CN116287227A - 用于诊断前列腺癌的试剂和试剂盒 - Google Patents
用于诊断前列腺癌的试剂和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于诊断前列腺癌的试剂和试剂盒。该试剂用于检测目标区域的甲基化水平,以GRCh38.p14为参考,目标区域包括以下区域中的一个或多个:Chr12:104458334‑104458711的负链的部分区域或全长;Chr2:200585783‑200586029的正链的部分区域或全长;Chr16:23835778‑23836250的正链的部分区域或全长;以及Chr2:190180542‑190181118的正链的部分区域或全长。上述试剂用于检测前列腺癌时特异性好且灵敏度高,且为非侵入方式。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂领域,特别是涉及一种用于诊断前列腺癌的试剂和试剂盒。
背景技术
前列腺癌是男性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,长期威胁着男性的健康,它是男性群体第二大常见癌症,且是第五大致命性的癌症。因为早期前列腺癌通常无明显症状,患者在确诊时往往已经处于晚期。因此,在早期进行前列腺癌的筛查,以便检测到病变从而为患者提供治愈性治疗的机会,是造福前列腺癌患者的重要手段。
目前临床上常用的前列腺癌的诊断方法包括直肠指检、血清学PSA(前列腺特异性抗原)检测、影像学检查及病理活检等。对前列腺病灶进行穿刺活检及病理学检查,是诊断前列腺癌的金标准,但是其为侵入性操作,取样存在局限性,且存在假阴性的风险。影像学检查包括前列腺彩超、磁共振、PET-CT等,前列腺彩超检测的灵敏度和特异性较低;磁共振虽然有利于对前列腺癌进行分期和了解其转移情况,但是其对于早期的前列腺癌检出率低。血清学PSA检测特异性低,在一些良性的前列腺增生患者中,其往往会出现假阳性结果,使用血清学PSA筛查的方法可能会导致更多惰性癌变被检出,从而造成过度治疗等不良影响。
发明内容
基于此,有必要提供一种用于检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备前列腺癌的诊断产品中的应用,通过检测Chr12:104458334-104458711、Chr2:200585783-200586029、Chr16:23835778-23836250及Chr2:190180542-190181118区域内的甲基化水平可以实现无创诊断,且灵敏度好、特异性高。
一种用于检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备前列腺癌的诊断产品中的应用,以GRCh38.p14为参考基因组,所述目标区域包括以下区域中的一个或多个:Chr12:104458334-104458711的负链的部分区域或全长;Chr2:200585783-200586029的正链的部分区域或全长;Chr16:23835778-23836250的正链的部分区域或全长;以及Chr2:190180542-190181118的正链的部分区域或全长。
在其中一个实施例中,所述Chr12:104458334-104458711的负链的部分区域包括如下区域中的至少一个:CHST11-R1:Chr12:104458602-104458711的负链、CHST11-R2:Chr12:104458559-104458682的负链、和CHST11-R3:Chr12:104458334-104458472的负链;所述Chr2:200585783-200586029的正链的部分区域包括如下区域中的至少一个:AOX1-R1:Chr2:200585783-200585900的正链、和AOX1-R2:Chr2:200585890-200586029的正链;所述Chr16:23835778-23836250的正链的部分区域包括如下区域中的至少一个:PRKCB-R1:Chr16:23835778-23835919的正链、PRKCB-R2:Chr16:23835959-23836062的正链、和PRKCB-R3:Chr16:23836175-23836250的正链;所述Chr2:190180542-190181118的正链的部分区域包括如下区域中的至少一个:C2orf88-R1:Chr2:190180542-190180678的正链、C2orf88-R2:Chr2:190180686-190180825的正链、C2orf88-R3:Chr2:190180828-190180927的正链、和C2orf88-R4:Chr2:190180994-190181118的正链。
在其中一个实施例中,所述目标区域包括CHST11-R3和C2orf88-R1;或者,所述目标区域包括CHST11-R3和PRKCB-R2;或者,所述目标区域包括CHST11-R3和AOX1-R2;或者,所述目标区域包括AOX1-R2和PRKCB-R2;或者,所述目标区域包括AOX1-R2和C2orf88-R1;或者,所述目标区域包括PRKCB-R2和C2orf88-R1;或者,所述目标区域包括CHST11-R3、AOX1-R2和PRKCB-R2;或者,所述目标区域包括CHST11-R3、AOX1-R2和C2orf88-R1;或者,所述目标区域包括CHST11-R3、PRKCB-R2和C2orf88-R1;或者,所述目标区域包括AOX1-R2、PRKCB-R2和C2orf88-R1;或者,所述目标区域包括CHST11-R3、AOX1-R2、PRKCB-R2和C2orf88-R1。
一种用于诊断前列腺癌的试剂,所述试剂用于检测目标区域的甲基化水平,以GRCh38.p14为参考,所述目标区域包括以下区域中的一个或多个:Chr12:104458334-104458711的负链的部分区域或全长;Chr2:200585783-200586029的正链的部分区域或全长;Chr16:23835778-23836250的正链的部分区域或全长;以及Chr2:190180542-190181118的正链的部分区域或全长。
在其中一个实施例中,所述试剂通过如下方法中的一种或多种实现对所述目标区的甲基化水平的检测:甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和甲基化荧光定量PCR法。
在其中一个实施例中,所述试剂包括以下引物对中的一种或多种:用于检测Chr12:104458602-104458711的负链的全长或部分区域的引物对、用于检测Chr12:104458559-104458682的负链的全长或部分区域的引物对、用于检测Chr12:104458334-104458472的负链的全长或部分区域的引物对、用于检测Chr2:200585783-200585900的正链的全长或部分区域的引物对、用于检测Chr2:200585890-200586029的正链的全长或部分区域的引物对、用于检测Chr16:23835778-23835919的正链的全长或部分区域的引物对、用于检测Chr16:23835959-23836062的正链的全长或部分区域的引物对、和用于检测Chr16:23836175-23836250的正链的全长或部分区域的引物对;用于检测Chr2:190180542-190180678的正链的全长或部分区域的引物对、用于检测Chr2:190180686-190180825的正链的全长或部分区域的引物对、用于检测Chr2:190180828-190180927的正链的全长或部分区域的引物对、和用于检测Chr2:190180994-190181118的正链的全长或部分区域的引物对。
