CN116064814A - 用于检测鼻咽癌特异性标志物甲基化的试剂盒及应用 - Google Patents

用于检测鼻咽癌特异性标志物甲基化的试剂盒及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116064814A
CN116064814A CN202211487949.XA CN202211487949A CN116064814A CN 116064814 A CN116064814 A CN 116064814A CN 202211487949 A CN202211487949 A CN 202211487949A CN 116064814 A CN116064814 A CN 116064814A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nasopharyngeal carcinoma
dna
methylation
seq
genes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211487949.XA
Other languages
English (en)
Inventor
胡立夫
南熠郎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Peoples Hospital
Original Assignee
Shenzhen Peoples Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Peoples Hospital filed Critical Shenzhen Peoples Hospital
Priority to CN202211487949.XA priority Critical patent/CN116064814A/zh
Publication of CN116064814A publication Critical patent/CN116064814A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于基因检测技术领域，公开了用于检测鼻咽癌特异性标志物甲基化的试剂盒及应用。具体公开了用于检测鼻咽癌特异性标志物甲基化的试剂盒，其中，上述标志物包括EBNA1、LMP1、ITGA9、RASSF1A和P16基因。从鼻咽癌病人鼻咽拭子或血浆中提取的游离DNA中，上述标志物特定CpG位点在癌变中发生高度甲基化。本发明采用上述试剂盒对鼻咽癌6基因甲基化进行PCR扩增，联合琼脂糖凝胶电泳检查结果，以任何2个或2个以上标志物阳性为鼻咽癌诊断标准，检测率是80％，特异性是90％。本发明适用于医院对鼻咽癌早期病人的筛查及对易感人群做风险评估，显示了很好的检出效果。

Description

用于检测鼻咽癌特异性标志物甲基化的试剂盒及应用
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及用于检测鼻咽癌特异性标志物甲基化的试剂盒及应用。
背景技术
“鼻咽癌”是中国特有的、常见的恶性肿瘤之一，是一种发生于鼻咽癌后壁粘膜上皮的恶性肿瘤。它的临床表现、流行病学和组织病理学与头颈部的其他鳞状细胞癌不同。鼻咽癌具有明显的民族和地理分布，在中国两广地区，鼻咽癌是头颈部最常见的肿瘤，其次在海南、福建等省、东南亚、北非和格陵兰岛高度流行。鼻咽癌的发生主要是和生活方式、习惯和环境有关，其次是人类疱疹病毒(EB病毒)感染，遗传因素小于10％。某些饮食习惯，如食用含有挥发性亚硝胺的咸鱼和腌制食品，在鼻咽癌的病因学中发挥了一定作用。无论发病率和地理分布如何，其发展都归因于多种因素的相互作用。
95％以上鼻咽癌患者的肿瘤细胞都是EB病毒感染阳性。病毒和细胞基因的异常可能参与了鼻咽癌上皮细胞向恶性肿瘤转化与发展。在鼻咽癌细胞中EB病毒特异性潜伏期程序的维持中也发挥着重要作用。有研究表明，染色体异常和异常启动子高甲基化在不同的地理区域表现出相似的模式，支持了鼻咽癌的共同致癌途径，而不受区域的限制。
癌前鼻咽上皮中也会发生基因改变，包括周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(P16)和Ras相关家族1A(RASSF1A)位点的脱氧核糖核酸DNA甲基化。肿瘤抑制基因(TSGs)异常甲基化是鼻咽癌中常见的早期事件。因此，筛查DNA高甲基化标记基因，如抑癌基因，在鼻咽癌的早期检测中具有很大的潜力。此外，EB病毒宿主的表观遗传相互作用以及鼻咽癌中基因调控表观遗传机制的可逆性，使得这些基因在鼻咽癌的治疗和预防方面具有重要意义。
鼻咽癌早筛对于提高鼻咽癌患者的生存期具有重大意义，因为约70％的鼻咽癌患者是在晚期确诊的，其治疗结果较差，这主要是由于患者只有非特异性的局部症状。鼻咽癌在Ⅰ期或Ⅱ期的诊断与高生存率相关(平均95％)，而在Ⅲ期或Ⅳ期(晚期)的诊断生存率仅略高于50％。因此，要提高鼻咽癌患者的生存期，除了仍需进一步开发新治疗方法外，鼻咽癌的早筛早诊具有重大意义。发展可靠、无创、经济有效的鼻咽癌早期检测方法是重中之重。而肿瘤标志物的应用为实现鼻咽癌的早期发现提供了相关途径。目前常用鼻咽肿瘤标志物之一是EA-VCA IgA，它显示机体对病毒感染的免疫反应，及EB病毒基因量，阳性者患鼻咽癌的机会比阴性者大得多，说明EB病毒被激活或激活了其他病毒的某些基因，但其有很多局限性，主要是缺乏特异性。
DNA甲基化在肿瘤诊断中受到越来越多的关注。其优点是：第一，在肿瘤形成过程中，启动子高甲基化频繁发生，甚至高于基因突变，其中有许多是与肿瘤形成相关的重要基因；其次，甲基化通常是发生在癌变的早期。第三，DNA甲基化是稳定存在的，可以通过PCR扩增效应检测出来。因此，甲基化检测在肿瘤早期诊断中具有潜在应用价值。
由于肿瘤标志物可以在体液或组织中检测到，能够反映肿瘤的存在、分化程度、预后估计和判断治疗效果等。相对于组织活检，血浆、痰液、粘擦液等标本容易获得，对受检者也没有创伤，能够连续采样，以进行动态随访比较。
粘擦液或血浆游离DNA(cfDNA)是实体肿瘤细胞向血液释放的衰老降解产物，同一基因的异常甲基化DNA只占外周血总DNA的极小部分，约为0.01％～0.1％。这些未甲基化的DNA与甲基化的DNA只是胞嘧啶上甲基化修饰略有不同，因此有必要从高度复杂的“背景”中检测出异常的甲基化DNA。此外，循环血液中的DNA通常是降解的(通常是几十到几百个碱基对)168核苷酸长片段，血浆游离肿瘤DNA(ctDNA)半衰期只有2.5小时，因此需要及时提取和好的提取技术才能获得高回收率。同时需要应用灵敏和特异技术才能得到鼻咽癌病例的基因甲基化状态。
为此，发明人研究了鼻咽癌病例的基因甲基化和表达。通过不同方法逐步验证，发现许多相关的甲基化基因可作为鼻咽癌的标志物，可用于鼻咽癌的早期检测。
