCACCTTCGTACTCGGGGGCGGGCGCCGGGGCTGGCGGCGGGGAGGGCTCGGAGCCTTCCTCGGGCGCCTTGGGGCAGGCGGGCCGCGCGCCCAGCCTCCTATCCCGCTCCTTCGCGCCCCGGGCGCCCCGCTCCGCCGGGAAGGTGCCGAGGATCCCGTCGTCCTTGGTAAACCCCAGGATGGCCTCGATGCTGTGAAGTCGCGAGGTGCTCCCGCCCGGGCTGCGGAGCAGGTGGCCGGCAAGCGAGAAGCTCCCGTCGGCCATGGCTGGCGCGCAGCCCGGCAGGTGCATGGGGAGCGCCGGGAGGCGGGAGGGCGCTTTGGAGACGGAGAGGAGAGGCTCGAAGCCGGGTCTTCCCGAGTGCGGCGGTGCAACCCGACGGGTCCCGACCCTAGGTCAAGCTCCGCGGGCGAAGCCCGCCCGGGCTGCGCACGCTGGGGGTGGCCGAGCGCTCAGCCCGCTGCCGCCTTAGTCCCAGAAGTCGGAAGTTCGGGCTCGGGGTAGCTGGGGCTCTCGGCGCTAAAGGCGGGGAGCCAACTGGCCCTCGGCTCCTCCCCTCTCGCCCTGGACCCAGCCCCTTCTCTCGGCCCCTCCCTCCACAGAGGGGCGTGTCCTCACCCGGCCCAGCCACAGGGTCCTCTAGTGGCCACCCCTGGGCCGGCACTAGGAATATTCCCCTTCCACCTCTTGATCCGTTTTAAGCTTTACAAACACACTCCGGGGATCCGCGGCGGGATGCCTGATGGGCTCGGGAACCTGGTCGCGGCGCACCCCTAGTCCTGCCTCAGTGGGGCCGACGCCCTTGGGCTCATCTCTCCCCTTGCGTTTGTCTCCCTCTACTTCGGGCTTACCCTCTCACTTCAGACTACCCCCTGGGGGTCACCTCCCTCCTTGGACGCACCCCTCCCCAGCTTCAGACTCGCCCCTCTAGCCCCCTCTGGCTCACCTCCGCGGGGCCGCCACCCTGGCCTGTGCCCCCTGGAAGCGCCGAGACCCAGCCGAAGGCTTCCCAGCCCCGCACTCGTCGCAGTTTGAATTTCCCCTCGCTGGCTCCCTTTTCGGGACCCACTCCTTTCTTGGCTGGGTTGTACGAAGTCCCGGACCTCGCGTTTAGTTTGTCCGTCTATATCTGTTGTAACTCCTCCCAGTCCCCTCGGACTTGAGCGCCGGCAGCCTCCCTCCTTCCCCGCAGCGCCCACCCCAGGGCCATTTATGTCCGCAAGTCCGGTGACCTCTAGCGCCCGATCGCCCAGCAGGAGACTGGGAGCCCCGAGTCGGATGTGCTGCCGGGCTCAGGTCCCGCAGGAGACCCACCTGGAGTTCCTCGCTCCCGCCCCTTGTCCTGCGGGGAGGGCGGGCTCCTTTACTGATGAGCAGCGGTGTCGCACTCCCG。
上述序列(SEQ ID NO.22)位于人18号染色体，例如以GRCh38/hg38基因组为参考，该序列位于Chr18:59272393-59274308区域(本文中所提到的以基因组为参考的位点或区域的位置均是以GRCh38/hg38为参考)。相应的，所述RAX基因的CpG岛的核苷酸序列还包括上述序列(SEQ ID NO.22)的反向互补的核苷酸序列SEQ ID NO.23。因此针对本申请实施例，作为甲基化水平检测目标的靶核苷酸序列可以包括SEQ ID NO.22，和/或SEQ IDNO.23。
在本申请实施例中，核苷酸序列“互补”是指一一对应的碱基互补。例如人基因组中DNA序列包括正义链和与之对应互补的反义链，正义链和反义链具有本领域已知的含义，一般来说，反义链(负链，nonsense strand)为mRNA转录时结合的模板链，而非模板链存储mRNA的编码信息，为正义链(正链，sense strand)。可以理解的是，在DNA双链中，只是在某一部分区域某一条链是正义链，部分是反义链，在另一个区域可能是完全相反的。
本领域技术人员可以理解，由于个体差异的不同，在同一染色体的相同区域，基因的碱基序列可能存在细微差别。因此在本申请实施例中，所述靶核苷酸序列还可以选自与SEQ ID NO.22，和/或SEQ ID NO.23存在至少70％、80％、90％、95％或99％的相似性的序列。
两个核酸序列之间的“相似性”，其百分比表示在最佳比对(best alignment)后获得的待比较的两个序列之间的相同核苷酸的统计学意义的百分比，两个序列之间的差异随机地分布在其整个长度上。通常，这种序列的比较可以手动进行，也可以利用计算机程序方法进行，其中计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相似性。
在一些实施例中，所述CpG岛的部分区域的核苷酸序列为SEQ ID NO.24至SEQ IDNO.29中的至少一种，或者选自与SEQ ID NO.24至SEQ ID NO.29具有至少70％、80％、90％、95％或99％的相似性的序列。
