CN116219023A

CN116219023A - 用于检测肺癌特异性标志物甲基化的凝胶法试剂盒及应用

Info

Publication number: CN116219023A
Application number: CN202310327340.4A
Authority: CN
Inventors: 胡立夫; 南熠郎
Original assignee: Shenzhen Peoples Hospital
Current assignee: Shenzhen Peoples Hospital
Priority date: 2023-03-24
Filing date: 2023-03-24
Publication date: 2023-06-06

Abstract

本发明属于基因检测技术领域，公开了用于检测肺癌特异性标志物甲基化的凝胶法试剂盒及应用。具体公开了用于检测肺癌特异性标志物甲基化的试剂盒，其中，上述标志物包括HIST1H3A、SHOX2、PITX2、HOXA9和RASSF1基因。从肺癌组织提取的DNA中，上述标志物特异CpG位点发生高度甲基化。本发明采用上述试剂盒对肺癌5基因和内参基因ACTB甲基化进行PCR扩增，联合琼脂糖凝胶电泳检查结果，以任何2个或2个以上标志物阳性为肺癌诊断标准，灵敏度为80％，特异性为90％。本发明适用于医院对肺癌早期患者的筛查及对易感人群做风险评估，显示了很好的检出效果。

Description

用于检测肺癌特异性标志物甲基化的凝胶法试剂盒及应用

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及用于检测肺癌特异性标志物甲基化的凝胶法试剂盒及应用。

背景技术

肺癌已经成为人类癌症死亡的主要原因之一。肺癌的发病率和死亡率居所有肿瘤之首，且呈快速上升趋势。我国肺癌死亡的主要原因之一，是缺乏有效的早期诊断手段。早期肺癌的5年生存率可以达到90％，而晚期肺癌的5年生存率只有15％。

肺癌的早期诊断总是比较困难。目前，肺癌的诊断主要依据临床症状、影像学检查和组织病理学检查等，如常见的磨玻璃为主的肺结节，它们的良恶性判断最主要就是基于胸部CT影像的表现，但是很难给予鉴别，最终诊断往往是在中晚期。

肺癌从最初病变发展成癌浸润转移需要5～10年时间，虽然有许多肿瘤早期已经出现，但是缺乏高敏感性和特异性的早期诊断技术。早期发现不仅治疗效果好，其医疗开支也低。一旦癌变中期，病变速度加快，治疗费用高，效果很差。因此，早期诊断和治疗是应对肺癌的最佳方法。

随着科技的快速发展，肿瘤标志物已经发展成为继影像诊断和病理诊断之后的肿瘤诊断和治疗的新领域，为肿瘤的早期筛选和诊断提供了新的挑战和希望。肿瘤标志物可在体液或组织中检测，可反映肿瘤的存在、分化程度、预后估计和治疗效果。与组织活检相比，肺泡灌洗液、血浆、痰液等样本容易随时获取，很少对受试者产生创伤。

随着基因诊断技术的不断发展，国内外研究发现，某些基因的甲基化DNA水平可用于早期诊断，其敏感性优于血清蛋白质中如CA199系列标志物，更特异，而且DNA甲基化几乎发生在所有肿瘤中，出现在癌变的早期，可以在疾病临床症状出现前检测到。它是肿瘤早期诊断、疾病风险预测、临床病程监测和疗效评价的潜在有用指标。

作为一种新的分子标记，DNA甲基化在肿瘤诊断中受到越来越多的关注。其优点是：第一，在肿瘤形成过程中，启动子高甲基化频繁发生，甚至高于基因突变，其中有许多与肿瘤形成相关的癌基因和抑癌基因的甲基化；其次，甲基化是肿瘤发生早期的重要事件；第三，DNA甲基化是稳定存在的，可以通过PCR扩增效应检测出来；第四，存在一定的组织特异性。因此，甲基化检测在肿瘤早期诊断中具有潜在的应用价值。

研究指出痰中相关基因启动子甲基化程度随肿瘤风险增加而增加，而确诊肺鳞癌前3年痰液中可检出CDKN2A或p16或MGMT基因。目前，有许多研究检测血液、痰液和肺泡灌洗液中细胞DNA的甲基化状态。

血浆游离DNA(cfDNA)是实体肿瘤细胞向血液释放的衰老降解产物，同一基因的异常甲基化DNA只占外周血总DNA的极小部分，约为0.01％～0.1％。这些未甲基化的DNA与甲基化的DNA只是胞嘧啶上甲基化修饰略有不同，因此有必要从高度复杂的“背景”中检测出异常的甲基化DNA。此外，循环血液中的DNA通常是降解的(一般为几十到几百个碱基对)168个核苷酸片段，血浆游离肿瘤DNA(ctDNA)半衰期只有2.5h，因此需要及时提取和好的提取技术才能获得高回收率。

近年来，已将检测DNA甲基化的方法应用到肿瘤的早期检测中。目前检测甲基化的方法大致分为特异位点的甲基化检测和全基因组的甲基化分析。其中特异位点的甲基化检测主要包括：甲基化特异性PCR(MS-PCR)、亚硫酸氢盐处理+测序、联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA)、荧光定量法(Methylight)、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析、焦磷酸测序；而甲基化图谱分析包括：基因芯片、高通量测序NGS、飞行质谱。目前最常用的方法为甲基化特异性PCR，其优点为经济实用，无需其他特殊仪器，且灵敏度高。经过亚硫酸盐处理后，通过设计引物扩增，即可进行甲基化特异PCR，进而分析检测位点是否存在甲基化。

癌变是多因素，多基因和多步骤的过程。例如肺癌发生可能是抽烟、遗传、生活习惯和职业工种引起，其癌变机理和信号传导系统大不相同。目前市场上使用1～2个基因标志物是无法覆盖由多种工作环境因素、生活习惯和遗传因素不同而造成的不同致癌基因，和引起癌变的主要机制的。

而本发明主要是采用经病理证实的肺癌组织和正常组织通过全基因甲基化测序和全基因表达的方法，获得和癌变相关的5个甲基化基因，涵盖了更多的致癌变的因素，提高了检测率。由此通过这些基因的特异性位点设计PCR扩增的引物，构建成一组由5个甲基化基因组成的标志物，提高对早期肺癌的检出率。

