CN117887849A - 一种子宫内膜良恶性病变的甲基化标志物及其应用 - Google Patents

一种子宫内膜良恶性病变的甲基化标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种子宫内膜良恶性病变的甲基化标志物及其应用，涉及子宫内膜良恶性病变的检测技术领域；所述的甲基化标志物分别选自SIM1基因、DAW1基因、GABRA4基因中至少一个靶区域内甲基化的核苷酸序列；其中，所述靶区域选自SIM1基因、DAW1基因和GABRA4基因中以下任一一段甲基化序列及区域：SIM1基因的hg19_dna range＝chr6:100895007‑100895246区域；DAW1基因的hg19_dna range＝chr2:228736230‑228736544区域；GABRA4基因的hg19_dna range＝chr4:46995128‑46995872区域。本发明筛选与子宫内膜癌高度相关的基因，形成功能互补，提高临床灵敏度。

Description

一种子宫内膜良恶性病变的甲基化标志物及其应用
技术领域
本发明涉及子宫内膜良恶性病变的检测技术领域，尤其涉及一种子宫内膜良恶性病变的甲基化标志物及其应用。
背景技术
子宫内膜癌作为一种妇科恶性肿瘤，对女性健康构成了严重威胁。尽管在医学领域取得了显著的进展，但目前仍然存在着许多子宫内膜癌检测和诊断方面的挑战和缺点。这些缺点限制了我们对该疾病的早期发现、准确诊断，影响后续的有效治疗。
目前的子宫内膜癌检测方法中，一些常用的筛查手段，比如子宫内膜细胞学检查和血清学标记物CA125，并不总是足够敏感，特别是在癌症的早期阶段。这可能导致许多患者在癌症的初期未被准确检测出来，延误了治疗的时机。另一个挑战是特异性，即在进行检测时，可能会出现误报的情况，比如影像学经阴道超声，受生理周期的影响很大。这会引发不必要的焦虑和额外的检查，同时可能错过了一些真正需要治疗的病例。
子宫内膜癌的确诊，需要侵入性的检测过程，如子宫内膜活检。这种方法可能会引发不适和并发症，使一些患者望而却步，从而延迟了他们的诊断。
子宫内膜细胞学、经阴道超声和子宫内膜活检，这些检测和诊断手段需要专业设备和培训医疗人员。我国人口基数大，这限制了全国范围内对这些方法的广泛应用。
总之，尽管子宫内膜癌检测和诊断领域已取得一些进展，但仍然存在许多挑战和局限性。检测方法的研究和技术创新将需要致力于提高敏感性、特异性和便捷性，以便更好地应对这一重要的健康问题。同时，应该着重考虑资源匮乏地区的需求，以确保更广泛范围内的早期检测。
基因甲基化检查是一种重要的分子生物学工具，已在子宫内膜癌的研究和诊断中取得了进展。基因甲基化检查可以帮助早期检测子宫内膜癌。它可以识别在癌前病变阶段发生的DNA甲基化变化，这些变化可能出现在癌症形成之前，使得早期干预和治疗成为可能。基因甲基化检查有助于确定子宫内膜癌的病情分级。通过分析特定基因的甲基化水平，医生可以更好地了解肿瘤的恶性程度，从而制定更精准的治疗计划。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过筛选与子宫内膜癌高度相关的基因，形成功能互补以提高临床灵敏度的子宫内膜良恶性病变的甲基化标志物。
本发明提供了一种子宫内膜良恶性病变的甲基化标志物，所述甲基化标志物分别选自SIM1基因、DAW1基因、GABRA4基因中至少一个靶区域内甲基化的核苷酸序列；其中，所述靶区域选自SIM1基因、DAW1基因和GABRA4基因中以下任一一段甲基化序列及区域：
SIM1基因的hg19_dna range＝chr6:100895007-100895246区域；
DAW1基因的hg19_dna range＝chr2:228736230-228736544区域；
GABRA4基因的hg19_dna range＝chr4:46995128-46995872区域。
进一步的，子宫内膜良恶性病变的甲基化标志物应用于制备子宫内膜良恶性病变诊断产品中。优选的，所述诊断产品包括试剂盒、制剂或芯片中的任意一种。
进一步的，所述试剂盒至少包括含有如上述所述的用于检测SIM1基因甲基化靶区域的前后引物和探针；其中，用于检测SIM1基因甲基化靶区域的前后引物和探针的碱基序列为：
进一步的，所述试剂盒至少包括含有如上述所述的用于检测DAW1基因甲基化靶区域的前后引物和探针；其中，用于检测DAW1基因甲基化靶区域的前后引物和探针的碱基序列为：
