CN113913522B

CN113913522B - 子宫内膜癌检测的试剂及试剂盒

Info

Publication number: CN113913522B
Application number: CN202111367602.7A
Authority: CN
Inventors: 苏雅婷; 郭洪; 王方媛; 郑义慧
Original assignee: Wuhan Aimisen Life Technology Co ltd
Current assignee: Wuhan Aimisen Life Technology Co ltd
Priority date: 2021-11-18
Filing date: 2021-11-18
Publication date: 2023-03-10
Anticipated expiration: 2041-11-18
Also published as: CN113913522A; WO2023088335A1

Abstract

本申请提供一种子宫内膜癌检测的试剂及试剂盒，通过特异性检测DNA样本中CADPS基因CpG岛中CpG二核苷酸位点的甲基化水平，来进行子宫内膜癌或癌前的诊断，对于I型或II型子宫内膜癌均具有较高的灵敏性和特异性；此外该试剂在组织样本、宫颈脱落细胞样本和血浆样本中均具有较好的检测效果，可用于子宫内膜癌的无创或微创检测。

Description

子宫内膜癌检测的试剂及试剂盒

技术领域

本申请涉及生物医药技术领域，具体涉及一种子宫内膜癌的诊断的试剂及试剂盒。

背景技术

子宫内膜癌(endometrial cancer)是由子宫内膜细胞异常增殖而来的一种子宫内膜上的上皮性肿瘤，也是发病率较高的女性生殖系统恶性肿瘤，对全世界女性的健康造成了严重威胁。

子宫内膜癌多发生在绝经后的女性中，其可能的原因是绝经后雌激素的分泌水平不稳定，此外，吸烟、高血压、超重和遗传性疾病等都可能导致癌症的发生。子宫内膜癌主要由两种类型组成，I型：多发生于处于绝经期或绝经前期的女性，并多有暴露于无拮抗的内源性或外源性雌激素的病史，与女性雌激素过多症有明显的相关性，如肥胖、无卵性的子宫出血、不孕症、多囊卵巢综合征、绝经后期和子宫内膜增生，是最常见的类型的子宫内膜癌，可达80％-85％，多为子宫内膜样癌，肿瘤分化程度较好，恶性程度一般较低，对孕激素类药物敏感，预后较好，5年生存率约为74％。II型：非雌激素依赖型，多发生于萎缩的子宫内膜中，形态学表现为低分化癌，多为浆液性乳头状廇、透明细胞癌等少见肿瘤，该类型肿瘤属高度恶性肿瘤，已发生深肌层浸润，预后比较差，5年的生存率在27％-42％。子宫内膜癌从癌前病变到癌症有时会经历长达5-8年的潜伏期，若不经过治疗，近50％的癌前病变最终会发展成子宫内膜癌。在中国，子宫内膜癌患者的五年相对生存率总体上在55％左右。生存率大小与癌症分期有关，FIGO分期I-II期的患者五年生存率在74％-91％之间，III期在57％-66％之间，IV期在20％-26％之间，因此，早诊早治是提高生存率的关键。

当前的子宫内膜癌的诊断主要是根据受试者的病史、临床检查、病理检查及各种辅助检查结果确定诊断及临床分期，主要检测方法包括：B超检查、诊断性刮宫、宫腔镜检查和淋巴造影，这些方法存在检出率不高、容易给病人造成严重的生理上的痛苦等缺点，因此开发灵敏性和特异性均较高且取材微创/无创的子宫内膜癌检测方法意义重大。

发明内容

本申请提供一种子宫内膜癌的检测试剂及试剂盒，可以用于子宫内膜癌检测或辅助诊断，具有良好的灵敏性和特异性。

第一方面，本申请提供一种子宫内膜癌检测的试剂，所述试剂包括：能够特异性检测DNA样本中靶核苷酸序列中的至少一个CpG二核苷酸位点甲基化水平的检测试剂，所述靶核苷酸序列源自CADPS基因CpG岛的全长或部分区域，其中所述部分区域至少包括一个CpG二核苷酸位点。

在一些实施例中，所述CADPS基因CpG岛的核苷酸序列包括SEQ ID NO.22及SEQ IDNO.23所示核苷酸序列中的一种或两种。

在一些实施例中，所述部分区域的核苷酸序列包括SEQ ID NO.24至SEQ ID NO.29所示核苷酸序列中的至少一种。

在一些实施例中，所述试剂包括：PCR试剂，所述PCR试剂包括能检测所述靶核苷酸的甲基化水平的特异性引物对和/或特异性探针。

在一些实施例中，所述引物对包括如下引物对中的任一组：

SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的组合；

SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的组合；

SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的组合；

SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11的组合；

SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14的组合；和/或

SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17的组合。

在一些实施例中，所述特异性探针选自：SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15和/或SEQ ID NO.18中的至少一种。