本发明自主建立了6道PCR反应系统，需要确保5个癌变相关基因和1个内参基因引物顺序设计的准确性及特异性，使它们之间在没有发生互相干扰作用的情况下同时在一个试管内扩增，提高对早期肺癌的特异性。

在大量已知肺肿瘤样品的验证下，筛选获得的一组由5个甲基化基因组成的标志物可以明显区分肿瘤和正常组织，为在血浆cfDNA，肺泡灌洗液DNA中应用奠定了基础。

琼脂糖凝胶电泳是常用于分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。常用上样缓冲液进行染色处理，在紫外光的作用下可清晰观察到DNA条带，并用凝胶成像仪输出照片，后续进行相关数据处理。琼脂糖凝胶电泳的优点为：1、操作简便且快速。2、设备简单，所需样品量少，分辨能力高。3、琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大(约占98％～99％)，近似自由电泳，样品扩散较自由，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。4、琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光等检测及定量测定。5、琼脂糖无毒，凝固过程中不会发生自由基聚合，无需催化剂。

应用数学组合模式

(combination)判断测试样品的甲基化状态，即待检的5个基因中出现2个或2个以上基因甲基化，判定呈现为甲基化阳性样品，可初步判断所测样品是来自肺癌高危人群或肺癌患者。单个基因阳性为随访对象。本发明的判读结果较通常“任一基因阳性”法严格一倍，减少了假阳性。即需要本发明有更高的反应灵敏度和特异性，才能得到通常的判断标准。

因此，本发明将甲基化特异性PCR与琼脂糖凝胶电泳技术结合，以此确保实验的真实性、准确性，达到对肺癌早期患者的筛查及检测要求的检出率和特异性。

发明内容

癌变是多因素、多基因和多步骤的过程；目前市场上使用1～2个基因标志物来对肺癌进行诊断，这种方法是无法覆盖多种病因的(如工作环境因素、生活习惯和遗传因素等)。为了克服目前已有的对肺癌诊断检测方法的局限性，改善目前市场上简单地对1～2个基因拷贝的低效率检测方法，本发明的首要目的是通过对临床各期中国人肺癌组织、肺癌旁正常组织的DNA进行全基因甲基化测序，对RNA进行全基因表达测序。从上万个基因中筛选至十几个基因，并用大量临床样本进行逐级逐个验证，原创自行构建了一组由5个基因组成的肺癌特异性标志物：HIST1H3A、SHOX2、PITX2、HOXA9和RASSF1。可覆盖肺癌癌变的多种通道，因此可以提高肿瘤检测率。

上述5个基因经亚硫酸盐修饰后得到了各自对应的甲基化基因。

具体地，上述筛选出的5个基因是与肺癌癌变程度成线性关系的。

第二目的，本发明提出一种检测所述肺癌特异性标志物甲基化的试剂盒，所述试剂盒通过PCR技术特异性检测HISTIH3A、SHOX2、PITX2、HOXA9和RASSF1基因是否发生甲基化。

因此，所述试剂盒包括用于检测所述肺癌特异性标志物甲基化的PCR引物对。

为此，本发明的第三目的是针对上述5个基因的甲基化片段设计了各自对应的引物对，设计过程中需让5个基因之间在相同扩增技术条件下能够互相不干扰地扩增，因此需要从众多候选引物对中筛选获得5个基因甲基化引物对。基因甲基化引物对的确定必须对肺癌有一定特异性，产生的甲基化信号强度和阳性肺癌细胞株DNA拷贝量成线性关系；PCR扩增产物必须是单一条带，并且在电泳凝胶上能和其他基因条带区分。

另外，还设计了内参基因ACTB的甲基化引物对，用于指示PCR反应中样品DNA的用量和DNA转化质量，及PCR反应系统是否正常工作。

第四目的，为同时检测多个肺癌特异性标志物的甲基化状态，建立了6重PCR扩增技术，包括试剂、酶、PCR反应温度和循环条件。使6个基因(5个肺癌特异性标志物和1个内参基因)的引物对中每个基因的引物对都能在一个试管内同时和其他基因的引物对联合进行PCR扩增反应，可反映每个基因的甲基化的相对丰度和强度。设计的引物对之间必须没有发生互相干扰和竞争反应，以明显提高甲基化检测效率，同时节约血浆来源宝贵的cfDNA用量。

第五目的，通过普通琼脂糖凝胶电泳技术同时将PCR各基因扩增产物明显区分，检测多个肺癌特异性标志物的甲基化状态。通过PCR扩增产物在凝胶上显示的不同分子量大小来确定相关靶基因的设计是否正确，靶基因之间是否会相互干扰或产生其他杂带，能同时确定多个肺癌特异性标志物的甲基化状态。

第六目的，本发明根据待检DNA样品中所述肺癌各个特异性标志物的甲基化状态，用数学组合模式

(combination)判断所述待检DNA样品是否来自肺癌患者或肺癌高危人群。即有2个或2个以上所述肺癌特异性标志物出现条带，显示为甲基化阳性，判断所述待检DNA样品来自肺癌患者或肺癌高危人群。此方法增强了检测的特异性。

为了使5基因甲基化PCR能联合凝胶电泳检测肺癌特异性标志物的甲基化，本发明的第一方面是筛选出多个肺癌特异性标志物，它们可覆盖肺癌癌变的多种通道，特征在于DNA甲基化序列中含有CpG结构，以胞嘧啶(C)带有甲基的基因作为检测试剂。

所述的肺癌特异性标志物，包括如下5个基因：HIST1H3A(Gene ID.8350)、SHOX2(Gene ID.6474)、PITX2(Gene ID.5308)、HOXA9(Gene ID.3205)和RASSF1(GeneID.11186)；

所述5个基因经亚硫酸盐修饰后得到的甲基化基因的核酸序列，包括：HIST1H3A的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，SHOX2的核酸序列如SEQ ID NO:2所示，PITX2的核酸序列如SEQ ID NO:3所示，HOXA9的核酸序列如SEQ ID NO:4所示，RASSF1的核酸序列如SEQ ID NO:5所示。5个所述甲基化基因作为检测试剂的化合物。