在其中一个实施例中,所述试剂包括以下引物对中的一种或多种:核苷酸序列如SEQIDNO:1~2所示的引物对、核苷酸序列如SEQIDNO:3~4所示的引物对、核苷酸序列如SEQIDNO:5~6所示的引物对、核苷酸序列如SEQIDNO:7~8所示的引物对、核苷酸序列如SEQIDNO:9~10所示的引物对、核苷酸序列如SEQIDNO:11~12所示的引物对、核苷酸序列如SEQIDNO:13~14所示的引物对、核苷酸序列如SEQIDNO:15~16所示的引物对、核苷酸序列如SEQIDNO:17~18所示的引物对、核苷酸序列如SEQIDNO:19~20所示的引物对、核苷酸序列如SEQIDNO:21~22所示的引物对和核苷酸序列如SEQIDNO:23~24所示的引物对。
在其中一个实施例中,所述试剂还包括与所述引物对对应的检测探针;
进一步地,与所述引物对对应的检测探针的核苷酸序列选自SEQIDNO:25~36中的一种。
一种用于诊断前列腺癌的试剂盒,所述试剂盒包括上述的用于诊断前列腺癌的试剂。
在其中一个实施例中,所述试剂盒包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、质控试剂、PCR反应试剂和测序试剂中的一种或者多种。
附图说明
图1为实施例1中CHST11基因、AOX1基因、PRKCB基因、C2orf88基因特定区域在前列腺癌组织和正常组织中的甲基化水平;
图2~图3为实施例3中各单个目标区域诊断前列腺癌患者和健康人血液样本的ROC曲线;
图4~图5为多个目标区域联合诊断前列腺癌患者和健康人血液样本的ROC曲线。
具体实施方式
为了便于理解本申请,下面将对本申请进行更全面的描述,本申请可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使本申请公开内容更加透彻全面。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本申请。
需要说明的是,在本文中,如未特殊说明,染色体上的位置均是以GRCh38.p14为参考;此外,因为染色体上的DNA是由正链和负链组成的双链结构,对于用染色体位置表示的区域,如果未指明是DNA的正链还是负链,则表示既可以是该区域的DNA的正链,也可以是该区域的DNA的负链,还可以是该区域的DNA的正负两条链。例如,若区域Chr12:104458334-104458711被描述为“Chr12:104458334-104458711”,则表示可以是Chr12:104458334-104458711区域内的DNA的正链,也可以是Chr12:104458334-104458711区域内的DNA的负链,还可以是Chr12:104458334-104458711区域内的DNA的正、负两条链。若区域Chr12:104458334-104458711被描述为“Chr12:104458334-104458711的正链”,则表示Chr12:104458334-104458711区域内的DNA的正链。若区域Chr12:104458334-104458711被描述为“Chr12:104458334-104458711的负链”,则表示Chr12:104458334-104458711区域内的DNA的负链。
术语“及/或”或“和/或”均是指包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
术语“多个”指两个以上;“多种”指两种以上;“以上”与数字结合表示数量时包括本数,例如“两个以上”包括两个。
术语“前列腺癌”是指发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤。2004年WHO《泌尿系统及男性生殖器官肿瘤病理学和遗传学》中前列腺癌病理类型上包括腺癌(腺泡腺癌)、导管腺癌、尿路上皮癌、鳞状细胞癌、腺鳞癌,其中前列腺腺癌占95%以上。
术语“诊断”包括辅助诊断、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子,优选多于三个,并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素,而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以任何方式产生,包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。
术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式,能够在不改变DNA序列的前提下,改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下,在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达。
术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数,既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中,可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。例如在一些情况下,可根据样本检测的Ct值进行比较;在一些情况下,可计算样本中基因甲基化的比例,即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100,然后再进行比较;在一些情况下,还需要对各个指标进行统计学上的分析整合,得出最终的判定指标。
术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中,基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常,用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素,包括温度、引物来源以及所用方法等。例如,对于诊断和预后应用,根据靶序列的复杂度,寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸,但是也可以含有更少的核苷酸。
术语“引物对”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。
术语“Taqman探针”是指包含5’荧光基团和3’淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时,因为荧光基团附近存在淬灭基团,探针不会发出荧光。在扩增过程中,如果探针与被扩增的链结合,DNA聚合酶(如Taq酶)的5’~3’核酸外切酶活性会消化探针,荧光基团远离淬灭基团,其能量不被吸收,即产生荧光信号。每经过一个PCR循环,荧光信号也和目的片段一样,有一个同步的指数增长的过程。