具体而言，所述SEQ ID NO.24为Chr18：59274062-59274208区域的正义链上的核苷酸序列；所述SEQ ID NO.25为Chr18：59274194-59274312区域正义链上的核苷酸序列；所述SEQ ID NO.26为Chr18：59274476-59274286区域负义链上的核苷酸序列；所述SEQ IDNO.27为Chr18:59274332-59274135区域负义链上的核苷酸序列；所述SEQ ID NO.28为Chr18：59273239-59273387区域正义链上的核苷酸序列；所述SEQ ID NO.29为Chr18：59273453-59273342区域负义链上的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述试剂包括：PCR试剂，所述PCR试剂包括能特异性检测所述靶核苷酸的甲基化水平特异性引物对和/或特异性探针。
术语“引物”是指在纯化的限制性消化物中天然存在的或合成产生的寡核苷酸，当处于其中诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下(例如，在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶的存在下并且在合适的温度和pH下)时，其能够作为合成的起点。引物优选是单链的，用于扩增的最大效率，但也可以是双链的。如果是双链，则在用于制备延伸产物之前首先处理引物以分离其链。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在诱导剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源以及方法的使用。
术语“探针”是指在纯化的限制性消化物中天然存在的或者合成、重组或通过PCR扩增产生的寡核苷酸(例如，核苷酸序列)，其能够与另一种目标寡核苷酸杂交。探针可以是单链或双链的。探针可用于特定基因序列的检测、鉴定和分离。
作为示例性方案，所述引物对包括如下引物对中的任一组：
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的组合；
SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的组合；
SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的组合；
SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11的组合；
SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14的组合；
SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17的组合；和/或，选自与上述序列具有至少70％、80％、90％、95％或99％的序列相似性的引物。
作为示例性方案，所述特异性探针选自：SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.18中的至少一种，或选自与上述序列具有多个连续核苷酸至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性探针。
本申请实施例中，所述探针为Taqman探针，标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团，在一些实施方式中，所述探针5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光猝灭基团为MGB。
在一些实施例中，所述试剂包括：
(a)反应试剂，能差异修饰所述DNA样本中的甲基化位点和非甲基化位点。
作为示例性方案，所述反应试剂包括重亚硫酸盐或其衍生物。
(b)检测试剂，在用所述反应试剂处理DNA样本之后，所述检测试剂能通过甲基化检测方法确定所述靶核苷酸中的特定CpG二核苷酸位点中的胞嘧啶的甲基化水平。
作为示例性方案，所述检测试剂包括内参基因以及所述内参基因对应的引物对和探针。
作为示例性方案，所述甲基化检测方法包括：甲基化特异性PCR方法、测序法(例如：亚硫酸氢盐测序法、全基因组甲基化测序法和焦磷酸测序法)、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法和甲基化敏感性限制性内切酶法。
在一些实施例中，所述DNA样本来自哺乳动物的离体生物学样本，包括人、非人类灵长动物。所述哺乳动物的离体生物学样本可以来自血液、子宫内膜组织及子宫内膜的细胞样本中的至少一种。具体的，所述血液样本包括：全血样本、血清样本、血浆样本和血细胞样本；所述子宫内膜的细胞样本可以为子宫来源的脱落细胞样本，包括：宫颈脱落细胞样本和子宫内膜脱落细胞样本。特别当所述样本来自子宫来源的脱落细胞样本时，所述试剂可适用于无创检测。
在一些实施例中，所述子宫内膜癌为I型或II型子宫内膜癌。
本申请一种用于子宫内膜癌的检测和诊断的试剂盒，包括以上任一项实施例所述的试剂。