根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：

本发明的5个肺癌特异性标志物是通过中国人临床肺癌组织和正常组织，经过全基因甲基化测序和表达，用大量已知样品验证后的原创设计。5个肺癌特异性标志物包括了与肺癌发生的主要癌变机理相关的基因，覆盖人肺细胞癌变中更多信号传导系统里的基因和蛋白酶，提高了检测肺癌的敏感性和特异性。国内也有肺癌诊断试剂盒投放市场，但都是简单的模仿和复制，这种基于1～2个基因的试剂盒并没有能覆盖肺癌癌变的所有主要机理，因此灵敏度和特异性较低。本发明可为患者提供更可靠的检测方法。

根据本发明的第二方面，提出了一种检测所述肺癌特异性标志物甲基化的试剂盒，包括用于检测所述肺癌特异性标志物甲基化的引物对；

所述引物对包括所述肺癌特异性标志物对应的5个引物对：

HIST1H3A引物对的上、下游核酸序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；

SHOX2引物对的上、下游核酸序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；

PITX2引物对的上、下游核酸序列分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；

HOXA9引物对的上、下游核酸序列分别如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；

RASSF1引物对的上、下游核酸序列分别如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示。

在本发明的一些实施方式中，所述引物对还包括内参基因ACTB对应的1个引物对，以此反映样品DNA加入量和DNA转化质量，及PCR反应系统是否正常工作；所述内参基因ACTB经亚硫酸盐修饰后得到的DNA序列如SEQ ID NO:6所示，ACTB引物对的上、下游核酸序列分别如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示。

所述内参基因用于指示样品DNA的用量和转化质量。

在本发明的一些实施方式中，上述甲基化特异的引物对，都是经过从5个肺癌特异性标志物基因甲基化CpG岛的多个引物对中经过多次筛选而确定的；对肺癌有很高的特异性，由这些引物对产生的甲基化信号是和阳性肺癌细胞株DNA量成线性关系的。

在本发明的一些实施方式中，上述甲基化特异的引物对本身，在PCR扩增后需要成单一条带，即没有基因引物之间形成次级非特异性反应。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括PCR反应试剂，用于与所述肺癌特异性标志物对应的5个引物对和所述内参基因ACTB对应的1个引物对配合进行6重PCR扩增(MMSP)，使6个引物对同时在一个试管25微升反应液内完成各基因间无干扰的扩增。

在本发明的一些实施方式中，所述PCR反应试剂包括DNA聚合酶、dNTPs、Mg²⁺和DNA聚合酶缓冲液。

本发明选用的5个肺癌特异性标志物包括了与肺癌发生的主要癌变机理相关的基因，覆盖人肺细胞癌变中更多信号传导系统里的基因和蛋白酶。提供上述5个肺癌特异性标志物甲基化的引物对，各引物对之间没有基因顺序间的竞争性，能与待测位点之间具有互补性和兼容性。且上述引物对对肺癌有一定特异性，可通过PCR技术来诊断是否患有肺癌；由于多种基因参与了扩增放大，提高了对肺癌诊断的准确性和检测率。

本发明提供的试剂盒操作简便，检出率大大提高，适于大规模推广应用，为肺癌早期筛查提供了重大作用，为进一步延伸至血浆cfDNA和肺泡灌洗液的细胞DNA应用建立了基础。

根据本发明的第三个方面，提出了采用所述试剂盒对肺癌特异性标志物进行联合扩增的方法，即多重甲基化特异性PCR(MMSP)；其中，用于检测所述肺癌特异性标志物甲基化的5个引物对是在同一试管的25微升反应液内同时完成扩增反应。具体包括以下步骤：

S1：对待检DNA样品中的DNA进行亚硫酸盐修饰，得甲基化转化DNA；

S2：以所述甲基化转化DNA为模板，通过所述试剂盒中的用于检测所述肺癌特异性标志物甲基化的所述引物对和PCR反应试剂进行PCR扩增反应，得扩增产物。

在本发明的一些实施方式中，步骤S2进行所述PCR扩增反应时还需内参基因ACTB对应的引物对。

5个甲基化的肺癌特异性标志物之间得到独立扩增放大。因此，需要对所述肺癌特异性标志物的各基因的引物进行合理组合筛选，使各基因的引物间在PCR反应中能有互相兼容性，减少顺序上的竞争性，获得有效和真实扩增是实现多重PCR的关键。

所述5个甲基化的肺癌特异性标志物在PCR扩增的条件下，各靶基因都是在相同样品和工作条件下扩增，可反映每个靶基因的甲基化的丰度和强度。

将5个甲基化的肺癌特异性标志物进行排列组合，在同一反应管中各个甲基化的肺癌特异性标志物都能得到放大，不受彼此影响，可获得肺癌特异性标志物中各个基因的甲基化状态。因此，多基因检测可以明显提高检测效率。

可以实现用一次PCR反应同时显示5个肺癌特异性标志物的甲基化状态，即可进行MMSP，明显减少对从血浆来源的cfDNA等宝贵样品的需求量。

根据本发明的第四个方面，建立了一种用于对待检DNA样品中多个肺癌特异性标志物甲基化进行MMSP的试剂盒的工作条件。具体为进行6重PCR，设计5个靶基因和1个内参基因同时在一个试管内进行PCR扩增的工作方法和条件，使各基因的引物之间不互相干扰，可以明显提高甲基化检测率。

所述待检DNA样品可为细胞、肺泡灌洗液、胸水、痰液、组织切片、活检组织、石蜡包埋的组织、血浆、血清、全血等来源DNA。所述待检DNA样品是经亚硫酸盐化学修饰后的DNA。

优选地，肺癌特异性标志物中5基因甲基化试剂盒的工作包括以下步骤：

(1)将肺癌DNA样品和非肿瘤对照DNA样品进行亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐处理，以便将DNA样品中的胞嘧啶转换为尿嘧啶，而5’甲基胞嘧啶不变，获得经过甲基化转化的DNA片段，进而获得经修饰后的待检DNA样品。

(2)在一个反应管内对待测DNA样品用HIST1H3A、SHOX2、PITX2、HOXA9、RASSF1基因和内参基因ACTB的引物对进行PCR扩增反应。每个基因的引物对都能和其他基因的引物对单独或联合工作。