本申请一实施方式提供了一种用于检测目的基因的甲基化水平的试剂在制备前列腺癌的诊断产品中的应用。具体地,目的基因包括人CHST11基因(NCBI数据库中的GeneID:50515,下同)、人AOX1基因(NCBI数据库中的Gene ID:316,下同)、人PRKCB基因(NCBI数据库中的Gene ID:5579,下同)和人C2orf88基因(NCBI数据库中的Gene ID:84281,下同)中的至少一种。
在一些实施例中,目的基因包括人CHST11基因和人PRKCB基因。在另一些实施例中,目的基因包括人CHST11基因、人PRKCB基因和人AOX1基因。在另一些实施例中,目的基因包括人CHST11基因、人PRKCB基因和人C2orf88基因。在一些实施例中,目的基因包括人CHST11基因、人PRKCB基因和人AOX1基因、C2orf88基因。
进一步地,本申请经研究发现,前列腺癌组织与正常前列腺组织在Chr12:104458334-104458711、Chr2:200585783-200586029、Chr16:23835778-23836250及Chr2:190180542-190181118区域内的甲基化水平有显著差异,上述四个区域可以作为诊断前列腺癌的潜在的标记物,且经过验证,通过检测上述任一区域的部分或全长的甲基化水平诊断前列腺癌时,特异性高,灵敏度好,还可以实现无创诊断。基于此,本申请一实施方式提供了一种用于检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备前列腺癌的诊断产品中的应用,以GRCh38.p14为参考基因组,目标区域包括以下区域中的一个或多个:Chr12:104458334-104458711的负链的部分区域或全长;Chr2:200585783-200586029的正链的部分区域或全长;Chr16:23835778-23836250的正链的部分区域或全长;以及Chr2:190180542-190181118的正链的部分区域或全长。
具体地,Chr12:104458334-104458711为人CHST11基因上的部分区域;Chr2:200585783-200586029为人AOX1基因上的部分区域;Chr16:23835778-23836250为人PRKCB基因上的部分区域;Chr2:190180542-190181118为人C2orf88基因上的部分区域。
在一些实施例中,目标区域包括Chr12:104458334-104458711的负链的部分区域或全长和Chr16:23835778-23836250的正链的部分区域或全长。在另一些实施例中,目标区域包括Chr12:104458334-104458711的负链的部分区域或全长、Chr2:200585783-200586029的正链的部分区域或全长和Chr16:23835778-23836250的正链的部分区域或全长。在另一些实施例中,目标区域包括Chr12:104458334-104458711的负链的部分区域或全长、Chr16:23835778-23836250的正链的部分区域或全长和Chr2:190180542-190181118的正链的部分区域或全长。在另一些实施例中,目标区域包括Chr12:104458334-104458711的负链的部分区域或全长、Chr2:200585783-200586029的正链的部分区域或全长、Chr16:23835778-23836250的正链的部分区域或全长和Chr2:190180542-190181118的正链的部分区域或全长。
在一些实施例中,Chr12:104458334-104458711的负链的部分区域、Chr2:200585783-200586029的正链的部分区域、Chr16:23835778-23836250的正链的部分区域以及Chr2:190180542-190181118的正链的部分区域的DNA片段长度为80bp~160bp。进一步地,Chr12:104458334-104458711的负链的部分区域、Chr2:200585783-200586029的正链的部分区域、Chr16:23835778-23836250的正链的部分区域以及Chr2:190180542-190181118的正链的部分区域的DNA片段长度为100bp~150bp。
在一些实施例中,Chr12:104458334-104458711的负链的部分区域包括如下区域中的至少一个:CHST11-R1:Chr12:104458602-104458711的负链、CHST11-R2:Chr12:104458559-104458682的负链、和CHST11-R3:Chr12:104458334-104458472的负链。
在一些实施例中,Chr2:200585783-200586029的正链的部分区域包括如下区域中的至少一个:AOX1-R1:Chr2:200585783-200585900的正链、和AOX1-R2:Chr2:200585890-200586029的正链。
在一些实施例中,Chr16:23835778-23836250的正链的部分区域包括如下区域中的至少一个:PRKCB-R1:Chr16:23835778-23835919的正链、PRKCB-R2:Chr16:23835959-23836062的正链、和PRKCB-R3:Chr16:23836175-23836250的正链。
在一些实施例中,Chr2:190180542-190181118的正链的部分区域包括如下区域中的至少一个:C2orf88-R1:Chr2:190180542-190180678的正链、C2orf88-R2:Chr2:190180686-190180825的正链、C2orf88-R3:Chr2:190180828-190180927的正链、和C2orf88-R4:Chr2:190180994-190181118的正链。
进一步地,目标区域包括CHST11-R3和C2orf88-R1;或者,目标区域包括CHST11-R3和PRKCB-R2;或者,目标区域包括CHST11-R3和AOX1-R2;或者,目标区域包括AOX1-R2和PRKCB-R2;或者,目标区域包括AOX1-R2和C2orf88-R1;或者,目标区域包括PRKCB-R2和C2orf88-R1;或者,目标区域包括CHST11-R3、AOX1-R2和PRKCB-R2;或者,目标区域包括CHST11-R3、AOX1-R2和C2orf88-R1;或者,目标区域包括CHST11-R3、PRKCB-R2和C2orf88-R1;或者,目标区域包括AOX1-R2、PRKCB-R2和C2orf88-R1;或者,目标区域包括CHST11-R3、AOX1-R2、PRKCB-R2和C2orf88-R1。
基于上述本申请一实施方式还提供了一种用于诊断前列腺癌的试剂盒,该试剂盒包括用于检测上述任一目标区域的甲基化水平的试剂。