目前，已有多种分析DNA甲基化的技术，每种技术都有其优点和局限性。常见的检测DNA甲基化的方法包括：亚硫酸盐测序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP)、高分辨率熔解曲线法(High Resolution Melting，HRM)、基因组直接测序法、甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR，MSP)、甲基化特异性的荧光定量PCR等。
BSP法是用亚硫酸盐处理基因组DNA，未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化，该方法称为BSP-直接测序方法；将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，该方法称为BSP-克隆测序法。但是，BSP法的流程复杂，不易批量操作，价格昂贵，通常可以开展PCR实验的单位才可独立完成。
HRM法是在非CpG岛位点设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变为胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化。但是，该方法对熔解设备温度的均一性要求非常高，带有HRM功能的定量PCR仪使用此方法比较合适，即该方法在使用上比较局限。
基因组直接测序法是用Maxam-Gilbert化学裂解法对基因组DNA进行处理，并通过PCR来放大信号强度，然后进行序列分析。此法是基于5mC在标准的Maxam-Gilbert胞嘧啶化学裂解反应中不被裂解，故5mC可通过在测序胶上缺少对应于胞嘧啶降解反应产物的一个条带而得以鉴定。该方法会受测序凝胶分辨能力的限制。
MSP法是用亚硫酸盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；设计针对甲基化和非甲基化的引物进行PCR，然后通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对甲基化处理DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。
甲基化特异性的荧光定量PCR，与MSP法相似，用于引物进行PCR扩增，用合成的荧光探针定量，通过CT值判读结果。该方法有较高的灵敏度和特异性，易于操作和实现检测常规化，但所需的荧光定量PCR仪比较昂贵，及荧光探针在普通或三、四线城市医院使用有一定的局限性。
虽然相关技术中已经发现了某些基因的DNA甲基化与鼻咽癌的相关性，国内也有诊断试剂盒投放市场，但大多数是简单地模仿和复制。此外，基于1～2个基因的试剂盒并不能覆盖癌变的所有主要机理，灵敏度和特异性不高，检出率较低。
因此，有必要提供一种检测的特异性好、灵敏度高、检测率高的鼻咽癌检测试剂盒。
为了克服目前已有的检测方法的局限性，本发明通过对临床各期中国人鼻咽癌组织DNA进行基因甲基化筛选，从几万个基因筛选至十几个基因，并用临床样本进行逐个扩大验证，它们包含鼻咽癌癌变中EB病毒基因和癌细胞的抑癌基因的甲基化，覆盖了癌变机制信号传导系统中重要的酶和蛋白基因。基于此，本发明的一个目的在于提供一种五基因甲基化诊断鼻咽癌的试剂盒，可以明显地提高肿瘤的检测率。对鼻咽癌相关5个基因甲基化设计大量引物，筛选甲基化特异性引物对。在同一试管内各对引物之间没有发生互相干扰，在PCR反应中有互相兼容性并获得有效扩增，是实现多重PCR的关键，对cfDNA量的要求压力减少。
本发明开发了多重甲基化特异性PCR(MMSP)技术，是快速、有效的基于PCR的检测方法，节约时间和样品，需要试剂、酶、温度和循环等条件的建立，即在同一反应条件下，各靶基因引物之间没有发生互相干扰，每个靶基因的引物对都能和其他靶基因的引物对单独或联合扩增，同时PCR产物大小可以在琼脂糖凝胶电泳中明显区分。
与MMSP相结合的琼脂糖凝胶电泳技术，是常用于分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。常用上样缓冲液进行染色处理，在紫外光的作用下可清晰观察到DNA条带，并用凝胶成像仪输出照片，后续进行相关数据处理。其优点为：1.可同时检测单个反应中多个标记物的甲基化状态。2.设备简单，操作简便且快速。3.所需样品量少，分辨能力高。4.琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大(约占98％～99％)，近似自由电泳，样品扩散较自由，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。5.琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。6.琼脂糖无毒，琼脂糖凝胶凝固过程不会发生自由基聚合，无需催化剂；这种方法成本低，适用于普通、常规生化实验室，以及三、四线城市医院的实验室开展基因甲基化与肿瘤早筛的工作。
发明内容
癌变是多因素、多基因、多步续的过程；单依靠1～2个基因是无法覆盖多种病因的。为了克服目前已有的对鼻咽癌诊断检测方法的局限性，改善目前市场上简单地拷贝基因的低效检测方法，本发明的首要目的是通过对临床各期中国人鼻咽癌组织DNA进行基因甲基化筛选，至十几个基因，并用临床样本进行逐个扩大验证，它们包含鼻咽癌癌变中EB病毒基因和癌细胞的抑癌基因的甲基化，覆盖了癌变机制信号传导系统中重要的酶和蛋白基因，也是自主发现的鼻咽癌基因甲基化标志物，增加了对肿瘤的检测率。
其次，本发明对鼻咽癌相关基因的甲基化状态是用PCR技术进行测定的，为此需要特定的设计各基因甲基化特异的PCR引物对。各个引物对都是从众多候选引物对中筛选获得的。基因甲基化引物对的确定必须对鼻咽癌有一定特异性，产生的甲基化信号是和阳性鼻咽癌细胞株DNA量成线性关系；PCR扩增产物必须是单一条带，并且在电泳凝胶上能和其他基因条带区分。
第三目的，为同时检测多个鼻咽癌特异性标志物的甲基化状态，建立了6道基因PCR扩增技术，包括试剂、酶、PCR反应温度和循环条件。使6个靶基因的引物对中每个靶基因的引物对都能在一个试管25微升反应液内同时和其他靶基因引物对联合进行PCR扩增反应，设计的引物对之间必须没有发生互相干扰，竞争反应。因此，多道PCR节约了血浆等来源的宝贵的cfDNA量。
第四目的，通过普通琼脂糖凝胶电泳技术能够同时将PCR各基因扩增产物明显区分，检测到多个鼻咽癌特异性标志物的甲基化状态。通过PCR扩增产物在凝胶上显示的不同的分子量大小来确定相关靶基因的设计是否正确，靶基因之间是否会相互干扰或产生其他杂带，能同时确定多个鼻咽癌特异性标志物的甲基化状态。
第五目的，根据待检DNA样品中所述鼻咽癌各个特异性标志物的甲基化状态，用组合模式判断所述待检DNA样品是否来自鼻咽癌患者，即有2个或2个以上所述鼻咽癌特异性标志物出现条带，显示为甲基化阳性，即可判断所述待检DNA样品来自鼻咽癌患者或高危人群。此方法增强了检测的特异性。