以ACTB DNA用作内参基因作为系统和PCR扩增反应的质量控制，用A549和H1299肺癌细胞系DNA的混合物作为阳性对照，用水作为空白对照。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒中包括引物对和PCR反应试剂，二者协同进行PCR扩增反应，得扩增产物。

优选地，所述PCR扩增反应体系(25μL)包括：各基因引物在反应中的最终浓度是2.5μM，包括TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg²⁺和10×DNA聚合酶缓冲液(buffer)。

更优选地，所述试剂盒还包括：针对内参基因ACTB的引物对的特异性检测试剂。上述的内参基因用于指示样品中DNA提取和修饰的质量。

PCR扩增程序如下：第一阶段：95℃，3min，1个循环；第二阶段：94℃，1min；60℃，30s；72℃，45s；4个循环；第三阶段：94℃，1min；56℃，1min；72℃，45s；28个循环；第四阶段：72℃，4min，1个循环。

通过各种反应参数比对后，确定的工作条件使实验结果重复性好，稳定性和准确性有很大的提高和保证。

根据本发明的第五个方面，提出了一种肺癌特异性标志物甲基化状态的检测方法，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过电泳结果判读所述肺癌特异性标志物的甲基化状态。

优选地，所述肺癌特异性标志物5基因甲基化联合凝胶电泳检测试剂盒还包括：2.5％琼脂糖预制胶、高压快速电泳液、DNA上样缓冲液。

本发明是通过琼脂糖凝胶电泳方法检查和阅读各基因在PCR反应后的甲基化状态。在电场作用下，不同大小的DNA片段迁移速率不同，从而在琼脂糖凝胶上有不同位置，通过DNA分子量标志物作为基准，可区别不同基因的DNA扩增片段。通过和阳性对照(肺癌细胞系DNA的混合物)比较，可判断各个靶基因的甲基化的相对丰度和强度，为进一步判断待测DNA样品是否来自肺癌患者或肺癌高危人群提供依据。

琼脂糖凝胶电泳是各医院及第三方医学检验所中常用的普通检测方法，其优点为经济、使用且方便。通过琼脂糖凝胶电泳可直观、准确地去判断扩增产物的DNA片段大小，以确定肺癌特异性标志物中每个基因的甲基化状态，避免通常的副反应，反映了检测的真实性。

本方法无需使用探针和荧光定量PCR仪，为没有条件满足拥有荧光定量PCR仪的实验室或医院提供了便利。不需要探针和荧光定量PCR仪，同样对肺癌有很好的早期检出率和特异性。同时该方法为开展荧光定量研究奠定了工作基础。

根据本发明的第六个方面，提出了根据待检DNA样品中所述肺癌特异性标志物的甲基化状态，用数学组合模式

判断所述待检DNA样品是否来自肺癌患者。如果待检的所述肺癌特异性标志物在凝胶电泳中出现任意至少2个或2个以上条带，呈现为甲基化阳性，即可判断所述待检DNA样品来自肺癌患者或肺癌高危人群。适用于普通医学生化实验室和第三方医学检验所推广使用。

优选地，特异性检测内参基因的检测试剂，也同时可用10％全甲基化人类基因组DNA标准品作为标准样品的甲基化阈值和各次实验结果比对。

本发明提供了肺癌特异性标志物中5基因甲基化PCR检测试剂盒及联合琼脂糖凝胶电泳检查结果，以任何两个或两个以上基因阳性判读所测DNA样品是否来自肺癌患者或肺癌高危人群。单一基因甲基化阳性只是作为随访观察。这比通常的判读方法(即任何一个基因甲基化阳性就划定为肿瘤或高危人群)更加严格，是通常判读方法(任一基因阳性)的一倍，更能减少假阳性。且由于采用多基因甲基化测试，已提高了肿瘤检测率和特异性，可以明显区分肿瘤和正常组织中不同基因甲基化状态，可应用于对肺癌早期病人的筛查及辅助诊断。

综上，本方法将多重PCR技术与琼脂糖凝胶电泳技术相结合，检测肺癌特异性标志物的甲基化状态。通过对病理证实的肺癌组织和正常肺组织进行DNA提取、DNA修饰、PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，建立了对肺癌早期筛选的检测方法。本方法能有效筛选扩增的引物，所采用的琼脂糖凝胶电泳技术为后续多重基因实时荧光PCR技术和液体活检样品使用创造了条件。本方法操作简单，不需要使用荧光PCR仪，适用于无法满足拥有荧光PCR仪的实验室或医院。本方法提供了可靠有效的检测工具，同样能准确地实现对肺癌的早期筛选检测所要求的灵敏度和特异性。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例1中非小细胞肺癌组织DNA、同患者癌旁匹配的非癌性正常组织DNA和正常肺组织DNA中5个肺癌特异性标志物的甲基化状态对比图；其中，Ladder代表DNA Marker；A549代表亚硫酸盐修饰的肺癌A549和H1299细胞系DNA的混合DNA(27ng A549和H1299的DNA，比例1：1)；T代表非小细胞肺癌组织DNA；MC代表同患者癌旁匹配的非癌性正常组织DNA；N代表正常肺组织DNA，后边的数字为正常人的编号；NSCLC后边的数字为患者编号。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明的描述中，除非另有明确的限定，甲基化、PCR等词语应做广义理解，所属技术领域技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本发明中的具体含义。

本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”等的描述意指结合该实施例描述的具体特征、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例。而且，描述的具体特征、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例中以合适的方式结合。

实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。

本发明首次揭示了一种通过协同检测5种肺癌特异性标志物的甲基化，来提高肺癌检出率的方法，所述的肺癌特异性标志物是HIST1H3A、SHOX2、PITX2、HOXA9和RASSF1基因；优化了相关的PCR扩增反应体系及程序、琼脂糖凝胶电泳检测方法，很大程度提高了肺癌检出的灵敏度或特异性。

