CN117210564A - 一种子宫内膜癌的生物标志物、探针引物组合和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子诊断领域，涉及一种用于子宫内膜癌诊断的生物标志物、探针引物组合和试剂盒。本发明采用对子宫内膜癌相关基因AJAP1，BHLHE22，CDO1，CELF4，GALR1，HS3ST2，MAGI2，ZNF454中的一种或多种基因的甲基化水平进行检测的方法，实现了对子宫内膜癌的辅助诊断和早期子宫内膜癌无创筛查；通过定位子宫内膜癌相关甲基化基因的靶区域，以及采用不同子宫内膜癌相关甲基化基因的组合，有效避免了子宫内膜癌相关甲基化标志物的不确定性和局限性，并提高了检测的准确性和特异性。并且，本发明的试剂盒可以检测通过无创手段获取的生物样品，提升了受试者的依从性。
Description
技术领域
本发明属于分子诊断领域，涉及一种用于子宫内膜癌诊断的生物标志物、探针引物组合和试剂盒。
背景技术
子宫内膜癌是女性生殖道三大常见恶性肿瘤之一，多发生于围绝经期及绝经后妇女。随着人口平均寿命的增加以及生活习惯的改变，子宫内膜癌的发病率近20年呈持续上升和年轻化趋势，尽管所有年龄组的新发病例均有增加，但是40岁以下病例增加一倍。2020年全球癌症统计数据显示，当年估计新增41.7万子宫内膜癌病例，在西方国家，子宫内膜癌已位居女性生殖系统恶性肿瘤发病率首位。在我国，子宫内膜癌作为继宫颈癌之后第二常见的妇科恶性肿瘤，约占妇科恶性肿瘤的20％～30％。部分发达城市(例如北京、上海、广州)的子宫内膜癌发病率已达妇科恶性肿瘤第一位，对女性的生育能力及健康造成严重影响。
绝大多数子宫内膜癌病人有绝经后阴道出血的临床表现，但是只有极少数绝经后阴道出血的病人被诊断为子宫内膜癌。子宫内膜癌患者的预后与肿瘤分期显著相关，FIGO分期I期的子宫内膜癌患者5年生存率为92％，而IV期的患者只有不到14％，因此，要想解决子宫内膜癌防治的诸多问题，最重要是建立和完善子宫内膜癌筛查及早诊体系。
目前临床上缺乏敏感性和特异性较高，并且可被患者和医生接受的子宫内膜癌筛查方法。现有的筛查方法主要有以下几种：(1)子宫颈巴氏涂片检查(Pap test)，对于子宫内膜癌的敏感性仅为40％-55％；(2)液基细胞学涂片，敏感性60％-65％；(3)经阴道超声检查，存在敏感性高、特异性差的特点；(4)子宫内膜活检或宫腔镜检查，为侵人性检查，对人体伤害较大，不适合用来作为子宫内膜癌的筛查；(5)子宫内膜脱落细胞学检查，样本处理制备过程繁琐，缺乏统一的判读标准，灵敏度、特异性也不高。因此，寻找新的无创、精确的子宫内膜癌筛查方法是当前临床上亟待解决的问题。
近年的研究显示DNA甲基化水平异常是肿瘤发生的早期事件，癌细胞中DNA甲基化模式较正常细胞明显不同，DNA总体甲基化水平(即甲基化谱)和特定基因甲基化程度改变可作为肿瘤诊断的标志物。越来越多的研究显示，甲基化分子标志物在肿瘤检测的敏感性上高于基因突变，拷贝数变异以及基因重排等分子变异，并且在组织溯源的准确率上高于其他分子变异，使其成为兼具灵敏度、特异性的理想肿瘤早期诊断靶标。目前研究显示，单基因甲基化检测在子宫内膜癌无创筛查中检出灵敏度均不高，而多基因甲基化的联合检测在子宫内膜癌组织、宫腔灌洗液、宫腔脱落细胞、宫颈脱落细胞、阴道脱落细胞等样本中均具有较高的的检出率，并且较单一基因甲基化检测灵敏度、特异性更高，可作为一种理想的子宫内膜癌早期诊断方法。
发明内容
本发明的目的之一，是提供一种用于子宫内膜癌辅助诊断的生物标志物、探针引物组合和检测试剂盒，可以弥补现有的子宫内膜癌诊断产品的灵敏度或特异性不够的问题，实现子宫内膜癌的早筛早诊。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种用于子宫内膜癌辅助诊断的生物标志物、探针引物组合和检测试剂盒，；所述引物对和荧光探针组合用于对亚硫酸盐处理后的子宫内膜癌相关基因的靶区域进行荧光定量PCR扩增；所述子宫内膜癌相关基因为AJAP1，BHLHE22，CDO1，CELF4，GALR1，HS3ST2，MAGI2，ZNF454中的一种或多种。
作为本发明的一种优选实施方式，所述子宫内膜癌相关基因为AJAP1，BHLHE22，CDO1，CELF4，GALR1，HS3ST2，MAGI2，ZNF454中的至少两种。
更加优选地，所述子宫内膜癌相关基因为AJAP1，BHLHE22，CDO1，CELF4，GALR1，HS3ST2，MAGI2，ZNF454中的至少三种。
最优选地，所述子宫内膜癌相关基因至少包括CDO1和AJAP1。
具体的，在上述技术方案中，所述子宫内膜癌相关基因的靶区域位置如下所示：
所述AJAP1基因检测靶区域选自GRCh38：1：4652609-4655609的全长区域或部分区域；
所述BHLHE22基因检测靶区域选自GRCh38：8：64578365-64581365的全长区域或部分区域；
所述CDO1基因检测靶区域选自GRCh38：5：115815659-115818659的全长区域或部分区域；
所述CELF4基因检测靶区域选自GRCh38：18：37564798-37567798的全长区域或部分区域；
所述GALR1基因检测靶区域选自GRCh38：18：77247848-77250848的全长区域或部分区域；