可选地,上述用于诊断前列腺癌的试剂通过如下方法中的一种或多种实现对目标区域的甲基化水平的检测:甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和甲基化荧光定量PCR法。相应地,试剂盒中包括上述检测甲基化水平的方法所必需的试剂。可以理解的是,在其他实施例中,上述用于诊断前列腺癌的试剂检测目标区域的甲基化水平的方法不限于上述。另外,需要说明的是,本文中,“可选地”表示举例。
在一些实施例中,上述试剂通过甲基化特异性荧光定量法(qMSP)检测目标区域的甲基化水平。可选地,上述试剂包括用于检测上述任一目标区域的引物对。进一步地,上述试剂包括以下引物对中的一种或多种:用于检测Chr12:104458602-104458711的负链的全长或部分区域的引物对、用于检测Chr12:104458559-104458682的负链的全长或部分区域的引物对、用于检测Chr12:104458334-104458472的负链的全长或部分区域的引物对、用于检测Chr2:200585783-200585900的正链的全长或部分区域的引物对、用于检测Chr2:200585890-200586029的正链的全长或部分区域的引物对、用于检测Chr16:23835778-23835919的正链的全长或部分区域的引物对、用于检测Chr16:23835959-23836062的正链的全长或部分区域的引物对、和用于检测Chr16:23836175-23836250的正链的全长或部分区域的引物对;用于检测Chr2:190180542-190180678的正链的全长或部分区域的引物对、用于检测Chr2:190180686-190180825的正链的全长或部分区域的引物对、用于检测Chr2:190180828-190180927的正链的全长或部分区域的引物对、和用于检测Chr2:190180994-190181118的正链的全长或部分区域的引物对。
更进一步地,上述试剂包括以下引物对中的一种或多种:核苷酸序列如SEQ IDNO:1~2所示的引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:3~4所示的引物对、核苷酸序列如SEQ IDNO:5~6所示的引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:7~8所示的引物对、核苷酸序列如SEQ IDNO:9~10所示的引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:11~12所示的引物对、核苷酸序列如SEQID NO:13~14所示的引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:15~16所示的引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:17~18所示的引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:19~20所示的引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:21~22所示的引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO:23~24所示的引物对。
在一些实施例中,上述试剂还包括与引物对对应的检测探针。可选地,与引物对对应的检测探针的核苷酸序列选自SEQ ID NO:25~36中的一种。可以理解的是,用于检测上述任一区域的引物对及检测探针的具体核苷酸序列均不限于上述,还可以是根据检测的目标区域设计的其他核苷酸序列。
在一些实施例中,上述试剂还包括内参引物对和与内参引物对对应的检测探针。可选地,内参引物对包括针对ACTB基因设计的ACTB引物对。在一个可选地具体示例中,ACTB引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:37~38所示,与ACTB引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:39所示。可以理解的是,在其他实施例中,还可以选择其他基因作为内参基因,此时,内参引物对和内参探针对应设计即可。
可选地,检测探针上连接有荧光基团。在一些实施例中,检测探针为Taqman探针。进一步地,检测探针上连接有荧光基团和淬灭基团。可选地,荧光基团位于探针的5’端,淬灭基团位于探针的3’端。可选地,检测探针上连接的荧光基团分别独立的选自FAM、HEX、VIC、CY5、ROX、Texsa Red、JOE及Quasar 705中的一种。当然,在同一个反应体系中有两种以上的探针时,不同探针上连接的荧光基团不同。可以理解的是,目标区域的检测探针和内参基因的检测探针上连接的荧光基团不限于上述,还可以是其他荧光基团。
此外,本申请一实施方式还提供了一种用于诊断前列腺癌的试剂盒,该试剂盒包括上述任一实施例的用于诊断前列腺癌的试剂。
在一些实施例中,上述的试剂盒还包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、质控试剂、PCR反应试剂和测序试剂中的一种或多种。核酸提取试剂用于提取核酸;甲基化转化试剂用于将DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变;质控试剂用于质控,例如阳性质控品和阴性质控品;PCR反应试剂用于构建PCR扩增反应体系;核酸测序试剂用于测序。
上述用于诊断前列腺癌的试剂盒通过检测目标区域的甲基化水平诊断前列腺癌,其灵敏度可达86.96%,其在健康人血液样本中的特异性为95.31%。
此外,本申请一实施方式还提供了一种前列腺癌的诊断方法,该方法通过检测上述任一实施例的目标区域的甲基化水平进行前列腺癌的诊断。
在一些实施例中,上述的诊断方法采用上述任一实施例的用于诊断前列腺癌的试剂或上述任一实施例的用于诊断前列腺癌的试剂盒检测待测样本(例如待测者的血液样本、尿液样本或组织样本)的上述任一目标区域的甲基化水平,并根据目标区域的甲基化水平确定该待测样本是否为前列腺癌阳性样本。
进一步地,上述的诊断方法包括步骤S10、步骤S20和步骤S30。具体地:
步骤S10:提取待测样本中的DNA并转化和纯化。
步骤S20:将经转化、纯化后的DNA与上述任一实施例的核酸产品混合后进行甲基化荧光定量PCR反应。
步骤S30:根据qPCR结果预测待测样本是否为前列腺癌阳性样本。
在一些实施例中,将CHST11-R3区域和C2orf88-R1区域作为检测的目标区域进行联合诊断。在使用CHST11-R3区域和C2orf88-R1区域联合诊断时,预测待测样本为前列腺癌阳性样本的概率(P)的公式为:ln(P/(1-P))=10.518+(-0.29)*ΔCt(CHST11-R3)+(-0.383)*ΔCt(C2orf88-R1);此时阈值为0.20。当待测样本的P大于或等于0.20时,则该待测样本为前列腺癌阳性样本;当待测样本的P小于0.20时,则该待测样本为前列腺癌阴性样本。
在一些实施例中,将CHST11-R3、AOX1-R2和C2orf88-R1作为检测的目标区域进行联合诊断。在使用CHST11-R3、AOX1-R2和C2orf88-R1联合诊断时,预测待测样本为前列腺癌阳性样本的概率(P)的公式为:ln(P/(1-P))=10.882+(-0.227)*ΔCt(CHST11-R3)+(-0.156)*ΔCt(AOX1-R2)+(-0.313)*ΔCt(C2orf88-R1);此时阈值为0.27。当待测样本的P大于或等于0.27,则该待测样本为前列腺癌阳性样本;当待测样本的P小于0.27,则该待测样本为前列腺癌阴性样本。