本申请还提供了用于子宫内膜癌检测和诊断的芯片，所述芯片能够特异性检测DNA样本中靶核苷酸序列中的至少一个CpG(胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤)二核苷酸位点甲基化水平的检测试剂，所述靶核苷酸序列源自RAX基因CpG岛的全长或部分区域。
本申请还提供一种以上实施例所述试剂盒的使用方法，该方法包括：
(1)提取DNA样品；
(2)加入反应试剂，对所述DNA样品进行处理；
(3)加入检测试剂，进行PCR扩增反应，检测所述DNA样品中靶核苷酸序列中CpG二核苷酸位点是否发生甲基化反应。所述靶核苷酸序列源自RAX基因CpG岛的全长或部分区域。具体的，所述反应试剂能差异修饰所述DNA样本中的甲基化位点和非甲基化位点，所述检测试剂能通过甲基化检测方法确定所述靶核苷酸的特定CpG中的胞嘧啶是甲基化的还是非甲基化的，或者进一步计算或评估靶核苷酸序列中的CpG二核苷酸位点发生甲基化的比例。
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本申请的内容。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过本领域已知方法制备。
实施例1～实施例6
实施例1～实施例6各提供一组子宫内膜癌检测的试剂，共6组试剂，其包括RAX基因区域1～区域6的一对甲基化特异性引物和一条特异性taqman探针，其中区域1～区域6、引物对和探针的序列如表1所示。
表1.RAX基因CpG岛内6个区域的甲基化引物探针
实施例1～实施例6提供的试剂可通过以下方法进行子宫内膜癌的诊断，具体步骤包括：
(1)样本DNA提取
若样本为福尔马林固定、石蜡包埋的组织样本(FFPE样本)时：采用QIAamp DNAFFPE Tissue Kit提取组织DNA，具体操作参见试剂盒说明书。
若样本为子宫内膜脱落细胞样本时：采用天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)提取子宫内膜脱落细胞DNA，具体操作参见试剂盒说明书。
若样本为血浆样本时：采用武汉艾米森生命科技有限公司的血浆cfDNA提取试剂(核酸提取试剂鄂汉械备20210740号)，具体操作参见试剂盒说明书。
(2)亚硫酸氢盐转化
所用核酸转化试剂盒为ZYMO RESEARCH的EZ DNA Methylation-Gold TM Kit，具体实验操作参见试剂盒说明书。
(3)甲基化特异性PCR
对CpG岛内的6个区域进行甲基化检测，6个区域的检测试剂分别对应实施例1～实施例6中的引物对和探针。
将亚硫酸氢盐转化后的DNA进行甲基化特异性PCR反应以检测RAX基因区域1～区域6的甲基化状态，每个区域单独进行检测，即一个PCR管中每次只加入一个区域的检测引物和探针，同时加入内参基因的检测探针。ACTB作为内参基因，其中ACTB上游引物为：AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG(SEQ ID NO.19)；ACTB下游引物为：AATAACACCCCCACCCTGC(SEQID NO.20)；ACTB探针为：GGAGTGGTTTTTGGGTTTG(SEQ ID NO.21)。
采用Taq热启动DNA聚合酶进行PCR扩增，PCR反应液配置体系如表2所示:
表2
如表2所示，在检测RAX基因区域1～区域6任一区域在样本中的甲基化状态时，只需将某一区域对应的引物探针、ACTB引物探针、缓冲液、dNTP、DNA酶和样本DNA等按照表中的体积加入到反应体系中。每个样本设置三个复孔。PCR反应条件如下表3所示。
表3
(4)质量控制
在每次检测时对阴性对照和阳性对照进行同步检测，阴性对照和阳性对照样本在进行PCR之前，同样要进行亚硫酸氢盐转化过程。
阴性对照为纯化水。
阳性对照为Hec-1A细胞系基因组，浓度为103copies/μL。
阴性对照要无扩增，阳性对照要有明显的指数增长期，待检样本的内参基因的Ct值应≤35，阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。
(5)PCR数据分析
Ct值读取：PCR完成后，调整基线，ACTB基因和待检目的基因的基线分开进行调整，将一次PCR中样本最小Ct值提前1-2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到每个样本待检测目的基因的Ct值和内参基因ACTB的Ct值。
结果分析：对于子宫内膜组织样本，记录区域1-6在样本中是否有扩增，对于子宫内膜脱落细胞样本和血浆样本的PCR检测结果，用SPSS软件进行ROC分析，对于没有扩增的样本，在进行ROC分析时将其Ct值定为45。将癌症样本的状态变量定为“1”，正常样本的状态变量定为“0”，读取AUC值，记录约登指数最大时的灵敏性和特异性。
实验例1
22例子宫内膜癌组织样本存取自武汉某医院，对22例样本采用实施例中所述的方法进行组织样本DNA提取、对提取到的DNA进行亚硫酸氢盐转化、以转化后的DNA为模板，利用实施例1～实施例6提供的试剂对区域1～区域6进行甲基化特异性PCR检测，统计实施例1～实施例6在各个样本中的甲基化情况，并计算灵敏性和特异性，结果如表4所示。
表4实施例1～实施例6在20例组织样本中的Ct值统计