所述HS3ST2基因检测靶区域选自GRCh38：16：22812162-22815162的全长区域或部分区域；
所述MAGI2基因检测靶区域选自GRCh38：7：79452667-79455667的全长区域或部分区域；
所述ZNF454基因检测靶区域选自GRCh38：5：178939198—178942198的全长区域或部分区域。
优选地，所述子宫内膜癌相关基因的两个靶区域位置具体如下所示：
AJAP1基因的两个靶区域的序列分别为GRCh38：1：4654906-4655061和GRCh38：1：4653837-4654023；
BHLHE22基因的两个靶区域的序列分别为GRCh38：8：64580654-64580841和GRCh38：8：64581078-64581250；
CDO1基因的两个靶区域的序列分别为GRCh38：5：115816271-115816079和GRCh38：5∶115816963—115816773；
CELF4基因的两个靶区域的序列分别为GRCh38：18：37566303-37566104和GRCh38：18：37567415—37567273；
GALR1基因的两个靶区域的序列分别为GRCh38：18：77250102-77250301和GRCh38：18：77249620-77249799；
HS3ST2基因的两个靶区域的序列分别为GRCh38：16：22813619-22813818和GRCh38：16：22814109-22814248；
MAGI2基因的两个靶区域的序列分别为GRCh38：7：79454097-79453898和GRCh38：7：79454286-79454103；
ZNF454基因的两个靶区域的序列分别为GRCh38：5：178940548—178940736和GRCh38：5：178941256—178941430。
针对不同子宫内膜癌相关基因的不同靶区域，采用不同的引物对和荧光探针组合进行检测。可以理解的是，所述引物对和荧光探针组合与对应的子宫内膜癌相关甲基化基因的经亚硫酸盐处理后的检测靶区域的序列互补。
优选地，对于所述的8种子宫内膜癌相关基因的靶区域，本发明提供了16种引物对和荧光探针组合，具体情况如表1所示。可以理解的是，所述检测试剂盒中至少包括表1中的一种组合，更加优选地，所述检测试剂盒中至少包括表1中的二种组合。
表1：子宫内膜癌相关基因的引物和探针组合
进一步地，在上述技术方案中，所述荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，所述荧光探针的3’端标记有荧光淬灭基团。
优选地，所述荧光报告基团为FAM、ROX、VIC、JOE、CY3、CY5、NED、TAMRA和TEXAS RED中的任意一种所述荧光淬灭基团为AMRA、DABCYL、ECLIPSE、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3和结合分子沟的非荧光淬灭剂(MGB)中的任意一种。
更加优选地，所述荧光报告基团为FAM、ROX、VIC、CY5中的至少两种，所述荧光淬灭基团为BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、MGB中的至少一种。
进一步地，在上述技术方案中，所述检测试剂盒还包括ACTB引物对和荧光探针组合，所述ACTB为内参基因，该组合用于扩增所述人源生物样品中经亚硫酸盐处理后的ACTB基因保守序列。
优选地，所述ACTB引物对和荧光探针组合的具体情况如表2所示：
表2：ACTB引物和探针组合
进一步地，在上述技术方案中，所述检测试剂盒的PCR反应体系包括如下组分：PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+离子、引物探针组合、纯化水。具体地，所述引物探针组合包括组合1～16中的至少一个以及组合17。
进一步地，在上述技术方案中，所述人源生物样品包括但不限于组织、血液、血浆、血清、宫颈脱落细胞和宫腔脱落细胞等。
优选地，所述人源生物样品为宫颈脱落细胞或宫腔脱落细胞。
更加优选地，所述人源生物样品为宫腔脱落细胞。
进一步地，在上述技术方案中，所述检测试剂盒中包含有阴性质控品和阳性质控品。
优选地，所述阴性质控品为纯化水、检测靶区域甲基化阴性的细胞DNA经亚硫酸盐转化后的bisDNA或人工合成的检测靶区域甲基化阴性的质粒中的任意一种。
优选地，所述阳性质控品为检测靶区域序列甲基化阳性的细胞DNA经亚硫酸盐转化后的bisDNA或人工合成的检测靶甲基化阳性的质粒中的任意一种。
进一步地，在上述技术方案中，所述检测试剂盒中还可以包括说明书，所述说明书用于阐述所述检测试剂盒的使用方法，以及对检测结果进行判断说明的方法。
优选地，所述说明书的内容包括：采用logistic回归的统计方法，针对不同甲基化基因靶序列或组合构建诊断模型，设定不同的cutoff值；根据检测结果，对受试者罹患子宫内膜癌的风险进行预测和评估。
优选地，所述检测试剂盒的使用方法可以参照以下步骤：
对待测样品进行处理得到bisDNA溶液，然后用试剂盒中的引物对和荧光探针组合进行甲基化检测，同时检测阳性质控品和阴性质控品；所述引物对和荧光探针组合包括组合1～16中的至少一个以及组合17；
使用检测试剂盒中的说明书分析检测样品子宫内膜癌相关基因靶序列的甲基化情况。
本发明的有益效果：本发明采用对子宫内膜癌相关基因AJAP1，BHLHE22，CDO1，CELF4，GALR1，HS3ST2，MAGI2，ZNF454中的一种或多种基因的甲基化水平进行检测的方法，实现了对子宫内膜癌的辅助诊断和早期子宫内膜癌无创筛查；通过定位子宫内膜癌相关甲基化基因的靶区域，以及采用不同子宫内膜癌相关甲基化基因的组合，有效避免了子宫内膜癌相关甲基化标志物的不确定性和局限性，并提高了检测的准确性和特异性。而且，本发明试剂盒可以检测通过无创手段获取的生物样品，提升了受试者的依从性。因此，本发明提供的试剂盒可以实现子宫内膜癌的早诊早治，提高患者生存率，具有良好的临床应用前景。
附图说明
图1为实施例2中的检测试剂盒检测结果与临床结果比对所得ROC曲线图；
图2为实施例3中8个甲基化基因检测结果与临床结果此对所得ROC曲线图；图3为实施例3中较优选组合标志物检测结果与临床结果此对所得ROC曲线。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明选取了8种子宫内膜癌相关甲基化基因标志物，具体为AJAP1，BHLHE22，CDO1，CELF4，GALR1，HS3ST2，MAGI2，ZNF454，并为每个标志物都提供了两个靶区域。进一步地，针对不同标志物的不同靶序列，分别设计了16个引物对和荧光探针组合。本发明提供的检测试剂盒包括16个组合中的至少一个组合；优选地，检测试剂盒包括16个组合中的至少两个组合，且两个组合最好来自不同的标志物。
针对上述检测试剂盒，本发明在某一具体的实施方式中采用logistic回归分析方式构建多标志物联合诊断模型来检测子宫内膜癌。通过将样本分成病例组和对照组，用SPSS软件对检测数据和临床结果进行logistic分析，得出每个标志物的回归系数和一个偏差常数，即得到相应的logistic回归方程。再将每个标志物的检测Ct值代入logistic回归方程中，根据logistic分数公式计算相应的逻辑分数，用SPSS软件对逻辑分数和临床结果进行ROC曲线分析，选择95％置信区间内最佳的cutoff值。
下述实施例中，未注明仪器、耗材和试剂，均为可通过市售购买的常规产品。
实施例1一种检测试剂盒
本实施例提供的检测试剂盒选择AJAP1、CDO1和ZNF454三个基因标志物中各一个靶区域作为检测区域，具体为：AJAP1基因的靶区域为GRCh38：1：4653837-4654023；CDO1基因的靶区域为GRCh38：5：115816271-115816079；ZNF454靶区域为GRCh38：5：178940548-178940736。
针对以上检测区域的核酸序列，分别构建甲基化状态下和非甲基化状态下经亚硫酸盐转化之后的人工合成质粒作为阳性质控品和阴性质控品，分别命名为AJAP1-M1、AJAP1-UM1、CDO1-M1、CDO1-UM1、ZNF454-M1和ZNF454-UM1。
为了质控模板DNA质量和PCR检测结果是否有效，以ACTB作为内参。根据ACTB检测区域经亚硫酸盐转化后的序列，构建对应的人工合成质粒bisACTB。
用以上质粒分别配制不同浓度梯度的甲基化基因溶液，包括单个基因甲基化、两个基因甲基化和三个基因甲基化，每种甲基化组合均配制出1x104copies/ulDNA模板中含有100％基因甲基化，10％基因甲基化，1％基因甲基化，0.1％基因甲基化和0％基因甲基化的模板DNA溶液。以CDO1为例，列出每种浓度甲基化DNA模板的配制方法如下：
(1)CDO1 100％甲基化溶液配制：10％体积的1×105copies/ul的CDO1-M1和10％体积的1×105copies/ul bisACTB以及80％体积的TE缓冲液充分混匀所得溶液；(2)CDO110％甲基化溶液配制：10％体积的1×104copies/ul的CDO1-M1、9％体积的1×105copies/ul的CDO1-UM1和10％体积的1×105copies/ul bisACTB以及71％体积的TE缓冲液充分混匀所得溶液；
(3)CDO1 1％甲基化溶液配制：10％体积的1×103copies/ul的CDO1-M1、9.9％体积的1×105copies/ul的CDO1-UM1和10％体积的1×105copies/ul bisACTB以及70.1％体积的TE缓冲液充分混匀所得溶液；
(4)CDO1 0.1％甲基化溶液配制：10％体积的1×102copies/ul的CDO1-M1、9.99％体积的1×105copies/ul的CDO1-UM1和10％体积的1×105copies/ul bisACTB以及70.01％体积的TE缓冲液充分混匀所得溶液；
(5)CDO1 0％甲基化溶液配制：10％体积的1×105copies/ul的CDO1-UM1和10％体积的1×105copies/ul bisACTB以及80％体积的TE缓冲液充分混匀所得溶液。
本实施例中检测以上甲基化基因组合的引物对和荧光探针组合包括检测AJAP1基因甲基化的组合2，检测CDO1甲基化的组合5，检测ZNF454甲基化的组合15，检测内参基因ACTB的组合17。
其中，组合2中荧光探针5’端荧光报告基团为FAM，3’端荧光淬灭基团为MGB；组合5中荧光探针5’端荧光报告基团为ROX，3’端荧光淬灭基团为BHQ-2；组合9中荧光探针5’端荧光报告基团为Cy5，3’端荧光淬灭基团为BHQ-3；组合15中荧光探针5’端荧光报告基团为VIC，3’端荧光淬灭基团为MGB。
本实施例中PCR反应体系除包括以上4个组合外，还包括qPCR缓冲液、6mM的MgCl2溶液、250nM的dNTPs、1.5U的DNA聚合酶以及纯化水，共20μL。
向以上20μL混合反应液中分别加入5μL不同浓度梯度的甲基化基因溶液，每种溶液重复检测3次，进行荧光定量PCR反应。
荧光定量PCR反应程序包括三个阶段：95℃10min；95℃15s，60℃35s，45个循环；72℃10min；在第三阶段收集FAM/ROX/Cy5/VIC荧光信号。以FAM/ROX/Cy5/VIC荧光信号达到设定的阈值所需的循环数Ct值为标准，出现扩增曲线的基因则为甲基化阳性，否则为阴性。
检测结果显示，不论是单个基因甲基化、两个基因甲基化，还是三个基因甲基化的不同浓度梯度甲基化溶液，每个甲基化基因均能稳定检出，且甲基化阴性模板无扩增。
由本实施例可知，本发明提供的子宫内膜癌辅助诊断和/或早期子宫内膜癌无创筛查的多基因甲基化检测试剂盒，能够检出1×104copies/μL DNA溶液中0.1％的基因甲基化。
实施例2logistic回归分析和cutoff值设置
本实施例采用实施例1中提供的试剂盒和检测方法，说明对样本进行logistic回归分析和cutoff值设置的方法。
本实施例通过检测30例正常人宫腔脱落细胞样本、25例子宫内膜良性疾病病人宫腔脱落细胞样本、55例子宫内膜癌病人宫腔脱落细胞样本中AJAP1、CDO1和ZNF454的甲基化情况，用SPSS软件对检测数据和临床结果进行逻辑分析，得到相应的逻辑回归方程：y＝k1×x1+k2×x2+k3×x3+b。其中x1/x2/x3分别为AJAP1、CDO1、ZNF454基因扩增ΔCt值，k1/k2/k3分别为AJAP1、CDO1、ZNF454基因的临床系数，b为常数，具体数值见表3：
表3：logistic回归方程
| 基因名称 | AJAP1 | CDO1 | ZNF454 | 常数 |
| 数值 | -0.125(k1) | -0.237(k2) | -0.078(k3) | 40.769(b) |
根据公式S＝EXP(y)/[EXP(y)+1]×100计算得出相应的逻辑分数。用SPSS软件对逻辑分数和临床结果进行ROC曲线分析，选择最佳cutoff值。
本实施例中ROC曲线如图1所示，获得的cutoff值见表4：
表4：cutoff值划分
根据以上表格，在检测临床样本时，当逻辑分数≥45.75时，即为罹患子宫内膜癌高风险，建议受试者接受进一步临床检查(分段诊刮、宫腔镜检查等)；当逻辑分数<45.75时，即为罹患子宫内膜癌低风险，建议受试者每年一次甲基化检测。
实施例3标志物的ROC曲线分析
本实施例提供了本发明中提供的8种甲基化基因标志物及多标志物联合检测模型ROC曲线分析结果。
收集245例临床宫腔脱落细胞样本，其中包括94例正常病人样本，56例内膜良性病变病人样本，95例子宫内膜癌病人样本。
使用本发明提供的各个标志物的引物对和荧光探针组合进行荧光定量PCR检测，获得每个标志物的甲基化水平检测数据。使用SPSS软件，选择95％置信区间，产生ROC曲线及其曲线下面积(AUC)值。
表5展示了本发明8个甲基化基因两个靶序列ROC曲线的曲线下面积(AUC)，各个基因的ROC曲线见图2。
表5：8个甲基化基因两个靶序列AUC
根据ROC曲线分析可知：8个甲基化基因的两个靶区域的曲线下面积结果较为一致，但也存在一定差异，可同时选择一个基因的两个靶区域或者任意一个进行检测；8个基因的曲线下面积中AJAP1和CDO1的面积最大且差异面积最大，优先选择二者组合。
同时检测标志物的两个靶区域或同时检测更多的标志物，可以获得更好的灵敏度和特异性，但会增加使用成本。采用荧光定量PCR的方法，同时检测3个标志物，无疑是兼顾灵敏度和特异性的较优方案。
本实施例采用至少包括AJAP1和CDO1的3个标志物的组合，用实施例2中的逻辑回归方法，不同组合的ROC曲线下面积(AUC)、cutoff值及对应的灵敏度和特异性，具体结果见表6，ROC曲线见图3。
表6：包括AJAP1和CDO1的3个标志物的组合检测结果
为了更好地说明表6中组合标志物的有益效果，本实施例中同时分析了一些不同时包括AJAP1和CDO1的标志物组合的ROC曲线下面积(AUC)、cutoff值及对应的灵敏度和特异性，具体结果见表7。
表7：其他3个标志物的组合检测结果
对比表6和表7结果，可以看出至少包括AJAP1和CDO1的三标志物联合检测模型与不同时包括AJAP1和CDO1的三标志物联合检测模型相此，ROC曲线下面积(AUC)明显更大，且在保持90％以上的特异性时，具有更好的灵敏度。说明至少包括AJAP1和CDO1的三标志物联合检测模型可以作为较优的组合标志物应用于子宫内膜癌临床检测。
需要说明的是，本实施例从使用成本上考虑只对包括AJAP1和CDO1在内的三个标志物单个检测区域联合检测模型进行展开分析，且只展开部分组合模型，不代表本发明的所有实施例。使用者可根据实际需要，如需要更好的有益效果，可以选择三个以及三个以上的标志物单个检测区域或两个检测区域进行联合检测。
同时，本实施例中不同组合模型cutoff值设定是在保持90％以上的特异性所设定的cutoff值，不代表本发明仅能使用该cutoff值，根据不同的使用目的，可在本发明提供的ROC曲线中选择合适的cutoff值。
实施例4多标志物联合检测模型在子宫内膜癌检测临床应用的效果
本实施例提供了实施例3中多标志物联合检测模型在子宫内膜癌检测临床应用的实际效果。
选择AJAP1/CDO1/ZNF454组合的临床检测结果进行分析，检测实际效果与临床诊断结果此对结果见表8所示。
表8：AJAP1/CDO1/ZNF454组合的临床检测结果
上表检测结果显示本发明提供AJAP1/CDO1/ZNF454标志物组合检测453例临床样本(187例正常病人样本，52例内膜良性病变病人样本，28例子宫内膜不典型增生病人样本，186例子宫内膜癌病人样本)，子宫内膜不典型增生的灵敏度为57.14％，子宫内膜癌的灵敏度为92.47％，总体特异度为94.98％，。故本申请提供的试剂盒可以用于子宫内膜癌的辅助诊断或者用于高风险人群的子宫内膜癌早期筛查。
本实施例只是用AJAP1/CDO1/ZNF454组合展现多标志物联合检测子宫内膜癌的临床使用效果，使用者可根据实际使用预期用途选择合适的组合模型进行临床应用。
以上所述实施例为本发明的部分实施例，并非全部实施例。本领域技术人员可以对上述各实施例的技术方案进行修改或对部分技术特征进行等同替换，这些修改和替换均在本发明保护范围之内。
Claims (10)
1.一种子宫内膜癌的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物选自以下用于检测子宫内膜癌相关基因的至少一个靶区域内甲基化的核苷酸序列；
所述子宫内膜癌相关基因为AJAP1，BHLHE22，CDO1，CELF4，GALRl，HS3ST2，MAGI2，ZNF454中的一种或多种；
所述AJAP1基因检测靶区域为GRCh38：1：4654906-4655061和GRCh38：1：4653837-4654023；
所述BHLHE22基因检测靶区域为GRCh38：8：64580654-64580841和GRCh38：8：64581078-64581250：
所述CD01基因检测靶区域为GRCh38：5：115816271-115816079和GRCh38：5：115816963-115816773；
所述CELF4基因检测靶区域为GRCh38：18：37566303-37566104和GRCh38：18：37567415-37567273；
所述GALR1基因检测靶区域为GRCh38：18：77250102-77250301和GRCh38：18：77249620-77249799；
所述HS3ST2基因检测靶区域为GRCh38：16：22813619-22813818和GRCh38：16：22814109-22814248：
所述MAGI2基因检测靶区域为GRCh38：7：79454097-79453898和GRCh38：7：79454286-79454103；
所述ZNF454基因检测靶区域为GRCh38：5：178940548-178940736和GRCh38：5：178941256-178941430；
所述AJAP1引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，AJAP1荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；或者所述AJAP1引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQID NO.5所示，所述AJAP1荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述BHLHE22引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，BHLHE22荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；或者所述BHLHE22引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.10和SEQ ID NO.11所示，所述BHLHE22荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
所述COD1引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示，COD1荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；或者所述COD1引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示，所述COD1荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；
所述CELF4引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示，CELF4荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示；或者所述CELF4引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示，所述CELF4荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；
所述GALR1引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.25和SEQ ID No.26所示，GALR1荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.27所示；或者所述GALR1引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示，所述GALR1荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示；
所述HS3ST2引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.31和SEQ ID No.32所示，HS3ST2荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.33所示；或者所述HS3ST2引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.34和SEQ ID NO.35所示，所述HS3ST2荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示；
所述MAGI2引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.37和SEQ ID No.38所示，MAGI2荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.39所示；或者所述MAGI2引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41所示，所述MAGI2荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示；
所述ZNF454引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.43和SEQ ID No.44所示，MAGI2荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.45所示；或者所述MAGI2引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.46和SEQ ID NO.47所示，所述MAGI2荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.48所示；
其中，
所述AJAP1引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，AJAP1荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；或者所述AJAP1引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQID NO.5所示，所述AJAP1荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述BHLHE22引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，BHLHE22荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；或者所述BHLHE22引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.10和SEQ ID NO.11所示，所述BHLHE22荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
所述COD1引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示，COD1荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；或者所述COD1引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示，所述COD1荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；
所述CELF4引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示，CELF4荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示；或者所述CELF4引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示，所述CELF4荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；
所述GALR1引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.25和SEQ ID No.26所示，GALR1荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.27所示；或者所述GALR1引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示，所述GALR1荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示；
所述HS3ST2引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.31和SEQ ID No.32所示，HS3ST2荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.33所示；或者所述HS3ST2引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.34和SEQ ID NO.35所示，所述HS3ST2荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示；
所述MAGI2引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.37和SEQ ID No.38所示，MAGI2荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.39所示；或者所述MAGI2引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.40和SEQID NO.41所示，所述MAGI2荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示；
所述ZNF454引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.43和SEQ ID No.44所示，MAGI2荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.45所示；或者所述MAGI2引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.46和SEQ ID NO.47所示，所述MAGI2荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.48所示。
2.根据权利要求1所述的子宫内膜癌的生物标志物，其特征在于，所述子宫内膜癌相关基因至少包括CDO1和AJAP1。
3.根据权利要求2所述的子宫内膜癌的生物标志物，其特征在于，所述子宫内膜癌相关基因包括CDO1和AJAP1以及BHLHE22、CELF4、GALR1、HS3ST2、MAGI2或ZNF454中的至少一种。
4.一种用于对权利要求1所述的生物标志物的靶区域进行荧光定量PCR扩增的引物对和荧光探针组合，其特征在于，所述荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，所述荧光探针的3’端标记有荧光淬灭基团。
5.根据权利要求4所述的引物对和荧光探针组合，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM、ROX、VIC、JOE、CY3、CY5、NED、TAMRA和TEXAS RED中的任意一种，所述荧光淬灭基团为AMRA、DABCYL、ECLIPSE、BHQ 1、BHQ 2、BHQ 3和结合分子沟的非荧光淬灭剂MGB中的任意一种。
6.根据权利要求5所述的引物对和荧光探针组合，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM、ROX、VIC、CY5中的至少两种，所述荧光淬灭基团为BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、MGB中的至少一种。
7.权利要求1-3任一项所述的生物标志物或权利要求4-6任一项所述的荧光探针组合在制备子宫内膜癌诊断产品中的应用。
8.一种含有权利要求4-6任一项所述的引物对和荧光探针组合的检测试剂盒。
9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含PCR反应体系和人源生物样品。
10.根据权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应体系包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+离子、如权利要求6-9任一项所述的引物探针组合中的至少一种、ACTB引物对和荧光探针组合和纯化水。
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| CN115820850A (zh) | 2023-03-21 |
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