在一些实施例中,使用CHST11-R3、AOX1-R2、PRKCB-R2和C2orf88-R1进行联合诊断。在使用CHST11-R3、AOX1-R2、PRKCB-R2和C2orf88-R1联合诊断时,预测待测样本为前列腺癌阳性样本的概率(P)的公式为:ln(P/(1-P))=12.808+(-0.268)*ΔCt(CHST11-R3)+(-0.285)*ΔCt(AOX1-R2)+(-0.003)*ΔCt(PRKCB-R2)+(-0.251)*ΔCt(C2orf88-R1);此时阈值为0.26。当待测样本的P值大于或等于0.26,则该待测样本为前列腺癌阳性样本;当待测样本的P值小于0.26,则该待测样本为前列腺癌阴性样本。
需要说明的是,在上述各个公式中,ΔCt值为目标基因与内参基因(例如ACTB)的Ct值之差。
上述前列腺癌的诊断方法为非侵入性诊断方法,且敏感性好,其诊断前列腺癌的灵敏度可达86.96%,其在健康人血液样本中的特异性为95.31%。
此外,本申请一实施方式还提供了一种前列腺癌的预测分析装置,该装置包括:计算分析模块和数据模块。
具体地,计算分析模块用于根据待测样本的目标区域的甲基化水平,计算待测样本为前列腺癌阳性样本的概率,并根据该概率与预设值预测待测样本是否为前列腺癌阳性样本。待测样本的目标区域为上述任一实施例的用于检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备前列腺癌的诊断产品中的应用中所定义的目标区域。数据模块用于向计算分析模块提供待测样本的目标区域的甲基化水平。可以理解的是,在一些实施例中,计算分析模块还具有输出显示单元,用于将分析结果输出为人类可识别语言。进一步地,计算待测样本为前列腺癌阳性样本的概率的公式如上文所述,此处不再赘述。
可以理解的是,上述前列腺癌的预测分析装置中的各个模块可全部或部分通过软件、硬件及其组合来实现。上述各模块可以硬件形式内嵌于或独立于计算机设备中的处理器中,也可以以软件形式存储于计算机设备中的存储器中,以便于处理器调用执行以上各个模块对应的操作。
此外,本申请一实施方式还提供了一种计算机设备,包括存储器和处理器,存储器存储有计算机程序,处理器执行计算机程序时实现上述任一实施例的前列腺癌的诊断方法的步骤。
可以理解的是,上述的计算机设备可以是终端。该计算机设备包括通过系统总线连接的处理器、存储器、通信接口、显示屏和输入装置。其中:该计算机设备的处理器用于提供计算和控制能力。该计算机设备的存储器包括非易失性存储介质、内存储器。该非易失性存储介质存储有操作系统和计算机程序。该内存储器为非易失性存储介质中的操作系统和计算机程序的运行提供环境。该计算机设备的通信接口用于与外部的终端进行有线或无线方式的通信。无线方式可通过WIFI、移动蜂窝网络、NFC(近场通信)或其他技术实现。该计算机程序被处理器执行时以实现一种血管炎症相关风险指数的计算方法。该计算机设备的显示屏可以是液晶显示屏或者电子墨水显示屏,该计算机设备的输入装置可以是显示屏上覆盖的触摸层,也可以是计算机设备外壳上设置的按键、轨迹球或触控板,还可以是外接的键盘、触控板或鼠标等。
另外,本申请一实施方式还提供了一种计算机可读存储介质,存储有计算机程序,计算机程序被处理器执行时实现上述任一实施例的前列腺癌的诊断方法的步骤。
此外,本申请一实施方式还提供了一种计算机程序产品或计算机程序,该计算机程序产品或计算机程序包括计算机指令,该计算机指令存储在计算机可读存储介质中。计算机设备的处理器从计算机可读存储介质读取该计算机指令,处理器执行该计算机指令,使得该计算机设备执行上述任一实施例的前列腺癌的诊断方法的步骤。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明,则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明,均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规条件,例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
实施例1 CHST11、AOX1、PRKCB和C2orf88基因区域在前列腺正常组织和前列腺癌组织中的甲基化状态
从TCGA数据库中下载Illumina 450K芯片的甲基化测序数据,分析CHST11、AOX1、PRKCB和C2orf88基因特定区域在前列腺正常组织和前列腺癌组织中的甲基化状态。以GRCh38.p14为参考基因组,CHST11基因选择的区域为Chr12:104458334-104458711,AOX1基因选择的区域为Chr2:200585783-200586029,PRKCB基因选择的区域为Chr16:23835778-23836250,C2orf88基因选择的区域为Chr2:190180542-190181118。基因在选择区域的甲基化水平表示为识别该区域的所有探针的β值的平均数,统计前列腺正常组织中和前列腺癌组织中各个基因在选择区域的平均甲基化水平,结果如图1所示,其中,图1所用的统计学方法为未配对的student t检验。
从图1可以看出,CHST11、AOX1、PRKCB和C2orf88基因特定区域在前列腺癌组织样本中是高甲基化的(平均β>0.4),在前列腺正常组织中是低甲基化的(平均β<0.2),四个基因特定区域在前列腺癌组织中的甲基化水平分别显著高于其在前列腺正常组织中的甲基化水平。根据CHST11、AOX1、PRKCB和C2orf88基因特定区域在前列腺癌组织和前列腺正常组织样本中甲基化水平的差异,推测这4个基因(所示区域)可能作为诊断前列腺癌的潜在的标记物。
实施例2甲基化特异性荧光定量法(qMSP)检测CHST11、AOX1、PRKCB和C2orf88基因特定区域的甲基化水平
以GRCh38.p14为参考基因组,以CHST11基因位于Chr12:104458334-104458711区域的负链DNA分子、AOX1基因位于Chr2:200585783-200586029区域的正链DNA分子、PRKCB基因位于Chr16:23835778-23836250区域的正链DNA分子和C2orf88基因位于Chr2:190180542-190181118区域的正链DNA分子为目标区域,设计适用于荧光定量PCR扩增的甲基化引物对和检测探针,用以扩增长度为80~160bp目的片段,来适配血液或尿液样本中游离DNA检测。具体的实验步骤包括:
1.样本DNA提取
收集抗凝血样本,离心后取上层血浆,用于提取血浆游离DNA。使用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA(cfDNA)提取试剂盒(DP709)进行血浆cfDNA提取,具体操作按照试剂盒说明书进行。
2.样本DNA的转化和纯化
样本DNA的转化和纯化所用试剂盒均为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号),具体操作步骤参见试剂盒说明书。