为了使5基因甲基化PCR能联合凝胶电泳检测鼻咽癌特异性标志物的甲基化，本发明的第一方面是筛选出多个与鼻咽癌特异性标志物，它们包含鼻咽癌癌变中EB病毒基因和癌细胞的抑癌基因的甲基化，覆盖了癌变机制信号传导系统中多个重要的酶和蛋白基因，其特征在于DNA甲基化序列中含有CpG结构，以胞嘧啶碱基(C)带有甲基的基因作为检测试剂。
所述的鼻咽癌特异性标志物，包括如下5个基因：EBNA1、LMP1、ITGA9、RASSF1A和P16；
所述5个基因经亚硫酸盐处理后得到的甲基化基因的核酸序列，包括EBNA1核酸序列如SEQ ID NO:1所示、LMP1核酸序列如SEQ ID NO:2所示、ITGA9核酸序列如SEQ ID NO:3所示、RASSF1A核酸序列如SEQ ID NO:4所示和P16核酸序列如SEQ IDNO:5所示。5个所述甲基化基因作为检测试剂的化合物。
根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：
本发明中的5个鼻咽癌特异性标志物覆盖了人鼻咽癌细胞癌变中更多信号传导系统里的基因和蛋白酶，特别包括了鼻咽癌发生的两个主要机理：体细胞基因甲基化(ITGA9、RASSF1A和P16)和EB病毒的感染(EBNA1和LMP1)。有多个基因参与，可提高对鼻咽癌的检测率。
国内也有鼻咽癌诊断试剂盒投放市场，但都是简单的模仿和复制，这种基于1～2个基因的试剂盒并没有能覆盖癌变的所有主要机理，因此灵敏度和特异性不高。本发明可为患者提供更可靠的检测方法。
根据本发明的第二个方面，是提供一种检测所述鼻咽癌特异性标志物甲基化的试剂盒，包括用于检测所述鼻咽癌特异性标志物甲基化的引物对；
所述引物对包括所述鼻咽癌特异性标志物对应的5个引物对：
EBNA1引物对的上、下游核酸序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；
LMP1引物对的上、下游核酸序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；
ITGA9引物对的上、下游核酸序列分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；
RASSF1A引物对的上、下游核酸序列分别如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；
P16引物对的上、下游核酸序列分别如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示。
在本发明的一些实施方式中，所述引物对还包括内参基因GAPDH对应的1个引物对，以此反映样品DNA加入量和DNA转化效率，及PCR反应系统是否正常工作；所述内参基因GAPDH经亚硫酸盐处理后得到的DNA序列如SEQ ID NO:6所示，GAPDH引物对的上、下游核酸序列分别如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示。
所述内参基因用于指示样品DNA的用量和转化质量。
在本发明的一些实施方式中，上述甲基化特异的引物对，都是经过从5个鼻咽癌特异性标志物基因甲基化CpG岛的多个引物对中经过多次筛选而确定的：对鼻咽癌有很高特异性，由这些引物对产生的甲基化信号是和阳性鼻咽癌细胞株DNA量成线性关系。
在本发明的一些实施方式中，上述甲基化特异的引物对本身，在PCR扩增后需要成单一条带，即没有基因引物之间形成次级非特异性反应。
在本发明的一些实施方式中，上述甲基化特异的引物对产生的PCR产物条带，在电泳凝胶上能在99～220bp核酸大小范围内进行互相区分，为下面第三方面的要求。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括PCR反应试剂，用于与所述鼻咽癌特异性标志物对应的5个引物对和所述内参基因GAPDH对应的1个引物对配合进行6重甲基化特异性PCR扩增(MMSP)，使6个引物对同时在一个试管25微升反应液内完成各基因间无干扰的扩增。
在本发明的一些实施方式中，所述PCR反应试剂包括DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+和DNA聚合酶缓冲液。
根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：
本发明选用的5个鼻咽癌特异性标志物既有鼻咽癌癌变中的EB病毒基因(EBNA1和LMP1)，又有体细胞基因(ITGA9、RASSF1A和P16)，覆盖了鼻咽癌癌变机制信号传导系统中重要的酶和蛋白质基因。提供上述5个鼻咽癌特异性标志物甲基化的引物对，对鼻咽癌的发生有一定特异性，可通过PCR技术来诊断是否患有鼻咽癌；由于多种基因参与扩增放大，提高了对鼻咽癌诊断的准确性和检测率。
根据本发明的第三个方面，是提供根据所述试剂盒对鼻咽癌特异性标志物进行联合扩增的方法，即所述多重甲基化特异性PCR(MMSP)：其中，用于检测所述鼻咽癌特异性标志物甲基化的5个引物对是在同一试管的25微升反应液内同时完成扩增反应。具体包括以下步骤：
S1：对待检DNA样品中的DNA进行亚硫酸盐处理，得甲基化转化DNA；
S2：以所述甲基化转化DNA为模板，通过所述试剂盒中的所述引物对和PCR反应试剂进行PCR扩增反应，得扩增产物。
在本发明的一些实施方式中，步骤S2进行所述PCR扩增反应时还需内参基因GAPDH对应的引物对。
5个甲基化的鼻咽癌特异性标志物之间得到独立扩增放大。因此，需要对所述鼻咽癌特异性标志物的各基因的引物进行合理组合筛选，使各基因的引物间在PCR反应中能有互相兼容性，减少顺序上的竞争性，获得有效和真实扩增是实现多重PCR的关键。
所述5个甲基化的鼻咽癌特异性标志物在PCR扩增的条件下，各靶基因都是在相同样品和工作条件下扩增，可反映每个靶基因的甲基化的丰度和强度。
根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：
将5个甲基化的鼻咽癌特异性标志物进行排列组合，在同一反应中各个甲基化的鼻咽癌特异性标志物都能得到放大，不受彼此影响，可获得鼻咽癌特异性标志物中各个基因的甲基化状态，因此，多基因检测可以明显地提高检测效率。
可以实现用一次PCR反应同时显示5个鼻咽癌特异性标志物的甲基化状态，即可进行MMSP，明显减少对从血浆等来源的宝贵样品的cfDNA需求。
根据本发明的第四个方面，是建立一种用于对待检DNA样品中多个鼻咽癌特异性标志物甲基化进行MMSP的试剂盒的工作条件。具体为进行6重PCR，设计5个靶基因和1个内参基因同时在一个试管内进行PCR扩增的工作方法和条件，使基因引物之间不能够互相干扰，可以明显提高甲基化检测率。
所述待检DNA样品可为细胞、鼻咽粘擦液、组织切片、活检组织、石蜡包埋的组织、血浆等来源DNA。所述待检DNA样品是经亚硫酸盐化学修饰后的DNA。