上述5个基因在肺癌发生过程中起着重要作用。其中，HIST1H3A，也被认为是预测子宫肌体子宫内膜癌(UCEC)临床结果的可靠生物标志物。其高甲基化已在肺鳞状细胞癌中报道。在Ⅰ期非小细胞肺癌(NSCLC)中，HIST1H4F高甲基化，已被证明具有预后价值。据报道，HIST1H3A的高甲基化与Ⅰ期NSCLC无复发生存期缩短显著相关，也与高级别非肌肉侵袭性膀胱癌相关。在另一项研究中，它被发现是一种泛癌症生物标志物。HIST1H3A过表达与喉鳞癌无病生存差有关。

SHOX2，位于人类3号染色体的长臂(q25 26.1)。SHOX2基因长约10kbp，有7个编码转录因子的外显子，SHOX2a、SHOX2b和SHOX2c。SHOX2基因序列有3个启动子和3个CpG岛。两个CpG岛位于启动子上，第三个CpG岛位于基因体上。SHOX2表达的调控与器官发育密切相关。研究发现，96％的肺癌患者SHOX2高度甲基化，且与基因拷贝数显著相关。也可能是癌症与良性结节的鉴别指标。甲基化实验证明，SHOX2甲基化可以帮助区分良性肺部疾病和恶性肿瘤，但在Ⅰ期肺癌中较少(54％)。

PITX2，是配对样同源域转录因子2，位于染色体4q25上，是成对样同源域转录因子家族的成员。编码三种亚型(PITX2A，PITX2B，PITX2C)。PITX2的DNA甲基化已被发现是NSCLC患者疾病进展的独立预后生物标志物，可能参与人类肿瘤的发生。研究发现，PITX2基因较高的甲基化程度与较低的疾病无进展生存风险相关，使这一标记物有助于优化个体化治疗。PITX2甲基化是肺癌、乳腺癌和前列腺癌疾病进展的一个预后标志物。PITX2已被确定为可能驱动肺腺癌病理分期变化的基因之一，也是肺癌进展的标志之一。

HOXA9，作为一种具有多个蛋白-蛋白相互作用域的细胞粘附分子，通过直接与促进或抑制生长的分子结合并调节其功能，参与细胞粘附和细胞-细胞识别。在多种癌症中，HOXA9启动子区域的高甲基化及其随后的转录沉默表明其作为广泛的抑癌基因的作用。HOXA9与干细胞癌、肺腺癌、胃腺癌和脑癌有关。

RASSF1，是RASSF1蛋白家族的成员。它在肺癌细胞系中的表达丢失或下调。在至少37种肿瘤类型中，启动子高甲基化可下调RASSF1的表达。在32％的ⅠA期肺腺癌中发现RASSF1A被甲基化，并与胸膜浸润和分化不良相关。它通过控制微管聚合来影响肿瘤抑制，并可能在基因组稳定性方面发挥作用。RASSF1A与细胞分化、增殖和存活有关，但据报道称其作为NSCLC的早期检测或预后效率低下。

本发明对上述5个基因设计了甲基化特异性的引物对，还应用内参基因来指示样品DNA提取和修饰的质量。基因甲基化位点的选择直接与临床检测灵敏度相关，一般都在基因的启动子区域，但很多基因与肿瘤相关的甲基化位点也有可能位于第一内含子与第一外显子区域。

如本发明所述，“待测样本”“待检样品”或“待测核酸样品”是指待检测的核酸样本，含有一种核酸或多种核酸，需要了解其中是否存在目标核酸，即靶基因甲基化片段。本发明中，待测DNA样品可以是：分离的血细胞、由血液中分离的细胞中的一种或多种、肺泡灌洗液、胸水、痰液、细胞系、组织切片、活检组织、石蜡包埋的组织、血浆、血清、全血等。

典型地，待检DNA样品中的DNA是经过亚硫酸盐修饰和多种基因甲基化引物对联合使用，以确定HIST1H3A，SHOX2，PITX2，HOXA9和RASSF1基因序列中CpG二核苷酸序列的甲基化状态。基因组CpG二核苷酸可以甲基化或未甲基化。因此，术语甲基化或甲基化状态也应被视为反映CpG位置甲基化程度的值。其中该临界值可以是代表给定人群的平均值或中值甲基化水平的值，或者它优选是最佳临界值。

本发明的方法中，亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐修饰均可应用于该种甲基化修饰。研究过程中，比较了ZYMO RESEARCH公司和诺因公司的亚硫酸盐修饰试剂盒，在转化率与回收率上，二者没有明显差别。

优选地，本发明建立了六重PCR，让5个靶基因和1个内参基因可同时在一个试管内扩增，之间不会互相干扰，因此需要通过对各基因引物进行大量筛选和匹配，使引物间有互补作用，通过多基因联合检测，可以明显提高肺癌特异性标志物甲基化的检测率。

本发明对上述肺癌特异性标志物甲基化状态的检测，是通过将PCR产物在琼脂糖凝胶电泳中分离，以PCR产物的大小和亮度与阳性对照稀释样品进行比较，来确定基因扩增的特异性和甲基化程度。

如本发明所述，“琼脂糖凝胶电泳”是以琼脂或琼脂糖凝胶为支撑介质的电泳法。对于分子量大的样品，例如大分子核酸、病毒等，一般可以使用孔径大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖凝胶电泳的分析原理与其他载体电泳最大的区别在于，它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时受到阻力，大分子物质涌出时受到的阻力较大，因此凝胶电泳中带电粒子的分离不仅取决于净电荷的性质和量，还取决于分子的大小，这将大大提高分辨率。

如本发明所述，“上样缓冲液”是指一种荧光染料(RedGel，取代以前致癌的EB)，该染料与核酸双链的碱基对结合，在紫外光的作用下发出荧光，通过凝胶成像仪输出照片，后续进行相关的数据分析。上样缓冲液可以显示两条带，蓝色的条带是溴酚蓝，绿色的条带是二甲苯腈蓝。其作用为：1、在琼脂糖凝胶中溴酚蓝约与300bp的双链线状DNA的迁移速度相同，而二甲苯腈蓝则与4kbp的双链线状DNA的迁移速度相等。上述成分在电泳中起到了指示作用，显示电泳的进程，以便适时终止电泳。2、上样缓冲液中的甘油成分可加大样品的密度，使样品密度大于TAE(凝胶电泳缓冲液)，防止样品飘出点样孔。

