CN116875700A - 一种子宫内膜良恶性病变的生物标志物及其应用 - Google Patents

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CN116875700A CN202311058802.3A CN202311058802A CN116875700A CN 116875700 A CN116875700 A CN 116875700A CN 202311058802 A CN202311058802 A CN 202311058802A CN 116875700 A CN116875700 A CN 116875700A
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    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers

Abstract

本发明提供了一种子宫内膜良恶性病变的生物标志物及其应用，所述生物标志物至少包括ZBTB38基因至少一个靶区域内甲基化的核酸序列。将上述所述的子宫内膜良恶性病变的生物标志物应用在制备子宫内膜癌诊断产品中。本发明筛选出ZBTB38基因为检测目标基因(靶基因)，确定了各基因中最佳的甲基化区域，能够相互联合可用于子宫内膜癌的早期检测。由于子宫内膜癌种类多样，选择多基因甲基化区域联合检测，形成功能互补，显著提高对子宫内膜癌的诊断性能。该检测对子宫内膜癌及非典型增生的检出具有临床价值。

Description

一种子宫内膜良恶性病变的生物标志物及其应用
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，尤其涉及一种子宫内膜良恶性病变的生物标志物及其应用。
背景技术
子宫内膜癌(EC，Endometrial carcinoma)在全世界是多见的妇科癌症，在女性生殖系统癌症中发病率居第三，排在宫颈癌和卵巢癌之后。目前子宫内膜癌患病人数逐年增加，发病年龄在趋于年轻化，病死率居高不下。全球每年约有14.2万例妇女患子宫内膜癌,4.2万人死于该疾病。按照组织病理学特点与发病原因将子宫内膜癌分为Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型占子宫内膜癌患病总数的80％以上，多由增生期的内膜组织发展而来，属于激素依赖型，预后较好。Ⅱ型多是由处于分泌期的内膜组织发展而来，属于非激素依赖型，预后较差。子宫内膜非典型增生指的是子宫内膜的腺细胞，目前正处于从单纯性增生向子宫内膜癌发展的中间阶段。一旦女性做刮宫检查结果显示子宫内膜非典型增生，一定要引起重视，提示目前正处于癌前病变的状态。如果治疗不及时很容易发展成子宫内膜癌，危及到女性的生命健康。
子宫内膜癌诊断的金标准是子宫外转移灶或手术切除组织标本病理学检查，均为侵入式的，对患者造成一定的损伤。目前临床上缺乏早期发现子宫内膜癌的标记物，主要依赖于影像学检查、突变基因和相关蛋白的检测。文献报道，超声诊断对早期子宫内膜癌的灵敏度和特异度不高，假阴性占40％，并且受其他因素的干扰。两种类型子宫内膜癌致癌所涉及的基因突变包括数十种，最有效的检测方法是高通量测序，操作复杂，成本高，不适合子宫内膜癌的早期检测。蛋白的检测项目主要是糖链抗原CA125和人附睾蛋白HE4等等。许多妇科良性疾病会造成血清中CA125增加，造成过度诊疗；而仅11％-33％的子宫内膜癌患者血清CA125升高，容易漏诊。HE4除了在生殖系统的上皮中表达，也在呼吸系统等其他组织正常腺上皮中标的，所以HE4的特异性差。另外，早期的子宫内膜癌CA125和HE4表达不会发生改变，只有中晚期癌症中才表达水平增加。所以这些方法难以做到子宫内膜癌的早期检测。另外，子宫内膜的癌前病变状态非典型增生更是无有效的生物标记物。如果未早发现早治疗，错过最佳预防时机，容易发展成子宫内膜癌，甚至危及到女性的生命健康。国内子宫内膜癌发病率高，亟需高效早期检测的手段。
近年来的研究表明，表观遗传修饰最主要的形式DNA甲基化可以参与调控细胞的分化、增殖、侵袭等癌症发生相关的生命活动。子宫内膜癌早期往往伴随着相关基因的甲基化改变。基因启动子区域甲基化水平低，基因正常表达；甲基化水平高，基因表达抑制，甚至沉默。肿瘤抑制基因的甲基化水平在癌症早期就表达降低，可以实现早期子宫内膜癌的检测。
现有技术中针对子宫内膜癌早期检测存在以下不足：
①忽视子宫内膜非典型增生：子宫内膜非典型增生是子宫内膜癌前病变的状态，大约14％-30％左右的机率转化为子宫内膜癌。
②忽视子宫内膜癌不同类型：子宫内膜癌按组织病理学特点与发病原因将子宫内膜癌分为Ⅰ型和Ⅱ型。
③对子宫内膜的正常、非典型增生和内膜癌没有预测性的评估。
发明内容
本发明提供了一种子宫内膜良恶性病变的生物标志物及其应用，所述生物标志物至少包括ZBTB38基因至少一个靶区域内甲基化的核酸序列，其中，所述靶区域选自ZBTB38基因中以下任一一段甲基化序列及区域：
ZBTB38基因的Chr3:141130440-141130560区域；
ZBTB38基因的Chr3:141122572-141122691区域。
如上述所述的子宫内膜良恶性病变的生物标志物在制备子宫内膜癌诊断产品中的应用。
可选的，所述诊断产品包括试剂盒、制剂和芯片中的任意一种。
可选的，所述试剂盒至少包括用于检测ZBTB38基因的第一引物对和第一探针，所述第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述第一探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
或者，所述第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，所述第一探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
可选的，应用所述诊断产品对子宫内膜良恶性病变的生物标志物进行检测过程中，对基因甲基化诊断子宫内膜癌及非典型增生的结果判读的方式如下：
用ΔCp值反应特定基因靶区的甲基化水平，其ΔCp值为：
ΔCp(ZBTB38[1])＝Cp(ZBTB38[1])-Cp(COL2A1)，ΔCp(ZBTB38[2])＝Cp(ZBTB38[2])-Cp(COL2A1)；
因甲基化的ΔCp≤k则判读为甲基化阳性，即表示受检样本是子宫内膜癌及非典型增生或子宫内膜癌；基因甲基化的ΔCp＞k则判读为甲基化阴性，即表示受检样本不是子宫内癌及非典型增生或子宫内膜癌；其中k为一个特定的数值。