进一步的，所述试剂盒至少包括含有如上述所述的用于检测GABRA4基因甲基化靶区域的前后引物和探针；其中，用于检测GABRA4基因甲基化靶区域的前后引物和探针的碱基序列为：
。
进一步的，应用所述诊断产品对子宫内膜良恶性病变的标志物进行检测过程中，对目标基因甲基化诊断子宫内膜良恶性病变的结果判读的方式如下：
用ΔCt值反应特定基因靶区域的甲基化水平，其ΔCt值为：
ΔCtSIM1＝CtSIM1-Ct内参
ΔCtDAW1＝CtDAW1-Ct内参
ΔCtGABRA4＝CtGABRA4-Ct内参
其中，内参指内参基因，所述的内参基因选自β-actin基因、COL2A1基因或GAPDH基因中的任意一个。
进一步的，应用所述诊断产品对子宫内膜良恶性病变的标志物进行检测过程中，对因甲基化检测结果判读的方式如下：
进一步的，应用所述诊断产品对子宫内膜良恶性病变的标志物进行检测过程中，采用SIM1基因甲基化和DAW1基因甲基化组合的双基因甲基化联合对子宫内膜良恶性病变的结果进行判读；
或者是，采用SIM1基因甲基化和GABRA4基因甲基化组合的双基因甲基化联合对子宫内膜良恶性病变的结果进行判读；
或者是，采用DAW1基因甲基化和GABRA4基因甲基化组合的双基因甲基化联合对子宫内膜良恶性病变的结果进行判读；
或者是，采用SIM1基因甲基化、DAW1基因甲基化和GABRA4基因甲基化组合的三基因甲基化联合对子宫内膜良恶性病变的结果进行判读。
进一步的，采用SIM1基因甲基化和DAW1基因甲基化组合的双基因甲基化联合对子宫内膜良恶性病变的结果进行判读的方式如下：
采用SIM1基因甲基化和GABRA4基因甲基化组合的双基因甲基化联合对子宫内膜良恶性病变的结果进行判读的方式如下：
采用DAW1基因甲基化和GABRA4基因甲基化组合的双基因甲基化联合对子宫内膜良恶性病变的结果进行判读的方式如下：
采用SIM1基因甲基化、DAW1基因甲基化和GABRA4基因甲基化组合的三基因甲基化联合对子宫内膜良恶性病变的结果进行判读的方式如下：
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明筛选与子宫内膜癌高度相关的基因，形成功能互补，提高临床灵敏度；采用自动化PCR检测技术，对早期子宫内膜癌和子宫内膜非典型增生都具有很高的检出效能。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明实施例中SIM1基因甲基化、DAW1基因甲基化、GABRA4基因甲基化诊断子宫内膜癌的ROC曲线示意图。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与本发明的技术领域技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1：
本发明提供的用于子宫内膜癌早期筛查诊断(具体包括用于对子宫内膜非典型增生以及非典型增生或内膜癌的筛查诊断)的甲基化标志物，所述标志物至少包括SIM1基因、DAW1基因和GABRA4基因中至少一个靶区域内甲基化的核苷酸序列。其中，SIM1基因、DAW1基因和GABRA4基因中每个基因中以下任意一段甲基化序列及区域如表1所示。
表1 SIM1基因、DAW1基因和GABRA4基因中的甲基化序列及区域
目标基因 甲基化序列及区域
SIM1 hg19_dnarange＝chr6:100895007-100895246
DAW1 hg19_dnarange＝chr2:228736230-228736544
GABRA4 hg19_dnarange＝chr4:46995128-46995872
具体的，针对上述目标基因，首先在https://genome.ucsc.edu/官网查询甲基化差异的序列，再进行甲基化特异性PCR扩增引物探针设计。经临床样本宫颈脱落细胞验证，SIM1基因甲基化、DAW1基因甲期货和GABRA4基因甲基化可作为早期筛查和辅助诊断子宫内膜癌的标记物，联合检测可大大提高临床灵敏度。
其中，在针对上述目标基因进行PCR扩增引物探针设计过程中，选用β-actin基因、COL2A1基因或GAPDH基因中的任意一个作为内参基因。
具体的，检测SIM1基因甲基化靶区域的前后引物和探针的碱基序列如表2所示，检测DAW1基因甲基化靶区域的前后引物和探针的碱基序列如表3所示，检测GABRA4基因甲基化靶区域的前后引物和探针的碱基序列如表4所示。