3.甲基化特异性荧光定量PCR
1)甲基化引物对和检测探针设计:
分别以各个基因的目标区域经亚硫酸氢盐转化后的序列为模板,设计甲基化引物对和检测探针用以扩增目的基因相应的区域。具体的,针对CHST11基因位于Chr12:104458334-104458711区域的负链DNA分子,共设计3对甲基化引物对和检测探针用以扩增不同的区域;针对AOX1基因位于Chr2:200585783-200586029区域的正链DNA分子,共设计2对甲基化引物对和检测探针用以扩增不同的区域;针对PRKCB基因位于Chr16:23835778-23836250区域的正链DNA分子,共设计3对甲基化引物对和检测探针用以扩增不同的区域;针对C2orf88基因位于Chr2:190180542-190181118区域的正链DNA分子,共设计4对甲基化引物对和检测探针用以扩增不同的区域。各基因的指定位置的DNA序列及经亚硫酸氢盐转化后的序列如表1所示,用以扩增各基因不同目标区域的甲基化引物对和检测探针的序列如表2所示,甲基化引物对和检测探针可检测的甲基化的胞嘧啶位点如表3所示。
表1 CHST11、AOX1、PRKCB、C2orf88基因指定位置的核酸序列及经亚硫酸氢盐转化后的序列
表2检测引物对和检测探针的核苷酸序列
表3检测引物对及探针可识别的甲基化的胞嘧啶位点
2)PCR扩增:
按照表4的配方配制甲基化荧光定量PCR反应体系,反应体系中用到的引物对和检测探针由上海生工生物合成,用到的模板为从各类样本中提取的且经亚硫酸氢盐转化的DNA,其它组分均购自Invitrogen(Cat:14966005)。在每个PCR管中,除加入目标区域的引物对和检测探针以外,还需加入内参基因ACTB的引物对和检测探针。内参基因ACTB的上游扩增引物为:AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG(SEQ ID NO:37),下游扩增引物为:AATAACACCCCCACCCTGC(SEQ ID NO:38),检测探针为:GGAGTGGTTTTTGGGTTTG(SEQ ID NO:39)。上述检测探针均为TaqMan探针,目标区域的检测探针5’端的荧光报告基团为FAM,3’端的荧光淬灭基团为MGB,ACTB基因的检测探针5’端的荧光报告基团为VIC,3’端的荧光淬灭基团为BHQ-1。PCR反应体系配制结束后按照表5所示的反应程序进行扩增。
表4 qMSP反应体系
表5 qMSP反应程序
进行qPCR反应检测样本的时,需要同时设置阴性对照和阳性对照,以保证实验体系是可靠的。阴性对照管:按照表4的配方配置PCR反应体系,但是模板为TE缓冲液。阳性对照管:按照表4的配方配置PCR反应体系,但是模板为含ACTB(转化后序列)和目标区域(转化后序列)的人工合成的质粒。阳性对照模板的制备方法:将ACTB基因经亚硫酸氢盐转化后的序列和各个目标区域经亚硫酸氢盐转化后的序列分别克隆至pUC57上,形成人工合成质粒,将各个质粒均稀释到103拷贝/微升。例如CHST11-R1的阳性对照模板为:103拷贝/微升的含转化后ACTB基因的质粒和103拷贝/微升的含CHST11-R1序列的质粒1:1混合而成。
Ct值读取:qPCR反应结束后,可手动调整基线,将基线荧光值标准差的10倍高度对应的荧光强度值设置为阈值,阈值线为穿过阈值的与X轴平行的直线,其必须位于指数扩增期内,阈值线与扩增曲线的交点所对应的循环数即为Ct值。
质量控制:阴性对照要无扩增,阳性对照要有明显的指数增长期,且阳性对照的Ct值应在26~30之间。待检样本的内参基因的Ct值应≤33,阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后,表明本次实验有效,可进行下一步样本结果的判定。否则,当次实验无效,须重新进行检测。
4.qMSP结果分析
定义ΔCt=Ct(目标区域)-Ct(ACTB),计算所有样本中扩增各个目标区域的ΔCt值,然后使用IBMSPSS22.0软件进行受试者操作曲线特征(ROC)分析。根据ROC分析结果,选择约登指数(灵敏度+特异性-1)最大时的ΔCt为截断值,若待测样本的ΔCt值小于等于截断值,则该样本为甲基化阳性,该样本为前列腺癌阳性样本;若待测样本的ΔCt值大于截断值,则该样本为甲基化阴性,该样本为前列腺癌阴性样本。
实施例3qMSP法检测待测样本中单个目标区域的甲基化水平诊断前列腺癌血液样本的性能
1)样本收集
收集142例经组织活检确诊为前列腺腺癌的患者的血液样本,收集健康人的血液样本160例作为对照,每份血样样本的体积大于8mL。所有血液样本的收集过程经过伦理委员会的审批,所有志愿者都签署了知情同意书,所有样本均采用匿名化处理。
2)血浆样本中游离DNA的提取、转化和纯化同实施例2。
3)qMSP检测及结果分析
随机选择96例前列腺腺癌血液样本和96例健康人血液样本作为训练集,并进行如下检测和分析:
采用实施例2中提供的引物对和探针分别扩增CHST11、AOX1、PRKCB、C2orf88基因的各个目标区域,根据得到的ΔCt值进行ROC分析。具体地,将前列腺腺癌血浆样本的状态变量定为“1”,将健康人血浆样本的状态变量定为“0”,点击“分析”-“ROC曲线图”,分别指定检验变量和状态变量的值,将状态变量的值定为1,并选择“较小的检验结果表示更明确的检验”,得出ROC分析结果,选择约登指数(灵敏度+特异性-1)最大时的ΔCt为截断值,并得到平均AUC值、灵敏度和特异性数值,结果如表6所示,各目标区域的ROC曲线如图2~图3所示。
表6各目标区域检测前列腺腺癌血液样本的性能
目标区域 | 灵敏度(%) | 特异性(%) | AUC值 | 截断值 |
CHST11-R1 | 55.2 | 96.9 | 0.759 | 15.81 |
CHST11-R2 | 57.3 | 93.7 | 0.758 | 17.25 |
CHST11-R3 | 64.6 | 97.9 | 0.810 | 17.23 |
AOX1-R1 | 53.1 | 94.8 | 0.741 | 17.44 |
AOX1-R2 | 65.6 | 97.9 | 0.814 | 17.06 |
PRKCB-R1 | 50.0 | 93.7 | 0.719 | 17.20 |
PRKCB-R2 | 62.5 | 95.8 | 0.800 | 17.42 |
PRKCB-R3 | 47.9 | 93.7 | 0.709 | 16.76 |
C2orf88-R1 | 66.7 | 96.9 | 0.810 | 17.30 |
C2orf88-R2 | 58.3 | 92.7 | 0.758 | 17.42 |
C2orf88-R3 | 56.3 | 93.7 | 0.744 | 17.29 |
C2orf88-R4 | 55.2 | 90.6 | 0.725 | 17.45 |
由表6可以看出,CHST11、AOX1、PRKCB和C2orf88基因各个不同的区域检测前列腺腺癌的效果不完全相同。总体来看,所有的区域对前列腺腺癌有一定的检出率,且特异性较高,其诊断前列腺腺癌血液样本的灵敏度均在47%以上,其诊断健康人血液样本的特异性均高于90%。具体地,CHST11、AOX1、PRKCB和C2orf88基因的各个区域诊断前列腺癌的AUC值范围为0.725~0.814。其中,当检测的目标区域为CHST11-R3、AOX1-R2、PRKCB-R2、C2orf88-R1时,诊断效果较好。