在一些实施例中，所述试剂包括：

(c)反应试剂，能差异修饰所述DNA样本中的甲基化位点和非甲基化位点；以及

(d)检测试剂，在用所述反应试剂处理DNA样本之后，所述检测试剂能通过甲基化检测方法确定所述靶核苷酸中的特定CpG二核苷酸位点中的胞嘧啶的甲基化水平。

在一些实施例中，所述反应试剂包括重亚硫酸盐或其衍生物；和/或，

所述甲基化检测方法包括：甲基化特异性PCR方法、亚硫酸氢盐测序法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法和甲基化敏感性限制性内切酶法。

在一些实施例中，所述DNA样本来自哺乳动物的离体生物学样本，所述哺乳动物的离体生物学样本来自血液、子宫内膜组织及子宫内膜的细胞样本中的至少一种。

第二方面，本申请还提供一种用于子宫内膜癌检测的试剂盒，包括第一方面所述的试剂。

有益效果：

本申请提供一种子宫内膜癌的检测和诊断的试剂及试剂盒，通过特异性检测DNA样本中CADPS基因CpG岛中CpG二核苷酸位点的甲基化水平，来进行子宫内膜癌或癌前病变的诊断，对于I型或II型子宫内膜癌均具有较高的灵敏性和特异性；此外在组织样本、宫颈脱落细胞样本和血浆样本中具有较好的检测效果，可用于子宫内膜癌的无创或微创检测。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。需说明的是，以下实施例的描述顺序不作为对实施例优选顺序的限定。另外，在本申请的描述中，术语“包括”是指“包括但不限于”。

发明人在研究过程中发现，CADPS基因CpG岛的甲基化水平与子宫内膜癌相关，并且经大量及长期的实验证明：检测CADPS基因CpG岛区域甲基化的增加可以对子宫内膜癌进行诊断或辅助诊断，具有较高的灵敏性和特异性。

鉴于此，本申请提供了一种用于子宫内膜癌检测的试剂。所述试剂包括：能够特异性检测DNA样本中靶核苷酸序列中的至少一个CpG(胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤)二核苷酸位点甲基化水平的检测试剂，所述靶核苷酸序列源自CADPS基因CpG岛的全长或部分区域，其中所述部分区域至少包括一个CpG二核苷酸位点。

术语“DNA甲基化水平”与一般理解相同，指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代表定性的概念，又代表定量的概念。举例来说，如果核酸序列内的胞嘧啶(C)残基为甲基化的，则可将其称为“高甲基化的”或具有“增加的甲基化”在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平，如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较，在一些情况下，可计算出样本中标记物的甲基化比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100，然后再进行比较，在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。

术语“CpG岛”是指DNA上的一个区域，此区域富含大量的用磷酸酯键相连的胞嘧啶和鸟嘌呤，其主要位于基因的启动子和外显子区域，是富含CpG二核苷酸的区域，长度在200-3000bp之间，G和C的总含量超过50％，针对本实施例，CADPS的CpG岛包括如下序列(5’-3’)：SEQ ID NO.22，位于人3号染色体，例如以GRCh38/hg38基因组为参考，该序列位于Chr3:62873943-62875515区域(本文中所提到的以基因组为参考的位点或区域的位置均是以GRCh38/hg38为参考)。相应的，所述CADPS基因的CpG岛的核苷酸序列还包括上述SEQ IDNO.22的反向互补的核苷酸序列SEQ ID NO.23。因此针对本申请实施例，作为甲基化水平检测目标的靶核苷酸序列可以包括SEQ ID NO.22，和/或SEQ ID NO.23。

在本申请实施例中，核苷酸序列“互补”是指一一对应的碱基互补。例如人基因组中DNA序列包括正义链和与之对应互补的反义链，正义链和反义链具有本领域已知的含义，一般来说，反义链(负链，nonsense strand)为mRNA转录时结合的模板链，而非模板链存储mRNA的编码信息，为正义链(正链，sense strand)。可以理解的是，在DNA双链中，只是在某一部分区域某一条链是正义链，部分是反义链，在另一个区域可能是完全相反的。