表2检测SIM1基因甲基化靶区域的前后引物和探针的碱基序列
注：表中所展示的探针序列未进行荧光基团标记和淬灭基团标记。
具体的，SIM1(hg19_dna range＝chr6:100895007-100895246)的核酸序列为：
GCGCAGCCAGCACTCGAGGGTCAAAATGGCATTCCCCGTGGCCCGAGCCTTGTCTAACCCGGCCGTGCCGCCACCCGCACTCTCGCAGAGAGCAGGGTCGCCTGGGGTGGGTGAAGGGGTCTCAGTCTTGCACTCACGTGAGGACATAGTTGACGCTGACGATACAGTGTGGCCTGGAGGAGCGACTGTTGTGCACGATGGTCGCGTAGCTCTGCACCCATACCCAGCCGCCGTGTTTCG
将该DNA链进行重亚硫酸盐转换(未甲基化的C转换为T，甲基化的C保持不变)，得到转换后的DNA链：
GCGTAGTTAGTATTCGAGGGTTAAAATGGTATTTTTCGTGGTTCGAGTTTTGTTTAATTCGGTCGTGTCGTTATTCGTATTTTCGTAGAGAGTAGGGTCGTTTGGGGTGGGTGAAGGGGTTTTAGTTTTGTATTTACGTGAGGATA TAGTTGACGTTGACGATATAGTGTGGTTTGGAGGAGCGATTGTTGTGTACGATGGTCGCGTAGTTTTGTATTTATAT TTAGTCGTCGTGTTTCG
序列中下划线部分即为最终所得到的SIM1(chr6:100895007-100895246)的引物探针的序列位置。
表3检测DAW1基因甲基化靶区域的前后引物和探针的碱基序列
注：表中所展示的探针序列未进行荧光基团标记和淬灭基团标记。
具体的，DAW1(hg19_dna range＝chr2:228736230-228736544)的核酸序列为：
TCGCCCCCCGCGCGCCGGAGCCCCGGGTCGCCACCAACCGCCCGCGGAGCCAGACCTCCCAGCTCTGCGCCCCAGGACCGCGCGGTGCAACCTGCGCATGCGCACCCGCGTCCCGCTGCTGTTTAGCCGTTTCCAAGGCTACGAAGCCCATCGGCCGGGGATAAGAGAGCAAGAAAATGAAGCTCAAGAGCCTCCTGCTCCGGTATTACCCGCCAGGTACGCACCAGCCCGGCCCCGTCATCCCCACGTGGGACCCTGGGCTCCCAGACTGGGAGGGTTTGGGGCGGAGGAGGGCGCAGCCACTGAAAGGCGGCG
将该DNA链进行重亚硫酸盐转换(未甲基化的C转换为T，甲基化的C保持不变)，得到转换后的DNA链：
TCGTTTTTCGCGCGTCGGAGTTTCGGGTCGTTATTAATCGTTCGCGGAGTTAGATTTTTTAGTTTTGCGTTTTAGGATCGCGCGGTGTAATTTGCGTATGCGTATTCGCGTTTCGTTGTTGTTTAGTCGTTTTTAAGGTTACGAAG TTTATCGGTCGGGGATAAGAGAGTAAGAAAATGAAGTTTAAGAGTTTTTTGTTTCGGTATTATTCGTTAGGTACGTATTAGTTCGGTTTCGTTATTTTTACGTGGGATTTTGGGTTTTTAGATTGGGAGGGTTTGGGGCGGAGGAGGGCGTAGTTATTGAAAGGCGGCG
序列中下划线部分即为最终所得到的DAW1(chr2:228736230-228736544)的引物探针的序列位置。
表4检测GABRA4基因甲基化靶区域的前后引物和探针的碱基序列
注：表中所展示的探针序列未进行荧光基团标记和淬灭基团标记。
具体的，GABRA4(hg19_dna range＝chr4:46995128-46995872strand＝+)的核酸序列为：