选择剩余的46例前列腺腺癌血液样本和64例健康人血液样本作为测试集,并根据实施例2中提供的引物对和探针分别扩增CHST11、AOX1、PRKCB、C2orf88基因的各个目标区域,然后计算得到的ΔCt值。测试集中,若待测样本的ΔCt值小于等于截断值,则认为该样本为甲基化阳性,进而判断该样本为癌症阳性样本;若待测样本的ΔCt值大于截断值,则该样本为甲基化阴性,进而判断该样本为癌症阴性样本。各个目标区域的截断值如表6所示。测试集中各个目标区域诊断前列腺腺癌血液样本的性能如表7所示。
表7各目标区域检测前列腺腺癌血液样本的性能
在测试集中,各区域诊断前列腺腺癌血浆样本的性能与训练集相似。以CHST11-R3、AOX1-R2、PRKCB-R2、C2orf88-R1作为目标区域时,诊断的灵敏度和特异性略高于其它区域,这4个区域检测前列腺腺癌血浆样本的灵敏度均高于63%,其检测健康人血浆样本的灵敏度均高于96%。
实施例4qMSP法检测待测样本中多个目标区域的甲基化水平联合诊断前列腺腺癌血液样本的性能
现利用实施例3中的训练集的数据结果,分析CHST11-R3、AOX1-R2、PRKCB-R2和C2orf88-R1这四个区域联合诊断前列腺腺癌血液样本的效果。在本实施例中,分别分析了来自2个基因的区域联合、来自3个基因的区域联合以及来自4个基因的区域联合诊断的效果。具体的分析方法为:首先对多个区域的ΔCt值进行二元或多元Logistic分析,得出一个概率值,再以概率值为检验变量进行ROC分析,软件设置过程同上述单一检测区域的分析过程。结果如表8和图4~图5所示。
表8多区域联合诊断前列腺腺癌血液样本的性能
由表8可以看出,将CHST11-R3、AOX1-R2、PRKCB-R2和C2orf88-R1这4个区域以任意的方式组合,其诊断前列腺腺癌的效果优于单独检测某一个区域,这4个区域的任意组合对应的诊断前列腺腺癌的AUC值均高于0.82。在两个区域联合诊断时,CHST11-R3和C2orf88-R1联合诊断的效果最好,其检测的灵敏度为81.3%,特异性为93.7%,AUC值为0.913。当三个区域联合诊断时,CHST11-R3、AOX1-R2和C2orf88-R1联合诊断的效果最好,其检测的灵敏度为82.3%,特异性为93.7%,AUC值为0.915。另外,从表8还可以看出,四个区域联合诊断前列腺腺癌的效果最佳,利用这四个区域的甲基化水平联合诊断的灵敏度为86.5%,特异性为93.7%,AUC值为0.920。综合来看,以CHST11-R3、AOX1-R2、PRKCB-R2和C2orf88-R1的组合作为目标区域,通过检测其甲基化水平,可以实现前列腺腺癌的有效诊断。
利用实施例3中测试集中的46例前列腺腺癌血液样本和64例健康人血液样本作为本实施例的测试集,来验证CHST11-R3和C2orf88-R1联合诊断、CHST11-R3、AOX1-R2、C2orf88-R1联合诊断以及CHST11-R3、AOX1-R2、PRKCB-R2、C2orf88-R1联合诊断前列腺腺癌的性能。根据Logistic回归分析,得到与概率值P相关的方程,当使用CHST11-R3和C2orf88-R1联合诊断时,该方程为:ln(P/(1-P))=10.518+(-0.29)*ΔCt(CHST11-R3)+(-0.383)*ΔCt(C2orf88-R1);当使用CHST11-R3、AOX1-R2、C2orf88-R1联合诊断时,关于概率值P的方程为:ln(P/(1-P))=10.882+(-0.227)*ΔCt(CHST11-R3)+(-0.156)*ΔCt(AOX1-R2)+(-0.313)*ΔCt(C2orf88-R1);当使用CHST11-R3、AOX1-R2、PRKCB-R2、C2orf88-R1联合诊断时,关于概率值P的方程为:ln(P/(1-P))=12.808+(-0.268)*ΔCt(CHST11-R3)+(-0.285)*ΔCt(AOX1-R2)+(-0.003)*ΔCt(PRKCB-R2)+(-0.251)*ΔCt(C2orf88-R1),ΔCt值为目标基因与内参基因ACTB的Ct值之差。根据上述方程,分别计算两区域、三区域和四区域联合诊断测试集样本时的概率值P,若P值小于截断值,则表明此样本为健康人样本,若P值大于等于截断值,则表明此样本为前列腺腺癌阳性样本。具体的诊断结果如表9所示。
表9多区域联合诊断前列腺腺癌血液样本的性能
由表9可以看出,在测试集中,两区域联合诊断、三区域联合诊断和四区域联合诊断前列腺腺癌血液样本效果很好。具体地,CHST11-R3和C2orf88-R1联合诊断时,其灵敏性为76.09%,特异性为96.88%;CHST11-R3、AOX1-R2和C2orf88-R1联合诊断时,其灵敏性为80.43%,特异性为95.31%;CHST11-R3、AOX1-R2、PRKCB-R2、C2orf88-R1联合诊断时,其灵敏性为86.96%,特异性为95.31%。综上,可以使用多基因区域联合诊断地方式诊断前列腺癌。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式,便于具体和详细地理解本申请的技术方案,但并不能因此而理解为对申请专利保护范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本申请构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本申请的保护范围。应当理解的是,在本领域技术人员在本申请提供的技术方案的基础上,通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案,均在本申请所附权利要求的保护范围内。因此,本申请专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准,说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (11)
1.一种用于检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备前列腺癌的诊断产品中的应用,其特征在于,以GRCh38.p14为参考基因组,所述目标区域包括以下区域中的一个或多个:
Chr12:104458334-104458711的负链的部分区域或全长;
Chr2:200585783-200586029的正链的部分区域或全长;
Chr16:23835778-23836250的正链的部分区域或全长;和
Chr2:190180542-190181118的正链的部分区域或全长。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述Chr12:104458334-104458711的负链的部分区域包括如下区域中的至少一个:
CHST11-R1:Chr12:104458602-104458711的负链、
CHST11-R2:Chr12:104458559-104458682的负链、和
CHST11-R3:Chr12:104458334-104458472的负链;
所述Chr2:200585783-200586029的正链的部分区域包括如下区域中的至少一个:
AOX1-R1:Chr2:200585783-200585900的正链、和AOX1-R2:Chr2:200585890-200586029的正链;
所述Chr16:23835778-23836250的正链的部分区域包括如下区域中的至少一个:
PRKCB-R1:Chr16:23835778-23835919的正链、
PRKCB-R2:Chr16:23835959-23836062的正链、和
PRKCB-R3:Chr16:23836175-23836250的正链;
所述Chr2:190180542-190181118的正链的部分区域包括如下区域中的至少一个:
C2orf88-R1:Chr2:190180542-190180678的正链、
C2orf88-R2:Chr2:190180686-190180825的正链、
C2orf88-R3:Chr2:190180828-190180927的正链、和
C2orf88-R4:Chr2:190180994-190181118的正链。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述目标区域包括CHST11-R3和C2orf88-R1;或者,所述目标区域包括CHST11-R3和PRKCB-R2;或者,所述目标区域包括CHST11-R3和AOX1-R2;或者,所述目标区域包括AOX1-R2和PRKCB-R2;或者,所述目标区域包括AOX1-R2和C2orf88-R1;或者,所述目标区域包括PRKCB-R2和C2orf88-R1;或者,所述目标区域包括CHST11-R3、AOX1-R2和PRKCB-R2;或者,所述目标区域包括CHST11-R3、AOX1-R2和C2orf88-R1;或者,所述目标区域包括CHST11-R3、PRKCB-R2和C2orf88-R1;或者,所述目标区域包括AOX1-R2、PRKCB-R2和C2orf88-R1;或者,所述目标区域包括CHST11-R3、AOX1-R2、PRKCB-R2和C2orf88-R1。
4.一种用于诊断前列腺癌的试剂,其特征在于,所述试剂用于检测目标区域的甲基化水平,以GRCh38.p14为参考,所述目标区域包括以下区域中的一个或多个:
Chr12:104458334-104458711的负链的部分区域或全长;
Chr2:200585783-200586029的正链的部分区域或全长;
Chr16:23835778-23836250的正链的部分区域或全长;以及
Chr2:190180542-190181118的正链的部分区域或全长。
5.根据权利要求4所述的试剂,其特征在于,所述试剂通过如下方法中的一种或多种实现对所述目标区的甲基化水平的检测:
甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和甲基化荧光定量PCR法。
6.根据权利要求5所述的试剂,其特征在于,所述试剂包括以下引物对中的一种或多种:
用于检测Chr12:104458602-104458711的负链的全长或部分区域的引物对、用于检测Chr12:104458559-104458682的负链的全长或部分区域的引物对、用于检测Chr12:104458334-104458472的负链的全长或部分区域的引物对、用于检测Chr2:200585783-200585900的正链的全长或部分区域的引物对、用于检测Chr2:200585890-200586029的正链的全长或部分区域的引物对、用于检测Chr16:23835778-23835919的正链的全长或部分区域的引物对、用于检测Chr16:23835959-23836062的正链的全长或部分区域的引物对、和用于检测Chr16:23836175-23836250的正链的全长或部分区域的引物对;用于检测Chr2:190180542-190180678的正链的全长或部分区域的引物对、用于检测Chr2:190180686-190180825的正链的全长或部分区域的引物对、用于检测Chr2:190180828-190180927的正链的全长或部分区域的引物对、和用于检测Chr2:190180994-190181118的正链的全长或部分区域的引物对。
7.根据权利要求6所述的试剂,其特征在于,所述试剂包括以下引物对中的一种或多种:
核苷酸序列如SEQ ID NO:1~2所示的引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:3~4所示的引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:5~6所示的引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:7~8所示的引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:9~10所示的引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:11~12所示的引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:13~14所示的引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:15~16所示的引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:17~18所示的引物对、核苷酸序列如SEQ IDNO:19~20所示的引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:21~22所示的引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO:23~24所示的引物对。
8.根据权利要求6或7所述的试剂,其特征在于,所述试剂还包括与所述引物对对应的检测探针;
进一步地,与所述引物对对应的检测探针的核苷酸序列选自SEQ ID NO:25~36中的一种。
9.一种用于诊断前列腺癌的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求4~8任一项所述的用于诊断前列腺癌的试剂。
10.根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、质控试剂、PCR反应试剂和测序试剂中的一种或者多种。
11.一种前列腺癌的预测分析装置,其特征在于,包括:
计算分析模块,所述计算分析模块用于根据待测样本的目标区域的甲基化水平,计算所述待测样本为前列腺癌阳性样本的概率,并根据所述概率与预设值确定所述待测样本是否为前列腺癌阳性样本,所述目标区域为权利要求1~3任一项所述的应用中所定义的目标区域;及
数据模块,所述数据模块用于向所述计算分析模块提供所述待测样本的目标区域的甲基化水平。
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