优选地，鼻咽癌特异性标志物中5基因甲基化试剂盒的工作包括以下步骤：
(1)将鼻咽癌DNA样品，非肿瘤对照DNA样品进行亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐处理，以便将DNA样品中的胞嘧啶转换为尿嘧啶，而5’甲基胞嘧啶不变，获得经过甲基化转化的DNA片段，进而获得经修饰后的待检DNA样品。
(2)在一个反应管内对待测DNA样品用EBNA1、LMP1、ITGA9、RASSF1A、P16基因和内参基因GAPDH的引物对进行PCR扩增反应。每个靶基因的引物对都能和其他靶基因的引物对单独或联合工作。
(3)以GAPDH DNA用作内参基因作为系统和PCR扩增反应的质量控制。CNE1(鼻咽癌细胞株，EB病毒阴性)和Namalwa(EB病毒阳性，潜伏期Ⅲ，伯基特淋巴瘤细胞株)的DNA以1：2比例混合得到的混合DNA作为阳性对照，用水作为空白对照。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒中包括引物对和PCR反应试剂，二者协同进行PCR扩增反应，得扩增产物。
优选地，所述PCR扩增反应体系(25μL)：各基因引物在反应中的最终浓度是2.5μM，包括Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+和10×DNA聚合酶缓冲液(buffer)。
更优选地，所述试剂盒还包括：针对内参基因GAPDH的引物对的特异性检测试剂。上述的内参基因用于指示样品中DNA提取和修饰的质量。
PCR扩增程序如下：第一阶段：95℃，3min，1个循环；第二阶段，94℃，1min；60℃，30s；72℃，45s；4个循环；第三阶段，94℃，1min；56℃，1min；72℃，45s；28个循环；第四阶段，72℃，4min，1个循环。
根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：通过各种反应参数比对后，确定的工作条件使实验结果重复性好，稳定性和准确性有很大的提高和保证。
根据本发明的第五个方面，提出了一种鼻咽癌特异性标志物甲基化状态的检测方法，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过电泳结果判读所述鼻咽癌特异性标志物的甲基化状态。
更佳地，所述鼻咽癌特异性标志物5基因甲基化联合凝胶电泳检测试剂盒还包括：2.5％琼脂糖预制胶、高压快速电泳液、DNA上样缓冲液。
本发明是通过琼脂糖凝胶电泳方法检查和阅读各基因在PCR反应后的甲基化状态。在电场作用下，不同大小的DNA片段迁移速率不同。同时可在凝胶成像仪荧光下观察到荧光强度不同的DNA片段。
上述的鼻咽癌特异性标志物5基因甲基化PCR扩增产物进行凝胶电泳检测。通过阳性DNA标志物作为基准，分析各靶基因是否发生甲基化，为进一步判断待测DNA样本是否来自鼻咽癌患者或高危人群提供依据。
根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：
琼脂糖凝胶电泳是各医院及第三方医学检验所中常用的普通检测方法，其优点为经济、适用且方便。
通过琼脂糖凝胶电泳可直观，准确地去判断扩增产物的DNA片段大小和荧光强度。因此，能够联合检测鼻咽癌特异性标志物中每个基因的甲基化状态。直接阅读结果，判断是否阳性。
本方法无须使用探针和荧光定量PCR仪，为没有条件满足拥有荧光定量PCR仪的实验室或医院提供了便利，但是这个方法为开展荧光定量研究奠定了工作基础。
本发明的第六个方面，是根据待检DNA样品中所述鼻咽癌特异性标志物的甲基化状态，用组合模式判断所述待检DNA样品是否来自鼻咽癌患者。如果待检的所述鼻咽癌特异性标志物在凝胶电泳中出现任意至少2个或2个以上条带，呈现为甲基化阳性，即可判断所述待检DNA样品来自鼻咽癌患者或高危人群。适用于普通医学生化实验室和第三方医学检验所推广使用。
更佳地，特异性检测内参基因的检测试剂，也同时可用1％全甲基化人类基因组DNA标准品作为标准样品的甲基化阈值和各次实验结果比对。
根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：
本发明提供了鼻咽癌特异性标志物中5基因甲基化PCR检测试剂盒及联合琼脂糖凝胶电泳检查结果，以任何两个或两个以上基因阳性判读所测DNA样品是否来自鼻咽癌患者或高危人群。单一基因甲基化阳性只是作为随访观察。这比通常判断方法，即任何一个基因甲基化阳性就划定为肿瘤或高危人群严格，更能减少假阳性，但是由于采用多基因甲基化测试，已提高了肿瘤检测率，所以本方法的检测率和特异性都依然分别大于85％和90％。可以明显地区分肿瘤和正常组织两者不同基因甲基化状态，可应用对鼻咽癌早期病人的筛查及辅助诊断。
综上，本方法将多道PCR技术与琼脂糖凝胶电泳技术相结合，检测鼻咽癌特异性标志物的甲基化状态。通过液体活检鼻咽拭子/粘擦液的方法，获取待检DNA样品，经甲基化转化修饰、PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，获得鼻咽癌特异性标志物的甲基化状态，然后用组合模式判断样品是否来自肿瘤患者或高危人群。本方法能有效筛选扩增引物，所采用的琼脂糖凝胶电泳技术为后续多重基因实时荧光PCR提供了先决条件。本方法操作简单，不需要使用探针和荧光定量PCR仪器，适用于无法满足拥有荧光定量PCR仪器条件的实验室或医院。本方法提供了可靠有效的检测工具，实现了检测的高效性和特异性。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例1中鼻咽癌患者的肿瘤组织DNA和正常人的鼻咽组织DNA中5个鼻咽癌特异性标志物的甲基化状态对比图；其中，Ladder代表DNA Marker；P代表来自CNE1和Namalwa的混合DNA，P1代表40ng CNE1和Namalwa的DNA，比例1：2，P2代表5ng CNE1和Namalwa的DNA，比例1：2；T代表鼻咽癌组织DNA，后边的数字为患者的编号；N代表正常鼻咽组织DNA，后边的数字为正常人的编号；
图2为本发明实施例1中鼻咽癌患者的肿瘤组织DNA、血浆DNA和正常人的血浆DNA中5个鼻咽癌特异性标志物的甲基化状态对比图；其中，Ladder代表DNA Marker；P代表来自CNE1和Namalwa的混合DNA，P1代表40ng CNE1和Namalwa的DNA，比例1：2，P2代表5ng CNE1和Namalwa的DNA，比例1：2；T代表鼻咽癌组织DNA；S代表鼻咽癌患者的血浆DNA；NS代表正常人的血浆DNA；每一组上边的数字为实验编号。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明的描述中，除非另有明确的限定，甲基化转化、PCR等词语应做广义理解，所属技术领域技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本发明中的具体含义。