可选的，应用所述诊断产品对子宫内膜良恶性病变的生物标志物进行检测过程中，对子宫内膜病变预测判读的方式如下：
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明筛选出ZBTB38基因为检测目标基因(靶基因)，确定了各基因中最佳的甲基化区域，能够相互联合可用于子宫内膜癌的早期检测。由于子宫内膜癌种类多样，选择多基因甲基化区域联合检测，形成功能互补，显著提高对子宫内膜癌的诊断性能。该检测对子宫内膜癌及非典型增生的检出具有临床价值。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1(a)是本发明实验例1中ZBTB38[1](Chr3:141130440-141130560)甲基化值ΔCp在良性病变、子宫内膜非典型增生、子宫内膜癌的箱线图；
图1(b)是本发明实验例1中ZBTB38[2](Chr3:141122572-141122691)甲基化值ΔCp在良性病变、子宫内膜非典型增生、子宫内膜癌的箱线图；
图1(c)是本发明实验例1中GYPC[1](Chr2:127413772-127413893)甲基化值ΔCp在良性病变、子宫内膜非典型增生、子宫内膜癌的箱线图；
图1(d)是本发明实验例1中GYPC[2](Chr2:127413870-127413996)甲基化值ΔCp在良性病变、子宫内膜非典型增生、子宫内膜癌的箱线图；
图1(e)是本发明实验例1中ZSCAN12[1](Chr6:28367484-28367600)甲基化值ΔCp在良性病变、子宫内膜非典型增生、子宫内膜癌的箱线图；
图1(f)是本发明实验例1中ZSCAN12[2](Chr6:28367510-28367631)甲基化值ΔCp在良性病变、子宫内膜非典型增生、子宫内膜癌的箱线图；
图1(g)是本发明实验例1中LPP[2](Chr3:188157018-188157138)甲基化值ΔCp在良性病变、子宫内膜非典型增生、子宫内膜癌的箱线图；
图2(a)是本发明实验例1中ZBTB38[1](Chr3:141130440-141130560)基因甲基化诊断子宫内膜癌的受试者曲线；
图2(b)是本发明实验例1中ZBTB38[2](Chr3:141122572-141122691)基因甲基化诊断子宫内膜癌的受试者曲线；
图2(c)是本发明实验例1中GYPC[1](Chr2:127413772-127413893)基因甲基化诊断子宫内膜癌的受试者曲线；
图2(d)是本发明实验例1中GYPC[2](Chr2:127413870-127413996)基因甲基化诊断子宫内膜癌的受试者曲线；
图2(e)是本发明实验例1中ZSCAN12[1](Chr6:28367484-28367600)基因甲基化诊断子宫内膜癌的受试者曲线；
图2(f)是本发明实验例1中ZSCAN12[2](Chr6:28367510-28367631)基因甲基化诊断子宫内膜癌的受试者曲线；
图2(g)是本发明实验例1中LPP[2](Chr3:188157018-188157138)基因甲基化诊断子宫内膜癌的受试者曲线；
图3(a)是本发明实验例1中ZBTB38[1](Chr3:141130440-141130560)基因甲基化诊断子宫内膜癌及非典型增生的受试者曲线；
图3(b)是本发明实验例1中ZBTB38[2](Chr3:141122572-141122691)基因甲基化诊断子宫内膜癌及非典型增生的受试者曲线；
图3(c)是本发明实验例1中GYPC[1](Chr2:127413772-127413893)基因甲基化诊断子宫内膜癌及非典型增生的受试者曲线；
图3(d)是本发明实验例1中GYPC[2](Chr2:127413870-127413996)基因甲基化诊断子宫内膜癌及非典型增生的受试者曲线；
图3(e)是本发明实验例1中ZSCAN12[1](Chr6:28367484-28367600)基因甲基化诊断子宫内膜癌及非典型增生的受试者曲线；
图3(f)是本发明实验例1中ZSCAN12[2](Chr6:28367510-28367631)基因甲基化诊断子宫内膜癌及非典型增生的受试者曲线；
图3(g)是本发明实验例1中LPP[2](Chr3:188157018-188157138)基因甲基化诊断子宫内膜癌及非典型增生的受试者曲线；
图4(a)是本发明实验例2中ZBTB38[1](Chr3:141130440-141130560)甲基化值ΔCp在良性病变、子宫内膜非典型增生、子宫内膜癌的箱线图；
图4(b)是本发明实验例2中ZBTB38[2](Chr3:141122572-141122691)甲基化值ΔCp在良性病变、子宫内膜非典型增生、子宫内膜癌的箱线图；
图4(c)是本发明实验例2中GYPC[1](Chr2:127413772-127413893)甲基化值ΔCp在良性病变、子宫内膜非典型增生、子宫内膜癌的箱线图；
图4(d)是本发明实验例2中GYPC[2](Chr2:127413870-127413996)甲基化值ΔCp在良性病变、子宫内膜非典型增生、子宫内膜癌的箱线图；
图4(e)是本发明实验例2中ZSCAN12[1](Chr6:28367484-28367600)甲基化值ΔCp在良性病变、子宫内膜非典型增生、子宫内膜癌的箱线图；
图4(f)是本发明实验例2中ZSCAN12[2](Chr6:28367510-28367631)甲基化值ΔCp在良性病变、子宫内膜非典型增生、子宫内膜癌的箱线图；
图4(g)是本发明实验例2中LPP[2](Chr3:188157018-188157138)甲基化值ΔCp在良性病变、子宫内膜非典型增生、子宫内膜癌的箱线图；
图5(a)是本发明实验例2中ZBTB38[1](Chr3:141130440-141130560)甲基化诊断子宫内膜癌的受试者曲线；
图5(b)是本发明实验例2中ZBTB38[2](Chr3:141122572-141122691)甲基化诊断子宫内膜癌的受试者曲线；
图5(c)是本发明实验例2中GYPC[1](Chr2:127413772-127413893)甲基化诊断子宫内膜癌的受试者曲线；
图5(d)是本发明实验例2中GYPC[2](Chr2:127413870-127413996)甲基化诊断子宫内膜癌的受试者曲线；
图5(e)是本发明实验例2中ZSCAN12[1](Chr6:28367484-28367600)甲基化诊断子宫内膜癌的受试者曲线；
图5(f)是本发明实验例2中ZSCAN12[2](Chr6:28367510-28367631)甲基化诊断子宫内膜癌的受试者曲线；
图5(g)是本发明实验例2中LPP[2](Chr3:188157018-188157138)甲基化诊断子宫内膜癌的受试者曲线；
图6(a)是本发明实验例2中ZBTB38[1](Chr3:141130440-141130560)甲基化的诊断子宫内膜癌及非典型增生的受试者曲线；
图6(b)是本发明实验例2中ZBTB38[2](Chr3:141122572-141122691)甲基化的诊断子宫内膜癌及非典型增生的受试者曲线；
图6(c)是本发明实验例2中GYPC[1](Chr2:127413772-127413893)甲基化的诊断子宫内膜癌及非典型增生的受试者曲线；
图6(d)是本发明实验例2中GYPC[2](Chr2:127413870-127413996)甲基化的诊断子宫内膜癌及非典型增生的受试者曲线；
图6(e)是本发明实验例2中ZSCAN12[1](Chr6:28367484-28367600)甲基化的诊断子宫内膜癌及非典型增生的受试者曲线；
图6(f)是本发明实验例2中ZSCAN12[2](Chr6:28367510-28367631)甲基化的诊断子宫内膜癌及非典型增生的受试者曲线；
图6(g)是本发明实验例2中LPP[2](Chr3:188157018-188157138)甲基化的诊断子宫内膜癌及非典型增生的受试者曲线；
图7(a)是本发明实验例2中ZBTB38[1](Chr3:141130440-141130560)甲基化预测子宫内膜病变程度的堆叠图；
图7(b)是本发明实验例2中ZBTB38[2](Chr3:141122572-141122691)甲基化预测子宫内膜病变程度的堆叠图；
图7(c)是本发明实验例2中GYPC[1](Chr2:127413772-127413893)甲基化预测子宫内膜病变程度的堆叠图；
图7(d)是本发明实验例2中GYPC[2](Chr2:127413870-127413996)甲基化预测子宫内膜病变程度的堆叠图；
图7(e)是本发明实验例2中ZSCAN12[1](Chr6:28367484-28367600)甲基化预测子宫内膜病变程度的堆叠图；
图7(f)是本发明实验例2中ZSCAN12[2](Chr6:28367510-28367631)甲基化预测子宫内膜病变程度的堆叠图；
图7(g)是本发明实验例2中LPP[2](Chr3:188157018-188157138)甲基化预测子宫内膜病变程度的堆叠图；
图8是本发明实验例2中宫颈脱落细胞样本中ZBTB38[1](Chr3:141130440-141130560)、GYPC[1](Chr2:127413772-127413893)、ZSCAN12[2](Chr6:28367510-28367631)三基因甲基化预测子宫内膜病变程度的堆叠图。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与本发明的技术领域技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1：
本发明提供的用于子宫内膜癌早期筛查诊断(具体包括用于对子宫内膜非典型增生以及非典型增生或内膜癌的筛查诊断)的生物标志物，所述生物标志物至少包括ZBTB38基因、GYPC基因、ZSCAN12基因、LPP基因至少一个靶区域内甲基化的核酸序列，其中，所述靶区域选自ZBTB38基因、GYPC基因、ZSCAN12基因、LPP基因中每个基因中以下任意一段甲基化序列及区域如表1所示。
表1 ZBTB38基因、GYPC基因、ZSCAN12基因、LPP基因中的甲基化序列及区域
目标基因 甲基化序列及区域[1] 甲基化序列及区域[2]
ZBTB38 Chr3:141130440-141130560 Chr3:141122572-141122691
GYPC Chr2:127413772-127413893 Chr2:127413870-127413996
ZSCAN12 Chr6:28367484-28367600 Chr6:28367510-28367631
LPP Chr3:188157018-188157138
注：甲基化序列及区域后的[1]和[2]分别表示同一个基因不同的靶区。
需要说明的是，无论是用何种方法检测上述ZBTB38、GYPC、ZSCAN12、LPP基因任意一条链的全长或其中部分区域的甲基化用于子宫内膜癌的诊断，均属于本发明的保护范围。
针对上述目标基因及区域进行PCR扩增的引物探针设计：
将用于检测上述目标基因的试剂分为用于检测ZBTB38基因的第一试剂、用于检测GYPC基因的第二试剂、用于检测ZSCAN12基因的第三试剂以及用于检测LPP基因的第四试剂；其中：
第一试剂为适用于采用PCR法检测ZBTB38基因甲基化的试剂，第一试剂检测的第一靶区域为选自Chr3:141130440-141130560的部分区域，第一试剂检测的第二靶区域为选自Chr3:141122572-141122691的部分区域；
第二试剂为适用于采用PCR法检测GYPC基因甲基化的试剂，第二试剂检测的第一靶区域为选自Chr2:127413772-127413893的部分区域，第二试剂检测的第二靶区域为选自Chr2:127413870-127413996的部分区域；
第三试剂为适用于采用PCR法检测ZSCAN12基因甲基化的试剂，第三试剂检测的第一靶区域为选自Chr6:28367484-28367600的部分区域，第三试剂检测的第二靶区域为选自Chr6:28367510-28367631的部分区域；
第四试剂为适用于采用PCR法检测LPP基因甲基化的试剂，第四试剂检测的第二靶区域为选自Chr3:188157018-188157138的部分区域。
第一试剂包括第一引物对和第一探针，检测上述各种第一靶区域的第一引物对和第一探针的序列见表2所示；第二试剂包括第二引物对和第二探针，检测上述各种第二靶区域的第二引物对和第二探针的序列见表3所示；第三试剂包括第三引物对和第三探针，检测上述各种第三靶区域的第三引物对和第三探针的序列见表4所示；第四试剂包括第四引物对和第四探针，检测上述各种第四靶区域的第四引物对和第四探针的序列见表5所示。
表2检测ZBTB38基因甲基化的第一引物对和第一探针的碱基序列
具体的，ZBTB38[1](Chr3:141130440-141130560)选自UCSC Genome Browser onHuman(GRCh37/hg19)，>hg19_dna range＝chr3:141130440-1411305605'pad＝03'pad＝0strand＝+repeatMasking＝none中的DNA链：
AGTCTGCAAAAGCCATGACGTGGCACTGAAATGAAGCCCTGTGTAGGGTTTTACTCAGACGTTAGAGAACTGGCTGCCCCTGAGTGCTGTGCTAACTAGGGAAAGAAAAAAAACCCTGACC
将该DNA链进行重亚硫酸盐转换(未甲基化的C转换为T，甲基化的C保持不变)，得到转换后的DNA链：
AGTTTGTAAAAGTTATGACGTGGTATTGAAATGAAGTTTTGTGTAGGGTTTTATTTAGACGTTAGAGAA TTGGTTGTTTTTGAGTGTTGTGTTAATTAGGGAAAGAAAAAAAATTTTGATT
序列中下划线部分即为最终所得到的ZBTB38[1](Chr3:141130440-141130560)的引物探针的序列。
具体的，ZBTB38[2](Chr3:141122572-141122691)选自UCSC Genome Browser onHuman(GRCh37/hg19)，>hg19_dna range＝chr3:141122572-1411226915'pad＝03'pad＝0strand＝+repeatMasking＝none中的DNA链：
TTCTATAGCTGTAAAATGGGGGAATGTTCCCTACATCTGAAGGTTGTTATGAAGACAACACGAAACCACATATGTCAACCACTTTGTGGGTGTTTGACTTATGTGTTCAATATGTGCTAA
将该DNA链进行重亚硫酸盐转换(未甲基化的C转换为T，甲基化的C保持不变)，得到转换后的DNA链：
TTTTATAGTTGTAAAATGGGGGAATGTTTTTTATATTTGAAGGTTGTTATGAAGATAATACGAAATTATATATGTTAATTATTTTGTGGGTGTTTGATTTATGTGTTTAATATGTGTTAA
序列中下划线部分即为最终所得到的ZBTB38[2](Chr3:141122572-141122691)的引物探针的序列。
表3检测GYPC基因甲基化的第一引物对和第一探针的碱基序列
具体的，GYPC[1](Chr2:127413772-127413893)选自UCSC Genome Browser onHuman(GRCh37/hg19)，>hg19_dna range＝chr2:127413772-1274138935'pad＝03'pad＝0strand＝+repeatMasking＝none中的DNA链：
CCTCCCCCGGCCCGGCCTGGCCCGGCCTGGCCAGTCCCCGCGGTCTCTGCCCGGGCTGACGCCCAGGAATGTGGTCGACGAGAAGCCCCAACAGCACGGCGTGGCCTCTCAGCCTCGGTGAG
将该DNA链进行重亚硫酸盐转换(未甲基化的C转换为T，甲基化的C保持不变)，得到转换后的DNA链：
TTTTTTTCGGTTCGGTTTGGTTCGGTTTGGTTAGTTTTCGCGGTTTTTGTTCGGGTTGACGTTTAGGAA TGTGGTCGACGAGAAGTTTTAATAGTACGGCGTGGTTTTTTAGTTTCGGTGAG
序列中下划线部分即为最终所得到的GYPC[1](Chr2:127413772-127413893)的引物探针的序列。
具体的，GYPC[2](Chr2:127413870-127413996)选自UCSC Genome Browser onHuman(GRCh37/hg19)，>hg19_dna range＝chr2:127413870-1274139965'pad＝03'pad＝0strand＝+repeatMasking＝none中的DNA链：
GCGTGGCCTCTCAGCCTCGGTGAGTACCCGCCGTGGGGAAGGGTCCTGGGGACCCACTGGAGGCCGCGGCCCGCAGCAGCCAGGGGCCGAGCCACGGCCACGGACGCCCTGGTGTCCCGGTCCGTGC
根据所选取的上述DNA链找出其DNA互补链：
GCACGGACCGGGACACCAGGGCGTCCGTGGCCGTGGCTCGGCCCCTGGCTGCTGCGGGCCGCGGCCTCCAGTGGGTCCCCAGGACCCTTCCCCACGGCGGGTACTCACCGAGGCTGAGAGGCCACGC
将该DNA互补链进行重亚硫酸盐转换(未甲基化的C转换为T，甲基化的C保持不变)，得到转换后的DNA互补链：
GTACGGATCGGGATATTAGGGCGTTCGTGGTCGTGGTTCGGTTTTTGGTTGTTGCGGGTCGCGGTTTTTAGTGGGTTTTTAGGATTTTTTTTTACGGCGGGTATTTATCGAGGTTGAGAGGTTACGT
序列中下划线部分即为最终所得到的GYPC[2](Chr2:127413870-127413996)的引物探针的序列。
表4检测ZSCAN12基因甲基化的第一引物对和第一探针的碱基序列
具体的，ZSCAN12[1](Chr6:28367484-28367600)选自UCSC Genome Browser onHuman(GRCh37/hg19)，>hg19_dna range＝chr6:28367484-28367600 5'pad＝0 3'pad＝0strand＝+repeatMasking＝none中的DNA链：
GAGGCCTCGAACCCTTTTGGGACCCGGAACCCATCAAAAGTGACCCACAAAGGCCGGAAGCGGCCACGGGGGGTCTAAGAACCAGCCCGCGCGGGGCGCACTTCCGCGGCCGCTCTA
根据所选取的上述DNA链找出其DNA互补链：
TAGAGCGGCCGCGGAAGTGCGCCCCGCGCGGGCTGGTTCTTAGACCCCCCGTGGCCGCTTCCGGCCTTTGTGGGTCACTTTTGATGGGTTCCGGGTCCCAAAAGGGTTCGAGGCCTC
将该DNA互补链进行重亚硫酸盐转换(未甲基化的C转换为T，甲基化的C保持不变)，得到转换后的DNA互补链：
TAGAGCGGTCGCGGAAGTGCGTTTCGCGCGGGTTGGTTTTTAGATTTTTCGTGGTCGTTTTCGGTTTTT GTGGGTTATTTTTGATGGGTTTCGGGTTTTAAAAGGGTTCGAGGTTTT
序列中下划线部分即为最终所得到的ZSCAN12[1](Chr6:28367484-28367600)的引物探针的序列。
具体的，ZSCAN12[2](Chr6:28367510-28367631)选自UCSC Genome Browser onHuman(GRCh37/hg19)，>hg19_dna range＝chr6:28367510-28367631 5'pad＝0 3'pad＝0strand＝+repeatMasking＝none中的DNA链：
GAACCCATCAAAAGTGACCCACAAAGGCCGGAAGCGGCCACGGGGGGTCTAAGAACCAGCCCGCGCGGGGCGCACTTCCGCGGCCGCTCTAGGAAGGGAGCGAAAGGGGCTTTCAACTCGGT
根据所选取的上述DNA链找出其DNA互补链：
ACCGAGTTGAAAGCCCCTTTCGCTCCCTTCCTAGAGCGGCCGCGGAAGTGCGCCCCGCGCGGGCTGGTTCTTAGACCCCCCGTGGCCGCTTCCGGCCTTTGTGGGTCACTTTTGATGGGTTC
将该DNA互补链进行重亚硫酸盐转换(未甲基化的C转换为T，甲基化的C保持不变)，得到转换后的DNA互补链：
ATCGAGTTGAAAGTTTTTTTCGTTTTTTTTTTAGAGCGGTCGCGGAAGTGCGTTTCGCGCGGGTTGGTT TTTAGATTTTTCGTGGTCGTTTTCGGTTTTTGTGGGTTATTTTTGATGGGTTT
序列中下划线部分即为最终所得到的ZSCAN12[2](Chr6:28367510-28367631)的引物探针的序列。
表5检测LPP基因甲基化的第一引物对和第一探针的碱基序列
具体的，LPP[2](Chr3:188157018-188157138)选自UCSC Genome Browser onHuman(GRCh37/hg19)，>hg19_dna range＝chr3:188157018-1881571385'pad＝03'pad＝0strand＝+repeatMasking＝none中的DNA链：
CTATTAATAATGTTAAAGGGGGTTACAGCCGTGACTCACTCCAGGAAGTCAACCATCATTCGCTTCCTCAATCTCACCAACCAGTCCCCATGTACAAAATCAGCGACTTCTGCAAATGAGT
根据所选取的上述DNA链找出其DNA互补链：
ACTCATTTGCAGAAGTCGCTGATTTTGTACATGGGGACTGGTTGGTGAGATTGAGGAAGCGAATGATGGTTGACTTCCTGGAGTGAGTCACGGCTGTAACCCCCTTTAACATTATTAATAG
将该DNA互补链进行重亚硫酸盐转换(未甲基化的C转换为T，甲基化的C保持不变)，得到转换后的DNA互补链：
ATTTATTTGTAGAAGTCGTTGATTTTGTATATGGGGATTGGTTGGTGAGATTGAGGAAGCGAATGATGGTTGATTTTTTGGAGTGAGTTACGGTTGTAATTTTTTTTAATATTATTAATAG
序列中下划线部分即为最终所得到的ZSCAN12[2](Chr6:28367510-28367631)的引物探针的序列。
注：在表2-表5的目标基因名后[1]和[2]分别表示同一个基因的第一靶区域和第二靶区域，且表2-表5中所展示的探针序列未进行荧光基团标记和淬灭基团标记。
实施例2：
本发明提供的试剂盒用于检测子宫内膜癌抑癌ZBTB38基因、GYPC基因、ZSCAN12基因、LPP基因的检测试验方法，其包括如下步骤：
1、样本DNA提取
采用石蜡组织切片样本DNA提取试剂或脱落细胞样本DNA提取试剂，进行基因组DNA提取，同时进行DNA质量监控(得率、纯度、完整度)，DNA总量在1ug-10ug之间，OD260/280在1.9-2.0之间，DNA电泳凝胶在200bp以上提示得率、纯度比较好，可以进行下一步测试。
2、DNA重亚硫酸盐转化
采用申请人自主开发的重亚硫酸盐转化试剂盒即甲基化检测样本前处理试剂盒(湖南宏雅基因技术有限公司湘长械备20200131号)作为DNA重亚硫酸盐转化试剂，对提取号的DNA进行重亚硫酸盐转化，DNA中未甲基化的胞嘧啶(C，cytosine)转变未尿嘧啶(U，uracil)，而甲基化的胞嘧啶(C)不变，得到重亚硫酸盐转化后的DNA(B-DNA)。本实例中重亚硫酸盐的转化效率为99.7％-100.0％，高于市场上大多数中亚硫酸盐转化试剂盒。
3、甲基化特异荧光定量PCR扩增
配置荧光定量PCR反应体系(荧光定量PCR反应体系如表6所示)后按荧光定量PCR上机程序参数(荧光定量PCR上机程序参数如表7所示)进行荧光定量PCR反应。
表6荧光定量PCR反应体系(20ul/人份)
编号 组分 一人份加入量(uL)
1 Master Mix 10
2 侦测(引物探针)混合液 1
3 重亚硫酸盐转化后样本DNA 2
4 纯化水 补足至20uL
注：重亚硫酸盐转化后样本DNA，或阴性质控品，或阳性质控品。
表7荧光定量PCR上机程序参数
注：适配机型为罗氏实时荧光定量PCR仪LC480或赛默飞ABI7500实时荧光定量PCR仪。
4、基因甲基化结果判读
4.1、质量控制合格：内控基因呈S型扩增且LC480测试的Cp≤q(20≤q≤40)为在控；
4.2、用ΔCp值反应特定基因靶区的甲基化水平，4个基因的ΔCp值分别为：
ΔCp(ZBTB38[1])＝Cp(ZBTB38[1])-Cp(COL2A1)，ΔCp(ZBTB38[2])＝Cp(ZBTB38[2])-Cp(COL2A1)；
ΔCp(GYPC[1])＝Cp(GYPC[1])-Cp(COL2A1)，ΔCp(GYPC[2])＝Cp(GYPC[2])-Cp(COL2A1)；
ΔCp(ZSCAN12[1])＝Cp(ZSCAN12[1])-Cp(COL2A1)，ΔCp(ZSCAN12[2])＝Cp(ZSCAN12[2])-Cp(COL2A1)；
ΔCp(LPP[2])＝Cp(LPP[2])-Cp(COL2A1)。
注：若采用的是赛默飞ABI7500实时荧光定量PCR仪进行的PCR反应，则将赛默飞ABI7500实时荧光定量PCR仪中的Ct值替换为Cp值。
其中：Cp值为罗氏公司提出的，C代表Cycle，p代表point，Cp值即为每个反应管内扩增曲线穿过阈值的循环数(即，荧光检测值显著增加的点)；
ΔCp值为靶标基因和相应的内参基因Cp值的差值。
Ct值为赛默飞公司提出的，C代表Cycle，t代表threshold，Ct值即为每个反应管内荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
4.3、基因甲基化诊断子宫内膜癌及非典型增生的结果如表8所示。
表8基因甲基化诊断子宫内膜癌及非典型增生的结果判读
编号 基因靶区 临界值 判读 临界值 判读 取值范围
0 COL2A1 Cp≤q 在控 Cp＞q或未起峰 失控 20≤q≤40
1 ZBTB38[1] ΔCp＞k1 阴性 ΔCp≤k1 阳性 4≤k1≤12
2 ZBTB38[2] ΔCp＞k2 阴性 ΔCp≤k2 阳性 5≤k2≤19
3 GYPC[1] ΔCp＞k3 阴性 ΔCp≤k3 阳性 5≤k3≤16
4 GYPC[2] ΔCp＞k4 阴性 ΔCp≤k4 阳性 4≤k4≤16
5 ZSCAN12[1] ΔCp＞k5 阴性 ΔCp≤k5 阳性 4≤k5≤18
6 ZSCAN12[2] ΔCp＞k6 阴性 ΔCp≤k6 阳性 4≤k6≤17
7 LPP[2] ΔCp＞k7 阴性 ΔCp≤k7 阳性 4≤k7≤19
注：基因甲基化的ΔCp≤k(k为一个特定的数值)则判读为甲基化阳性，即表示受检样本是子宫内膜癌及非典型增生或子宫内膜癌；基因甲基化的ΔCp＞k则判读为甲基化阴性，即表示受检样本不是子宫内膜癌及非典型增生或子宫内膜癌。
4.4、子宫内膜病变预测判读
表9基因甲基化水平分为低度、中度和高度甲基化的取值范围
4.5多基因联合预测子宫内膜病变判读如表10所示。
表10多基因联合预测子宫内膜病变判读
注：①ZBTB38[1]、GYPC[1]、ZSCAN12[2]分别代表甲基化水平，低度甲基化取值0，中度甲基化取值为1，高度甲基化取值为2，代入公式运算；
②MV是ZBTB38[1]、GYPC[1]、ZSCAN12[2]甲基化联合预测子宫内膜病变的预测值计算。
实验例1：
基于石蜡组织切片标本进行子宫内膜癌基因甲基化检测的具体过程如下：
选取已知明确病理信息结果的96例子宫内膜癌石蜡组织切片样本：20例为子宫内膜良性样本；30例为子宫内膜非典型增生样本；46例子宫内膜癌样本，其中38例为Ⅰ型子宫内膜癌和8例为Ⅱ型子宫内膜癌。按样本DNA提取、DNA重亚硫酸盐转化和甲基化特异荧光定量PCR扩增，基因甲基化在样本中的分布参见图1(a)-图1(g)所示，NS：P＞0.05，无显著差异；*：0.01＜P＜0.05；**：0.001＜P＜0.01；***：P＜0.001。
本发明的引物探针试剂对子宫内膜癌的鉴定能力参见图2(a)-图2(g)所示(其中：AUC表示为受试者工作曲线下面积)，分析如下：
ZBTB38[1](Chr3:141130440-141130560)甲基化测试鉴定子宫内膜癌的受试者工作曲线ROC的面积(AUC)为0.910。
ZBTB38[2](Chr3:141122572-141122691)甲基化测试鉴定子宫内膜癌的受试者工作曲线ROC的面积(AUC)为0.883。
GYPC[1](Chr2:127413772-127413893)甲基化测试鉴定子宫内膜癌的受试者工作曲线ROC的面积(AUC)为0.928。
GYPC[2](Chr2:127413870-127413996)甲基化测试鉴定子宫内膜癌的受试者工作曲线ROC的面积(AUC)为0.895。
ZSCAN12[1](Chr6:28367484-28367600)甲基化测试鉴定子宫内膜癌的受试者工作曲线ROC的面积(AUC)为0.906。
ZSCAN12[2](Chr6:28367510-28367631)甲基化测试鉴定子宫内膜癌的受试者工作曲线ROC的面积(AUC)为0.897。
LPP[2](Chr3:188157018-188157138)甲基化测试鉴定子宫内膜癌的受试者工作曲线ROC的面积(AUC)为0.881。
石蜡组织切片标本中，本发明的引物探针试剂对子宫内膜癌及非典型增生的鉴定能力参见图3(a)-图3(g)所示，分析如下：
ZBTB38[1](Chr3:141130440-141130560)甲基化测试鉴定子宫内膜癌及非典型增生的受试者工作曲线ROC的面积(AUC)为0.995；该基因靶区甲基化测试结果阴阳性的临界值为ΔCp＝8.0，ΔCp≤8.0，判读为阳性；在子宫内膜癌标本中的阳性率为100.0％(46/46)，在子宫内膜非典型增生标本中的阳性率为83.3％(25/30)，在子宫内膜良性标本中的阳性率为0.0％(0/20)。
ZBTB38[2](Chr3:141122572-141122691)甲基化测试鉴定子宫内膜癌及非典型增生的受试者工作曲线ROC的面积(AUC)为0.886；该基因靶区甲基化测试结果阴阳性的临界值为ΔCp＝15.0，ΔCp≤15.0，判读为阳性；在子宫内膜癌标本中的阳性率为100.0％(46/46)，在子宫内膜非典型增生标本中的阳性率为60.0％(18/30)，在子宫内膜良性标本中的阳性率为5.0％(1/20)。
GYPC[1](Chr2:127413772-127413893)甲基化测试鉴定子宫内膜癌及非典型增生的受试者工作曲线ROC的面积(AUC)为1.000；该基因靶区甲基化测试结果阴阳性的临界值为ΔCp＝11.5，ΔCp≤11.5，判读为阳性；在子宫内膜癌标本中的阳性率为100.0％(46/46)，在子宫内膜非典型增生标本中的阳性率为100.0％(30/30)，在子宫内膜良性标本中的阳性率为0.0％(0/20)。
GYPC[2](Chr2:127413870-127413996)甲基化测试鉴定子宫内膜癌及非典型增生的受试者工作曲线ROC的面积(AUC)为0.983；该基因靶区甲基化测试结果阴阳性的临界值为ΔCp＝11.0，ΔCp≤11.0，判读为阳性；在子宫内膜癌标本中的阳性率为97.8％(45/46)，在子宫内膜非典型增生标本中的阳性率为90.0％(27/30)，在子宫内膜良性标本中的阳性率为5.0％(1/20)。
ZSCAN12[1](Chr6:28367484-28367600)甲基化测试鉴定子宫内膜癌及非典型增生的受试者工作曲线ROC的面积(AUC)为0.896；该基因靶区甲基化测试结果阴阳性的临界值为ΔCp＝15.2，ΔCp≤15.2，判读为阳性；在子宫内膜癌标本中的阳性率为100.0％(46/46)，在子宫内膜非典型增生标本中的阳性率为60.0％(18/30)，在子宫内膜良性标本中的阳性率为0.0％(0/20)。
ZSCAN12[2](Chr6:28367510-28367631)甲基化测试鉴定子宫内膜癌及非典型增生的受试者工作曲线ROC的面积(AUC)为0.999；该基因靶区甲基化测试结果阴阳性的临界值为ΔCp＝9.2，ΔCp≤9.2，判读为阳性；在子宫内膜癌标本中的阳性率为97.8％(45/46)，在子宫内膜非典型增生标本中的阳性率为100.0％(30/30)，在子宫内膜良性标本中的阳性率为0.0％(0/20)。
LPP[2](Chr3:188157018-188157138)甲基化测试鉴定子宫内膜癌及非典型增生的受试者工作曲线ROC的面积(AUC)为0.942；该基因靶区甲基化测试结果阴阳性的临界值为ΔCp＝15.2，ΔCp≤15.2，判读为阳性；在子宫内膜癌标本中的阳性率为100.0％(46/46)，在子宫内膜非典型增生标本中的阳性率为70％(21/30)，在子宫内膜良性标本中的阳性率为5.0％(1/20)。
实验例2：
基于宫颈脱落细胞样本进行子宫内膜癌基因甲基化检测的具体过程如下：
选取已知明确病理信息结果的150例宫颈脱落细胞样本：57例为正常样本；19例为子宫内膜非典型增生样本；74例子宫内膜癌样本，其中58例为Ⅰ型子宫内膜癌和16例为Ⅱ型子宫内膜癌。按样本DNA提取、DNA重亚硫酸盐转化和甲基化特异荧光定量PCR扩增，基因甲基化在子宫内膜不同病变程度的宫颈脱落细胞中的分布参见图4(a)-图4(g)所示，其中：NS：P＞0.05，无显著差异；*：0.01＜P＜0.05；**：0.001＜P＜0.01；***：P＜0.001。
本发明的引物探针试剂对子宫内膜癌和子宫内膜癌及非典型增生的鉴定能力参见图5(a)-图5(g)以及图6(a)-图6(g)所示，分析如下：
ZBTB38[1](Chr3:141130440-141130560)甲基化测试鉴定子宫内膜癌的受试者工作曲线ROC的面积(AUC)为0.955。
ZBTB38[2](Chr3:141122572-141122691)甲基化测试鉴定子宫内膜癌的受试者工作曲线ROC的面积(AUC)为0.940。
GYPC[1](Chr2:127413772-127413893)甲基化测试鉴定子宫内膜癌的受试者工作曲线ROC的面积(AUC)为0.950。
GYPC[2](Chr2:127413870-127413996)甲基化测试鉴定子宫内膜癌的受试者工作曲线ROC的面积(AUC)为0.938。
ZSCAN12[1](Chr6:28367484-28367600)甲基化测试鉴定子宫内膜癌的受试者工作曲线ROC的面积(AUC)为0.942。
ZSCAN12[2](Chr6:28367510-28367631)甲基化测试鉴定子宫内膜癌的受试者工作曲线ROC的面积(AUC)为0.950。
LPP[2](Chr3:188157018-188157138)甲基化测试鉴定子宫内膜癌的受试者工作曲线ROC的面积(AUC)为0.942。
ZBTB38[1](Chr3:141130440-141130560)甲基化测试鉴定子宫内膜癌及非典型增生的受试者工作曲线ROC的面积(AUC)为0.976。
ZBTB38[2](Chr3:141122572-141122691)甲基化测试鉴定子宫内膜癌的受试者工作曲线ROC的面积(AUC)为0.958。
GYPC[1](Chr2:127413772-127413893)甲基化测试鉴定子宫内膜癌及非典型增生的受试者工作曲线ROC的面积(AUC)为0.975。
GYPC[2](Chr2:127413870-127413996)甲基化测试鉴定子宫内膜癌及非典型增生的受试者工作曲线ROC的面积(AUC)为0.952。
ZSCAN12[1](Chr6:28367484-28367600)甲基化测试鉴定子宫内膜癌及非典型增生的受试者工作曲线ROC的面积(AUC)为0.943。
ZSCAN12[2](Chr6:28367510-28367631)甲基化测试鉴定子宫内膜癌及非典型增生的受试者工作曲线ROC的面积(AUC)为0.990。
LPP[2](Chr3:188157018-188157138)甲基化测试鉴定子宫内膜癌及非典型增生的受试者工作曲线ROC的面积(AUC)为0.938。
可选的，基因甲基化根据实验例1所取临界值在子宫内膜不同病变宫颈脱落细胞中的阳性率参见表11。
表11宫颈脱落细胞中基因甲基化在病理类型中的阳性率
可选的，本发明的7对引物探针试剂按实验例1取的临界值对子宫内膜癌和子宫内膜癌及非典型增生的临床诊断性能参见表12所示。
表12宫颈脱落细胞中基因甲基化诊断子宫内膜癌及非典型增生的临床性能
可选的，根据ZBTB38[1](Chr3:141130440-141130560)、ZBTB38[2](Chr3:141122572-141122691)、GYPC[1](Chr2:127413772-127413893)、GYPC[2](Chr2:127413870-127413996)、ZSCAN12[1](Chr6:28367484-28367600)、ZSCAN12[2](Chr6:28367510-28367631)、LPP[2](Chr3:188157018-188157138)的各最佳临界值进行两个基因联合检测，根据实验例1的临界值取值，选取ZBTB38[1]、GYPC[1]、GYPC[2]、ZSCAN12[2]四个靶区域联合检测，对子宫内膜癌和子宫内膜癌及非典型增生的临床性能分析如表13和表14的结果。
表13宫颈脱落细胞中双基因甲基化联合诊断子宫内膜癌及非典型增生的临床性能
表14宫颈脱落细胞中双基因甲基化联合诊断子宫内膜癌的临床性能
其中：表示中的或为：信任阳性，任一阳性结果判读为阳性，双阴性结果判读为阴性；表示中的和为：信任阴性，任一阴性结果判读为阴性，双阳性结果判读为阳性。
可选的，根据ZBTB38[1](Chr3:141130440-141130560)、ZBTB38[2](Chr3:141122572-141122691)、GYPC[1](Chr2:127413772-127413893)、GYPC[2](Chr2:127413870-127413996)、ZSCAN12[1](Chr6:28367484-28367600)、ZSCAN12[2](Chr6:28367510-28367631)、LPP[2](Chr3:188157018-188157138)的各最佳临界值进行三个基因联合检测，根据实验例1的临界值取值，选取ZBTB38[1]、GYPC[1]、GYPC[2]、ZSCAN12[2]四个靶区域联合检测，对子宫内膜癌和子宫内膜癌及非典型增生的临床性能分析如表15和表16的结果。
表15宫颈脱落细胞中三基因甲基化联合诊断子宫内膜癌及非典型增生的临床性能
表16宫颈脱落细胞中三基因甲基化联合诊断子宫内膜癌的临床性能
可选的，根据ZBTB38[1](Chr3:141130440-141130560)、ZBTB38[2](Chr3:141122572-141122691)、GYPC[1](Chr2:127413772-127413893)、GYPC[2](Chr2:127413870-127413996)、ZSCAN12[1](Chr6:28367484-28367600)、ZSCAN12[2](Chr6:28367510-28367631)、LPP[2](Chr3:188157018-188157138)的各最佳临界值进行四个基因联合检测，根据实验例临界值取值，选取ZBTB38[1]、GYPC[1]、GYPC[2]、ZSCAN12[2]四个靶区域联合检测，对子宫内膜癌和子宫内膜癌及非典型增生的临床性能分析如表17结果。
表17宫颈脱落细胞中四基因甲基化联合诊断子宫内膜癌及非典型增生的临床性
可选的，根据ZBTB38[1](Chr3:141130440-141130560)、ZBTB38[2](Chr3:141122572-141122691)、GYPC[1](Chr2:127413772-127413893)、GYPC[2](Chr2:127413870-127413996)、ZSCAN12[1](Chr6:28367484-28367600)、ZSCAN12[2](Chr6:28367510-28367631)、LPP[2](Chr3:188157018-188157138)甲基化值ΔCp在不同子宫内膜病变(正常或良性病变、非典型增生、子宫内膜癌)的分布具有显著性差异(参见图1(a)-图1(g)以及图4(a)-图4(g)所示)，每个基因靶区域取两个合适的临界值后，各基因预测子宫内膜病变程度参见图7(a)-图7(g)所示。
可选的，根据ZBTB38[1](Chr3:141130440-141130560)、ZBTB38[2](Chr3:141122572-141122691)、GYPC[1](Chr2:127413772-127413893)、GYPC[2](Chr2:127413870-127413996)、ZSCAN12[1](Chr6:28367484-28367600)、ZSCAN12[2](Chr6:28367510-28367631)、LPP[2](Chr3:188157018-188157138)甲基化值ΔCp在不同子宫内膜病变(正常或良性病变、非典型增生、子宫内膜癌)的分布具有显著性差异(参见图1(a)-图1(g)以及图4(a)-图4(g)所示)，每个基因靶区域取两个合适的临界值后，可两个、三个、四个基因联合预测子宫内膜病变程度，实验例2选取ZBTB38[1]、GYPC[1]、ZSCAN12[2]三个基因联合根据图7(a)-图7(g)临界值取值，构建联合预测值MV预测子宫内膜病变程度的能力见图8所示，MV预测正常患者的准确率为98.2％，预测子宫内膜非典型增生的准确率为68.4％，预测子宫内膜癌的准确率为93.3％；其中：MV＝w1×ZBTB38[1]+w2×GYPC[1]+w3×ZSCAN12[2]，其中w1＝3.27，w2＝2.74,w3＝4.14。
本发明相对于现有技术具有的优势包括：
①针对子宫内膜癌差异甲基化基因，设计开发更加高效的引物探针；
②单个基因在子宫内膜石蜡组织标本和宫颈脱落细胞标本中的诊断子宫内膜癌症具有很高的AUC，同时对子宫内膜非典型增生有很好的检出率；
③基因联合，对不同子宫内膜癌的检出具有互补性，不仅早期检测EC，对非典型增生也具预测价值，提高对临床的应用价值。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种子宫内膜良恶性病变的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物至少包括ZBTB38基因至少一个靶区域内甲基化的核酸序列，其中，所述靶区域选ZBTB38基因中以下任一一段甲基化序列及区域：
ZBTB38基因的Chr3:141130440-141130560区域；
ZBTB38基因的Chr3:141122572-141122691区域。
2.权利要求1所述的子宫内膜良恶性病变的生物标志物在制备子宫内膜癌诊断产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述诊断产品包括试剂盒、制剂和芯片中的任意一种。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒至少包括用于检测ZBTB38基因的第一引物对和第一探针，所述第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述第一探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
或者，所述第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，所述第一探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，应用所述诊断产品对子宫内膜良恶性病变的生物标志物进行检测过程中，对基因甲基化诊断子宫内膜癌及非典型增生的结果判读的方式如下：
用ΔCp值反应特定基因靶区的甲基化水平，其ΔCp值为：
ΔCp(ZBTB38[1])＝Cp(ZBTB38[1])-Cp(COL2A1)，ΔCp(ZBTB38[2])＝Cp(ZBTB38[2])-Cp(COL2A1)；
因甲基化的ΔCp≤k则判读为甲基化阳性，即表示受检样本是子宫内膜癌及非典型增生或子宫内膜癌；基因甲基化的ΔCp＞k则判读为甲基化阴性，即表示受检样本不是子宫内癌及非典型增生或子宫内膜癌；其中k为一个特定的数值。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，应用所述诊断产品对子宫内膜良恶性病变的生物标志物进行检测过程中，对子宫内膜病变预测判读的方式如下：
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