GCGCGCCCCGCCGCAAGACCCCCAGTGCCCACACGCCTCTTGGATCCTGCGCCCTTGGTGCTCTCCGCATCTATGCGGTCACAGAAAAGCCTGGCTTCGGCCCCTGCTCTTACAGCTGAGATAAGAAGACCTAGTCCACCCAGGGAGGAGCGAGTGGCCAAAGGGGTCCCGGAGCTAGCCATTTCTCCACTTTCCGTTGCCCACCTCCTCGCACCCCAGAGAACTCACCAAACCGCCAGGCACAGGAAGCGCAGGAGGGCGAAACTGACCCCGGCGGACAGAGCGATCGCGGGTACCTTCTTGGCAGAAACCATCTTTGCAACATGCCATACTTCAAGCCTGTTCACGTTTCCAGGCTCTTCAGATGCCCTGAGCAGGGTGCGAGGAGAGGGCAGAGAGGCTCCCGCGGCGTGCGCACACTCGCGCTCACACTCGCCCGCGCTCAGCCAGCCCGAGCCGCGGTGGGCGTGTGTGTGCACGGGGCCAGGGGAGGCGGAACCTGCCTTCCTCGCCCCCTCCTTTCTCGCTCAGCGCTCAATGTGTATGTAGAGCTATGTATACCGCTCCACACCCTTTCGTGCCCGCGCGCTGAAGGTTCTGGGGTTCGTATCCGCGCGCTTGCGCTGCAAGACTCGGCAAGTTTGTTCCGACTGTAACTCCGGGGATGAGGAACGGGGTCTCTCGCCCCTCCTCCGGCTTCGCAGCCCCCGACCCCAAGTGGGCTCCCCGCCCACAGCAGTGTTCG
将该DNA链进行重亚硫酸盐转换(未甲基化的C转换为T，甲基化的C保持不变)，得到转换后的DNA链：
GCGCGTTTCGTCGTAAGATTTTTAGTGTTTATACGTTTTTTGGATTTTGCGTTTTTGGTGTTTTTCGTATTTATGCGGTTATAGAAAAGTTTGGTTTCGGTTTTTGTTTTTATAGTTGAGATAAGAAGATTTAGTTTATTTAGGGAGGAGCGAGTGGTTAAAGGGGTTTCGGAGTTAGTTATTTTTTTATTTTTCGTTGTTTATTTTTTCGTATTTTAGAGAATTTATTAAATCGTTAGGTATAGGAAGCGTAGGAGGGCGAAATTGATTTCGGCGGATAGAGCGATCGCGGGTATTTTTTTGGTAGAAATTATTTTTGTAATATGTTATATTTTAAGTTTGTTTACGTTTTTAGGTTTTTTAGATGTTTTGAGTAGGGTGCGAGGAGAGGGTAGAGAGGTTTTCGCGGCGTGCGTATATTCGCGTTTATATTCGTTCGCGTTTAGTTAGTTCG AGTCGCGGTGGGCGTGTGTGTGTACGGGGTTAGGGGAGGCGGAATTTGTTTTTTTCGTTTTTTTTTTTTTCGTTTAGCGTTTAATGTGTATGTAGAGTTATGTATATCGTTTTATATTTTTTCGTGTTCGCGCGTTGAAGGTTTTGGGGTTCGTATTCGCGCGTTTGCGTTGTAAGATTCGGTAAGTTTGTTTCGATTGTAATTTCGGGGATGAGGAACGGGGTTTTTCGTTTTTTTTTCGGTTTCGTAGTTTTCGATTTTAAGTGGGTTTTTCGTTTATAGTAGTGTTCG
序列中下划线部分即为最终所得到的GABRA4(chr4:46995128-46995872)的引物探针的序列位置。
实施例2
本发明提供的试剂用于子宫内膜癌诊断SIM1基因、DAW1基因和GABRA4基因的检测试验方法，其包括如下步骤：
一、样本采集与DNA提取
1.样本准备：首先，专业医生用宫颈刷在宫颈口同一方向旋转3-5圈，避免出血。停留5-10后，取出宫颈刷，放入细胞保存瓶，漂洗3次，折断刷柄，拧紧瓶盖。置于4℃冰箱，以防止DNA降解。
2.细胞破碎和溶解：使用细胞裂解液和/或组织破碎缓冲液来打破细胞膜并释放细胞内成分。
3.蛋白质消化：加入蛋白酶，消化细胞或组织中的蛋白质，使得DNA被释放。
4.DNA沉淀：加入乙醇或异丙醇，使得DNA沉淀出来。在这个步骤中，DNA会从溶液中析出，形成可见的白色沉淀物。
5.洗涤和沉淀：用乙醇洗涤DNA沉淀，以去除杂质，然后将DNA进行离心沉淀，去除洗涤液。
6.溶解和储存：将洗净的DNA用适当的缓冲液(例如TE缓冲液，Tris-EDTA缓冲液)溶解，以便于后续实验操作。提取得到的DNA可以存储在-20℃或更低温度下，以保持其稳定性