本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”等的描述意指结合该实施例描述的具体特征、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例。而且，描述的具体特征、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例中以合适的方式结合。
实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
本发明首次揭示了一种通过协同检测5种鼻咽癌特异性标志物的甲基化，来提高鼻咽癌检出率的方法，所述的鼻咽癌特异性标志物是人EBNA1、LMP1、ITGA9、RASSF1A和P16基因。这5个基因在鼻咽癌发生过程中起着重要作用。其中，人EBNA1基因，称为EB病毒核抗原1，是唯一在EB病毒相关肿瘤细胞中均有表达的蛋白。该蛋白由641个氨基酸组成，包括氨基末端(aa1～89)、甘-丙氨酸重复区(aa90～326)和羧基末端(aa327～641)。根据EBNA1蛋白第487为氨基酸的变异，可以把EB病毒分为P-ala(即B95.8原型)，P-thr，V-val，V-pro和V-leu共5种亚型。EBNA1可辅助EB病毒的潜伏性感染、促进EB病毒相关肿瘤的发生。
人LMP1基因，称为潜伏性膜蛋白1，被认为是EB病毒重要的致瘤蛋白，LMP1胞浆区包括3个羧基末端活化区(CTAR)。LMP1是EB病毒在鼻咽癌细胞中表达的最重要的致癌蛋白，对于EB病毒介导的感染细胞的生长是必不可少的，其在鼻咽癌的发生、发展、侵袭和转移中起重要作用。
人ITGA9基因，定位于染色体3p21.3区域，其mRNA为3962bp。已有研究显示ITGA9在多种肿瘤的发生、发展及高血压、淋巴系统等方面具有重要作用。
人RASSF1A基因，称为Ras相关家族1A基因。RASSF1A调控的靶基因涉及基因转录、信号转导、细胞骨架、细胞周期、细胞黏附及凋亡等多方面内容，具有广泛的生物学作用。RASSF1A基因作为一种新型肿瘤抑制基因，其在肿瘤发生及发展过程中的作用尤为重要。目前认为，RSSF1A基因表达失活主要与启动子区异常的高甲基化、杂合性缺失及染色体缺失有关。
人P16基因，一种新型的肿瘤抑制基因。P16基因的突变与多种肿瘤的发生有关。研究表明，在鼻咽癌的发生过程中，遗传易感性在发病中发挥重要作用，P16基因突变导致抗凋亡机制失调，引起细胞周期发生畸变，从而导致鼻咽癌的发生。
本发明对上述5个基因设计了甲基化特异性的引物对，优化了相关的PCR扩增反应体系及程序、琼脂糖凝胶电泳检测方法，很大程度提高了对鼻咽癌检出的灵敏度或特异性。
本发明中，待检DNA样品包括鼻咽拭子样品、口腔拭子样品、血细胞、血清、血浆、胸腔积液、痰液、活检组织、粪便、尿液中的任一种。
一种用于检测鼻咽癌特异性标志物甲基化的试剂盒，包括检测鼻咽癌特异性标志物甲基化(EBNA1、LMP1、ITGA9、RASSF1A和P16)的引物对(具体序列见以下的实施例)和PCR反应试剂。具体地，将待检DNA样品、空白对照液、阳性对照液和阴性对照液进行PCR扩增反应，PCR扩增反应是以亚硫酸盐修饰的DNA(该DAN来自待检DNA样品)为模板，对检测基因和内参基因同时进行多重PCR联合扩增反应，并将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，由于核酸分子在琼脂糖凝胶中具有电荷效应和分子筛效应，导致不同分子量大小的DNA在电场中迁移速率不同，进而分辨待检DNA分子的大小。通过对电泳图中显示的条带的明亮及位置，得到所述待检DNA样品的上述5个鼻咽癌特异性标志物的甲基化状态。
本发明直观地运用凝胶分析系统来判断待检DNA样品中的基因是否发生甲基化。在琼脂糖凝胶电泳中，若出现2个或2个以上鼻咽癌特异性标志物的条带，且GAPDH的条带出现时，判定呈甲基化阳性，则分析该待检DNA样品来自鼻咽癌患者或高危人群；若没有出现条带且GAPDH有条带时，则分析该待检DNA样品为阴性；若只出现1个鼻咽癌特异性标志物的条带，且GAPDH有条带出现，则表示该待检DNA样品需要重复测试或随访。
本发明的方法和试剂盒适合于鼻咽癌的早期诊断，其特点是使用常用的PCR仪，普通琼脂糖凝胶电泳仪，产生有较高灵敏度、较高特异性的检测结果。检测时间短，操作简单，可直接观察和有效判断结果准确性，减少假阴性和假阳性结果。
实施例1
本实施例利用用于检测鼻咽癌特异性标志物甲基化的试剂盒对鼻咽癌患者的组织和血浆中5个鼻咽癌特异性标志物的甲基化状态进行了检测，具体过程为：
甲基化DNA作为检测靶标具有明显的优点，相比蛋白质类标志物，DNA是可以扩增的，并且很容易从活检样品获得。与突变类标志物相比，甲基化DNA都位于基因的特定部位，一般在启动子区，使引物设计变得更容易和方便。基于此，为了优化适用于同时检测EBNA1、LMP1、ITGA9、RASSF1A和P16甲基化状态的试剂盒，发明人经过反复研究对比后，选定了个基因的扩增区域序列，并设计了相应的引物对及内参基因引物对，核酸序列见表1。
表1
Figure BDA0003963461950000141
Figure BDA0003963461950000151
5个鼻咽癌特异性标志物和内参基因经亚硫酸盐处理后的核酸序列如下：
EBNA1(SEQ ID NO:1：GAGGTAGTGGAGGTCGGGGTCGAGGAGGTAGTGGA GGTCGGGGTCGAGGAGGTAGTGGAGGTCGTCGGGGTAGAGGACGTGAAAGAGTTAGGGGGGGAAGTCGTGAAAGAGTTAGGGGGAGAGGTCGTGGACGTGGAGAAAAGAGGTTTAGGAGTTTTAGTAGTTAGTTATTATTATTCGGGTTTTTATCGCGTAGGTTTTTTTTAGGTAGAAGGTTATTTTTTTATTTTGTAGGGGAAGTCGATTATTTTGAATATTATTAAGAAGGTGGTTTAGATGGTGAGTTTGACGTGTTTTCGGGAGCGATAGAGTAGGGTTTCGTAGATGATTTAGGAGAAGGTTTAAGTATTGGATTTCGGGGTTAGGGTGATGGAGGTAGGCGTAAAAAAGGAGGGTGGTTTGGAA)；
LMP1(SEQ ID NO:2：AATGATTTTTTAATGTTGTGTGTTTTGTGTTTTTTTGT GTAGATTATATTGTTGTTTTTTATAATATTATGTATTTTTTTTTTTGATTGTTGTATTGTTTTTTTATTTTTTGTTGTATTTGGTTATTGTATTTTTATAGTTTGTTTTTTGGGGATTTGTTTTTTTAATATAAATATATGTTTTTTATTTTTTTTTTTTATGTTTATATGTATATATATATTGTTGTTTTTGGGAAATTTGTATTTGTATTGTTTTTGGTAGATTTTGTAAATTTTTTTGGGTTTATATTTTAAGAAATATGTGTTATTTTGATGTAGTTGTTTTATATAAGTTTTTTATATTGTTTTGTTTTTTTTTTTTTTTAATTGTTTTGTTTTTGATATATTGTTTTGAGGATGGAATATG)；