本发明是建立PCR技术与经典琼脂糖凝胶电泳技术相结合的检测模式，是在已知病理证实肺癌和正常样品情况下，筛选出甲基化的肺癌特异性标志物。它提供了可靠有效的检测工具，能准确地实现对肺癌的早期筛选检测所要求的灵敏度和特异性。目的是用在未知组织DNA样品和采用液体活检血浆cfDNA样品检测，同时为使用荧光探针PCR方法建立了基础。

本发明直观的运用凝胶分析系统来判断待检DNA检样品基因是否发生甲基化。在琼脂糖凝胶电泳图中，若出现2条及以上条带时，且ACTB内参基因条带出现时，则该样本为阳性，来自肺癌高风险人群或肺癌早期患者；若出现一条带或没有条带时，且ACTB内参基因条带出现时，则该样品为阴性。待检DNA样品中ACTB内参基因没有出现条带，则表示反应有问题，数据没有真实性。

本发明的检测试剂被置于试剂盒中，从而便于人们应用。除了引物和试剂，试剂盒中还包含：PCR反应试剂，对照品，阴性对照和使用说明书。

本发明的方法和试剂盒很适合于肺癌的早期筛选，其特点是检测时间短及操作简单、符合检测上对灵敏度和特异性的一般要求。

实施例1

本实施例利用用于检测肺癌特异性标志物甲基化的试剂盒对肺癌患者的组织标本中5个肺癌特异性标志物的甲基化状态进行了检测，具体过程为：

甲基化DNA都位于基因的特定部位，一般在启动子区，使引物设计变得更容易和方便。基于此，为了优化适用于同时检测HISTIH3A、SHOX2、PITX2、HOXA9和RASSF1甲基化状态的试剂盒，经过反复研究对比后，选定了各基因的扩增区域序列，并设计了相应的引物对及内参基因引物对，核酸序列见表1。

表1

5个肺癌特异性标志物和内参基因经亚硫酸氢盐修饰后的核酸序列如下：

HIST1H3A(SEQ ID NO:1：GGTAAGGCGTTACGTAAATAGTTGGTTATTAAGGTAGTTCGTA AAAGCGTTTCGGTTATCGGCGGCGTGAAAAAGTTTTATCGTTATCGGTCGGGTATCGTGGTTTTG CGCGAGATTCGTCGTTATTAGAAGTTTATTGAATTGTTTATTCGTAAATTATTTTTTTAGCGTTTGG TGCGCGAGATTGCGTAGGATTTTAAAATAGATTTGCGTTTTTAGAGTTTCGTTGTG)；

SHOX2(SEQ ID NO:2：CGAAAGGTATTAGCGAGAGTAATAGATTTCGGTGTTGTGTCGTA TAGGGAGTCGTATTCGTAGACGTTTTTCGTTGTTTTTGGGTTCGGGTTAAATTTTGTATAAGGTTTTTTGGATAGTTAGGTAATTTTCGTTTCGTTTGTTCGATCGGGGTCGTACGAGTATAGGCGTTTACGTTATGTTGGTTGTTTAAAGGGTTCGTCGTTTAAGTCGGGTTAGAAGGTAGGAGGCGGAAAATTAGTTTTCGGTGGCGGGCGAAAGTAATCGTTTTTTTTGTTTTTTTTTCGTTTTTTTTCGTGGAAACGTAGATTCGATTTTAAACGTTTAATTTATAGAGATTAATAGGTTTAAGCGGAATATTCGCGATTTTCG)；

PITX2(SEQ ID:3：GATTGTTTATTTTCGTTATTAGTTGAAGGTAAGGTCGTTTTGTTACGAG CGTTTTTTAATTTTTATAAAATGAAAAGAAAAAAAGGGAGGATTATTAGTTTATTATTTAGAGGA ATGGGGAGGTTGTAAAAATCGTCGATGGGTAGAGGTGAAGATGTTTTTTTTTCGGATTGTATTTT TCGGTGTTTTGTAATTAGAGTTTAGTTGTGGGATTTGTTGAAGAAATTTGAT)；

HOXA9(SEQ ID NO:4：AAAATTATGATTGTAAAATATCGGATTATTAATAGCGTGCGGAGT GATTTACGCGTTATTGTTTTGTTGGACGGGTACGTGACGCGTACGGTTAATGGGGGCGCGGGCGTCGGTAATTTATTAGGTGATTGTATTTTTTTTTCGGTGTTATTAAGTTGTTATATGAAATTTGTAGTTTTATAATTTTCGTGGGTCGGGTCGGGCGGGTTAGGCGTTGGGTACGGTGATGGTTATTATTGGGGTTTTGGGTAATTATTACGTGGATTCGTTTTTGTTGGGCGTCGACGTCGCGGATGAGTTGAGCGTTG)；

RASSF1(SEQ ID NO:5：ATGTCGGGGGAGTTTGAGTTTATTGAGTTGCGGGAGTTGGTAT TCGTTGGGCGCGTTGGGAAGGGTCGTATTCGGTTGGAGCGTGTTAACGCGTTGCGTATCGCGCGGGGTATCGCGTGTAATTTTATACGGTAGTTGGTTTTTGGTCGTGGTTATCGTTTTTAGTTCGCGGGGTTCGTTACGTATACGTGGTGCGATTTTTGTGGCGATTTTATTTGGGGCGTCGTGCGTAAAGGTTTG)；

ACTB(SEQ ID NO:6：GAAGGTTGGAAGAGTGTTTTAGGGTAGCGGAATCGTTTATTGTTA ATGGTGATGATTTGGTCGTTAGGTAGTTCGTAGTTTTTTTTTAGGGAGGAGTTGGAAGTAGTCGTGGTTATTTTTTGTTCGAAGTTTAGGGCGACGTAGTATAGTTTTTTTTTAATGTTACGTACGATTTTTCGTTCGGTCGTGGTGGTGAAGTTGTAGTCGCGTTCGGTGAGGATTTTTATGAGGTAGTTAGTTAGGTTTCGGTTAGTTAGGTTTAGACGTAGGATGGTATGGGGGAGGGTATATTTTTCGTAGATGGGTATAGTGTGGGTGATTTCGTTATCGGAGTTTATTACGATGTTAGTGGTACGGTTAGAGGCGTATAGGGATAGTATAGTTT)。