由表4的结果可以看出，在22例子宫内膜癌样本中，实施例1、实施例2、实施例4和实施例6均能扩增对应的区域，实施例3仅在两例样本中未扩增，实施例5仅在1例样本中未扩增，表明实施例1～实施例6对应的区域在子宫内膜癌样本中是高甲基化的。
实验例2
41例子宫内膜癌样本和21例子宫内膜正常样本取自于武汉某医院，所有样本均为子宫内膜脱落细胞样本，样本由专业医务人员收集，样本信息如表4所示。对62例样本采用实施例中所述的方法进行细胞样本DNA提取，对提取到的DNA进行亚硫酸氢盐转化，以转化后的DNA为模板，利用实施例1～实施例6提供的试剂对区域1～区域6进行甲基化特异性PCR检测，统计实施例1～实施例6在各个样本中的Ct值，结果如表5所示。用癌症样本和健康样本的Ct值进行ROC分析，得出灵敏性、特异性和AUC值数据，结果如表6所示，ROC曲线如附图1所示。
表5.实施例1～实施例6在子宫内膜脱落细胞样本中的Ct值。
表6.实施例1～实施例6在子宫内膜脱落细胞样本上的ROC分析结果
序号 灵敏性 特异性 AUC值
实施例1 95.1％ 90.5％ 0.921
实施例2 97.6％ 90.5％ 0.962
实施例3 92.7％ 95.2％ 0.936
实施例4 95.1％ 95.2％ 0.956
实施例5 92.7％ 90.5％ 0.930
实施例6 92.7％ 90.5％ 0.948
从表6的结果可以看出，在子宫内膜脱落细胞样本中，实施例1～实施例6的甲基化的检测灵敏性均不低于90％，与实验例1的结果一致，其中子宫内膜样癌属于I型子宫内膜癌，透明细胞癌属于II型子宫内膜癌，实施例1～实施例6对I型和II型子宫内膜癌均有良好的检测效果，在21例正常样本中，实施例1-6的检测特异性均不低于90％。
实验例3
44例子宫内膜癌血浆样本、56例健康人血浆样本取自于武汉某医院，样本由专业医务人员收集，样本信息如表7所示。对100例样本采用实施例中所述的方法进行细胞样本DNA提取、对提取到的DNA进行亚硫酸氢盐转化、以转化后的DNA为模板对实施例1～实施例6进行甲基化特异性PCR检测，统计实施例1～实施例6在各个样本中的甲基化Ct值，结果如表7所示，并对癌症样本和正常样本的Ct值做ROC分析，并计算灵敏性和特异性，结果如表8和图2所示。
表7.实施例1～实施例6在血浆样本中的检测结果
表8.实施例1～实施例6在子宫癌血浆样本和正常血浆样本上的ROC分析结果
序号 灵敏性 特异性 AUC值
实施例1 77.3％ 96.4％ 0.862
实施例2 79.5％ 98.2％ 0.892
实施例3 70.5％ 96.4％ 0.837
实施例4 75％ 94.6％ 0.851
实施例5 63.6％ 96.4％ 0.808
实施例6 65.9％ 98.2％ 0.823
由表8和图2的结果可以看出，在血浆样本中，实施例1～实施例6对子宫内膜癌样本的整体灵敏性在60％-70％之间，其中实施例1、实施例2和实施例4的灵敏性最高，不低于75％。在56例健康人血浆样本中，实施例1～实施例6的检测特异性均在94％以上。
综上所述，本申请提供一种子宫内膜癌检测的试剂及试剂盒，通过对RAX基因CpG岛DNA甲基化水平的检测，实现子宫内膜癌诊断或辅助诊断，无论是采用宫颈脱落细胞样本、组织样本还是血浆样本，均具有较高的灵敏性和特异性，将该试剂应用于血浆样本中时，可简化取样环节，减小取样创伤，将该试剂应用于宫颈脱落细胞样本时，可通过阴道拭子采样，减少病人痛苦，提高检测试剂的普及性。另一方面，对于各种类型的子宫内膜癌，例如I型的子宫内膜样癌，II型的透明细胞癌，本申请提供的检测试剂均有较好的检测效果。此外，发明人还发现，将RAX基因上的特定CpG岛区域(即：SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQID NO.27)作为靶核苷酸，检测这些基因中CpG二核苷酸位点的甲基化水平，对于子宫内膜癌检测具有更优的灵敏度。
以上对本申请所提供的一种子宫内膜癌检测和诊断的试剂及试剂盒，进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的技术方案及其核心思想；本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请实施例的技术方案的范围。
序列表
<110> 武汉艾米森生命科技有限公司
<120> 子宫内膜癌检测的试剂及试剂盒
<141> 2021-11-08
<160> 29
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
agttttttcg gatttgagcg tc 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
aacccgacaa cacatccgac t 21
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tcgtaagttc ggtgattttt agcgt 25
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
atgtgttgtc gggtttaggt ttc 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
aaaacgaaaa tacgacaccg ct 22