ITGA9(SEQ ID:3：TTTGATAAGTTTTTAGATGACGTTGATGTTGTTGGTTCGG AGATTATATTTCGGGAATTATTGGTGTACGAGATTAAGTGATTAGAATATGGAGGGGTGTTTTGTTCGTTTTTACGTGGTTATTATTGTTATGAATAATAATAGTCGGCGTTTATTGAGTATTGTTTTTATAGTTTATTTTATAATTGGGTGAAGGAGTAGAGGATGCGTAGGGTTAGAATTTGGAGTTTAAATTCGTTTTTTATTCGGGTTGTTTTGGATTTTATTGGTTGTGAGATAGGGAGGGAAAGAGAGATAAAGGTAGGGAG)；
RASSF1A(SEQ ID NO:4：TAGTAAAGTTGGTTTTTAGAAATACGGGTATTTTC GCGTGGTGTTTTGCGGTCGTCGTCGTTGTGGTCGTTCGGGGTGGGGTGTGAGGAGGGGACGAAGGAGGGAAGGAAGGGTAAGGCGGGGGGGGTTTTGCGAGAGCGCGTTTAGTTTCGTTTTCGGGTTTTATAGTTTTTGTATTTAGGTTTTTATTGCGCGGTTTTTTTTAGTTTTTTTTCGTCGTTTAGTTTGGATTTTGGGGGAGGCGTTGAAGTCGGGGTTCGTTTTGTGGTTTCGTTCGGTTCGCGTTTGTTAGCGTTTAAAGTTAGCGAAGTACGGGTTTAATCGGGTTATGTCGGGGGAGTTTGAGTTTATTGAGTTGCGGGAGTTGGTATTCGTTGGGCGCGTTGGGAAGGGTCGTATTCGGTTGGAGCGTGTTAACGCGTTGCGTATCGCGCGGGGTATCGCGTGTAATTTTATACGGTAGTTGGTTTTTGGTCGTGGTT)；
P16(SEQ ID NO:5：TGTTCGGAGTTAATAGTATTTTTTTCGAGTATTCGTTTAC GGCGTTTTTTTGTTTGGAAAGATATCGCGGTTTTTTTAGAGGATTTGAGGGATAGG GTCGGAGGGGGTTTTTTCGTTAGTATCGGAGGAAGAAAGAGGAGGGGTTGGTTGG TTATTAGAGGGTGGGGCGGAT)；
GAPDH(SEQ ID NO:6：TTTGGGTTATATTGAGTATTAGGTGGTTTTTTTTGAT TTTAATAGCGATATTTATTTTTTTATTTTTGACGTTGGGGTTGGTATTGTTTTTAACGATTATTTTGTTAAGTTTATTTTTTGGTATGTGGTTGGGGTTAGAGATTGGTTTTTAAAAAGTGTAGGGTTTGGCGTTTTTTGGTGGTTGGTTTAGAAAAAGGGTTTTGATAATTTTTTTTATTTTTTAGGTATGATAACGAATTTGGTTATAGTAATAGGGTGGTGGATTTTATGGTTTATATGGTTTTTAAGGAGTAAGATTTTTGGATTATTAGTTTTAGTAAGAGTATAAGAGGAAGAGAGAGATTTTTATTGTTGGGGAGTTTTTGTTATATTTAGTTTTTTATTATATTGAATTTTTTTTTTTTA)。
检测方法如下：
a.鼻咽癌患者的肿瘤组织和正常人的鼻咽组织
(1)提取DNA：收集确诊鼻咽癌患者的肿瘤组织标本、正常人的鼻咽组织标本，分离细胞，用天根生化科技(北京)有限公司基因组DNA的提取试剂盒(DP710)来提取两种DNA。
(2)DNA甲基化转化：根据ZYMO RESEARCH生物公司试剂盒EZ DNA Methylation-DirectTM KIT(D5001)的说明书对上述两种DNA进行DNA甲基化转化修饰，得两种甲基化转化DNA。
(3)扩增：以上述两种甲基化转化DNA为模板，表1中的引物对为引物，进行多重甲基化特异性PCR反应。其中，以来自CNE1(鼻咽癌细胞株，EB病毒阴性)和Namalwa(潜伏期Ⅲ，伯基特淋巴瘤细胞株，EB病毒阳性)的DNA以1：2比例混合得到的混合DNA为阳性对照，以获得5个鼻咽癌特异性标志物的甲基化的阳性信号；以水作为空白对照液，GAPDH内参基因用作控制DNA的质量和系统工作状况；多重甲基化特异性PCR的反应体系如表2所示；
表2
Figure BDA0003963461950000171
Figure BDA0003963461950000181
根据具体情况加纯化水补至总体积为25μL；
多重甲基化特异性PCR的反应程序如下：
第一阶段：95℃，3min，1个循环；
第二阶段：94℃，1min；60℃，30s；72℃，45s；4个循环；
第三阶段：94℃，1min；56℃，1min；72℃，45s；28个循环；
第四阶段：72℃，4min，1个循环。
(4)检测：准确称取2.5g琼脂糖，倒入锥形瓶中；用量筒量取100mL的0.5×TAE溶液，倒入锥形瓶中，摇匀；将锥形瓶放入微波炉中加热，至琼脂糖完全溶解，再加入10μL的GelRed核酸凝胶染料，摇匀，倒入制胶架中，冷却成型即制成琼脂糖凝胶；
向25μL扩增产物中加入5μL的6×DNA凝胶上样缓冲液，制成电泳样品；取3μL的DNA分子标准品(DNA Marker)加入第一个孔道中，将30μL的电泳样品加入其他孔道中，在90V电压下电泳45min；电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪中，拍照并分析结果。在分析结果时，首先要分析实验是否可信：如果GAPDH基因的条带出现，且所有待检DNA样品中的GAPDH条带的亮度大致相同，则实验可信；如果不同待检DNA样品中GAPDH条带的亮度有明显差别，应重新测DNA浓度，然后重新进行多重甲基化特异性PCR和琼脂糖凝胶电泳操作后再分析结果。
结果如图1所示，Ladder代表DNA Marker；P代表来自CNE1和Namalwa的混合DNA，P1代表40ng CNE1和Namalwa的DNA，比例1：2，P2代表5ng CNE1和Namalwa的DNA，比例1：2；T代表鼻咽癌组织DNA，后边的数字为患者的编号；N代表正常鼻咽组织DNA，后边的数字为正常人的编号。可以看出，各样品中GAPDH条带的亮度大致相同，说明实验可信；阳性对照P1和P2中的5个鼻咽癌特异性标志物EBNA1、LMP1、ITGA9、RASSF1A和P16的条带均有显示，空白对照液水中没有出现上述5个甲基化标志物的条带，说明引物对的设计、多重甲基化特异性PCR反应和琼脂糖凝胶电泳工作均正常；用DNA分子标准品可大致分析各基因的扩增产物的大小和已知设计的引物的片段大小相同，可知所设计的引物是正确的，且没有发现其他杂带，说明各引物对之间没有干扰反应。