二、DNA重亚硫酸盐转化
DNA重亚硫酸盐(DNA bisulfite)转化是将未甲基化的胞嘧啶(Cytosine，C)转化成尿嘧啶(Uracil，U)，而已甲基化的胞嘧啶仍然保持不变。然后通过DNA测序方法在DNA中准确测定甲基化的位置，从而了解基因组的表观遗传学变化。
1.亚硫酸盐处理：将适量DNA加入重亚硫酸盐(Sodium Bisulfite)溶液中，在一定温度下孵育，将未甲基化的胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)。
2.DNA纯化：通过磁珠法或过柱法将DNA从重亚硫酸盐溶液中纯化出来。
三、甲基化特异荧光定量PCR扩增
3.1反应组分：
DNA模板：重亚硫酸盐转化后的样本DNA
引物和探针：引物为扩增目标序列的两个互补片段对应的核苷酸片段，一个用于前向扩增，一个用于反向扩增。探针为两引物之间一段核苷酸片段，包含有特殊的荧光标记，用于在PCR反应中定量测量DNA量。
DNA聚合酶：使用热稳定的DNA聚合酶，催化PCR反应。
dNTPs(脱氧核苷酸)混合物：包含脱氧腺嘌呤、脱氧胞嘧啶、脱氧鸟嘌呤和脱氧胸腺嘧啶。
缓冲液：缓冲液用于维持PCR反应的pH，并提供离子条件来支持DNA聚合酶的活性。
MgCl2：PCR反应需要额外的镁离子来优化反应。
3.2PCR反应
按表5程序参数进行PCR反应。
表5PCR上机程序参数
四、基因甲基化相对定量PCR
样本经过甲基化特异引物探针PCR后，可获得每个基因的Ct值。基因甲基化结果为ΔCt值，ΔCt值越小，甲基化程度越高，具体的，计算公式如下：
ΔCtSIM1＝CtSIM1-Ct内参
ΔCtDAW1＝CtDAW1-Ct内参
ΔCtGABRA4＝CtGABRA4-Ct内参
其中，内参具体为内参基因。
五、单基因检测结果判读
PCR反应完成，观察内参基因的扩增曲线及Ct，判读是否正常。在内参基因扩增正常的情况下，对每一个基因进行高度甲基化和低度甲基化判读，判读标准参见表6。
表6基因甲基化检测结果判读
六、双基因甲基化联合检测结果判读
本发明双基因甲基化联合采用任一基因甲基化阳性判读为阳性的标准进行判读，具体判读参见表7、表8和表9。
表7SIM1、DAW1双基因甲基化联合检测结果判读
表8SIM1、GABRA4双基因甲基化联合检测结果判读
表9DAW1、GABRA4双基因甲基化联合检测结果判读
七、三基因甲基化联合检测结果判读
对于筛查人群，为了不漏诊子宫内膜癌，临床敏感性非常重要，因此本发明三基因甲基化联合采用任一基因甲基化阳性判读为阳性的标准进行判读，具体参见表10。
表10SIM1、DAW1、GABRA4三基因甲基化联合检测结果判读
实验例1：
选取已知明确病理信息结果的255样本。子宫内膜正常或良性病变172例；子宫内膜非典型增生8例；子宫内膜癌75例，其中内膜样腺癌67例，混合型癌5例，浆液性癌1例，透明细胞癌2例。
按照实施例1，对宫颈脱落细胞进行DNA提取，重亚硫酸盐转化后，采用荧光定量PCR对SIM1、DAW1和GABRA4基因靶区域行甲基化特异检测，本发明的试剂对子宫内膜癌的鉴定能力，参见图1，具体分析如下：
SIM1(chr6:100895007-100895246)甲基化检测诊断子宫内膜癌及非典型增生的受试者曲线下面积(AUC)为0.932(95％CI＝0.893-0.959)；
DAW1(chr2:228736230-228736544)甲基化检测诊断子宫内膜癌及非典型增生的受试者曲线下面积(AUC)为0.843(95％CI＝0.793-0.886)；
GABRA4(chr4:46995128-46995872)甲基化检测诊子宫内膜癌及非典型增生的受试者曲线下面积(AUC)为0.924(95％CI＝0.884-0.953)。
按照实施例1中的对基因甲基化结果的判读，结合临床样本数据取临界值k1＝8.5，k2＝10.4，k3＝8.4，分析单基因、双基因和三基因联合检测的诊断性能，参见表11。子宫内膜非典型增生是子宫内膜癌的癌前病变，恶性程度较高，需临床尽可能检测出来，加以干预，防止进展为子宫内膜癌，本发明的基因甲基化标记物在8子宫内膜非典型增生病例中的结果参见表12。
表11基因甲基化检测及其联合检测的临床性能
表12宫颈脱落细胞基因甲基化在子宫内膜非典型增生病例中的结果
SIM1、DAW1、GABRA4基因甲基化辅助诊断子宫内膜癌的性能满足临床需求，可进行多基因的联合提高灵敏度。本发明的子宫内膜癌基因甲基化标记物，取样简单，自动化检测，对子宫内膜癌及非典型增生有很好的敏感度和特异度，对子宫内膜癌的防治具有重要意义。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种子宫内膜良恶性病变的甲基化标志物，其特征在于，所述甲基化标志物分别选自SIM1基因、DAW1基因、GABRA4基因中至少一个靶区域内甲基化的核苷酸序列；其中，所述靶区域选自SIM1基因、DAW1基因和GABRA4基因中以下任一一段甲基化序列及区域：
SIM1基因的hg19_dna range＝chr6:100895007-100895246区域；
DAW1基因的hg19_dna range＝chr2:228736230-228736544区域；
GABRA4基因的hg19_dna range＝chr4:46995128-46995872区域。
2.权利要求1所述的子宫内膜良恶性病变的甲基化标志物在制备子宫内膜良恶性病变诊断产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述诊断产品包括试剂盒、制剂或芯片中的任意一种。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒至少包括含有如权利要求1所述的用于检测SIM1基因甲基化靶区域的前后引物和探针；其中，用于检测SIM1基因甲基化靶区域的前后引物和探针的碱基序列为：
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒至少包括含有如权利要求1所述的用于检测DAW1基因甲基化靶区域的前后引物和探针；其中，用于检测DAW1基因甲基化靶区域的前后引物和探针的碱基序列为：
6.根据权利要求3所述的甲基化标志物，其特征在于，所述试剂盒至少包括含有如权利要求1所述的用于检测GABRA4基因甲基化靶区域的前后引物和探针；其中，用于检测GABRA4基因甲基化靶区域的前后引物和探针的碱基序列为：
7.根据权利要求4-6任意一项所述的应用，其特征在于，应用所述诊断产品对子宫内膜良恶性病变的标志物进行检测过程中，对目标基因甲基化诊断子宫内膜良恶性病变的结果判读的方式如下：
用ΔCt值反应特定基因靶区域的甲基化水平，其ΔCt值为：
ΔCtSIM1＝CtSIM1-Ct内参
ΔCtDAW1＝CtDAW1-Ct内参
ΔCtGABRA4＝CtGABRA4-Ct内参
其中，内参指内参基因，所述的内参基因选自β-actin基因、COL2A1基因或GAPDH基因中的任意一个。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，应用所述诊断产品对子宫内膜良恶性病变的标志物进行检测过程中，对因甲基化检测结果判读的方式如下：
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，应用所述诊断产品对子宫内膜良恶性病变的标志物进行检测过程中，采用SIM1基因甲基化和DAW1基因甲基化组合的双基因甲基化联合对子宫内膜良恶性病变的结果进行判读；
或者是，采用SIM1基因甲基化和GABRA4基因甲基化组合的双基因甲基化联合对子宫内膜良恶性病变的结果进行判读；
或者是，采用DAW1基因甲基化和GABRA4基因甲基化组合的双基因甲基化联合对子宫内膜良恶性病变的结果进行判读；
或者是，采用SIM1基因甲基化、DAW1基因甲基化和GABRA4基因甲基化组合的三基因甲基化联合对子宫内膜良恶性病变的结果进行判读。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，采用SIM1基因甲基化和DAW1基因甲基化组合的双基因甲基化联合对子宫内膜良恶性病变的结果进行判读的方式如下：
采用SIM1基因甲基化和GABRA4基因甲基化组合的双基因甲基化联合对子宫内膜良恶性病变的结果进行判读的方式如下：
采用DAW1基因甲基化和GABRA4基因甲基化组合的双基因甲基化联合对子宫内膜良恶性病变的结果进行判读的方式如下：
采用SIM1基因甲基化、DAW1基因甲基化和GABRA4基因甲基化组合的三基因甲基化联合对子宫内膜良恶性病变的结果进行判读的方式如下：
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