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ttttcgtttt ttgttttgcg gggag 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
tcgattagtt attgtgggtt acgga 25
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
taaacaacga tatcgcactc cc 22
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
ttatttttga attttcgggg aggcg 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
ttggttcgga gtgttggagg gaggc 25
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
caaatccgat aacctctaac gc 22
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
ttcgtttttt tcgtaggata agggg 25
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
agacggagag gagaggttcg a 21
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
ctaaaacgac aacgaactaa acgct 25
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
agtgcggcgg tgtaattcga c 21
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
gttggttttt cgtttttagc gtc 23
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
tacgcacgct aaaaataacc ga 22
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
ttcgattttt gggattaagg cggta 25
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
aaggtggttg ggtggttgtt ttg 23
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
aataacaccc ccaccctgc 19
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
ggagtggttt ttgggtttg 19
<210> 22
<211> 1916
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 22
cggccagctc ctcgcggctg tacacgtccg ggtagtggga cttctcgaac gcgcgctcca 60
gctcatgcag ctggtacgtg gtgaaagtcg tgcggttccg ccgatgcttt ttcttgggct 120
gttcctcctc tgacagtttc gcttcgccgg tggctggccc gacgggcagc cctgggctcg 180
gccgtgcctc cccgggctcc ttggggcagt agggtcgagg ggctggggcg acgaggcccg 240
ggagggtcag atgcactccc caaaacaccc ttgggccgac cccgcctcgc tgtgggcact 300
ggccagcccg cctgcgggct ccgagatggc ccggggaggt ccgtggtgag ggcggcgatg 360
ggtcctaagc tttctctgaa tgcaaattgg aagctcccgc catagacggt ccccaacccc 420
gcgcccagtt gccttaataa aagttaagga aggggcgctc tcgtctggcc aactcctaag 480
ctcgggcgcc cgaacggcct cgcacagcca ggggtgcgca ctcaccttcg tactcggggg 540
cgggcgccgg ggctggcggc ggggagggct cggagccttc ctcgggcgcc ttggggcagg 600
cgggccgcgc gcccagcctc ctatcccgct ccttcgcgcc ccgggcgccc cgctccgccg 660
ggaaggtgcc gaggatcccg tcgtccttgg taaaccccag gatggcctcg atgctgtgaa 720
gtcgcgaggt gctcccgccc gggctgcgga gcaggtggcc ggcaagcgag aagctcccgt 780
cggccatggc tggcgcgcag cccggcaggt gcatggggag cgccgggagg cgggagggcg 840
ctttggagac ggagaggaga ggctcgaagc cgggtcttcc cgagtgcggc ggtgcaaccc 900
gacgggtccc gaccctaggt caagctccgc gggcgaagcc cgcccgggct gcgcacgctg 960
ggggtggccg agcgctcagc ccgctgccgc cttagtccca gaagtcggaa gttcgggctc 1020
ggggtagctg gggctctcgg cgctaaaggc ggggagccaa ctggccctcg gctcctcccc 1080
tctcgccctg gacccagccc cttctctcgg cccctccctc cacagagggg cgtgtcctca 1140
cccggcccag ccacagggtc ctctagtggc cacccctggg ccggcactag gaatattccc 1200
cttccacctc ttgatccgtt ttaagcttta caaacacact ccggggatcc gcggcgggat 1260
gcctgatggg ctcgggaacc tggtcgcggc gcacccctag tcctgcctca gtggggccga 1320
cgcccttggg ctcatctctc cccttgcgtt tgtctccctc tacttcgggc ttaccctctc 1380
acttcagact accccctggg ggtcacctcc ctccttggac gcacccctcc ccagcttcag 1440
actcgcccct ctagccccct ctggctcacc tccgcggggc cgccaccctg gcctgtgccc 1500
cctggaagcg ccgagaccca gccgaaggct tcccagcccc gcactcgtcg cagtttgaat 1560
ttcccctcgc tggctccctt ttcgggaccc actcctttct tggctgggtt gtacgaagtc 1620
ccggacctcg cgtttagttt gtccgtctat atctgttgta actcctccca gtcccctcgg 1680
acttgagcgc cggcagcctc cctccttccc cgcagcgccc accccagggc catttatgtc 1740
cgcaagtccg gtgacctcta gcgcccgatc gcccagcagg agactgggag ccccgagtcg 1800
gatgtgctgc cgggctcagg tcccgcagga gacccacctg gagttcctcg ctcccgcccc 1860
ttgtcctgcg gggagggcgg gctcctttac tgatgagcag cggtgtcgca ctcccg 1916
<210> 23
<211> 1916
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 23
cgggagtgcg acaccgctgc tcatcagtaa aggagcccgc cctccccgca ggacaagggg 60
cgggagcgag gaactccagg tgggtctcct gcgggacctg agcccggcag cacatccgac 120
tcggggctcc cagtctcctg ctgggcgatc gggcgctaga ggtcaccgga cttgcggaca 180
taaatggccc tggggtgggc gctgcgggga aggagggagg ctgccggcgc tcaagtccga 240
ggggactggg aggagttaca acagatatag acggacaaac taaacgcgag gtccgggact 300
tcgtacaacc cagccaagaa aggagtgggt cccgaaaagg gagccagcga ggggaaattc 360
aaactgcgac gagtgcgggg ctgggaagcc ttcggctggg tctcggcgct tccagggggc 420
acaggccagg gtggcggccc cgcggaggtg agccagaggg ggctagaggg gcgagtctga 480
agctggggag gggtgcgtcc aaggagggag gtgaccccca gggggtagtc tgaagtgaga 540
gggtaagccc gaagtagagg gagacaaacg caaggggaga gatgagccca agggcgtcgg 600
ccccactgag gcaggactag gggtgcgccg cgaccaggtt cccgagccca tcaggcatcc 660
cgccgcggat ccccggagtg tgtttgtaaa gcttaaaacg gatcaagagg tggaagggga 720
atattcctag tgccggccca ggggtggcca ctagaggacc ctgtggctgg gccgggtgag 780
gacacgcccc tctgtggagg gaggggccga gagaaggggc tgggtccagg gcgagagggg 840
aggagccgag ggccagttgg ctccccgcct ttagcgccga gagccccagc taccccgagc 900
ccgaacttcc gacttctggg actaaggcgg cagcgggctg agcgctcggc cacccccagc 960
gtgcgcagcc cgggcgggct tcgcccgcgg agcttgacct agggtcggga cccgtcgggt 1020
tgcaccgccg cactcgggaa gacccggctt cgagcctctc ctctccgtct ccaaagcgcc 1080
ctcccgcctc ccggcgctcc ccatgcacct gccgggctgc gcgccagcca tggccgacgg 1140
gagcttctcg cttgccggcc acctgctccg cagcccgggc gggagcacct cgcgacttca 1200
cagcatcgag gccatcctgg ggtttaccaa ggacgacggg atcctcggca ccttcccggc 1260
ggagcggggc gcccggggcg cgaaggagcg ggataggagg ctgggcgcgc ggcccgcctg 1320
ccccaaggcg cccgaggaag gctccgagcc ctccccgccg ccagccccgg cgcccgcccc 1380
cgagtacgaa ggtgagtgcg cacccctggc tgtgcgaggc cgttcgggcg cccgagctta 1440
ggagttggcc agacgagagc gccccttcct taacttttat taaggcaact gggcgcgggg 1500
ttggggaccg tctatggcgg gagcttccaa tttgcattca gagaaagctt aggacccatc 1560
gccgccctca ccacggacct ccccgggcca tctcggagcc cgcaggcggg ctggccagtg 1620
cccacagcga ggcggggtcg gcccaagggt gttttgggga gtgcatctga ccctcccggg 1680
cctcgtcgcc ccagcccctc gaccctactg ccccaaggag cccggggagg cacggccgag 1740
cccagggctg cccgtcgggc cagccaccgg cgaagcgaaa ctgtcagagg aggaacagcc 1800
caagaaaaag catcggcgga accgcacgac tttcaccacg taccagctgc atgagctgga 1860
gcgcgcgttc gagaagtccc actacccgga cgtgtacagc cgcgaggagc tggccg 1916
<210> 24
<211> 147
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 24
agtcccctcg gacttgagcg ccggcagcct ccctccttcc ccgcagcgcc caccccaggg 60
ccatttatgt ccgcaagtcc ggtgacctct agcgcccgat cgcccagcag gagactggga 120
gccccgagtc ggatgtgctg ccgggct 147
<210> 25
<211> 119
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 25
atgtgctgcc gggctcaggt cccgcaggag acccacctgg agttcctcgc tcccgcccct 60
tgtcctgcgg ggagggcggg ctcctttact gatgagcagc ggtgtcgcac tcccgcctc 119
<210> 26
<211> 191
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 26
ccgatcagtc actgtgggcc acggaagcct cgagggggtc caaaggagaa agaactgcaa 60
gccaattact cctgaaccct cggggaggcg agaggcctct tccccgggag aaggtccttc 120
cccagccagc tctgggccat ctccttggcc cggagtgttg gagggaggcg ggagtgcgac 180
accgctgctc a 191
<210> 27
<211> 198
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 27
ttggcccgga gtgttggagg gaggcgggag tgcgacaccg ctgctcatca gtaaaggagc 60