检测方法如下：

(1)提取DNA：收集非小细胞肺癌患者的肿瘤组织标本、同患者癌旁匹配的非癌性正常组织标本和正常人的肺部组织标本，分离细胞，用天根生化科技(北京)有限公司基因组DNA的提取试剂盒(DP710)来提取两种DNA。

(2)DNA甲基化转化：根据ZYMO RESEARCH生物公司试剂盒EZ DNA Methylation-Direct^TM KIT(D5001)的说明书对上述三种DNA进行DNA甲基化转化修饰(即亚硫酸盐修饰)，得三种甲基化转化DNA。

(3)扩增：以上述三种甲基化转化DNA为模板，表1中的引物对为引物，进行多重甲基化特异性PCR反应。其中，以亚硫酸盐修饰的肺癌A549和H1299细胞系DNA的混合DNA为阳性对照，以获得5个肺癌特异性标志物的甲基化的阳性信号；以水作为空白对照液，ACTB内参基因用作控制DNA的质量和系统工作状况；多重甲基化特异性PCR的反应体系如表2所示；

表2

名称	浓度	一人份加入量(μL)
			HIST1H3A上下游引物	均为2.5μM	各0.5
SHOX2上下游引物	均为5μM	各0.5
			PITX2上下游引物	均为2.5μM	各0.5
HOXA9上下游引物	均为2.5μM	各0.5
			RASSF1上下游引物	均为2.5μM	各0.5
ACTB上下游引物	均为2.5μM	各0.5
			Tris-HCl	20mM	0.5
KCl	80mM	2
			甘油	0.5％	0.6
MgCl₂	8mM	4
			dNTPs	600μM	1.5
DNA酶	2.5U	0.5
			甲基化转化DNA	2.5mM	5
纯化水	-	5

反应体系总体积为25μL；

多重甲基化特异性PCR的反应程序如下：

第一阶段：95℃，3min，1个循环；

第二阶段：94℃，1min；60℃，30s；72℃，45s；4个循环；

第三阶段：94℃，1min；56℃，1min；72℃，45s；28个循环；

第四阶段：72℃，4min，1个循环。

(4)检测：准确称取2.5g琼脂糖，倒入锥形瓶中；用量筒量取100mL的0.5×TAE溶液(避免加热时蒸发使得凝胶浓度过高)，倒入锥形瓶中，摇匀；将锥形瓶放入微波炉中加热，至琼脂糖完全溶解，再加入10μL的GelRed核酸凝胶染料，摇匀，倒入制胶架中，冷却成型即制成琼脂糖凝胶；

向25μL扩增产物中加入5μL的6×DNA凝胶上样缓冲液，制成电泳样品；取3μL的DNA分子量标志物(DNA Marker)加入第一个孔道中，将30μL的电泳样品加入其他孔道中，在90V电压下电泳45min；电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪中，拍照并分析结果。在分析结果时，首先要分析实验是否可信：如果ACTB基因的条带出现，且所有待检DNA样品中的ACTB条带的亮度大致相同，则实验可信；如果不同待检DNA样品中ACTB条带的亮度有明显差别，应重新测DNA浓度，然后重新进行多重甲基化特异性PCR和琼脂糖凝胶电泳操作后再分析结果。

结果如图1所示，Ladder代表DNA Marker；A549代表亚硫酸盐修饰的肺癌A549和H1299细胞系DNA的混合DNA(27ng A549和H1299的DNA，比例为1：1)；T代表非小细胞肺癌组织DNA；MC代表同患者癌旁匹配的非癌性正常组织DNA；N代表正常肺组织DNA，后边的数字为正常人的编号。可以看出，各样品中ACTB条带的亮度大致相同，说明实验可信；阳性对照A549中的5个肺癌特异性标志物HISTIH3A、SHOX2、PITX2、HOXA9和RASSF1的条带均有显示，空白对照液水中没有出现上述5个甲基化标志物的条带，说明引物对的设计、多重甲基化特异性PCR反应和琼脂糖凝胶电泳工作均正常；用DNA分子量标志物可大致分析各基因的扩增产物的大小和已知设计的引物的片段大小相同，可知所设计的引物是正确的，且没有发现其他杂带，说明各引物对之间没有干扰反应。

5个肺癌特异性标志物在非小细胞肺癌患者(编号分别为No.358和No.569)的癌组织和癌旁组织中的表达完全不同，5个肺癌特异性标志物在癌组织中出现清晰条带，而在癌旁组织和正常组织中均未出现条带。非小细胞肺癌患者(编号No.208和No.572)显示PITX2、SHOX2和HOXA9三个阳性条带；非小细胞肺癌患者(编号No.211)显示PITX2、HIST1H3A和RASSF1三个阳性条带。由此说明上述肺癌样本中，不同肺癌患者其癌变机制是不同的，5个肺癌特异性标志物的甲基化状态也是不同的。电泳条带可用作基因甲基化的依据，去判断提供样本的患者是否患有肿瘤。

将加入的半定量参考品(即阳性对照A549)条带的明亮程度与待测患者样本进行对比分析。通过已知的半定量参考品DNA的浓度，通过反推的方法，可大致判断待测患者样本的DNA浓度。

结果判定是采用数学组合模式

判断电泳结果，即待检的5个基因中出现任意2个或2个以上阳性条带，且ACTB基因出现条带，则该样本为发生甲基化的样本，可初步判断所测样本来自肺癌患者或肺癌高危人群。若5个基因中，只任一个基因甲基化阳性，并不能判断为阳性病例，而属于随访病例。若5个基因都没有出现条带，且ACTB基因出现条带，则该样本为未甲基化样本，为阴性；若ACTB基因没有出现条带，则产生的数据不可靠，需要重复试验。