本领域技术人员可以理解，由于个体差异的不同，在同一染色体的相同区域，基因的碱基序列可能存在细微差别。因此在本申请实施例中，所述靶核苷酸序列还可以选自与SEQ ID NO.22，和/或SEQ ID NO.23存在至少70％、80％、90％、95％或99％的相似性的序列。

两个核酸序列之间的“相似性”，其百分比表示在最佳比对(best alignment)后获得的待比较的两个序列之间的相同核苷酸的统计学意义的百分比，两个序列之间的差异随机地分布在其整个长度上。通常，这种序列的比较可以手动进行，也可以利用计算机程序方法进行，其中计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相似性。

在一些实施例中，所述CpG岛区域的核苷酸序列为SEQ ID NO.24至SEQ ID NO.29中的至少一种，或者选自与SEQ ID NO.24至SEQ ID NO.29具有至少70％、80％、90％、95％或99％的相似性的序列。

所述SEQ ID NO.24为Chr3:62874785-62874899区域的正义链上的核苷酸序列；所述SEQ ID NO.25为Chr3:62875096-62875225区域正义链上的核苷酸序列；所述SEQ IDNO.26为Chr3:62875250-62875421区域正义链上的核苷酸序列；所述SEQ ID NO.27为Chr3:62875225-62875108区域负义链上的核苷酸序列；所述SEQ ID NO.28为Chr3:62875068-62874902区域负义链上的核苷酸序列；所述SEQ ID NO.29为Chr3:62874798-62874689区域负义链上的核苷酸序列。

在一些实施例中，所述试剂包括：PCR试剂，所述PCR试剂包括能特异性检测所述靶核苷酸的甲基化水平的特异性引物对和/或特异性探针。

术语“引物”是指在纯化的限制性消化物中天然存在的或合成产生的寡核苷酸，当处于其中诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下(例如，在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶的存在下并且在合适的温度和pH下)时，其能够作为合成的起点。引物优选是单链的，用于扩增的最大效率，但也可以是双链的。如果是双链，则在用于制备延伸产物之前首先处理引物以分离其链。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在诱导剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源以及方法的使用。

术语“探针”是指在纯化的限制性消化物中天然存在的或者合成、重组或通过PCR扩增产生的寡核苷酸(例如，核苷酸序列)，其能够与另一种目标寡核苷酸杂交。探针可以是单链或双链的。探针可用于特定基因序列的检测、鉴定和分离。

作为示例性方案，所述引物对包括如下引物对中的任一组：

SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的组合；

SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的组合；

SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的组合；

SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11的组合；

SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14的组合；

SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17的组合；和/或，选自与上述序列具有至少70％、80％、90％、95％或99％的序列相似性的引物。

作为示例性方案，所述特异性探针选自：SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.18中的至少一种，或选自与上述序列具有多个连续核苷酸至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性探针。

本申请实施例中，所述探针为Taqman探针，标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团，在一些实施方式中，所述探针5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光猝灭基团为MGB。

在一些实施例中，所述试剂包括：

(a)反应试剂，能差异修饰所述DNA样本中的甲基化位点和非甲基化位点。

作为示例性方案，所述反应试剂包括重亚硫酸盐或其衍生物。

(b)检测试剂，在用所述反应试剂处理DNA样本之后，所述检测试剂能通过甲基化检测方法确定所述靶核苷酸中的特定CpG二核苷酸位点中的胞嘧啶的甲基化水平。

作为示例性方案，所述甲基化检测方法包括：甲基化特异性PCR方法、测序法(例如：亚硫酸氢盐测序法、全基因组甲基化测序法和焦磷酸测序法)、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法和甲基化敏感性限制性内切酶法。

在一些实施例中，所述DNA样本来自哺乳动物的离体生物学样本，包括人、非人类灵长动物。所述哺乳动物的离体生物学样本可以来自血液、子宫内膜组织及子宫内膜的细胞样本中的至少一种。具体的，所述血液样本包括：全血样本、血清样本、血浆样本和血细胞样本；所述子宫内膜的细胞样本可以为子宫来源的脱落细胞样本，包括：宫颈脱落细胞样本和子宫内膜脱落细胞样本。当所述样本来自子宫来源的脱落细胞样本时，所述试剂可适用于无创检测，可以减轻患者的采样痛苦，提高检测试剂的普及性。