ccgccctccc cgcaggacaa ggggcgggag cgaggaactc caggtgggtc tcctgcggga 120
cctgagcccg gcagcacatc cgactcgggg ctcccagtct cctgctgggc gatcgggcgc 180
tagaggtcac cggacttg 198
<210> 28
<211> 149
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 28
agacggagag gagaggctcg aagccgggtc ttcccgagtg cggcggtgca acccgacggg 60
tcccgaccct aggtcaagct ccgcgggcga agcccgcccg ggctgcgcac gctgggggtg 120
gccgagcgct cagcccgctg ccgccttag 149
<210> 29
<211> 112
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 29
gttggctccc cgcctttagc gccgagagcc ccagctaccc cgagcccgaa cttccgactt 60
ctgggactaa ggcggcagcg ggctgagcgc tcggccaccc ccagcgtgcg ca 112

Claims (5)

1.一种检测子宫内膜癌的试剂，其特征在于，所述试剂包括：能够特异性检测DNA样本中靶核苷酸序列中的至少一个CpG二核苷酸位点甲基化水平的试剂，所述靶核苷酸序列源自RAX基因CpG岛的全长或部分区域，所述RAX基因CpG岛的全长的核苷酸序列为SEQ IDNO.22所示的核苷酸序列或SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列，所述RAX基因CpG岛的部分区域的核苷酸序列为SEQ ID NO.24至SEQ ID NO.29所示核苷酸序列中的至少一种；
所述试剂包括能检测所述靶核苷酸序列的甲基化水平的特异性引物对和特异性探针，所述特异性引物对和所述特异性探针包括下述任意一组：
(1) 所述引物对为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的组合，所述特异性探针为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
(2) 所述引物对为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的组合，所述特异性探针为SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；
(3) 所述引物对为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的组合，所述特异性探针为SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列；
(4) 所述引物对为SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示核苷酸序列的组合，所述特异性探针为SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列；
(5) 所述引物对为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示核苷酸序列的组合，所述特异性探针为SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列；
(6) 所述引物对为SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示核苷酸序列的组合，所述特异性探针为SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括：
能差异修饰所述DNA样本中的甲基化位点和非甲基化位点的反应试剂；以及，能通过甲基化检测方法确定所述靶核苷酸中的特定CpG二核苷酸位点中的胞嘧啶的甲基化水平的检测试剂。
3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述反应试剂包括重亚硫酸盐；和/或，
所述检测试剂包括内参基因以及所述内参基因对应的引物对和探针；和/或，
所述甲基化检测方法包括：甲基化特异性PCR方法、亚硫酸氢盐测序法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率熔解曲线法和甲基化敏感性限制性内切酶法。
4.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述DNA样本来自哺乳动物的离体生物学样本，所述哺乳动物的离体生物学样本来自血液、子宫内膜组织及子宫内膜的细胞样本中的至少一种。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的试剂在制备子宫内膜癌检测试剂盒中的应用。
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