5个鼻咽癌患者的鼻咽癌组织DNA(T)中均出现了2个或2个以上鼻咽癌特异性标志物的条带，而正常的鼻咽组织DNA(N)中只出现GAPDH的条带，5个鼻咽癌特异性标志物的条带均未显示。表明本发明中检测鼻咽癌的方法具有优异的准确性、特异性和检测效率。
b.鼻咽癌患者的肿瘤组织、血浆和正常人的血浆
方法同a，只是在第一步要收集确诊患者的肿瘤组织标本、血浆样品和正常人的血浆样品。
结果如图2所示，Ladder代表DNA Marker；P代表来自CNE1和Namalwa的混合DNA，P1代表40ng CNE1和Namalwa的DNA，比例1：2，P2代表5ng CNE1和Namalwa的DNA，比例1：2；T代表鼻咽癌组织DNA；S代表鼻咽癌患者的血浆DNA；NS代表正常人的血浆DNA；每一组上边的数字为实验编号。
可以看出，4组鼻咽癌患者的鼻咽癌组织DNA(T)和血浆DNA(S)均出现了2个或2个以上鼻咽癌特异性标志物的条带，而正常人的血浆DNA(NS)中只出现GAPDH的条带，5个鼻咽癌特异性标志物的条带均未显示，表明本发明的方法对于检测组织来源的DNA的甲基化状态具有优异的准确性、特异性和检测效率。另外，5个甲基化标志物的条带在鼻咽癌组织DNA中呈现信号较强的条带，而在鼻咽癌患者的血浆DNA中的条带信号很弱，这是由于在血浆DNA中只含有少量来自鼻咽癌患者肿瘤细胞的DNA，同时由于受到血液中杂质干扰，其检测率和特异性会稍低。
实施例2
本实施例利用用于检测鼻咽癌特异性标志物甲基化的试剂盒对鼻咽癌患者的鼻咽拭子样品中5个鼻咽癌特异性标志物的甲基化状态进行了检测，具体过程为：
收集44例病理证实的鼻咽癌患者的鼻咽拭子样品和18例正常人的鼻咽拭子样品，提取相应的DNA。所用试剂盒和具体检测方法同实施例1。
对检测结果进行了统计，如表3所示，其中甲基化病例是通过琼脂糖凝胶电泳检测结果分析得到的有2个或2个以上鼻咽癌特异性标志物条带的病例；未甲基化人数是有2个以下鼻咽癌特异性标志物条带的人数。
表3
Figure BDA0003963461950000201
结果显示，44例鼻咽癌患者和18例正常人的鼻咽拭子样品DNA和阳性对照均能出现GAPDH的条带，鼻咽癌患者的鼻咽拭子样品DNA中均出现至少2个鼻咽癌特异性标志物的条带，正常人的鼻咽拭子样品DNA中的甲基化标志物的甲基化状态为阴性(即有2个以下鼻咽癌特异性标志物的条带)。
表3显示，在鼻咽癌患者的鼻咽拭子样品DNA中，EBNA1的灵敏度最高(82％)，而RASSF1A的灵敏度最低(25％)；在正常人的鼻咽拭子样品DNA中，P16的特异性最高，为100％，而RASSF1A的特异性最低，为72％。表明本发明的检测方法和试剂盒具有较高的灵敏度、准确性和检测效率。
另外，还用多重甲基化特异性PCR对鼻咽癌患者的组织和鼻咽拭子样品的DNA进行比较，显示EBNA1在鼻咽拭子样品的DNA上检测结果和组织DNA的结果上有98％的符合率，在LMPA上有87％的符合率，在RASSF1A上有74％的符合率，倘若应用EBNA1和任何其他鼻咽癌特异性标志物作为判别标准，则诊断结果有98％的符合率，具有一定的临床应用价值。使用20例正常人的鼻咽组织和鼻咽拭子样品的DNA进行比较，结果均为阴性，有100％的符合率。因此，使用合并计算方法即
Figure BDA0003963461950000211
算法，5个鼻咽癌的甲基化标志物中任何2个或2个以上鼻咽癌特异性标志物的甲基化呈阳性，即可作为鼻咽癌诊断标准，鼻咽拭子样品DNA的检测率是80％，特异性是90％。
综上所述，本发明中，通过多重甲基化特异性PCR检测EBNA1、LMP1、ITGA9、RASSF1A和P16基因的甲基化，使得鼻咽癌检测的灵敏度和特异性有明显的提高，而使用组合
Figure BDA0003963461950000212
算法，增加了特异性，减少假阳性，从而保证了检测结果的准确性和可靠性。
通过利用琼脂糖凝胶电泳技术分析待检DNA样品中DNA的方法，能方便地实现针对EBNA1、LMP1、ITGA9、RASSF1A、P16和GAPDH基因的同时检测，并能根据电泳图来简便、直观地判断样本是否为阳性，提供了一种无创性的癌症快捷检测方法。
最后，本发明还公开了至少一组的效果较好的、设计达到最优化的用于检测EBNA1、LMP1、ITGA9、RASSF1A、P16是否甲基化的上下游引物对，确保检测效果达到最优化。
上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.鼻咽癌特异性标志物，其特征在于，包括如下5个基因：EBNA1、LMP1、ITGA9、RASSF1A和P16；所述5个基因经亚硫酸盐处理后得到的甲基化基因的核酸序列分别如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:5所示。
2.检测权利要求1所述鼻特异性标志物甲基化的试剂盒，其特征在于，包括用于检测所述鼻咽癌特异性标志物甲基化的引物对；
所述引物对包括所述鼻咽癌特异性标志物对应的5个引物对：
EBNA1引物对的上、下游核酸序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；
LMP1引物对的上、下游核酸序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；
ITGA9引物对的上、下游核酸序列分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；
RASSF1A引物对的上、下游核酸序列分别如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；
P16引物对的上、下游核酸序列分别如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对还包括内参基因GAPDH对应的1个引物对；所述内参基因GAPDH经亚硫酸盐处理后得到的DNA序列如SEQ ID NO:6所示，GAPDH引物对的上、下游核酸序列分别如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应试剂，用于与所述鼻咽癌特异性标志物对应的5个引物对和所述内参基因GAPDH对应的1个引物对配合，在PCR扩增条件下进行6重甲基化特异性PCR扩增，使6个引物对同时在一个试管反应体系内完成各基因间无干扰的扩增。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂包括DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+和DNA聚合酶缓冲液。