实施例2

本实施例对用于检测肺癌特异性标志物甲基化的试剂盒的特异性和灵敏度进行了检测，具体过程为：

提供用于检测肺癌特异性标志物甲基化的试剂盒，包括：PCR体系中的各组分和对应的浓度、用量，及同实施例1相同的PCR扩增反应体系。

检测样品为非小细胞肺癌组织(T)、同患者癌旁匹配的非癌性正常组织(MC)和正常组织(N)样本的DNA。用亚硫酸盐修饰的肺癌A549和H1299细胞系DNA的混合DNA作阳性对照，灭菌水作空白对照。

可见，本实施例是一种采用上述试剂盒将检测HIST1H3A、SHOX2、PITX2、HOXA9和RASSF1基因甲基化的PCR扩增方法和琼脂糖凝胶电泳检测方法联合对肺癌早期病人进行筛查的方法。它包括相关检测方法，试剂和试剂盒(包括有内参基因ACTB)。ACTB的引物设计用于扩增亚硫酸氢盐转化的基因组DNA，而不区分甲基化和未甲基化CpG。以此确定待测样品用量、亚硫酸氢盐转化质量和PCR扩增系统正常性。

特异性和灵敏度实验：

收集70例肺癌患者组织样品和24例正常人肺组织样品，阳性对照和阴性对照作为检测样本。DNA提取、亚硫酸盐修饰、PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测与上下游引物序列同实施例1。

通过电泳图结果显示的条带来分析样本是否为阳性。结果判断采用数学组合模式

即待检测的5个基因中出现任意2个或2个以上阳性条带，且ACTB基因出现条带，则该样本为发生甲基化的样本，可初步判断所测样品来自肺癌患者或肺癌高危人群。

对检测结果进行了统计，其中甲基化病例是通过琼脂糖凝胶电泳检测结果分析得到的有2个或2个以上肺癌特异性标志物条带的病例；未甲基化人数是有2个以下肺癌特异性标志物条带的人数。24例正常人肺组织样品DNA都没有在琼脂糖凝胶电泳中显示出阳性条带，而在70例肺癌患者组织样品DNA中，呈现不同阳性条带，统计结果如表3所示。

表3

结果显示，24例正常人肺组织样品和70例肺癌患者的肿瘤样品和阳性对照均能出现ACTB基因的条带，除阳性对照中相应基因甲基化DNA检测阳性外，24例正常人肺组织样品中相应基因甲基化DNA检测均为阴性，说明试剂盒特异性良好，本发明的检测体系会出现很低的假阳性。

表3显示了70例肺癌患者中包含的所有单个标志物的敏感性和特异性。HOXA9的敏感度最高为87％(61/70)，而RASSF1最低，敏感度为47％(33/70)。HOXA9特异性为93％(65/70)，SHOX2和PITX2的特异性都可以达到90％；RASSF1的特异性最低，为84％(59/70)。在24例正常人肺组织样品DNA中，这5个甲基化标记物的表达均为阴性。

采用数学组合模式

即待检的5个基因中出现任意2个或2个以上阳性条带，且ACTB基因出现条带，则该样本为发生甲基化的样本，可初步判断所测组织样品来自肺癌患者或肺癌高危人群。对上述70例肺癌患者测试中，其检测灵敏度为80％，特异性为90％。表明本发明的检测方法和试剂盒具有较高的灵敏度和特异性。

本发明公开了一组效果较好的、设计达到最优化的5基因甲基化检测方法，通过联合应用HIST1H3A、SHOX2、PITX2、HOXA9和RASSF1基因及其片段的甲基化的序列，可显示对肺癌肿瘤很好的早期检出率和特异性，也证明使用该检测方法的准确性和可靠性。

综上所述，本发明公开了一种肺癌相关的5基因作为肺癌特异性标志物，多重PCR扩增联合琼脂糖凝胶电泳检测方法，可以明显地区分肿瘤和正常组织两者不同基因甲基化状态。本发明可进一步延伸到组织DNA样品至血浆cfDNA和肺泡灌洗液细胞DNA上进行应用，及为荧光定量PCR方法建立了工作基础。

上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims

1.肺癌特异性标志物，其特征在于，包括如下5个基因：HIST1H3A、SHOX2、PITX2、HOXA9和RASSF1；所述5个基因经亚硫酸盐修饰后得到的甲基化基因的核酸序列分别如SEQ IDNO:1～SEQ ID NO:5所示。

2.检测权利要求1所述肺癌特异性标志物甲基化的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测所述肺癌特异性标志物甲基化的引物对；

所述引物对包括所述肺癌特异性标志物对应的5个引物对：

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对还包括内参基因ACTB对应的1个引物对；所述内参基因ACTB经亚硫酸盐修饰后得到的DNA序列如SEQ ID NO:6所示，ACTB引物对的上、下游核酸序列分别如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应试剂，用于与所述肺癌特异性标志物对应的5个引物对和所述内参基因ACTB对应的1个引物对配合，在PCR扩增条件下进行6重甲基化特异性PCR扩增，使6个引物对同时在一个试管反应体系内完成各基因间无干扰的扩增。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂包括DNA聚合酶、dNTPs、Mg²⁺和DNA聚合酶缓冲液。

6.采用权利要求2～5任一项所述的试剂盒扩增肺癌特异性标志物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S2进行所述PCR扩增反应时还需内参基因ACTB对应的引物对；

优选地，步骤S2所述PCR扩增反应为多重甲基化特异性PCR反应。

8.一种肺癌特异性标志物甲基化状态的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：对根据权利要求6～7任一项所述方法扩增得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，用内参基因ACTB指示样品DNA用量、DNA转化质量和PCR扩增工作状况，将所述扩增产物的电泳条带与空白对照水、阳性对照肺癌细胞系DNA电泳条带进行比较。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪中，通过成像系统观察不同大小的DNA条带，以分析所述扩增产物中所述肺癌特异性标志物和所述阳性对照比较后是否有发生甲基化，进而判断待检DNA样品中所述肺癌特异性标志物的甲基化状态。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述电泳的结果的判读方法包括：根据所述待检DNA样品中所述肺癌特异性标志物的甲基化状态，用数学组合模式

进行分析，若所述待检DNA样品中有2个或2个以上所述肺癌特异性标志物出现条带，显示为甲基化阳性，即可判断所述待检DNA样品来自肺癌患者或肺癌高危人群。/>