本申请一种用于子宫内膜癌的检测和诊断的试剂盒，包括以上任一项实施例所述的试剂。

本申请还提供了用于子宫内膜癌的检测和诊断的芯片，所述芯片能够特异性检测DNA样本中靶核苷酸序列中的至少一个CpG(胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤)二核苷酸位点甲基化水平的检测试剂，所述靶核苷酸序列源自CADPS基因CpG岛的全长或部分区域。

本申请还提供一种以上实施例所述试剂盒的使用方法，该方法包括：

(1)提取DNA样品。

所述DNA样品可以为宫颈脱落细胞样本、子宫内膜组织样本或血液样本。

(2)加入反应试剂，对所述DNA样品进行处理。

所述反应试剂用于差异修饰所述DNA样本中的甲基化位点和非甲基化位点。具体可以选自重亚硫酸盐或其衍生物。

(3)加入检测试剂，进行PCR扩增反应，检测所述DNA样品中靶核苷酸序列中CpG二核苷酸位点是否发生甲基化反应。所述靶核苷酸序列源自CADPS基因CpG岛的全长或部分区域。具体的，所述检测试剂能通过甲基化检测方法确定所述靶核苷酸的特定CpG中的胞嘧啶是甲基化的还是非甲基化的，或者进一步计算或评估靶核苷酸序列中的CpG二核苷酸位点发生甲基化的比例。

本申请还提供一种应用，包括将所述检测试剂用于I型子宫内膜癌或II型子宫内膜癌的检测、诊断或辅助诊断；或者I型子宫内膜癌或II型子宫内膜癌癌前病变的检测。具体的，所述试剂可应用于：乳头状浆液性腺癌、透明细胞癌、鳞状细胞癌及子宫内膜样癌中的至少一种。

在一些实施例中，所述检测试剂还可以用于I期、II期、III期和IV期的子宫内膜癌的检测。

需要说明的是，本申请所称的I期、II期、III期和IV期的子宫内膜癌可以是参考国际妇产科学联合会所定义的FIGO分期系统。针对本申请实施例，即使患者处于I期、II期、III期和IV期或者更早期的病变，本申请的检测试剂盒均可检出，对于提高患者的生存率具有重要意义。

下面对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本申请的内容。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过本领域已知方法制备。

实施例

实施例用于提供子宫内膜癌检测的试剂，共6组试剂，分别为实施例1～实施例6，各实施例的试剂包括目的基因的一对甲基化特异性引物和一条特异性taqman探针，其中目的基因、引物对和探针的序列信息如表1所示。

表1.CADPS基因CpG岛内6个区域的甲基化引物对和探针

实施例1～实施例6提供的试剂可通过以下方法进行子宫内膜癌的诊断，具体步骤包括：

(1)样本DNA提取

若样本为福尔马林固定、石蜡包埋的组织样本(FFPE样本)时：则采用QIAamp DNAFFPE Tissue Kit提取组织DNA，具体操作参见试剂盒说明书。

若样本为宫颈脱落细胞样本时：则采用天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)提取宫颈脱落细胞DNA，具体操作参见试剂盒说明书。

若样本为血浆样本时：则采用武汉艾米森生命科技有限公司的血浆cfDNA提取试剂(核酸提取试剂鄂汉械备20210740号)，具体操作参见试剂盒说明书。

(2)亚硫酸氢盐转化

所用核酸转化试剂盒为ZYMO RESEARCH的EZ DNA Methylation-Gold TM Kit，具体实验操作参见试剂盒说明书。

(3)甲基化特异性PCR

利用本申请实施例1～实施例6提供的试剂，对CpG岛内的6个区域进行甲基化检测。具体为：将亚硫酸氢盐转化后的DNA进行甲基化特异性PCR反应以检测CADPS基因区域1～区域6的甲基化状态，每个区域单独进行检测，即一个PCR管中每次只加入一个实施例的检测引物和探针，同时加入内参基因的检测探针。ACTB作为内参基因，其中ACTB上游引物为：AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG(SEQ ID NO.19)；ACTB下游引物为：AATAACACCCCCACCCTGC(SEQ ID NO.20)；ACTB探针为：GGAGTGGTTTTTGGGTTTG(SEQ ID NO.21)。区域1-6探针的发光基团为FAM，猝灭基团为MGB，ACTB的发光基团为VIC，猝灭基团为BHQ1。

采用Platinum II Taq热启动DNA聚合酶进行PCR扩增，PCR反应液配置体系如表2所示:

表2

组分	规格	体积(μL)
			PCR缓冲液	5×	4
dNTPs	各2.5mM	2
			区域上游引物	10μM	0.4
区域下游引物	10μM	0.4
			区域探针	10μM	0.4
ACTB上游引物	10μM	0.4
			ACTB下游引物	10μM	0.4
ACTB探针	10μM	0.4
			Taq酶	/	0.3
待测样本DNA	/	5
			纯化水	/	补至25

如表3所示，在检测CADPS基因区域1～区域6任一区域在样本中的甲基化状态时，只需将某一区域对应的引物探针、ACTB引物探针、缓冲液、dNTP、DNA酶和样本DNA等按照表中的体积加入到反应体系中。每个样本设置三个复孔。

PCR反应条件如下表3所示。

表3

(4)质量控制

在每次检测时对阴性对照和阳性对照进行同步检测。

阴性对照为纯化水。

阳性对照为Hec-1A细胞系基因组，浓度为10³copies/μL。

阴性对照要无扩增，阳性对照要有明显的指数增长期，待检样本的内参基因的Ct值应≤35，阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。

(5)PCR数据分析

Ct值读取：PCR完成后，分别调整目标区域和内参基因的基线，将一次PCR中样本最小Ct值提前1-2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到每个样本待检测目的基因的Ct值和内参基因ACTB的Ct值。

结果分析和判读方法：若一孔中待检区域的Ct值≤38时，则认为该区域在该孔中被检出甲基化，当三个复孔中至少有两孔被检出甲基化时，则判定该区域在该样本中为甲基化阳性，否则为甲基化阴性。计算区域1～区域6在子宫内膜癌前病变样本、子宫内膜癌样本中的灵敏性，检测各区域在癌旁样本或正常样本中的特异性。

灵敏性＝甲基化阳性个数/(子宫内膜癌前病变or子宫内膜癌样本总数)

特异性＝甲基化阴性个数/(癌旁样本or正常样本总数)

实验例1

本实验例用于利用前面实施例提供的检测试剂和方法，对临床组织样本的进行检测。

20例子宫内膜癌和20例癌旁组织样本存取自武汉某医院，所有样本均为FFPE样本，样本由专业医务人员制备，在20例子宫内膜癌样本中，有13例为子宫内膜样癌，2例为乳头状浆液性腺癌，3例为透明细胞癌，2例为鳞状细胞癌。对40例样本采用实施例中所述的方法进行组织样本DNA提取、对提取到的DNA进行亚硫酸氢盐转化，以转化后的DNA为模板，利用实施例1～实施例6提供的试剂对区域1～区域6进行甲基化特异性PCR检测，统计实施例1～实施例6在各个样本中的甲基化情况，并计算灵敏性和特异性，结果如表4所示。

表4临床组织样本中的甲基化检测结果

由表4的结果可以看出，在20例子宫内膜癌样本中，实施例1～实施例6的甲基化检测的灵敏性均不低于95％，其中实施例1、实施例3和实施例6的灵敏性为100％。在20例子宫内膜癌样本中，子宫内膜样癌属于I型子宫内膜癌，乳头状浆液性腺癌、透明细胞癌和鳞状细胞癌属于II型子宫内膜癌，上述结果表明实施例1～实施例6对于I型和II型子宫内膜癌均有良好的检测效果；在20例癌旁样本中，实施例1～实施例6至多有2个被检出甲基化阳性，特异性均不低于90％。

实验例2

本实验例主要为针对宫颈脱落细胞样本的检测。

10例子宫内膜癌样本、15例子宫内膜癌前病变样本和20例子宫内膜正常样本取自于武汉某医院，所有样本均为宫颈脱落细胞样本，样本由专业医务人员收集，样本信息如表5所示。对45例样本采用实施例中所述的方法进行细胞样本DNA提取、对提取到的DNA进行亚硫酸氢盐转化，以转化后的DNA为模板，利用实施例1～实施例6提供的试剂对区域1～区域6进行甲基化特异性PCR检测，统计实施例1～实施例6在各个样本中的甲基化情况，并计算灵敏性和特异性，结果如表5所示。

表5脱落细胞临床样本信息及甲基化检测结果

从表5的结果可以看出，在20例宫颈脱落细胞样本中，实施例1～实施例6的甲基化的检测敏感性均不低于90％，与实验例1的结果一致，实施例1～实施例6对I型和II型子宫内膜癌均有良好的检测效果，另外，实施例1～实施例6对于癌前病变的检测灵敏性为73.3％或80％，表明实施例1～实施例6提供的试剂对子宫内膜癌前病变也有较好的检测效果。在20例正常样本中，除实施例1有3例为甲基化阳性外(特异性为85％)，实施例2～实施例5的甲基化阳性例数均不多于2个，特异性不低于90％。

实验例3

本实验例主要为针对血浆样本的检测。

30例子宫内膜癌血浆样本、45例健康人血浆样本取自于武汉某医院，样本由专业医务人员收集，样本信息如表6所示。对75例样本采用实施例中所述的方法进行细胞样本DNA提取、对提取到的DNA进行亚硫酸氢盐转化、以转化后的DNA为模板，利用实施例1～实施例6提供的试剂对区域1～区域6进行甲基化特异性PCR检测，统计实施例1～实施例6在各个样本中的甲基化情况，并计算灵敏度和特异性，结果如表6所示。

表6.血浆样本中的检测结果

由表6的结果可以看出，在血浆样本中，实施例1～实施例6对I-IV期子宫内膜癌样本的整体灵敏性在60％-70％之间，其中实施例3、实施例4和实施例6的敏感性最高，为70％，六组实施例对I期、II期、III期和IV期的子宫内膜癌均能检出。在45例健康人血浆样本中，六组实施例的检测特异性均在90％以上。

综上所述，根据以上实验结果可以得出，无论是采用宫颈脱落细胞样本、组织样本还是血浆样本，本申请提供的检测试剂对于子宫内膜癌的检测均具有较高的灵敏性和特异性，将该试剂应用于血浆样本中时，可简化取样环节，减小取样创伤，将该试剂应用于宫颈脱落细胞样本时，可通过阴道拭子采样，减少病人痛苦，提高检测试剂的普及性。另一方面，对于各种类型的子宫内膜癌，例如I型的子宫内膜样癌，II型的乳头状浆液性腺癌、透明细胞癌和鳞状细胞癌，本申请提供的检测试剂均有较好的检测效果。并且，对于各个阶段的子宫内膜癌，包括I期、II期、III期和IV的子宫内膜癌，本申请提供的检测试剂均能检出。此外，还值得注意的是，对于癌前病变的样本，本申请提供的试剂依旧能够检出，因此对于早期筛查，对于早日治疗介入及改善患者预后具有重要意义。

以上对本申请所提供的一种子宫内膜癌检测的试剂及试剂盒，进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的技术方案及其核心思想；本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请实施例的技术方案的范围。

序列表

<110> 武汉艾米森生命科技有限公司

<120> 子宫内膜癌检测的试剂及试剂盒

<141> 2021-11-08

<160> 29

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ttgttgggtt gtagtttttc gg 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

acaacgccga actaaaaaac gac 23

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ttgttcgcgt cgttgttttc gt 22

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

aggtagtcgg ggattagttt tttcg 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

tctaaatcta aacccaactc gcgac 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

ttaggttagg gagcgagagc gttgt 25

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

agaggtgcgt tcgtggattc g 21

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

tccccaatcg acaaaatacc tcttc 25

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

ttatttgcgg ttgttgaagg aggc 24

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

tttgggtttg agtttagttc gc 22

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

atcaactctc ccgaataaac gct 23

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

tcgaggttga gtagtagcgt tttcg 25

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

agtcgggggt tttagagatt tc 22

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

accgaaccct cgctaatacg 20

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

ttttcgttta gcgaagaaga atcgg 25

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

ttgtaattta gtagtcgcgt tggc 24

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

tcctcctcct ctttctacaa ccg 23

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

agttttagtt cgtcggtggt gagcg 25

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

aaggtggttg ggtggttgtt ttg 23

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

aataacaccc ccaccctgc 19

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

ggagtggttt ttgggtttg 19

<210> 22

<211> 1573

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 22

cgaggacact ttggcgacgc tagtcggtga tcagctgacc cgggcaggga gaggagggtg 60

cccttcgcag agtcacggga agcttcgcct tctgggcttg ctttctcccg cctgcccctg 120

cggttgctct ctgccccagc gagcggagcg ctgctccaag acgctcttct ccctccacct 180

cggcgccccc acctgccgtt gcccccgccc gccgaacgca cgcccaggag ggcgggcccg 240

gagttgagcg cagccgcccg ccgctggaga gcgctgggag ccctgcaagc gagcaaggcc 300

tctctgggcg ccgcgggcag caaatcactc cccgagcctc tcggtccaca aagcgggacc 360

tgcctgcctc gctcaccaac gctcccgggc tgggggggct cgagcaagcg gcgctgcgct 420

ccgcggccct cgccggtccc agtcagctcc aggagcgctc caggctgggt tgggctgggc 480

ctgggcgagc ccggccgctg ggagggggcc tcgtagccct ttccccaggg cgcggtctcc 540

acctctcctg ctcctcctcg ccagctgcgc cgccagctcc cattgttcac cccgcccgcc 600

tggcgacgtc cgggtgctgc tccctgggcc tcccaggcgc acctaccttc tgctgccggc 660

gagccatgtc ggtgggctgc ttggcattaa aggggtaggc gatgcagcgc atcacgaaca 720

catacagctg cagcctcttc ttcctctcct cctcctcttt ctgcagccgc tccaactctt 780

ccttctcctt ctcgctcacc accgacgggc tggggctgga gggccggccg ccgccagcgc 840

ggctgctggg ttgcagcccc ccggccccgc cgccgctgct cgcgccgctg cccccgccgc 900

cgcctgcacc caccccggct ccggcgccgg cgccgccgcc ccccagcccg gcgctgccgg 960

ccgagccctc gctggtacgg ctgggagaca ggcgcgcgcc ggacggggcc gagccgagca 1020

cctccttgcc gctctcctcc tccacgatct catccgattc ttcttcgctg gacgaagggt 1080

ccagcatagt ggcgcctggg gagcggggtc tctggagccc ccggcttgga gtgcaaaagg 1140

tggggggcgc tggaggcagc cggggatcag ctctcccggg tgggcgcttc tccccaggtc 1200

agggagcgag agcgctgctg ctcagcctcg gccgccgcga ctgatcctct gcccggcggt 1260

cgcgagctgg gctcagaccc agaagcgcga agggaggagg ggaagggaga ggtgcgtccg 1320

tggactcgag gtgggcaagg gggagaatca attgcgagcc ccgagcccgc agccggatgc 1380

catctgcggc tgctgaagga ggcgcctcca gaaaagatgc cgagtgttgc aagctgtcga 1440

tgcagccaag agccgaagag gcatcttgcc gattggggag ggagcggcgc ttacgtgttt 1500

attggcttaa ctctcccgtg tccgcggcgt aaagggctgc tgcagagggc tggagggggg 1560

agagcgcgga gcg 1573

<210> 23

<211> 1573

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 23

cgctccgcgc tctcccccct ccagccctct gcagcagccc tttacgccgc ggacacggga 60

gagttaagcc aataaacacg taagcgccgc tccctcccca atcggcaaga tgcctcttcg 120

gctcttggct gcatcgacag cttgcaacac tcggcatctt ttctggaggc gcctccttca 180

gcagccgcag atggcatccg gctgcgggct cggggctcgc aattgattct cccccttgcc 240

cacctcgagt ccacggacgc acctctccct tcccctcctc ccttcgcgct tctgggtctg 300

agcccagctc gcgaccgccg ggcagaggat cagtcgcggc ggccgaggct gagcagcagc 360

gctctcgctc cctgacctgg ggagaagcgc ccacccggga gagctgatcc ccggctgcct 420

ccagcgcccc ccaccttttg cactccaagc cgggggctcc agagaccccg ctccccaggc 480

gccactatgc tggacccttc gtccagcgaa gaagaatcgg atgagatcgt ggaggaggag 540

agcggcaagg aggtgctcgg ctcggccccg tccggcgcgc gcctgtctcc cagccgtacc 600

agcgagggct cggccggcag cgccgggctg gggggcggcg gcgccggcgc cggagccggg 660

gtgggtgcag gcggcggcgg gggcagcggc gcgagcagcg gcggcggggc cggggggctg 720

caacccagca gccgcgctgg cggcggccgg ccctccagcc ccagcccgtc ggtggtgagc 780

gagaaggaga aggaagagtt ggagcggctg cagaaagagg aggaggagag gaagaagagg 840

ctgcagctgt atgtgttcgt gatgcgctgc atcgcctacc cctttaatgc caagcagccc 900

accgacatgg ctcgccggca gcagaaggta ggtgcgcctg ggaggcccag ggagcagcac 960

ccggacgtcg ccaggcgggc ggggtgaaca atgggagctg gcggcgcagc tggcgaggag 1020

gagcaggaga ggtggagacc gcgccctggg gaaagggcta cgaggccccc tcccagcggc 1080

cgggctcgcc caggcccagc ccaacccagc ctggagcgct cctggagctg actgggaccg 1140

gcgagggccg cggagcgcag cgccgcttgc tcgagccccc ccagcccggg agcgttggtg 1200

agcgaggcag gcaggtcccg ctttgtggac cgagaggctc ggggagtgat ttgctgcccg 1260

cggcgcccag agaggccttg ctcgcttgca gggctcccag cgctctccag cggcgggcgg 1320

ctgcgctcaa ctccgggccc gccctcctgg gcgtgcgttc ggcgggcggg ggcaacggca 1380

ggtgggggcg ccgaggtgga gggagaagag cgtcttggag cagcgctccg ctcgctgggg 1440

cagagagcaa ccgcaggggc aggcgggaga aagcaagccc agaaggcgaa gcttcccgtg 1500

actctgcgaa gggcaccctc ctctccctgc ccgggtcagc tgatcaccga ctagcgtcgc 1560

caaagtgtcc tcg 1573

<210> 24

<211> 115

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 24

ctgctgggtt gcagcccccc ggccccgccg ccgctgctcg cgccgctgcc cccgccgccg 60

cctgcaccca ccccggctcc ggcgccggcg ccgccgcccc ccagcccggc gctgc 115

<210> 25

<211> 130

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 25

aggcagccgg ggatcagctc tcccgggtgg gcgcttctcc ccaggtcagg gagcgagagc 60

gctgctgctc agcctcggcc gccgcgactg atcctctgcc cggcggtcgc gagctgggct 120

cagacccaga 130

<210> 26

<211> 172

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 26

agaggtgcgt ccgtggactc gaggtgggca agggggagaa tcaattgcga gccccgagcc 60

cgcagccgga tgccatctgc ggctgctgaa ggaggcgcct ccagaaaaga tgccgagtgt 120

tgcaagctgt cgatgcagcc aagagccgaa gaggcatctt gccgattggg ga 172

<210> 27

<211> 118

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 27

tctgggtctg agcccagctc gcgaccgccg ggcagaggat cagtcgcggc ggccgaggct 60

gagcagcagc gctctcgctc cctgacctgg ggagaagcgc ccacccggga gagctgat 118

<210> 28

<211> 167

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 28

agccgggggc tccagagacc ccgctcccca ggcgccacta tgctggaccc ttcgtccagc 60

gaagaagaat cggatgagat cgtggaggag gagagcggca aggaggtgct cggctcggcc 120

ccgtccggcg cgcgcctgtc tcccagccgt accagcgagg gctcggc 167

<210> 29

<211> 110

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 29

ctgcaaccca gcagccgcgc tggcggcggc cggccctcca gccccagccc gtcggtggtg 60

agcgagaagg agaaggaaga gttggagcgg ctgcagaaag aggaggagga 110

Claims

1.一种子宫内膜癌检测的试剂，其特征在于，所述试剂包括：能够特异性检测DNA样本中靶核苷酸序列中的至少一个CpG二核苷酸位点甲基化水平的检测试剂，所述靶核苷酸序列源自CADPS基因CpG岛的全长或部分区域，其中所述部分区域至少包括一个CpG二核苷酸位点；

其中，所述CADPS基因CpG岛的全长的核苷酸序列包括SEQ ID NO.22及SEQ ID NO.23所示核苷酸序列中的一种或两种；所述CADPS基因CpG岛的部分区域的核苷酸序列包括SEQ IDNO.24至SEQ ID NO.29所示核苷酸序列中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂包括：PCR试剂，所述PCR试剂包括能检测所述靶核苷酸的甲基化水平的特异性引物对和/或特异性探针。

3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述引物对包括如下引物对中的任一组：

SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的组合；

SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的组合；

SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的组合；

SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11的组合；

SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14的组合；和/或

SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17的组合。

4.根据权利要求2或3所述的试剂，其特征在于，所述特异性探针选自：SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15和/或SEQ ID NO.18中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂包括：

(a)反应试剂，能差异修饰所述DNA样本中的甲基化位点和非甲基化位点；以及

6.根据权利要求5所述的试剂，其特征在于，所述反应试剂包括重亚硫酸盐或其衍生物；和/或，

7.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述DNA样本来自哺乳动物的离体生物学样本，所述哺乳动物的离体生物学样本来自血液、子宫内膜组织及子宫内膜的细胞样本中的至少一种。

8.根据权利要求1至7任一项中所述的试剂在制备子宫内膜癌检测的试剂盒中的应用。