6.根据权利要求2～5任一项所述的试剂盒扩增鼻咽癌特异性标志物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：对待检DNA样品中的DNA进行亚硫酸盐处理，得甲基化转化DNA；
S2：以所述甲基化转化DNA为模板，通过所述试剂盒中的所述引物对和PCR反应试剂进行PCR扩增反应，得扩增产物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S2所述PCR扩增反应为多重甲基化特异性PCR反应。
8.一种鼻咽癌特异性标志物甲基化状态的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：对根据权利要求6～7任一项所述方法扩增得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，用内参基因GAPDH指示样品DNA用量、DNA转化效率和PCR扩增工作状况控制，将所述扩增产物的电泳条带与空白对照水、阳性对照鼻咽癌细胞株DNA、半定量参考品不同量阳性DNA电泳条带进行比较。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪中，通过成像系统观察不同大小的DNA条带，以分析所述扩增产物中所述鼻咽癌特异性标志物和所述阳性对照比较后是否有发生甲基化，进而判断待检DNA样品中所述鼻咽癌特异性标志物的甲基化状态。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述电泳的结果的判读方法包括：根据所述待检DNA样品中所述鼻咽癌特异性标志物的甲基化状态，用组合模式进行分析，若所述待检DNA样品中有2个或2个以上所述鼻咽癌特异性标志物出现条带，显示为甲基化阳性，即可判断所述待检DNA样品来自鼻咽癌患者或高危人群。
CN202211487949.XA 2022-11-25 2022-11-25 用于检测鼻咽癌特异性标志物甲基化的试剂盒及应用 Pending CN116064814A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211487949.XA CN116064814A (zh) 2022-11-25 2022-11-25 用于检测鼻咽癌特异性标志物甲基化的试剂盒及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211487949.XA CN116064814A (zh) 2022-11-25 2022-11-25 用于检测鼻咽癌特异性标志物甲基化的试剂盒及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116064814A true CN116064814A (zh) 2023-05-05

Family

ID=86175888

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211487949.XA Pending CN116064814A (zh) 2022-11-25 2022-11-25 用于检测鼻咽癌特异性标志物甲基化的试剂盒及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116064814A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108866192B (zh) 基于甲基化修饰的肿瘤标记物stamp-ep1
RU2700088C2 (ru) Способы скрининга рака
CN107974503A (zh) 多个肺癌相关基因甲基化联合检测试剂盒、联合检测方法和应用
CN109456968B (zh) 基于甲基化修饰的肿瘤标记物
US20130344479A1 (en) Method for early diagnosis of carcinomas of the anogenital tract
CN110484621A (zh) 一种肝癌早期预警的方法
CN107630093B (zh) 用于诊断肝癌的试剂、试剂盒、检测方法及用途
CN109652541B (zh) 基于甲基化修饰的肿瘤标记物stamp-ep6
CN115341031A (zh) 一种泛癌甲基化生物标志物的筛选方法、生物标志物及应用
US20090186360A1 (en) Detection of GSTP1 hypermethylation in prostate cancer
WO2020221315A1 (zh) 基于甲基化修饰的肿瘤标记物stamp-ep8及其应用
WO2013070950A1 (en) Identification of a dna methylation marker for blood-based detection of ovarian cancer
CN108179195A (zh) 一种结直肠癌超早期病变检测的试剂盒、方法及其应用
CN116064814A (zh) 用于检测鼻咽癌特异性标志物甲基化的试剂盒及应用
JP7383727B2 (ja) メチル化修飾に基づく腫瘍マーカーｓｔａｍｐ－ｅｐ７及びその応用
RU2770928C1 (ru) Опухолевый маркер, реагент для выявления метилирования, набор и их применение
CN111020034A (zh) 新型的诊断肿瘤的标志物及其应用
WO2007057231A1 (en) Method for the determination of the dna methylation level of a cpg position in identical cells within a tissue sample
CN114959030B (zh) 检测hcg9基因甲基化的试剂在制备诊断膀胱癌的产品中的应用
CN116219023A (zh) 用于检测肺癌特异性标志物甲基化的凝胶法试剂盒及应用
WO2024031860A1 (zh) 一种用于结直肠癌诊断的多基因dna甲基化联合检测试剂盒及应用
RU2775177C1 (ru) Опухолевый маркер, реагент для выявления метилирования, набор и их применение
CN116516005A (zh) 一种用于检测头颈鳞癌的核酸产品、试剂盒及应用
CN116287227A (zh) 用于诊断前列腺癌的试剂和试剂盒
CN118076753A (zh) 胆道癌症的诊断和/或预后的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination