CN117106907A - 一种用于检测肾透明细胞癌的试剂、试剂盒及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因检测技术领域，更具体地，涉及一种用于检测肾透明细胞癌的试剂、试剂盒及应用。本发明提供了能够用于检测肾透明细胞癌的基因标记物，其包括TRIM58基因的Chr1:247857195‑247857595正链的全长区域或部分区域，和/或，PENK基因的Chr8:56445554‑56445854负链的全长区域或部分区域。本发明提供的用于检测肾透明细胞癌的试剂和试剂盒，通过检测样本中肾透明细胞癌基因标记物的甲基化水平，能够有效区分肾透明细胞癌患者和健康人，在实现无创检测的同时，可以对肾透明细胞癌进行高灵敏性、高特异性检测。

Description

一种用于检测肾透明细胞癌的试剂、试剂盒及应用
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，更具体地，涉及一种用于检测肾透明细胞癌的试剂、试剂盒及应用。
背景技术
肾细胞癌是起源于肾小管上皮的恶性肿瘤，其中75％左右的患者为肾透明细胞癌。2020年，全球肾细胞癌的发病率居恶性肿瘤第14位，其死亡率居第15位。
目前诊断肾透明细胞癌的技术主要包括：影像学技术(B超、多层螺旋CT、磁共振成像、PEI-CT全身扫面检查技术等)，病理学技术(肾脏穿刺活检)、及分子生物学技术(荧光原位杂交技术、免疫组织化学技术)等。然而，由于肾脏的位置隐匿，患者发生肿瘤的早期症状不明显，大部分患者被确诊时多处于癌症晚期，此时患者已失去了根治性手术的机会。因此，临床上需要可靠且有效的生物标记物去诊断肾透明细胞癌以满足患者实际需求。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供了一种用于检测肾透明细胞癌的试剂、试剂盒及应用，以改善现有技术对于肾透明细胞癌的诊断性能差，尤其是对肾透明细胞癌尿液样本的检测灵敏性、特异性低等的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种用于检测肾透明细胞癌的试剂，其为用于检测样本中肾透明细胞癌基因标记物甲基化水平的试剂，所述肾透明细胞癌基因标记物包括TRIM58基因的Chr1:247857195-247857595正链的全长区域或部分区域，和/或PENK基因的Chr8:56445554-56445854负链的全长区域或部分区域。
优选地，所述试剂包括用于检测所述肾透明细胞癌基因标记物甲基化水平的甲基化引物对和非甲基化引物对。
优选地，所述试剂包括用于检测Chr1:247857195-247857595正链的全长区域的甲基化水平的第一甲基化引物对和第一非甲基化引物对；和/或，用于检测Chr8:56445554-56445854负链的全长区域的甲基化水平的第二甲基化引物对和第二非甲基化引物对。
进一步优选地，所述第一甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.17～18所示；所述第一非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.19～20所示；所述第二甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.21～22所示；所述第二非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.23～24所示。
优选地，所述Chr1:247857195-247857595正链的部分区域包括如下区域中的至少一个：Chr1:247857241-247857341、Chr1:247857359-247857429和Chr1:247857454-247857576；所述Chr8:56445554-56445854负链的部分区域包括如下区域中的至少一个：Chr8:56445556-56445669、Chr8:56445682-56445818和Chr8:56445786-56445854。
优选地，所述试剂包括用于检测Chr1:247857195-247857595正链的部分区域的甲基化水平的引物对；和/或，用于检测Chr8:56445554-56445854负链的部分区域的甲基化水平的引物对。
优选地，所述引物对选自如下组合中的至少一组：
(1)SEQ ID NO.38～39所示的第一引物对；
(2)SEQ ID NO.41～42所示的第二引物对；
(3)SEQ ID NO.44～45所示的第三引物对；
(4)SEQ ID NO.47～48所示的第四引物对；
(5)SEQ ID NO.50～51所示的第五引物对；
(6)SEQ ID NO.53～54所示的第六引物对。
进一步优选地，所述试剂还包括检测探针，所述检测探针选自SEQ ID NO.40、SEQID NO.43、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.52和SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列中的至少一个。
本发明还提供了一种用于检测肾透明细胞癌的试剂盒，其包括所述试剂，还包括核酸提取试剂、核酸纯化试剂、甲基化转化试剂、PCR反应试剂、质控品、内参基因的检测引物对和内参基因的检测探针中的一种或多种。
本发明提供了所述的试剂或所述的试剂盒在制备检测肾透明细胞癌的产品中的应用。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明提供的用于检测肾透明细胞癌的试剂、试剂盒，通过检测样本中肾透明细胞癌基因标记物的甲基化水平，能够对肾透明细胞癌进行高灵敏性、高特异性检测。上述试剂盒检测肾透明细胞癌尿液样本的灵敏性可达92.6％，检测健康人尿液样本的特异性可达97.9％。
(2)本发明提供了能够用于检测肾透明细胞癌的基因标记物，包括TRIM58基因的Chr1:247857195-247857595正链的全长或部分区域和/或PENK基因的Chr8:56445554-56445854负链的全长或部分区域，根据上述肾透明细胞癌基因标记物的甲基化信息，能够有效区分肾透明细胞癌患者和健康人，在实现无创检测的同时，提高肾透明细胞癌检测的灵敏性和特异性。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
术语“诊断”是指确定受试者的健康状态，涵盖检测疾病的存在与否、对治疗手段的反应、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。在一些情况下，术语“诊断”指的是作为一个单一因素用于确定、验证或确认患者的临床状态，“辅助诊断”用于在患者临床状态确定或验证过程中提供各种信息辅助判断，不作为唯一确定指标。一些实施例中，“检测”肾透明细胞癌是指检测疾病的存在与否，即判断受试者是否患有肾透明细胞癌。
术语“样本”被定义为在本文中所述的分析或实验方法中要被测试的任何材料。样本通常从本文中所述的受试者获得。在一些实施方案中，样本是经由非侵入性方法获得(例如是非侵入性样本)。示例性非侵入性方法包括但不限于被动收集体液或无伤害的刮擦从外部环境可接近的(例如表皮或嘴的)组织。示例性非侵入性样本包括但不限于唾液、痰液、粘液、汗液、尿液、粪便、精液、子宫颈阴道分泌物、母乳、发炎性分泌物、泪液或脸颊上皮拭子。在一些实施方案中，样本是经由微侵入性方法获得。示例性微侵入性方法包括但不限于毛细管收集、静脉穿刺、胸腔穿刺、羊膜穿刺、针吸或洗胃。示例性微侵入性样本包括但不限于血液或血液级分(例如血浆或PBMC制品)、组织间液、胆汁、胃液和羊水。在一些实施方案中，样本是经由活检获得。示例性活检样本包括但不限于皮肤活检样本(例如通过穿孔、刮剃、碟形手术、楔入、切开或切除活检获得)、骨髓样本(例如通过抽吸活检获得)、淋巴结或乳房活检(例如通过细针抽吸、芯针活检、真空辅助活检或图像引导活检获得)、手术活检样本(例如通过切除或切开活检获得内部器官的样本)，或嘴、胃肠道、肺、膀胱或尿道活检样本(例如通过内镜检查获得)。
术语“受试者”或“个体”同义，可以包括人类或非人类动物。因此，本文中所述的方法和组合物可应用于人类和兽医疾病和动物模型。优选的受试者是“患者”，即，针对疾病或病症接受医学护理的活着的人类。这包括没有定义的疾病的个人，对其研究病理学体征。还包括疑似具有或处于定义的疾病风险的个人。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是人类。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，优选多于三个，并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素，而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。
术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。
术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代笔定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较；在一些情况下，可计算样本中基因甲基化的比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100％，然后再进行比较；在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。
术语“基因标记物”是指一种可在样品中检测到的指示物。基因标记物可用作个体应答或受益于治疗的可能性的指示物和/或用作以某些分子、病理学、组织学和/或临床表现为特征的疾病或疾患(例如，癌症)特定亚型的指示物。基因标记物包括但不限于多核苷酸(例如DNA和/或RNA)、多核苷酸拷贝数改变(例如，DNA拷贝数)、多肽、多肽和多核苷酸修饰(例如，翻译后修饰)、碳水化合物和/或基于糖脂的分子标记。
术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中，基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源以及所用方法等。例如，对于诊断和预后应用，根据靶序列的复杂度，寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸，但是也可以含有更少的核苷酸。在本发明公开内容中，术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。“引物对”是指上游引物和下游引物组成的组。
术语“甲基化特异性PCR”是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一，能发现最低约50pg DNA的甲基化。单链DNA经亚硫酸氢盐转化后，所有未甲基化的胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶，而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变，因此分别设计两对针对甲基化和非甲基化序列的引物，通过PCR扩增即可将甲基化与非甲基化的DNA序列区分开来。
术语“甲基化特异性荧光定量PCR(qMSP)”是将荧光定量PCR技术和甲基化特异性PCR技术相结合的实验技术。该技术也是基于不同甲基化状态的DNA经亚硫酸氢盐转化后的序列差异来设计合适的引物对，从而将甲基化和未甲基化的序列区分开来，但是qMSP最终的检测指标为荧光信号，因此，在qMSP反应系统中，除加入甲基化检测引物以外，还需要加入荧光探针或者荧光染料。与传统的甲基化特异性PCR技术相比，qMSP检测DNA甲基化水平的灵敏性和特异性更高，更适合检测癌症早期患者DNA中混合的痕量的发生异常甲基化的DNA片段，且该技术不需要凝胶电泳检测，操作更加简便。在本申请公开内容中，进行实时定量甲基化特异性PCR时加入甲基化引物，若Ct值满足所述要求(例如在组织样本中Ct≤35)，则表明目标序列是甲基化的。
术语“TaqMan探针”是指包含5’荧光基团和3’淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时，因为荧光基团附近存在淬灭基团，探针不会发出荧光。在扩增过程中，如果探针与被扩增的链结合，DNA聚合酶(如Taq酶)的5’-3’核酸外切酶活性会消化探针，荧光基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步的指数增长的过程。
TRIM58基因是含三方基序58，该基因所在的TRIM家族是一个结构保守，进化快速的蛋白家族，它参与细胞凋亡，细胞周期调控，细胞对病毒的应答等重要的生命活动。
PENK基因是脑啡肽原，该基因编码一种前原蛋白，该蛋白经过蛋白水解处理可产生多种蛋白质产物。
本发明提供了一种用于检测肾透明细胞癌的试剂，其为用于检测样本中肾透明细胞癌基因标记物甲基化水平的试剂，所述肾透明细胞癌基因标记物包括TRIM58基因的Chr1:247857195-247857595正链的全长区域或部分区域，和/或PENK基因的Chr8:56445554-56445854负链的全长区域或部分区域。
一些实施例中，上述试剂包括用于检测上述肾透明细胞癌基因标记物甲基化水平的甲基化引物对和非甲基化引物对。
一些实施例中，上述试剂包括用于检测Chr1:247857195-247857595正链的全长区域的甲基化水平的第一甲基化引物对和第一非甲基化引物对；和/或，用于检测Chr8:56445554-56445854负链的全长区域的甲基化水平的第二甲基化引物对和第二非甲基化引物对。
较佳实施例中，上述第一甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.17～18所示，上述第一非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.19～20所示；上述第二甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.21～22所示，上述第二非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.23～24所示。
一些实施例中，上述Chr1:247857195-247857595正链的部分区域包括如下区域中的至少一个：Chr1:247857241-247857341、Chr1:247857359-247857429和Chr1:247857454-247857576。一些实施例中，上述Chr8:56445554-56445854负链的部分区域包括如下区域中的至少一个：Chr8:56445556-56445669、Chr8:56445682-56445818和Chr8:56445786-56445854。
一些实施例中，上述试剂包括用于检测Chr1:247857195-247857595正链的部分区域的甲基化水平的引物对；和/或，用于检测Chr8:56445554-56445854负链的部分区域的甲基化水平的引物对。
一些实施例中，上述试剂包括用于检测Chr1:247857241-247857341的甲基化水平的第一引物对、用于检测Chr1:247857359-247857429的甲基化水平的第二引物对和用于检测Chr1:247857454-247857576的甲基化水平的第三引物对中的至少一组。较佳实施例中，上述第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.38～39所示；上述第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.41～42所示；上述第三引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.44～45所示。
一些实施例中，上述引物对包括用于检测Chr8:56445556-56445669的甲基化水平的第四引物对、用于检测Chr8:56445682-56445818的甲基化水平的第五引物对和用于检测Chr8:56445786-56445854的甲基化水平的第六引物对中的至少一组。
较佳实施例中，上述第四引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.47～48所示；上述第五引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.50～51所示；上述第六引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.53～54所示。
一些实施例中，上述引物对选自如下组合中的至少一组：
(1)SEQ ID NO.38～39所示的第一引物对；
(2)SEQ ID NO.41～42所示的第二引物对；
(3)SEQ ID NO.44～45所示的第三引物对；
(4)SEQ ID NO.47～48所示的第四引物对；
(5)SEQ ID NO.50～51所示的第五引物对；
(6)SEQ ID NO.53～54所示的第六引物对。
需要说明的是，若一种引物对与上述引物对(第一甲基化引物对、第一非甲基化引物对、第二甲基化引物对、第二非甲基化引物对、第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对、第六引物对)所示的核苷酸序列具有至少具有85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)等以上的序列一致性，且该检测引物对同样具有一定的肾透明细胞癌诊断功能(特异性或灵敏性与本申请的引物对相比，相当或略有下降或略有提高或大幅提高等)，也在本发明的保护范围内。
一些实施例中，上述检测探针选自与上述第一引物对对应的第一检测探针、与上述第二引物对对应的第二检测探针、与上述第三引物对对应的第三检测探针、与上述第四引物对对应的第四检测探针、与上述第五引物对对应的第五检测探针、与上述第六引物对对应的第六检测探针中的至少一个。较佳实施例中，上述第一检测探针的核苷酸序列如SEQID NO.40所示；上述第二检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.43所示；上述第三检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.46所示；上述第四检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.49所示；上述第五检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.52所示；上述第六检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.55所示。
一些实施例中，上述试剂选自如下组合中的至少一组：
(1)SEQ ID NO.17～18所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.19～20所示的第一非甲基化引物对；
(2)SEQ ID NO.21～22所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.23～24所示的第二非甲基化引物对；
(3)SEQ ID NO.38～39所示的第一引物对和SEQ ID NO.40所示的第一检测探针；
(4)SEQ ID NO.41～42所示的第二引物对和SEQ ID NO.43所示的第二检测探针；
(5)SEQ ID NO.44～45所示的第三引物对和SEQ ID NO.46所示的第三检测探针；
(6)SEQ ID NO.47～48所示的第四引物对和SEQ ID NO.49所示的第四检测探针；
(7)SEQ ID NO.50～51所示的第五引物对和SEQ ID NO.52所示的第五检测探针；
(8)SEQ ID NO.53～54所示的第六引物对和SEQ ID NO.55所示的第六检测探针。
本发明还提供了一种用于检测肾透明细胞癌的试剂盒，其包括上述试剂，还包括内参基因的检测引物对、内参基因的检测探针、核酸提取试剂、核酸纯化试剂、甲基化转化试剂、PCR反应试剂和质控品中的一种或多种。
一些实施例中，上述内参基因的检测引物对和内参基因的检测探针是针对ACTB基因设计的检测引物对和检测探针。在一个可选地具体示例中，ACTB基因的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.29～30所示，ACTB基因的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示。可以理解的是，在其他实施例中，还可以选择其他基因作为内参基因，此时，内参基因的检测引物对和检测探针对应设计即可。
一些实施例中，本发明所用检测探针为荧光探针，可选地，检测探针为TaqMan探针。具体地，上述基因标记物的检测探针和内参基因的检测探针的5’端均含有荧光报告基团，3’端均含有荧光淬灭基团。可选地，荧光报告基团位于检测探针的5’端，荧光淬灭基团位于检测探针的3’端。可选地，荧光报告基团选自FAM、ROX、CY5、VIC、TET、JOE和HEX中的一种或多种，荧光淬灭基团选自MGB、BHQ1、BHQ-2和BHQ-3中的一种或多种。在同一个反应体系中有两种以上的检测探针时，不同检测探针上连接的荧光基团不同。可以理解的是，检测探针的荧光基团不限于上述，还可以是其他荧光基团。
一些实施例中，上述甲基化转化试剂用于将DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，但不会影响甲基化胞嘧啶残基。一些实施例中，上述甲基化转化试剂为亚硫酸氢盐转化试剂。用亚硫酸氢盐转化试剂处理后，DNA中残留的唯一一种胞嘧啶是甲基化胞嘧啶。一些实施例中，上述PCR反应试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或多种。
上述试剂盒的检测样本包括血浆样本、血清样本、血液样本、尿液样本、唾液、尿液、粪便、脑脊液、精液、阴道分泌物、痰液、汗液、母乳、滑液、粘液(包括发炎性分泌物)、泪液、胆汁、胃液、组织间液、组织的活检或上皮细胞(其是自然脱落的或特意从身体收集的(例如脸颊细胞刮屑)、房水、羊水、胸膜液或受试者的呼气。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒的检测样本包括肾透明细胞癌组织样本、癌旁正常组织样本、尿液样本。
基于本发明公开的内容，本领域技术人员可以采用任何本领域熟知的技术对上述肾透明细胞癌基因标记物的甲基化水平进行检测，对肾透明细胞癌进行诊断，无论采用何种技术，其都是属于本发明的保护范围。
在可选的实施方案中，上述肾透明细胞癌基因标记物的甲基化水平通过如下至少一种的方法进行检测：甲基化敏感性随机引物聚合酶链反应(MS AP-PCR)、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms-SNuPE)、甲基化特异性PCR(qMSP)、甲基化敏感性DNA限制酶分析、基于限制酶的测序、基于限制酶的微阵列分析、联合亚硫酸氢盐限制性分析(COBRA)、甲基化CpG岛扩增(MCA)、甲基化CpG岛扩增和微阵列(MCAM)、通过连接介导PCR进行的HpaII小片段富集(HELP)、亚硫酸氢盐测序、亚硫酸氢盐微阵列分析、甲基化特异性焦磷酸测序、HELP测序(HELP-seq)、TET辅助吡啶硼烷测序(TAPS)、Gal水解和连接衔接子依赖性PCR(GLAD-PCR)、甲基化DNA免疫沉淀测序(MeDIP-Seq)或甲基化DNA免疫沉淀-微阵列分析(MeDIP-chip)、使用甲基敏感性限制酶的Southern印迹法和基于甲基化特异性巨磁阻传感器的微阵列分析。
本发明提供了上述试剂或上述试剂盒在制备检测肾透明细胞癌的产品中的应用。检测肾透明细胞癌的产品可以为试剂盒、芯片和测序文库等中的一种或多种。可选地，上述试剂可以是冻干粉状、溶液、悬浮液、乳液等形态。
需要说明的是，本发明提供的检测肾透明细胞癌的产品并不限于上述所列举的用于检测肾透明细胞癌的试剂、试剂盒，只要能满足肾透明细胞癌的诊断或辅助诊断的需求的产品均在本发明的保护范围内。
以下结合具体实施例，对上述技术方案详细说明。本申请所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本申请的内容。除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过本领域已知方法制备。
实施例1肾透明细胞癌基因标记物的筛选
通过检测组织样本中ANKS1B、TRIM58、PENK、PCDHGA1基因序列部分高甲基化状态的区域，即为分离的多核苷酸，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4，筛出健康人和癌症患者间甲基化水平存在显著差异的基因标记物，选取多个基因标记物，设计多重荧光PCR体系引物，在组织样本上验证检测体系的灵敏性和特异性。
因此本发明提供分离的多核苷酸序列(如表1)，以GRCh38.p14为参考基因组，上述ANKS1B(SEQ ID NO.1)、TRIM58(SEQ ID NO.2)、PENK(SEQ ID NO.3)、PCDHGA1(SEQ IDNO.4)经重亚硫酸盐处理后的序列为模板，分别设计各个基因标记物特异性的甲基化引物对和非甲基化引物对。所述甲基化引物对和非甲基化引物对均具有良好的扩增特异性，即甲基化引物对不会扩增非甲基化的模板，且非甲基化引物对不会扩增甲基化的模板；将表2中的引物进行人工合成，并稀释到合适的工作浓度备用。
表1分离的多核苷酸及转化后的序列
表2甲基化引物对和非甲基化引物对的核苷酸序列
收集50例肾透明细胞癌组织样本、50例癌旁正常组织样本进行PCR扩增，并进行Sanger测序：分析测序峰图、以Sanger测得的甲基化/非甲基化结果为标准，初步计算每个基因标记物的灵敏度和特异性；选择灵敏性≥80％，特异性≥90％的基因标记物进行下一步验证，剔除掉不合格基因标记物。具体过程如下：
1)组织样本收集：
共收集经病理活检确诊为肾透明细胞癌患者的癌组织样本和对应的癌旁正常组织样本各50例。所有的组织样本都为福尔马林固定且经石蜡包埋的样本，所有样本的收集过程获得伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。
2)组织样本DNA的提取：
使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(56404)提取组织样本基因组DNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。
3)组织样本DNA的转化和纯化：
样本DNA的转化和纯化所用试剂盒均为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号)，具体操作步骤见试剂盒说明书。
4)PCR扩增及测序：
以亚硫酸氢盐转化后的组织样本DNA为模板，加入SYBR Green PCR Mix、内参基因ACTB的检测引物对，ACTB基因检测引物对的上游引物的核苷酸序列为：AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG(SEQ ID NO.29)，下游引物的核苷酸序列为AATAACACCCCCACCCTGC(SEQ ID NO.30)，和表2中的甲基化引物对和非甲基化引物对进行PCR扩增。PCR反应体系见表3，PCR反应条件见表4。将PCR扩增产物送至测序公司进行Sanger测序，分析测序峰图、以Sanger测得目标区域内单个CpG位点的甲基化状态为准。
表3 SYBR Green PCR反应体系
表4 SYBR Green PCR反应程序
5)结果分析
剔除测序失败的样本，保留测序成功的样本进行结果分析。根据不同扩增子的测序峰图中CpG位点的甲基化情况，计算所有CpG位点的甲基化值。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果为胸腺嘧啶，则其为非甲基化的；若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果为胞嘧啶，则其为完全甲基化的；若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果既有胞嘧啶也有胸腺嘧啶(双峰)，则其为部分甲基化的。本实施例中，如果某多核苷酸中95％以上的CpG二核苷酸中胞嘧啶是甲基化的，则认为此样本中该基因标记物是甲基化阳性。计算不同基因标记物的特异性和灵敏性。灵敏性＝病理结果为阳性的样本检出甲基化阳性的比例；特异性＝病理结果为阴性的样本检出甲基化阴性的比例。检测基因标记物的甲基化水平见表5。
表5不同基因标记物在组织样本上的特异性和灵敏性
表5中，基因标记物ANKS1B的灵敏性＞80％、特异性＜90％；基因标记物PCDHGA1的灵敏性＜80％、特异性＞90％；基因标记物TRIM58、PENK的灵敏性均≥80％，特异性均≥90％，因此剔除掉不合格基因标记物ANKS1B、PCDHGA1，选择基因标记物TRIM58、PENK进行下一步验证。
实施例2肾透明细胞癌基因标记物的引物探针的筛选
根据上述结果选用分离的多核苷酸SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3，对分离的多核苷酸SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3进行转化获得分离的多核苷酸SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7，以分离的多核苷酸SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7为模板，根据其不同位置CpG位点设计多种甲基化检测引物对和探针组合，不同甲基化检测引物对及其扩增的产物包含在靶序列中。具体甲基化检测引物对和探针设计如表6所示，在实施例1中组织样本上进筛选出特异性和灵敏性最优的引物和探针组合。将表6中的甲基化检测引物对和探针分别进行人工合成，并稀释至合适的浓度备用。以经过亚硫酸氢盐转化和纯化的组织样本DNA为模板，分别加入表6中特异性的甲基化检测引物对和探针，同时加入内参基因ACTB的检测引物对(SEQ ID NO.29～30)和检测探针，检测探针的核苷酸序列为GGAGTGGTTTTTGGGTTTG(SEQ ID NO.31)，用以监测样本质量，ACTB的检测引物对和探针扩增靶序列的Ct值小于等于34，表明样本质量合格。再按照表7配置TaqMan PCR扩增体系，同时还需要设置阴性和阳性对照。阴性对照为超纯水，阳性对照为103copies/μL含靶序列(转化后序列)的质粒和103copies/μL含转化后ACTB序列的质粒等体积混合而成。然后再按照表8设置的程序进行qMSP。若检测单个基因标记物，则不加入另一个基因标记物的检测引物对及检测探针，其体积用超纯水补足。
本申请中，上述检测探针均为TaqMan探针，基因标记物的检测探针5’端的荧光报告基团为ROX、VIC，3’端的荧光淬灭基团为BHQ或BHQ1，ACTB基因的检测探针5’端的荧光报告基团为FAM，3’端的荧光淬灭基团为MGB。
表6SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3的甲基化检测引物对和探针的核苷酸序列
表7 TaqMan PCR反应体系
组分 规格 体积(μL)
Platinum II PCR缓冲液 5× 5
dNTPs 各2.5mM 3
一个基因标记物的上游引物 10μM 0.5
一个基因标记物的下游引物 10μM 0.5
一个基因标记物的检测探针 10μM 0.5
另一个基因标记物的上游引物 10μM 0.5
另一个基因标记物的下游引物 10μM 0.5
另一个基因标记物的检测探针 10μM 0.5
ACTB基因上游引物 10μM 0.5
ACTB基因下游引物 10μM 0.5
ACTB基因检测探针 10μM 0.5
DNA聚合酶 / 0.5
待测样本DNA / 5
超纯水 / 补至25
表8 TaqMan PCR程序
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qPCR反应结束后，需手动调整基线和设置合适的阈值，基线通常是3-15个循环的荧光信号，同一反应中针对不同基因单独设置基线，阈值置于指数扩增期内，同一反应中针对不同基因单独设置阈值，但对于同一个基因扩增用同一个阈值。根据质量控制的要求剔除检测不成功的样本，读取合格样本的Ct值。所述质量控制的标准为：1)阴性对照无扩增；2)阳性对照管扩增曲线呈S型，且所有基因的Ct值在26-30之间；3)实验管内参基因的Ct值小于等于34。若不满足上述质量控制要求，则此样本需重新检测。若样本均满足上述要求，可以对待测样本进行结果分析：阳性判断值为38，若使用某检测引物对和探针联用进行扩增的Ct值≤38，判定该样本为甲基化阳性；若使用某检测引物对和探针联用进行扩增的Ct值＞38，判定该样本为甲基化阴性。
表9SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3不同甲基化引物探针组合的检测性能
结果见表9，表明根据同一靶序列不同位置CpG位点设计的甲基化检测引物对和探针组合，检测肾透明细胞癌组织样本中多核苷酸的甲基化状态。引物探针组合SEQ IDNO.41～SEQ ID NO.43检测其扩增的区域Chr1:247857359-247857429的特异性为100％，灵敏性为82％，是检测基因标记物TRIM58最优的甲基化检测引物对和探针组合；引物探针组合SEQ ID NO.47～SEQ ID NO.49检测其扩增的区域Chr8:56445556-56445669的特异性为96％，灵敏性为84％，是检测基因标记物PENK最优的甲基化检测引物对和探针组合。
实施例3肾透明细胞癌基因标记物组合在临床样本上的性能验证
为了实现无创检测和进一步提高试剂盒诊断肾透明细胞癌体液样本的灵敏度，本实施例分析了基因标记物TRIM58、PENK的甲基化水平诊断肾透明细胞癌患者体液样本的性能。具体的，以引物探针组合SEQ ID NO.41～SEQ ID NO.43扩增的区域Chr1:247857359-247857429、引物探针组合SEQ ID NO.47～SEQ ID NO.49扩增的区域Chr8:56445556-56445669作为检测目标区域，通过检测受试者尿液脱落细胞样本中多核苷酸的甲基化水平来诊断肾透明细胞癌患者。具体过程如下：
1)临床样本收集：
本实施例所采用的样本为健康人尿液样本189例，肾透明细胞癌患者68例。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。
2)样本DNA的提取：
使用武汉艾米森生命科技有限公司核酸提取试剂盒(鄂汉械备20210740号)进行尿液样本DNA的提取，具体操作按照试剂盒说明书进行。
3)样本DNA的转化和纯化：
样本DNA的转化和纯化所用试剂盒均为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号)，具体操作步骤见试剂盒说明书。
4)qMSP具体过程同实施例2。
5)结果分析：读取每个待测尿液样本对应的目标区域和ACTB的Ct值。对于待测尿液样本，计算其目标区域的Ct值与扩增ACTB基因的Ct值的差值，即ΔCt值，ΔCt＝Ct子目标区域-ΔCt ACTB。根据ΔCt值对肾透明细胞癌和非癌受试者的尿液样本进行ROC(Receiveroperating characteristic curve，受试者操作特征曲线)分析，记录约登指数最大时的cut-off值，基因标记物TRIM58的子区域SEQ ID NO.33和基因标记物PENK的子区域SEQ IDNO.35的cut-off值分别为12.5和13.2。
具体的，在一个待测样本中，若某样本目标区域的ΔCt值≤cut-off值，则该样本为肾透明细胞癌阳性样本；若某样本目标区域的ΔCt值＞cut-off值，则该样本为非肾透明细胞癌样本。灵敏性为病理阳性的样本中该判断方法检测为阳性样本(简称“检阳”)的比例，特异性为病理阴性的样本中该判断方法诊断为阴性样本(简称“检阴”)的比例，具体诊断结果如表10所示。
表10两个基因标记物的子目标区域组合诊断肾透明细胞癌尿液样本的性能
靶序列 病理阳性/检阳 病理阴性/检阴 灵敏性 特异性
SEQ ID NO.33 68/59 189/186 86.8％ 98.4％
SEQ ID NO.35 68/60 189/185 88.2％ 97.9％
SEQ ID NO.33+SEQ ID NO.35 68/63 189/185 92.6％ 97.9％
由表10可以看出，通过qMSP法检测尿液样本中单一基因标记物的子目标区域的甲基化水平进而诊断肾透明细胞癌的效果良好，具体地，基因标记物TRIM58的子目标区域SEQID NO.33检测健康人尿液样本的特异性为98.4％，其检测肾透明细胞癌患者尿液样本的灵敏性为86.8％；基因标记物PENK的子目标区域SEQ ID NO.35检测健康人尿液样本的特异性为97.9％，其检测肾透明细胞癌患者尿液样本的灵敏性为88.2％。
将两个基因标记物的子目标区域进行组合诊断，其检测肾透明细胞癌患者尿液样本的灵敏性为92.6％，相较于单一基因标记物的子目标区域的诊断性能有较大的提升；其检测健康人尿液样本的特异性为97.9％，相较于单一基因标记物的子目标区域的诊断性能持平或仅有小幅下降。综上，通过检测基因标记物TRIM58的子目标区域和基因标记物PENK的子目标区域组合或其中任一子目标区域的甲基化水平都能够对肾透明细胞癌进行临床医学的辅助诊断。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测肾透明细胞癌的试剂，其特征在于，其为用于检测样本中肾透明细胞癌基因标记物甲基化水平的试剂，所述肾透明细胞癌基因标记物包括TRIM58基因的Chr1:247857195-247857595正链的全长区域或部分区域，和/或PENK基因的Chr8:56445554-56445854负链的全长区域或部分区域。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，其包括用于检测所述肾透明细胞癌基因标记物甲基化水平的甲基化引物对和非甲基化引物对。
3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，其包括用于检测Chr1:247857195-247857595正链的全长区域的甲基化水平的第一甲基化引物对和第一非甲基化引物对；
和/或，用于检测Chr8:56445554-56445854负链的全长区域的甲基化水平的第二甲基化引物对和第二非甲基化引物对。
4.根据权利要求3所述的试剂，所述第一甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.17～18所示；所述第一非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.19～20所示；所述第二甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.21～22所示；所述第二非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.23～24所示。
5.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述Chr1:247857195-247857595正链的部分区域包括如下区域中的至少一个：Chr1:247857241-247857341、Chr1:247857359-247857429和Chr1:247857454-247857576；
所述Chr8:56445554-56445854负链的部分区域包括如下区域中的至少一个：Chr8:56445556-56445669、Chr8:56445682-56445818和Chr8:56445786-56445854。
6.根据权利要求5所述的试剂，其特征在于，其包括用于检测Chr1:247857195-247857595正链的部分区域的甲基化水平的引物对；
和/或，用于检测Chr8:56445554-56445854负链的部分区域的甲基化水平的引物对。
7.根据权利要求6所述的试剂，其特征在于，所述引物对选自如下组合中的至少一组：
(1)SEQ ID NO.38～39所示的第一引物对；
(2)SEQ ID NO.41～42所示的第二引物对；
(3)SEQ ID NO.44～45所示的第三引物对；
(4)SEQ ID NO.47～48所示的第四引物对；
(5)SEQ ID NO.50～51所示的第五引物对；
(6)SEQ ID NO.53～54所示的第六引物对。
8.根据权利要求5至7任一项所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括检测探针，所述检测探针选自SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.52和SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列中的至少一个。
9.一种用于检测肾透明细胞癌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求4至8任一项所述的试剂，还包括核酸提取试剂、核酸纯化试剂、甲基化转化试剂、PCR反应试剂、质控品、内参基因的检测引物对和内参基因的检测探针中的一种或多种。
10.根据权利要求1至8任一项所述的试剂或权利要求9所述的试剂盒在制备检测肾透明细胞癌的产品中的应用。
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