JP2022539904A - 遺伝子マーカー組成物及びその使用 - Google Patents
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Abstract
腫瘍マーカー、メチル化検出試薬、キット及びその使用に関する。ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化レベルを検出することにより、糞便サンプルから結腸直腸がんサンプルを良好に判断することができ、結腸直腸がんに対する検出感度及び特異性は９０％以上に達する。【選択図】図１
Description
本発明は、生物医学分野に属し、特に、腫瘍マーカー、メチル化検出試薬、キット及びその使用に関する。
結腸直腸がんは、大腸がんとも呼ばれ、よく見られる消化管悪性腫瘍である。中国では結腸直腸がんの発症率が年々高くなり、上海や広州などの中国の沿岸地域では、結腸直腸がんの発症率は肺がんに次いで第２位となった。現在、腸がんの発症は、遺伝的及び後成的欠陥の蓄積によると考えられている。結腸直腸がんの発症は、初期には潜行性であり、明らかな症状がないことが多く、晩期には、血便、腹痛、下痢などの症状が現れることがある。症状が現れ診察を受けると、ほとんど既に晩期となっているため、患者に大きな痛みと高価な治療をもたらす。したがって、早期発見、早期診断、早期治療は、結腸直腸がんの発症率と死亡率を減らすための重要な措置である。
スクリーニングにより、腸がんと前がん病変を早期に発見し、病巣を取り除くことで、腸がんの発症を防止することができる。現在、大腸がんのスクリーニング方法には、主に潜血検査と大腸内視鏡検査が含まれる。潜血検査では、食物の影響を受けやすく、又は腺腫の検出率が低いという問題がある。大腸内視鏡検査は、腸がん診断金の基準であるが、スクリーニング手段として使用する場合、患者のコンプライアンスが高くない。そのため、精度とコンプライアンスが高い腸がんのスクリーニング方法が必要とされている。
糞便の遺伝子検出は、腸がんの新しいスクリーニング方法としてますます注目されている。この方法（Ｃｏｌｏｇｕａｒｄ（登録商標））は、２０１６年に米国の腸がんスクリーニングガイドラインに組み込まれた。この方法は便利で、非侵襲的で、腸がんと前がん病変腺腫に対する検出率が高いという特徴を持っている。腸がんに対する検出性が高い糞便遺伝子検出キットを作製するために、主に糞便ＤＮＡの抽出とマーカーの選択の２つの問題を克服する必要がある。一方、糞便中の成分は複雑で、下流の反応を抑制するものが多く、細菌ＤＮＡも多くあり、このような混合物からヒトの標的遺伝子を抽出するためには、高感度の遺伝子抽出と精製方法が必要である。一方、現在、腸がんに関連するマーカー、特にＤＮＡメチル化マーカーが多くなり、研究によると、ＤＮＡメチル化は腫瘍形成の早期イベントである。しかし、多くのメチル化マーカーは、細胞レベル及び組織レベルで良好に機能するが、糞便や血液などのスクリーニング媒体に使用されると、腸がんに対する感度と特異性が低下する。例えば、ｖｉｍｅｎｔｉｎ遺伝子は、組織において感度が８３％であるが、糞便サンプルにおいて４６％に低下する（Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．２００５Ａｕｇ ３；９７（１５）：１１２４－３２．）。
また、大腸がんの発症メカニズムが比較的複雑なため、多遺伝子遺伝疾患である。現在、大腸がんに対する単一メチル化マーカーの検出方法には、以下の２つの制限がある。第一に、従来の研究及び製品の検出方法は、いずれも1つのＰＣＲ反応ウェル内で1つのマーカーを検出することであり、検出方法では１つのＰＣＲ反応ウェル内でメチル化マーカーに対する多重検出を実現することができなかった。第二に、大腸がんを検出するためのメチル化マーカー、例えば、ＳＤＣ２、ＩＴＡＧ４、Ｓｅｐｔｉｎ９などは、単一遺伝子のメチル化レベルを検出することにより大腸がんを検出するときの検出感度は、遺伝的要因により制限されている。メチル化ＳＤＣ２遺伝子の検出感度は８４．２％、特異性は９７．９％である。メチル化ＩＴＧＡ４の検出感度は８３．８％、特異性は９５．２％である。メチル化Ｓｅｐｔｉｎ９の検出感度は７９．３％、特異性は９４．３％である。これらの単一マーカーは、いずれも大腸がんに対する検出特異性が９０％以上であるが、特異性が９０％以上の場合の感度は、いずれも９０％以上に達していない。
大腸がんの単一のメチル化マーカーはいくつかの大腸がんを検出することができるが、分子生物学的方法によってできるだけ多くの大腸がん患者を検出するために大腸がん関連マーカーを組み合わせる必要がある。しかし、直面する問題は以下のとおりである。１、ほとんどの大腸がん遺伝子メチル化マーカーは、大腸がんに対する検出価値において性能が重複する現象を示す。つまり、同一の大腸がん患者サンプルの検出状況は、ほとんどのメチル化マーカーにおいて一致する。そのため、大腸がんに対する検出能力が相互補完できる遺伝子メチル化マーカーを選別するのは非常に困難であり、大量の研究が必要である。また、遺伝子メチル化マーカーが多くなるほど、検出系の偽陽性現象が重なり、検出特異性が低下する。そのため、一定の検出特異性を確保する前提で大腸がんの検出感度を向上させることは非常に困難である。２、検出コスト、感度及び特異性のバランスをとる必要がある。
中国特許出願ＣＮ１０９２０７５９２Ａにおいて、多くのマーカーにより結腸直腸がんを検出するモデルを分析した結果、ＳＥＰＴ９、ＮＤＲＧ４、ＳＤＣ２組合せ検出の感度は僅か８８．６％、特異性は僅か８９．１％であり、ＫＲＡＳ、ＢＭＰ３、ＮＤＲＧ４、ＳＥＰＴ９、ＳＤＣ２の多くの異なる組み合わせ検出モデルでは、ＲＯＣ曲線のＡＵＣ値は最大僅か０．９１２であり、この０．９１２のＡＵＣ値を得るのに同時に５つの遺伝子マーカーを共同で検出する必要があった。
いくつかの実施形態において、特異性が高く、感度が高い結腸直腸がんの遺伝子マーカー、この遺伝子マーカーを用いた診断試薬及びその使用が提供される。
いくつかの実施形態において、遺伝子マーカー組成物が提供される。前記遺伝子マーカーは、ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４を含む。従来の腸がんを検出するためのマーカーに比べ、本発明で提供されるＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子組成物及び技術案は、極めて高い感度及び特異性で結腸直腸がんを検出することができる。本発明に係る技術案は、結腸直腸がんに対する検出感度及び特異性がいずれも９０％よりも高い。
いくつかの実施形態において、ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子組成物のメチル化に対して組合せ検出を行う。この方法により、多遺伝子に対する組合せ検出が実現され、試験の複雑さが大幅に低下し、検出効率が向上する。
いくつかの実施形態において、ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出試薬を含む検出試薬／検出キットが提供される。
いくつかの実施形態において、ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子組成物を含むメチル化検出試薬を用いる抽出検出方法は、結腸直腸がん及び健常者を非常に便利で正確に判断することができる。この遺伝子組成物のメチル化検出試薬は、糞便遺伝子検出キット及び腸がんの臨床検出への適用が期待され得る。
いくつかの実施形態において、前記試薬／キットは、メチル化レベルによりがんを検出及び診断する。数多くの研究により、メチル化レベルの変化は腫瘍形成の初期のイベントであることが実証されている。そのため、メチル化異常の検出により、早期病変がより容易に発見され得る。
いくつかの実施形態において、前記検出試薬／検出キットは、ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子に対する捕捉配列、プライマー及び／又はプローブを含む。
いくつかの実施形態において、前記捕捉配列は、単離された捕捉配列である。
いくつかの実施形態において、前記プライマーは、単離されたプライマーである。
いくつかの実施形態において、前記プローブは、単離されたプローブである。
いくつかの実施形態において、前記検出試薬／検出キットは、それぞれの遺伝子のＣｐＧアイランドに対して得られる捕捉配列、プライマー及び／又はプローブを含む。
いくつかの実施形態において、前記ＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出捕捉配列は、
Ｉ：配列番号１又は配列番号２に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＩＩ：前記Ｉに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
Ｉ：配列番号１又は配列番号２に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＩＩ：前記Ｉに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
及び／又は、前記ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出捕捉配列は、
ＩＩＩ：配列番号６に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＩＶ：前記ＩＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
ＩＩＩ：配列番号６に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＩＶ：前記ＩＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
及び／又は、前記ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出捕捉配列は、
Ｖ：配列番号１０に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＶＩ：前記Ｖに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
Ｖ：配列番号１０に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＶＩ：前記Ｖに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記ＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出プライマーにおける上流プライマーは、
ＶＩＩ：配列番号３に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＶＩＩＩ：前記ＶＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
ＶＩＩ：配列番号３に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＶＩＩＩ：前記ＶＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
及び／又は、前記ＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出プライマーにおける下流プライマーは、
ＩＸ：配列番号４に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
Ｘ：前記ＩＸに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
ＩＸ：配列番号４に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
Ｘ：前記ＩＸに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
及び／又は、前記ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プライマーにおける上流プライマーは、
ＸＩ：配列番号７又は配列番号１８に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＩＩ：前記ＸＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
ＸＩ：配列番号７又は配列番号１８に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＩＩ：前記ＸＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
及び／又は、前記ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プライマーにおける下流プライマーは、
ＸＩＩＩ：配列番号８又は配列番号１９に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＩＶ：ＸＩＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
ＸＩＩＩ：配列番号８又は配列番号１９に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＩＶ：ＸＩＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号７及び配列番号８に示される。
いくつかの実施形態において、前記ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号１８及び配列番号１９に示される。
及び／又は、前記ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プライマーにおける上流プライマーは、
ＸＶ：配列番号１１又は配列番号１６に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＶＩ：前記ＸＶに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
ＸＶ：配列番号１１又は配列番号１６に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＶＩ：前記ＸＶに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
及び／又は、前記ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プライマーにおける下流プライマーは、
ＸＶＩＩ：配列番号１２又は配列番号１７に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＶＩＩＩ：前記ＸＶＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
ＸＶＩＩ：配列番号１２又は配列番号１７に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＶＩＩＩ：前記ＸＶＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号１１及び配列番号１２に示される。
いくつかの実施形態において、前記ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号１６及び配列番号１７に示される。
いくつかの実施形態において、前記ＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出プローブは、
ＸＩＸ：配列番号５に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＸ：前記ＸＩＸに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
ＸＩＸ：配列番号５に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＸ：前記ＸＩＸに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
及び／又は、前記ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プローブは、
ＸＸＩ：配列番号９に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＸＩＩ：前記ＸＸＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
ＸＸＩ：配列番号９に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＸＩＩ：前記ＸＸＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
及び／又は、前記ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プローブは、
ＸＸＩＩＩ：配列番号１３に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＸＩＶ：前記ＸＸＩＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
ＸＸＩＩＩ：配列番号１３に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＸＩＶ：前記ＸＸＩＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
いくつかの具体的な実施形態において、ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子組成物におけるそれぞれの遺伝子のプロモーター領域のメチル化レベルを検出することにより、糞便サンプルから結腸直腸がんサンプルを効率的に判断することができる。この遺伝子組成物を含むメチル化組合せ検出試薬により結腸直腸がんを検出し、腸がんに対する検出感度及び特異性は極めて高い。
いくつかの実施形態において、結腸直腸腫瘍検出試薬又はキットの製造における多遺伝子のメチル化組合せ検出試薬の使用が提供される。前記遺伝子は、ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４を含む。
いくつかの実施形態において、前記多遺伝子メチル化組合せ検出試薬は、それぞれの遺伝子のメチル化検出捕捉配列、プライマー及び／又はプローブを含む。
いくつかの実施形態において、それぞれの遺伝子のＣｐＧアイランドに対して得られる捕捉配列、プライマー及び／又はプローブを含む。
本発明の「ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２」とは、「ＣＯＬ４Ａ１又はＣＯＬ４Ａ２」を指す。ヒト遺伝子ＣＯＬ４Ａ１及びＣＯＬ４Ａ２は、１３番染色体長腕の遠位において緊密に結合され、「Ｈｅａｄ－ｔｏ－Ｈｅａｄ」の位置関係にあり、転写方向が互いに逆向きである。ＣＯＬ４Ａ１及びＣＯＬ４Ａ２遺伝子の５’末端が互いに近く、間隔が１２７ｂｐである。この部分の配列は、両遺伝子が共有する双方向プロモーター領域である［１］。そのため、両者が共する双方向プロモーターに応じて設計される配列は、ＣＯＬ４Ａ１及びＣＯＬ４Ａ２の両方に対応することができる。本発明において、ＣＯＬ４Ａ１とＣＯＬ４Ａ２のどちらで配列情報を標識しても違いはない。
本発明における遺伝子マーカーＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４は、共同で検出される。いくつかの実施形態において、ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４に対して、それぞれメチル化レベルを検出してもよい。別の実施形態において、ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４に対してメチル化レベルを同時に検出することができ、例えば、リアルタイム多重蛍光定量ＰＣＲにより複数の遺伝子のメチル化レベルを検出する。いくつかの態様では、多重ＰＣＲによりＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４を同時に検出するのがより便利である。
本明細書において、「検出」と「診断」は、同じであり、結腸直腸腫瘍の早期診断に加えて、結腸直腸腫瘍の中期及び晩期診断を含み、結腸直腸腫瘍の選別、リスクの評価、予後、疾患の識別、病期の診断及び治療標的の選択も含む。
結腸直腸腫瘍マーカーであるＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４の組み合わせの使用により、結腸直腸腫瘍の早期診断は可能となる。がん細胞におけるメチル化遺伝子が臨床的又は形態学的に正常に発現する細胞においてメチル化されたことが確定された場合、この正常に発現する細胞はがんに発展していることが示されている。そのため、結腸直腸がんは、正常に発現する細胞における結腸直腸腫瘍特異性ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子組成物のメチル化により早期に診断することができる。
そのうち、早期診断とは、転移前、好ましくは組織又は細胞の形態学的変化の前にがんを発見する可能性を指す。
結腸直腸腫瘍の早期診断に加え、本発明における試薬／キットは、結腸直腸腫瘍の選別、リスクの評価、予後診断、疾患識別、病期での診断、及び治療標的の選択にも適用できる。
病期で選択可能な実施形態として、結腸直腸腫瘍の異なる段階又は時期での進行に応じてサンプルから得られるＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子組成物のメチル化程度の測定により診断することができる。結腸直腸がんの各段階のサンプルから単離された核酸のＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子組成物のメチル化程度と異常な細胞増殖がない腸組織のサンプルから単離された１つ又は複数の核酸のＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子組成物のメチル化程度とを比較することにより、サンプルにおける結腸直腸腫瘍の具体的な段階を確定することができる。
一般的に、ＣｐＧアイランドとは、ＣｐＧジヌクレオチドが大量に含まれる領域を指し、通常、プロモーター及びその近傍の領域に位置する。本発明のメチル化の検出部位は、ＣｐＧアイランドのみならず、他の領域、例えば、遺伝子本体若しくは遺伝子間領域のヘテロメチル化のＣｐＧ部位、又は独立したＣｐＧ部位を含む。
前記ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子組成物のメチル化組合せ検出試薬は、従来技術におけるメチル化検出試薬であってもよい。従来技術には、標的遺伝子のメチル化を検出可能な方法が多くなり、例えば、メチル化特異性ＰＣＲ（ＭＳＰ）、メチル化特異的定量ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）、メチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質のＰＣＲ、定量ＰＣＲ及びＤＮＡチップ、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ、バイサルファイトシークエンス法又はパイロシーケンス法などがある。他のメチル化検出方法として、特許ＵＳ６２００７６８７に記載の方法が挙げられる。それぞれの検出方法には、対応する試薬があり、これらの試薬はいずれも本発明のＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子組成物のメチル化検出に適用できる。
いくつかの実施形態において、本発明によれば、ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子組成物におけるそれぞれの遺伝子に対して得られる捕捉配列、プライマー及び／又はプローブを含むＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子組成物のメチル化組合せ検出試薬がさらに提供される。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子組成物におけるそれぞれの遺伝子のＣｐＧアイランドに対して得られる捕捉配列、プライマー及び／又はプローブを含む。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、プライマー及び／又はプローブは、定量的メチル化特異的ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）によりＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子組成物におけるそれぞれの遺伝子のメチル化を検出する。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明で提供されるメチル化検出試薬により、ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子組成物におけるそれぞれの遺伝子の遺伝子本体、遺伝子間領域、又はプロモーター領域及びプロモーター領域の近傍の領域のメチル化レベルを検出する。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明で提供されるメチル化組合せ検出試薬は、ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子組成物におけるそれぞれの遺伝子のプロモーター領域又は前記プロモーター領域の近傍領域のＣｐＧアイランドに対して得られる捕捉配列、プライマー及び／又はプローブを含む。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明で提供されるメチル化組合せ検出試薬における前記ＳＤＣ２遺伝子捕捉配列は、
Ｉ：配列番号１及び配列番号２に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＩＩ：前記Ｉに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
Ｉ：配列番号１及び配列番号２に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＩＩ：前記Ｉに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
及び／又は、前記ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出捕捉配列は、
ＩＩＩ：配列番号６に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＩＶ：ＩＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
ＩＩＩ：配列番号６に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＩＶ：ＩＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
及び／又は、前記ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出捕捉配列は、
Ｖ：配列番号１０に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＶＩ：前記Ｖに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
Ｖ：配列番号１０に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＶＩ：前記Ｖに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明で提供される前記ＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出プライマーにおける上流プライマーは、
ＶＩＩ：配列番号３に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＶＩＩＩ：前記ＶＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
ＶＩＩ：配列番号３に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＶＩＩＩ：前記ＶＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
及び／又は、前記ＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出プライマーにおける下流プライマーは、
ＩＸ：配列番号４に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
Ｘ：前記ＩＸに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
ＩＸ：配列番号４に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
Ｘ：前記ＩＸに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
及び／又は、前記ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プライマーにおける上流プライマーは、
ＸＩ：配列番号７及び配列番号１４に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＩＩ：前記ＸＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
ＸＩ：配列番号７及び配列番号１４に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＩＩ：前記ＸＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
及び／又は、前記ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プライマーにおける下流プライマーは、
ＸＩＩＩ：配列番号８及び配列番号１５に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＩＶ：ＸＩＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
ＸＩＩＩ：配列番号８及び配列番号１５に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＩＶ：ＸＩＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号７及び配列番号８に示される。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号１４及び配列番号１５に示される。
いくつかの実施形態において、前記ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プライマーにおける上流プライマーは、
ＸＶ：配列番号１１及び配列番号１６に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＶＩ：前記ＸＶに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
ＸＶ：配列番号１１及び配列番号１６に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＶＩ：前記ＸＶに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
及び／又は、前記ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プライマーにおける下流プライマーは、
ＸＶＩＩ：配列番号１２及び配列番号１７に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＶＩＩＩ：前記ＸＶＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
ＸＶＩＩ：配列番号１２及び配列番号１７に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＶＩＩＩ：前記ＸＶＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号１１及び配列番号１２に示される。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号１６及び配列番号１７に示される。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明で提供されるメチル化検出試薬中前記ＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出プローブは、
ＸＩＸ：配列番号５に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＸ：前記ＸＩＸに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
ＸＩＸ：配列番号５に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＸ：前記ＸＩＸに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
及び／又は、前記ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プローブは、
ＸＸＩ：配列番号９に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＸＩＩ：前記ＸＸＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
ＸＸＩ：配列番号９に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＸＩＩ：前記ＸＸＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
及び／又は、前記ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プローブは、
ＸＸＩＩＩ：配列番号１３に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＸＩＶ：前記ＸＸＩＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
ＸＸＩＩＩ：配列番号１３に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＸＩＶ：前記ＸＸＩＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記核酸プローブ上には、標識、例えば、放射性同位元素、蛍光基、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート及び酵素のうちの１種又は複数種をさらに含む。
いくつかの実施形態において、プローブの標識が蛍光基である。これらの蛍光基には、ＶＩＣ、ＲＯＸ、ＦＡＭ、Ｃｙ５、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＥＤ及びＴｅｘａｓ Ｒｅｄなどのうちの１種又は複数種が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、前記ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子のプローブは、同じ蛍光基で標識される。これによって、１つの蛍光チャネルのみによりこれらの遺伝子のメチル化レベルの和を容易に検出することができ、それぞれの遺伝子に対して異なる蛍光チャネルで検出する必要がないため、試験の複雑さが低下する。
いくつかの実施形態において、本発明によれば、前記メチル化組合せ検出試薬を含む腫瘍検出キットがさらに提供される。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明で提供されるキットは、捕捉試薬を含む第１容器と、増幅用のプライマーペアを含む第２容器と、プローブを含む第３容器とを含む。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明で提供されるキットは、キットに一般的に使用される試薬をさらに含む。例えば、ｑＭＳＰに一般的に使用される転換剤は、メチル化されていないシトシン塩基をウラシルに転換するが、メチル化されたシトシン塩基が変化しない。前記転換剤には特に制限がなく、従来技術に開示のシトシンからウラシルへの転換を実現できる試薬であればよく、例えば、ヒドラジン塩、重亜硫酸水素塩及び亜硫酸水素塩（例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素カリウム、亜硫酸水素セシウム、亜硫酸水素アンモニウムなど）のうちの１種又は複数種が挙げられる。また、前記キットは、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子の増幅に一般的に使用されるＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、Ｍｇ２＋イオン及び緩衝液などをさらに含んでもよい。
いくつかの具体的な実施形態において、前記キットは、捕捉試薬を含む第１容器と、増幅に使用されるプライマーペアを含む第２容器と、プローブを含む第３容器と、メチル化されていないシトシンを転換するための転換試薬を含む第４容器とを含む。
いくつかの具体的な実施形態において、前記キットは、説明書をさらに含む。
いくつかの具体的な実施形態において、前記キットは、核酸抽出試薬をさらに含む。
いくつかの具体的な実施形態において、前記キットは、サンプリング装置をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本発明によれば、結腸直腸腫瘍検出試薬又はキットの製造におけるＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化組合せ検出試薬の使用が提供される。
いくつかの実施形態において、本発明によれば、プライマーが提供される。前記プライマーは、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７に示される配列又はその相補配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有する配列から選択される少なくともいずれか１つである。
いくつかの実施形態において、前記プライマーは、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７に示される配列から選択されるいずれか１つである。
いくつかの実施形態において、前記プライマーペアは、配列番号３及び配列番号４、配列番号７及び配列番号８、配列番号１１及び配列番号１２、配列番号１４及び配列番号１５、並びに配列番号１６及び配列番号１７に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有する配列から選択される少なくとも１対のプライマーペアである。
いくつかの実施形態において、前記プライマーペアは、配列番号３及び配列番号４、配列番号７及び配列番号８、並びに配列番号１１及び配列番号１２に示されるプライマーペアから選択される。
いくつかの実施形態において、前記プライマーペアは、配列番号３及び配列番号４、配列番号１４及び配列番号１５、並びに配列番号１６及び配列番号１７に示されるプライマーペアから選択される。
いくつかの実施形態において、本発明によれば、捕捉配列が提供される。前記捕捉配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号６、配列番号１０に示される配列又はその相補配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有する配列から選択される少なくともいずれか１つである。
いくつかの実施形態において、前記捕捉配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号６、配列番号１０に示される配列のうちの少なくとも１つである。
いくつかの実施形態において、前記捕捉配列は、配列番号１、配列番号６及び配列番号１０に示される配列から選択される。
いくつかの実施形態において、前記捕捉配列は、配列番号２、配列番号６及び配列番号１０に示される配列から選択される。
いくつかの実施形態において、本発明によれば、核酸プローブがさらに提供される。前記核酸プローブは、配列番号５、配列番号９、配列番号１３に示される配列又はその相補配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有する配列から選択される少なくともいずれか１つである。
いくつかの実施形態において、前記核酸プローブは、配列番号５、配列番号９、配列番号１３に示される配列から選択される少なくとも１つである。
いくつかの実施形態において、前記核酸プローブは、配列番号５、配列番号９及び配列番号１３に示される配列から選択される。
いくつかの実施形態において、本発明によれば、メチル化検出試薬若しくはキット又は結腸直腸腫瘍の検出試薬若しくはキットの製造における前記メチル化検出試薬、キット、捕捉配列、プライマー及び／又はプローブの使用がさらに提供される。
いくつかの実施形態において、本発明によれば、メチル化検出又は結腸直腸腫瘍の検出における前記メチル化検出試薬、キット、捕捉配列、プライマー及び／又はプローブの使用がさらに提供される。
いくつかの実施形態において、本発明によれば、
（１）ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化組合せ検出部と、
（２）データ処理部と、
（３）結果出力部と、
を含む腫瘍検出システムがさらに提供される。
（１）ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化組合せ検出部と、
（２）データ処理部と、
（３）結果出力部と、
を含む腫瘍検出システムがさらに提供される。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記メチル化検出部は、メチル化検出機器を含む。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記メチル化検出部は、前記メチル化組合せ検出試薬、キット、捕捉配列、プライマー及びプローブのうちの１種又は複数種を含む。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記メチル化検出機器は、蛍光定量ＰＣＲ装置、ＰＣＲ装置、シーケンサのうちの１種又は複数種を含む。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記データ処理部は、データ処理装置を含む。
前記データ処理装置は、当業者が使用できるデータ処理可能な任意の設備、機器又は装置を含む。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記データ処理装置は、計算器、コンピュータのうちの１種又は複数種を含む。
前記コンピュータには、当業者が使用できるデータ処理又は統計分析可能な任意のソフトウェア又はプログラムが搭載されている。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記コンピュータは、ＳＰＳＳ、ＳＡＳ、Ｅｘｃｅｌのうちの１種又は複数種のソフトウェアが搭載されたコンピュータを含む。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記結果出力部は、結果出力装置を含む。
前記出力装置は、データ処理結果を読み取り可能なコンテンツとして表示可能な設備、機器又は装置を含む。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記結果出力装置は、スクリーン、紙報告書のうちの１種又は複数種を含む。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記データ処理装置は、ａ．検出サンプル及び正常対照サンプルのテストデータを受信し、ｂ．検出サンプル及び正常対照サンプルのテストデータを記憶し、ｃ．同じタイプの検出サンプルと正常対照サンプルとのテストデータを比較し、ｄ．比較結果に基づいて被験体が腫瘍に罹患する確率又は可能性を判断するように構成される。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記結果出力部は、被験体罹が腫瘍に罹患する確率又は可能性の出力に用いられる。
いくつかの実施形態において、本発明によれば、結腸直腸腫瘍の診断方法がさらに提供される。前記方法は、以下のステップを含む。
（１）被験体に由来の検出サンプルにおけるＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化レベルを検出する。
（２）検出サンプルと正常対照サンプルのＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子メチル化レベルを比較する。
（３）検出サンプルと正常対照サンプルのメチル化レベルのずれに基づいて結腸直腸腫瘍を診断する。
（２）検出サンプルと正常対照サンプルのＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子メチル化レベルを比較する。
（３）検出サンプルと正常対照サンプルのメチル化レベルのずれに基づいて結腸直腸腫瘍を診断する。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化レベル検出は、メチル化特異的定量ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）などの従来技術に存在するメチル化定量検出方法により行われる。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化レベル検出は、前記捕捉配列、プライマー及び／又はプローブを用いて行われる。
本発明の診断方法は、結腸直腸腫瘍の治療前後に使用されてもよく、治療と併用されてもよい。治療後の使用は、例えば、治療の成功の評価、或いは治療後の結腸直腸腫瘍の緩和、再発及び／又は進行（転移を含む）の監視である。
いくつかの実施形態において、本発明によれば、結腸直腸腫瘍の診断方法がさらに提供される。前記方法は、以下のステップを含む。
（１）被験体に由来の検出サンプルにおけるＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化レベルを検出する。前記検出は、被験体検出サンプルとＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化レベル検出試薬とを接触させることを含む。
（２）前記検出サンプルと正常対照サンプルのＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化レベルを比較する。
（３）検出サンプルと正常対照サンプルのメチル化レベルのずれに基づいて結腸直腸腫瘍を診断する。
（２）前記検出サンプルと正常対照サンプルのＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化レベルを比較する。
（３）検出サンプルと正常対照サンプルのメチル化レベルのずれに基づいて結腸直腸腫瘍を診断する。
いくつかの実施形態において、本発明によれば、結腸直腸腫瘍の治療方法が提供される。前記方法は、前記診断方法により結腸直腸腫瘍として診断された患者に対して、手術、化学療法、放射線療法、放射線化学療法、免疫療法、腫瘍溶解性ウイルス療法、当該技術分野で使用される他のタイプの結腸直腸腫瘍の治療方法、又はこれらの治療方法の組み合わせを実施することを含む。
いくつかの実施形態において、結腸直腸腫瘍の治療方法が提供される。前記方法は、以下のステップを含む。
（１）被験体に由来の検出サンプルにおけるＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化レベルを検出する。
（２）検出サンプルと正常対照サンプルのＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化レベルを比較する。
（３）検出サンプルと正常対照サンプルのメチル化レベルのずれに基づいて結腸直腸腫瘍を診断する。被験体が結腸直腸腫瘍患者として診断された場合、前記被験体に結腸直腸腫瘍治療薬を投与して治療を行う。
（２）検出サンプルと正常対照サンプルのＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化レベルを比較する。
（３）検出サンプルと正常対照サンプルのメチル化レベルのずれに基づいて結腸直腸腫瘍を診断する。被験体が結腸直腸腫瘍患者として診断された場合、前記被験体に結腸直腸腫瘍治療薬を投与して治療を行う。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記腫瘍的検出システムにおけるデータ処理部又は前記結腸直腸腫瘍の診断方法の判断標準は、メチル化特異的定量ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）のＣｔ値の限界値に基づいて腫瘍サンプル及び正常サンプルを判断することである。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、Ｃｔ値の限界値は約３６－３９である。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、Ｃｔ値の限界値は約３８である。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記Ｃｔ値の限界値は約３６－３９である。
いくつかの実施形態において、対象となるサンプルは、糞便サンプルである。
本発明の別の技術態様において、ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子組成物のメチル化検出試薬は、糞便サンプルに対して特異性が９５．２８％である場合に９１．３６％の結腸直腸がんを検出することができるため、糞便を検出サンプルとして結腸直腸がんを信頼性が高い診断を行うことができる。糞便サンプルは、入手が容易であり、サンプリングが非侵襲的で簡単であるため、患者に苦痛や不便を与えることはない。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記検出サンプルのＣｔ値が前記Ｃｔ値の限界値未満である場合、腫瘍サンプルとして判断され、前記検出サンプルのＣｔ値が前記Ｃｔ値の限界値以上である場合、正常サンプルとして判断される。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明に記載の腫瘍は、結腸直腸腫瘍である。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明に記載の腫瘍は、結腸直腸がん又は腺腫である。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明の対象となる検出サンプル又はサンプルのタイプは、組織、体液又は排泄物を含む。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明に記載の組織は、腸組織を含む。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明に記載の体液は、血液、血清、血漿、細胞外液、組織液、リンパ液、脳脊髄液又は房水を含む。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記排泄物は、喀痰、尿液、唾液又は糞便を含む。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記排泄物は、糞便を含む。
いくつかの実施形態において、上述配列は、単離された配列である。
以下、具体的な実施例により本発明の技術的手段をさらに説明する。以下の実施例は、本発明の保護範囲を制限するものではない。当業者が本発明の思想に基づいて行う非本質的な修正及び調整も本発明の保護範囲に含まれる。
本明細書において、「捕捉配列」、「プライマー」又は「プローブ」とは、標的核酸分子（例えば、標的遺伝子）の少なくとも６つの連続ヌクレオチド配列と相補的な領域を含むオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態において、前記プライマー又はプローブの少なくとも一部の配列は、増幅した配列と相補的ではない。いくつかの実施形態において、プライマー又はプローブは、標的分子の少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９又は少なくとも２０個の連続ヌクレオチドの配列と相補的な領域を含む。プライマー又はプローブが「標的分子の少なくともｘ個の連続ヌクレオチドと相補的な」領域を含む場合、前記プライマー又はプローブは、標的分子の少なくともｘ個の連続又は非連続のブロックヌクレオチドの少なくとも９５％と相補的である。いくつかの実施形態において、プライマー又はプローブは、標的分子の少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％と相補的である。
本明細書において、「正常」サンプルとは、前記がん又は腫瘍がないと知られている個体から分離された同じタイプのサンプルを指す。
本明細書において、前記「被験体」は、哺乳動物、例えば、ヒトである。
本明細書において、メチル化検出用のサンプルは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡを含むＤＮＡ及びＲＮＡサンプル、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを含むが、これらに限定されない。ＤＮＡ及びＲＮＡは一本鎖でも二本鎖でもよい。
本明細書において、「メチル化レベル」は「メチル化程度」と同義であり、通常メチル化シトシンの百分率（メチル化シトシンの数をメチル化シトシンの数と非メチル化シトシンの数との和で割る）として示されてもよく、メチル化標的遺伝子の数を内部参照遺伝子の数で割る現在一般的に使用している方法及び従来技術における他のメチル化レベル表示方法によりメチル化レベルを示してもよい。
本明細書において、「サンプル」は「検体」と同義である。
本明細書において、用語「及び／又は」とは、１つ又は複数の関連する列挙項目のいずれか及びすべての組み合わせを指す。２つ以上の項目のリストに使用される場合、用語「及び／又は」は、列挙項目におけるいずれか１つを単独で使用してもよいか、又はこれらの項目のいずれかの組み合わせを使用してもよいことを指す。例えば、組成物、組み合わせ、構造などが成分Ａ、Ｂ、Ｃ及び／又はＤを含む（又は含有する）として記述される場合、この組成物は、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、Ｄ単独；ＡとＢの組み合わせ、ＡとＣの組み合わせ、ＡとＤの組み合わせ、ＢとＣの組み合わせ、ＢとＤの組み合わせ、ＣとＤの組み合わせ、ＡとＢとＣの組み合わせ、ＡとＢとＤの組み合わせ、ＡとＣとＤの組み合わせ、ＢとＣとＤの組み合わせ、又はＡとＢとＣとＤの組み合わせであり得る。
実施例１
９３５例の糞便サンプル（３５９例の結腸直腸がん、６７例の腺腫（≧１ｃｍ）、５０９例の非腫瘍被験体；いずれも大腸内視鏡検査による診断又は病理検査による診断済）を選択し、研磨して遠心分離し、５０ｕｌ捕捉磁気ビーズ（ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ２、ＩＴＧＡ４及び内部参照遺伝子ＡＣＴＢの捕捉配列を含む）を加え、以下の「手順」に従って操作した。
１）大腸内視鏡検査又は病理検査結果を有する正常なヒト及び結腸直腸腫瘍患者の糞便サンプルを収集し、１ｇ糞便：４ｍＬ保護液の割合で混合して研磨した後、５０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、沈殿を捨て、上清を収集した。
２）１０ｍＬ上清を取り、再度遠心分離し、３．２ｍＬ上清を取り、そこに２ｍＬ溶解液及び５０ｕｌ捕捉磁気ビーズＭ１を加え、９５℃で１５ｍｉｎインキュベートし、その後、室温で３０ｍｉｎ静置した。
３）マグネットスタンドに置き、上清の一部を捨てた後、磁気ビーズを洗浄して２ｍＬ遠心分離管に移し、８００ｕｌ洗浄液Ｗ１を加え、室温、１３００ｒｐｍで１ｍｉｎインキュベートし、マグネットスタンドに置き、上清を吸い取って除去し、上記を２回繰り返した。
４）５０ｕｌ溶出液を加え、室温、１３００ｒｐｍで５ｍｉｎインキュベートし、マグネットスタンドに置き、３ｍｉｎ以内で溶出液を新しいＥＰ管に移した。
５）ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、前のステップで得られたＤＮＡ断片に対して参考文献［２］に記載の方法によりメチル化処理を行い、最後の溶出液２０ｕｌをｑＭＳＰ検出に使用した。
最終的にバイサルファイト変換後のＤＮＡを２０ｕｌ得た。そして、ｑＭＳＰ検出を行い、最後にＣＴ値に基づいてサンプルにおけるＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧ４遺伝子組成物のメチル化レベルを判断した。
９３５例の糞便サンプル（３５９例の結腸直腸がん、６７例の腺腫（≧１ｃｍ）、５０９例の非腫瘍被験体；いずれも大腸内視鏡検査による診断又は病理検査による診断済）を選択し、研磨して遠心分離し、５０ｕｌ捕捉磁気ビーズ（ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ２、ＩＴＧＡ４及び内部参照遺伝子ＡＣＴＢの捕捉配列を含む）を加え、以下の「手順」に従って操作した。
１）大腸内視鏡検査又は病理検査結果を有する正常なヒト及び結腸直腸腫瘍患者の糞便サンプルを収集し、１ｇ糞便：４ｍＬ保護液の割合で混合して研磨した後、５０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、沈殿を捨て、上清を収集した。
２）１０ｍＬ上清を取り、再度遠心分離し、３．２ｍＬ上清を取り、そこに２ｍＬ溶解液及び５０ｕｌ捕捉磁気ビーズＭ１を加え、９５℃で１５ｍｉｎインキュベートし、その後、室温で３０ｍｉｎ静置した。
３）マグネットスタンドに置き、上清の一部を捨てた後、磁気ビーズを洗浄して２ｍＬ遠心分離管に移し、８００ｕｌ洗浄液Ｗ１を加え、室温、１３００ｒｐｍで１ｍｉｎインキュベートし、マグネットスタンドに置き、上清を吸い取って除去し、上記を２回繰り返した。
４）５０ｕｌ溶出液を加え、室温、１３００ｒｐｍで５ｍｉｎインキュベートし、マグネットスタンドに置き、３ｍｉｎ以内で溶出液を新しいＥＰ管に移した。
５）ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、前のステップで得られたＤＮＡ断片に対して参考文献［２］に記載の方法によりメチル化処理を行い、最後の溶出液２０ｕｌをｑＭＳＰ検出に使用した。
最終的にバイサルファイト変換後のＤＮＡを２０ｕｌ得た。そして、ｑＭＳＰ検出を行い、最後にＣＴ値に基づいてサンプルにおけるＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧ４遺伝子組成物のメチル化レベルを判断した。
本実施例のｑＭＳＰ反応系：３０ｕｌ（ヌクレアーゼフリー水２．９８ｕｌ，５×Ｃｏｌｏｒｌｅｓｓ ＧｏＴａｑ Ｆｌｅｘｉ Ｂｕｆｆｅｒ ６ｕｌ，ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）５ｕｌ，ｄＮＴＰｓ（１０ｍＭ）１ｕｌ，ＧｏＴａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ０．６ｕｌ，ＡＣＴＢ－ＦＰ（１００ｕＭ）０．０８ｕｌ，ＡＣＴＢ－ＲＰ（１００ｕＭ）０．０８ｕｌ，ＡＣＴＢ－Ｐｒｏｂｅ（１００ｕＭ）０．０６ｕｌ，ＳＤＣ２－ＦＰ（１００ｕＭ）０．１２ｕｌ，ＳＤＣ２－ＲＰ（１００ｕＭ）０．１２ｕｌ，ＳＤＣ２－Ｐｒｏｂｅ（１００ｕＭ）０．０４ｕｌ，ＣＯＬ４Ａ２－ＦＰ（１００ｕＭ）０．０６ｕｌ，ＣＯＬ４Ａ２－ＲＰ（１００ｕＭ）０．０６ｕｌ，ＣＯＬ４Ａ２－Ｐｒｏｂｅ（１００ｕＭ）０．０４ｕｌ，ＩＴＧＡ４－ＦＰ（１００ｕＭ）０．０６ｕｌ，ＩＴＧＡ４－ＲＰ（１００ｕＭ）０．０６ｕｌ，ＩＴＧＡ４－Ｐｒｏｂｅ（１００ｕＭ）０．０４ｕｌ，ＤＮＡ １０ｕｌ）。反応プロセス：９５℃５ｍｉｎ，（９５℃１５ｓ，５８℃３０ｓ，７２℃３０ｓ）×４８Ｃｙｃｌｅｓ，４０℃３０ｓ。
捕捉及びＰＣＲ反応ではＡＣＴＢを内部参照遺伝子として使用し、最後にＣＴ値に基づいてサンプルのメチル化レベルを判断した。標的遺伝子のＣＴ値≦３８の場合、陽性として判断し、ＣＴ値＞３８の場合、陰性として判断した。
ＣＯＬ４Ａ１及びＣＯＬ４Ａ２遺伝子は、５’末端が互いに近く、間隔が１２７ｂｐであり、共有の双方向プロモーター領域である。本実施例で検出されるメチル化領域はＣＯＬ４Ａ１及びＣＯＬ４Ａ２遺伝子の双方向プロモーター領域である。そのため、本実施例では、この２つの遺伝子におけるＣＯＬ４Ａ２の遺伝子方向で配列情報を標識した。
ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化部位は、主にプロモーター領域又はその近傍のＣｐＧアイランドに位置する。
本実施例において、同一の蛍光基でＳＤＣ２，ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４のＰＣＲプローブを標識するため、１つの蛍光チャネルのみによりこれらの遺伝子のメチル化レベルの和を容易に検出することができ、それぞれの遺伝子に対して異なる蛍光チャネルで検出する必要がないため、試験の複雑さが低下する。
本実施例の捕捉配列、プライマープローブは以下の通りである。
配列番号１：ＳＤＣ２の捕捉配列１：
５’－ＡＧＣＣＣＧＣＧＣＡＣＡＣＧＡＡＴＣＣＧＧＡＧＣＡＧＡＧＴＡＣＣＧ－３’；又は
配列番号２：ＳＤＣ２の捕捉配列２：
５’－ＣＴＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＧＣＴＣＧＧＣＧＣＡＧＣＣＣＧＣ－３’
ＳＤＣ２のｑＭＳＰプライマープローブ：
配列番号３：ＳＤＣ２－ＦＰ：５’－ＧＡＧＧＡＡＧＣＧＡＧＣＧＴＴＴＴＣ－３’
配列番号４：ＳＤＣ２－ＲＰ：５’－ＡＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡＡＣＧＡＴＴＡＣＧＡ－３’
配列番号５：ＳＤＣ２－Ｐｒｏｂｅ：５’－ＡＧＴＴＴＣＧＡＧＴＴＣＧＡＧＴＴＴＴＣＧＡＧＴＴＴＧ－３’
ＳＤＣ２の２本の捕捉配列は同じの捕捉効果を有するため、１本を選択すればよい。
配列番号１：ＳＤＣ２の捕捉配列１：
５’－ＡＧＣＣＣＧＣＧＣＡＣＡＣＧＡＡＴＣＣＧＧＡＧＣＡＧＡＧＴＡＣＣＧ－３’；又は
配列番号２：ＳＤＣ２の捕捉配列２：
５’－ＣＴＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＧＣＴＣＧＧＣＧＣＡＧＣＣＣＧＣ－３’
ＳＤＣ２のｑＭＳＰプライマープローブ：
配列番号３：ＳＤＣ２－ＦＰ：５’－ＧＡＧＧＡＡＧＣＧＡＧＣＧＴＴＴＴＣ－３’
配列番号４：ＳＤＣ２－ＲＰ：５’－ＡＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡＡＣＧＡＴＴＡＣＧＡ－３’
配列番号５：ＳＤＣ２－Ｐｒｏｂｅ：５’－ＡＧＴＴＴＣＧＡＧＴＴＣＧＡＧＴＴＴＴＣＧＡＧＴＴＴＧ－３’
ＳＤＣ２の２本の捕捉配列は同じの捕捉効果を有するため、１本を選択すればよい。
配列番号６：ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２の捕捉配列：
５’－ＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＡＡＣＧＣＡＴＴＧＧＣＣＣＴＴＣＣＡＧＡＡＧＣＡ－３’
ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２のｑＭＳＰプライマープローブ：
配列番号７：ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２－ＦＰ：５’－ＡＧＡＧＡＧＴＴＴＡＧＴＡＡＧＧＴＣＧＧＧＣ－３’
配列番号８：ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２－ＲＰ：５’－ＧＡＣＴＴＣＡＡＡＡＡＣＴＡＣＴＡＣＣＣＧ－３’；又は
配列番号１４：ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２－ＦＰ：
５’－ＡＧＡＧＡＧＴＴＴＡＧＴＡＡＧＧＴＣＧＧＡＣ－３’
配列番号１５：ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２－ＲＰ：
５’－ＧＡＣＴＴＣＡＡＡＡＡＣＴＡＣＴＡＣＣＣＧ－３’
配列番号９：ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２－Ｐｒｏｂｅ：５’－ＴＧＴＣＧＧＴＧＴＧＴＣＧＴＣＧＧＣ－３’
ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２の２対のプライマーは同じの増幅特異性を有し、いずれも陽性サンプルと陰性サンプルを良好に区別できるため、一方を選択すればよい。
５’－ＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＡＡＣＧＣＡＴＴＧＧＣＣＣＴＴＣＣＡＧＡＡＧＣＡ－３’
ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２のｑＭＳＰプライマープローブ：
配列番号７：ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２－ＦＰ：５’－ＡＧＡＧＡＧＴＴＴＡＧＴＡＡＧＧＴＣＧＧＧＣ－３’
配列番号８：ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２－ＲＰ：５’－ＧＡＣＴＴＣＡＡＡＡＡＣＴＡＣＴＡＣＣＣＧ－３’；又は
配列番号１４：ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２－ＦＰ：
５’－ＡＧＡＧＡＧＴＴＴＡＧＴＡＡＧＧＴＣＧＧＡＣ－３’
配列番号１５：ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２－ＲＰ：
５’－ＧＡＣＴＴＣＡＡＡＡＡＣＴＡＣＴＡＣＣＣＧ－３’
配列番号９：ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２－Ｐｒｏｂｅ：５’－ＴＧＴＣＧＧＴＧＴＧＴＣＧＴＣＧＧＣ－３’
ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２の２対のプライマーは同じの増幅特異性を有し、いずれも陽性サンプルと陰性サンプルを良好に区別できるため、一方を選択すればよい。
配列番号１０：ＩＴＧＡ４的捕捉配列：
５’－ＣＴＡＣＧＣＧＣＧＧＣＴＧＣＡＧＧＧＧＧＣＧＣＴＧＧＧＧＡＡＣＣＴ－３’
ＩＴＧＡ４のｑＭＳＰプライマープローブ：
配列番号１１：ＩＴＧＡ４－ＦＰ：５’－ＡＣＧＣＧＡＧＴＴＴＴＧＣＧＴＡＧＡＣ－３’
配列番号１２：ＩＴＧＡ４－ＲＰ：５’－ＧＣＴＡＡＡＴＡＡＡＡＴＣＣＣＧＡＡＣＧ－３’；又は
配列番号１６：ＩＴＧＡ４－ＦＰ：５’－ＡＣＧＣＧＡＧＴＴＴＴＧＣＧＴＡＧＴＣ－３’
配列番号１７：ＩＴＧＡ４－ＲＰ：５’－ＧＣＴＡＡＡＴＡＡＡＡＴＣＣＣＧＡＡＣＧ－３’
配列番号１３：ＩＴＧＡ４－Ｐｒｏｂｅ：５’－ＡＣＧＧＡＧＴＴＣＧＧＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＴＣ－３’
５’－ＣＴＡＣＧＣＧＣＧＧＣＴＧＣＡＧＧＧＧＧＣＧＣＴＧＧＧＧＡＡＣＣＴ－３’
ＩＴＧＡ４のｑＭＳＰプライマープローブ：
配列番号１１：ＩＴＧＡ４－ＦＰ：５’－ＡＣＧＣＧＡＧＴＴＴＴＧＣＧＴＡＧＡＣ－３’
配列番号１２：ＩＴＧＡ４－ＲＰ：５’－ＧＣＴＡＡＡＴＡＡＡＡＴＣＣＣＧＡＡＣＧ－３’；又は
配列番号１６：ＩＴＧＡ４－ＦＰ：５’－ＡＣＧＣＧＡＧＴＴＴＴＧＣＧＴＡＧＴＣ－３’
配列番号１７：ＩＴＧＡ４－ＲＰ：５’－ＧＣＴＡＡＡＴＡＡＡＡＴＣＣＣＧＡＡＣＧ－３’
配列番号１３：ＩＴＧＡ４－Ｐｒｏｂｅ：５’－ＡＣＧＧＡＧＴＴＣＧＧＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＴＣ－３’
ＩＴＧＡ４の２対のプライマーは同じの増幅特異性を有し、いずれも陽性サンプルと陰性サンプルを良好に区別できるため、一方を選択すればよい。
この９３５例の糞便サンプル結果に基づいて、ＩＢＭＳＰＳＳ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ２０ソフトウェアにてこのマーカー組成物による結腸直腸がん及び腺腫の検出結果のＲＯＣ曲線を作成し、図１に示す。
結果から分かるように、ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧ４遺伝子のメチル化組合せ検出では、特異性が９５．２８％である場合、結腸直腸がんに対する感度は９１．３６％と高く、腺腫に対する感度は５０．７５％であった。ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧ４遺伝子のメチル化組合せ検出では、結腸直腸がんのＲＯＣ曲線下面積は０．９７９であり、９５％ＣＩは０．９７０～０．９８８であり、腺腫のＲＯＣ曲線下面積は０．８３２であり、９５％ＣＩは０．７７１～０．８９４であった。
実施例２
２３例の結腸直腸がんと診断された患者を選択し、それぞれ手術前及び手術後の３－６月目に患者の糞便サンプルを収集し、本発明のマーカー組成物（ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４）により手術前後の合計４６例の糞便サンプルを検出し、手術前後の糞便におけるこのマーカー組成物のメチル化レベルを比較した。
２３例の結腸直腸がんと診断された患者を選択し、それぞれ手術前及び手術後の３－６月目に患者の糞便サンプルを収集し、本発明のマーカー組成物（ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４）により手術前後の合計４６例の糞便サンプルを検出し、手術前後の糞便におけるこのマーカー組成物のメチル化レベルを比較した。
マーカー組成物の検出手順及び結果判断標準は実施例１と同様であった。標的遺伝子のＣＴ値≦３８の場合、陽性として判断し、ＣＴ値＞３８の場合陰性として判断する。結果を図２に示す。
結果から分かるように、手術前に２３例の結腸直腸がん患者の検出結果はいずれも陽性であり、手術後にその糞便サンプルを再度検出した結果、いずれも陰性になった。これは、手術により腫瘍を切除した後、このマーカー組成物のメチル化レベルが顕著に低下することを示しており、このマーカー組成物が結腸直腸がん患者の術後フォローアップモニタリングに適用できることを示唆している。
比較例１
研究により、糞便中のメチル化ＳＯＸ２１遺伝子の検出は結腸直腸がんの補助診断に適用できることが発見された。以下、糞便サンプルを用いてメチル化ＳＯＸ２１により結腸直腸がんを検出することを比較例とする。以下は、糞便においてＳＯＸ２１遺伝子を検出する流れ及び結果を示す。
研究により、糞便中のメチル化ＳＯＸ２１遺伝子の検出は結腸直腸がんの補助診断に適用できることが発見された。以下、糞便サンプルを用いてメチル化ＳＯＸ２１により結腸直腸がんを検出することを比較例とする。以下は、糞便においてＳＯＸ２１遺伝子を検出する流れ及び結果を示す。
２４０例の糞便サンプル（８０例の結腸直腸がん、７７例の腺腫（≧１ｃｍ）、８３例の正常；いずれも大腸内視鏡検査による診断又は病理検査による診断済）を選択し、研磨して遠心分離し、５０ｕｌ捕捉磁気ビーズ（ＳＯＸ２１及び内部参照遺伝子ＡＣＴＢの捕捉配列を含む）を加え、実施例１の「手順」と同様に操作した結果、バイサルファイト変換後のＤＮＡを２０ｕｌ得た。そして、ｑＭＳＰ検出を行い、最後にＣＴ値に基づいてサンプルにおけるサンプルにおけるＳＯＸ２１のメチル化レベルを判断した。
試薬に含まれる捕捉配列、プライマープローブ、ｑＭＳＰ反応系及びプロセスは、参考文献［２］を参照されたい。２４０例の糞便サンプルの結果に基づいて、ＳＯＸ２１遺伝子による結腸直腸がん及び腺腫の検出結果のＲＯＣ曲線を作成し、図３に示す。
結果から分かるように、メチル化ＳＯＸ２１の特異性が９７．６％である場合、結腸直腸がんに対する感度は８０％であり、腺腫に対する感度は３３．８％であった。ＳＯＸ２１検出による結腸直腸がんのＲＯＣ曲線下面積は０．９２６であり、９５％ＣＩは０．８８５～０．９６８であり、腺腫のＲＯＣ曲線下面積は０．６６７であり、９５％ＣＩは０．５８３～０．７５１であった。
比較例２
１６１例の糞便サンプル（７９例の結腸直腸がん、８２例の正常；いずれも大腸内視鏡検査による診断又は病理検査による診断済）を選択し、研磨して遠心分離し、５０ｕｌ捕捉磁気ビーズ（ＳＯＸ２１、ＳＤＣ２及び内部参照遺伝子ＡＣＴＢの捕捉配列を含む）を加え、実施例１の「手順」と同様に操作した結果、バイサルファイト変換後のＤＮＡを２０ｕｌ得た。そして、ｑＭＳＰ検出を行い、最後にＣＴ値に基づいてサンプルにおけるＳＯＸ２１及びＳＤＣ２のメチル化レベルを判断した。
１６１例の糞便サンプル（７９例の結腸直腸がん、８２例の正常；いずれも大腸内視鏡検査による診断又は病理検査による診断済）を選択し、研磨して遠心分離し、５０ｕｌ捕捉磁気ビーズ（ＳＯＸ２１、ＳＤＣ２及び内部参照遺伝子ＡＣＴＢの捕捉配列を含む）を加え、実施例１の「手順」と同様に操作した結果、バイサルファイト変換後のＤＮＡを２０ｕｌ得た。そして、ｑＭＳＰ検出を行い、最後にＣＴ値に基づいてサンプルにおけるＳＯＸ２１及びＳＤＣ２のメチル化レベルを判断した。
ＳＯＸ２１の捕捉配列、プライマープローブ、ｑＭＳＰ反応系及びプロセスは比較例１と同様であった。ＳＤＣ２の捕捉配列、プライマープローブ、ｑＭＳＰ反応系及びプロセスは実施例１と同様であった。
検出結果から分かるように、メチル化ＳＤＣ２遺伝子の検出感度は８８．６％、特異性は９３．９％、曲線下面積は０．９３９であった。メチル化ＳＯＸ２１遺伝子の検出感度は７９．７％、特異性は８６．６％、曲線下面積は０．９２４であった。メチル化ＳＯＸ２１遺伝子とメチル化ＳＤＣ２遺伝子との組成物の検出感度は８７．３４％、特異性は９３．９％であった。メチル化ＳＤＣ２遺伝子とメチル化ＳＯＸ２１遺伝子の組合せ検出の検出感度は、メチル化ＳＤＣ２遺伝子の単独を大腸がんマーカーとする場合の検出感度よりも高く、かつ本発明のＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧ４遺伝子のメチル化組合せ検出の検出感度よりも低かった。
比較例３
１０９例の糞便サンプル（６１例の結腸直腸がん、４８例の正常；いずれも大腸内視鏡検査による診断又は病理検査による診断済）を選択し、研磨して遠心分離し、５０ｕｌ捕捉磁気ビーズ（ＩＴＧＡ４、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及び内部参照遺伝子ＡＣＴＢの捕捉配列を含む）を加えた。
１０９例の糞便サンプル（６１例の結腸直腸がん、４８例の正常；いずれも大腸内視鏡検査による診断又は病理検査による診断済）を選択し、研磨して遠心分離し、５０ｕｌ捕捉磁気ビーズ（ＩＴＧＡ４、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及び内部参照遺伝子ＡＣＴＢの捕捉配列を含む）を加えた。
ＩＴＧＡ４、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２の捕捉配列、プライマープローブ、ｑＭＳＰ反応系及びプロセスは実施例１と同様であった。
この１０９例の糞便サンプルの結果に基づいて、このマーカー組成物による結腸直腸がんの検出結果のＲＯＣ曲線を作成し、図４に示す。
結果から分かるように、結腸直腸がんと健常者サンプルの区別の曲線下面積は０．９６４であった。陽性判断Ｃｔ値が３８である場合、メチル化ＩＴＧＡ４＋ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子は大腸がんに対する検出感度が８６．８９％、特異性が９１．６７％であった。その感度及び特異性はいずれも本発明のＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧ４遺伝子のメチル化組合せ検出の感度及び特異性よりも低かった。
以上の説明は本発明の好ましい実施形態に過ぎない。本発明の原理から逸脱しない限り、当業者が種々の改良及び修飾を行うことができ、これらの改良及び修飾も本発明の保護範囲に含まれる。
参考文献
1.Fischer G,Schmidt,Cornelia,et al.Identification of a novel sequence element in the common promoter region of human collagen type IV genes,involved in the regulation of divergent transcription.Biochem.J.1993 292:687-695.
2.Niu F,Wen J,Fu X,et al.Stool DNA Test of Methylated Syndecan-2 for the Early Detection of Colorectal Neoplasia.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2017；26:1411-1419.
3.劉相林，文加玲，牛鳳ら.結腸直腸がんの診断における糞便中SOX21遺伝子メチル化検出の応用価値[J].中華腫瘍防治雑誌,2018(24):1710-1715.
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2.Niu F,Wen J,Fu X,et al.Stool DNA Test of Methylated Syndecan-2 for the Early Detection of Colorectal Neoplasia.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2017；26:1411-1419.
3.劉相林，文加玲，牛鳳ら.結腸直腸がんの診断における糞便中SOX21遺伝子メチル化検出の応用価値[J].中華腫瘍防治雑誌,2018(24):1710-1715.
Claims (12)
- 遺伝子マーカー組成物であって、
前記遺伝子マーカーは、ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４を含む、遺伝子マーカー組成物。 - ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出試薬を含む検出試薬／検出キットであって、
好ましくは、前記検出試薬／検出キットは、ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子に対する捕捉配列、プライマー及び／又はプローブを含み、
好ましくは、前記検出試薬／検出キットは、それぞれの前記遺伝子のＣｐＧアイランドに対して得られる捕捉配列、プライマー及び／又はプローブを含み、
好ましくは、前記ＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出捕捉配列は、
Ｉ：配列番号１又は配列番号２に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＩＩ：前記Ｉに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、前記ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出捕捉配列は、
ＩＩＩ：配列番号６に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＩＶ：前記ＩＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、前記ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出捕捉配列は、
Ｖ：配列番号１０に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＶＩ：前記Ｖに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
好ましくは、前記ＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出プライマーにおける上流プライマーは、
ＶＩＩ：配列番号３に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＶＩＩＩ：前記ＶＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、前記ＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出プライマーにおける下流プライマーは、
ＩＸ：配列番号４に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
Ｘ：ＩＸに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、前記ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プライマーにおける上流プライマーは、
ＸＩ：配列番号７又は配列番号１４に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；
ＸＩＩ：前記ＸＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、前記ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プライマーにおける下流プライマーは、
ＸＩＩＩ：配列番号８又は配列番号１５に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＩＶ：前記ＸＩＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
好ましくは、前記ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号７及び配列番号８に示され、
好ましくは、前記ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号１４及び配列番号１５に示され、
及び／又は、前記ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プライマーにおける上流プライマーは、
ＸＶ：配列番号１１又は配列番号１６に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＶＩ：前記ＸＶに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、前記ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プライマーにおける下流プライマーは、
ＸＶＩＩ：配列番号１２又は配列番号１７に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＶＩＩＩ：前記ＸＶＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
好ましくは、前記ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号１１及び配列番号１２に示され、
好ましくは、前記ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号１６及び配列番号１７に示され、
好ましくは、前記ＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出プローブは、
ＸＩＸ：配列番号５に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＸ：前記ＸＩＸに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、前記ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プローブは、
ＸＸＩ：配列番号９に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＸＩＩ：前記ＸＸＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、前記ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プローブは、
ＸＸＩＩＩ：配列番号１３に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＸＩＶ：前記ＸＸＩＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、検出試薬／検出キット。 - 結腸直腸腫瘍検出試薬又はキットにおける多遺伝子メチル化組合せ検出試薬の使用であって、
前記遺伝子は、ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４を含み、
好ましくは、前記多遺伝子メチル化組合せ検出試薬は、それぞれの前記遺伝子のメチル化検出捕捉配列、プライマー及び／又はプローブを含み、
好ましくは、それぞれの前記遺伝子のＣｐＧアイランドに対して得られる捕捉配列、プライマー及び／又はプローブを含み、
好ましくは、前記ＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出捕捉配列は、
Ｉ：配列番号１及び配列番号２に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＩＩ：前記Ｉに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、前記ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出捕捉配列は、
ＩＩＩ：配列番号６に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＩＶ：前記ＩＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、前記ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出捕捉配列は、
Ｖ：配列番号１０に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＶＩ：前記Ｖに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
好ましくは、前記ＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出プライマーにおける上流プライマーは、
ＶＩＩ：配列番号３に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＶＩＩＩ：前記ＶＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、前記ＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出プライマーにおける下流プライマーは、
ＩＸ：配列番号４に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
Ｘ：前記ＩＸに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、前記ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プライマーにおける上流プライマーは、
ＸＩ：配列番号７及び配列番号１４に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＩＩ：前記ＸＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、前記ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プライマーにおける下流プライマーは、
ＸＩＩＩ：配列番号８及び配列番号１５に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＩＶ：前記ＸＩＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
好ましくは、前記ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号７及び配列番号８に示され、
好ましくは、前記ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号１４及び配列番号１５に示され、
及び／又は、前記ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プライマーにおける上流プライマーは、
ＸＶ：配列番号１１及び配列番号１６に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＶＩ：前記ＸＶに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、前記ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プライマーにおける下流プライマーは、
ＸＶＩＩ：配列番号１２及び配列番号１７に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＶＩＩＩ：前記ＸＶＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
好ましくは、前記ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号１１及び配列番号１２に示され、
好ましくは、前記ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号１６及び配列番号１７に示され、
好ましくは、前記ＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出プローブは、
ＸＩＸ：配列番号５に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＸ：ＸＩＸに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、前記ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プローブは、
ＸＸＩ：配列番号９に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＸＩＩ：前記ＸＸＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、前記ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プローブは、
ＸＸＩＩＩ：配列番号１３に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＸＩＶ：前記ＸＸＩＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、使用。 - 前記結腸直腸腫瘍は、結腸直腸がん又は腺腫である、請求項２又は３に記載の使用。
- 検出試薬の対象となる検出サンプルは、組織、体液又は排泄物を含み、
好ましくは、前記組織は、腸組織を含み、
好ましくは、前記体液は、血液、細胞外液、組織液、リンパ液、脳脊髄液又は房水を含み、
好ましくは、前記血液は、血清、血漿を含み、
好ましくは、前記排泄物は、喀痰、尿液、唾液又は糞便を含み、
好ましくは、前記排泄物は、糞便を含む、請求項２又は３に記載の使用。 - 結腸直腸腫瘍の検出システムであって、
前記システムは、
（１）ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化組合せ検出部と、
（２）データ処理部と、
（３）結果出力部と、
を含み、
好ましくは、前記メチル化検出部は、メチル化検出機器を含み、
好ましくは、前記メチル化検出機器は、蛍光定量ＰＣＲ装置、ＰＣＲ装置、及びシーケンサのうちの１種又は複数種を含み、
好ましくは、前記データ処理部は、データ処理装置を含み、
好ましくは、前記データ処理装置は、計算器及びコンピュータのうちの１種又は複数種を含み、
好ましくは、前記コンピュータは、ＳＰＳＳ、ＳＡＳ、Ｅｘｃｅｌのうちの１種又は複数種のソフトウェアが搭載されたコンピュータを含み、
好ましくは、前記結果出力部は、結果出力装置を含み、
好ましくは、前記結果出力装置は、スクリーン及び紙報告書のうちの１種又は複数種を含み、
好ましくは、前記メチル化検出部は、請求項３又は４に記載の多遺伝子のメチル化組合せ検出試薬をさらに含み、
好ましくは、前記データ処理部は、ａ．検出サンプル及び正常対照サンプルのテストデータを受信し、ｂ．検出サンプル及び正常対照サンプルのテストデータを記憶し、ｃ．同じタイプの検出サンプルと正常対照サンプルのテストデータを比較し、ｄ．比較結果に基づいて被験体が結腸直腸腫瘍に罹患する確率又は可能性を判断するように構成され、
好ましくは、前記結果出力部は、被験体が結腸直腸腫瘍に罹患する確率又は可能性を出力するために用いられる、結腸直腸腫瘍の検出システム。 - 前記データ処理部の判断標準では、メチル化蛍光定量のＣｔ値の限界値に基づいて結腸直腸腫瘍サンプル及び正常サンプルを判断し、
好ましくは、Ｃｔ値の限界値の範囲は約３６－３９であり、より好ましくは、Ｃｔ値の限界値は約３８であり、
好ましくは、前記検出サンプルのＣｔ値が前記Ｃｔ値の限界値未満である場合、結腸直腸腫瘍サンプルとして判断され、前記検出サンプルのＣｔ値が前記Ｃｔ値の限界値以上である場合、正常サンプルとして判断される、請求項６に記載の結腸直腸腫瘍の検出システム。 - 前記結腸直腸腫瘍は、結腸直腸がん又は腺腫である、請求項６又は７に記載の結腸直腸腫瘍の検出システム。
- 前記検出システムの対象となる検出サンプルは、組織、体液又は排泄物を含み、
好ましくは、前記組織は、腸組織であり、
好ましくは、前記体液は、血液、細胞外液、組織液、リンパ液、脳脊髄液又は房水を含み、
好ましくは、前記血液は、血清、血漿を含み、
好ましくは、前記排泄物は、喀痰、尿液、唾液又は糞便を含み、
より好ましくは、前記排泄物は、糞便である、請求項６から８のいずれか１項に記載の結腸直腸腫瘍の検出システム。 - 以下のステップ（１）から（３）を含む結腸直腸腫瘍の診断方法であって、
ステップ（１）：被験体に由来の検出サンプルにおけるＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化レベルを検出し、
ステップ（２）：検出サンプルと正常対照サンプルとのＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化レベルを比較し、及び
ステップ（３）：検出サンプルと正常対照サンプルとのメチル化レベルのずれに基づいて、結腸直腸腫瘍を診断し、
好ましくは、メチル化特異的定量ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）によりＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化レベルを検出し、
好ましくは、メチル化蛍光定量のＣｔ値の限界値に基づいて結腸直腸腫瘍サンプル及び正常サンプルを判断し、
好ましくは、Ｃｔ値の限界値の範囲は約３６－３９であり、より好ましくは、Ｃｔ値の限界値は約３８であり、
好ましくは、前記検出サンプルのＣｔ値が前記Ｃｔ値の限界値未満である場合、結腸直腸腫瘍サンプルとして判断され、前記検出サンプルのＣｔ値が前記Ｃｔ値の限界値以上である場合、正常サンプルとして判断され、
好ましくは、前記方法の対象となる検出サンプルは、組織、体液又は排泄物を含み、
好ましくは、前記組織は、腸組織であり、
好ましくは、前記体液は、血液、細胞外液、組織液、リンパ液、脳脊髄液又は房水を含み、
好ましくは、前記血液は、血清、血漿を含み、
好ましくは、前記排泄物は、喀痰、尿液、唾液又は糞便を含み、
より好ましくは、前記排泄物は、糞便であり、
好ましくは、捕捉配列、プライマー及び／又はプローブによりＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化レベルを検出し、
好ましくは、ＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出捕捉配列は、
Ｉ：配列番号１及び２に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＩＩ：前記Ｉに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出捕捉配列は、
ＩＩＩ：配列番号６に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＩＶ：前記ＩＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出捕捉配列は、
Ｖ：配列番号１０に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＶＩ：前記Ｖに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
好ましくは、ＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出プライマーにおける下流プライマーは、
ＶＩＩ：配列番号３に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＶＩＩＩ：前記ＶＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、前記ＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出プライマーにおける下流プライマーは、
ＩＸ：配列番号４に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
Ｘ：前記ＩＸに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プライマーにおける上流プライマーは、
ＸＩ：配列番号７及び配列番号１４に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＩＩ：前記ＸＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プライマーにおける下流プライマーは、
ＸＩＩＩ：配列番号８及び配列番号１５に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＩＶ：前記ＸＩＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
好ましくは、前記ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号７及び配列番号８に示され、
好ましくは、前記ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号１４及び配列番号１５に示され、
及び／又は、ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プライマーにおける上流プライマーは、
ＸＶ：配列番号１１及び配列番号１６に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＶＩ：前記ＸＶに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プライマーにおける下流プライマーは、
ＸＶＩＩ：配列番号１２及び配列番号１７に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＶＩＩＩ：前記ＸＶＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
好ましくは、前記ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号１１及び配列番号１２に示され、
好ましくは、前記ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号１６及び配列番号１７に示され、
好ましくは、ＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出プローブは、
ＸＩＸ：配列番号５に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＸ：前記ＸＩＸに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プローブは、
ＸＸＩ：配列番号９に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＸＩＩ：前記ＸＸＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プローブは、
ＸＸＩＩＩ：配列番号１３に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＸＩＶ：前記ＸＸＩＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、結腸直腸腫瘍の診断方法。 - 以下のステップ（１）から（３）を含む結腸直腸腫瘍の診断方法であって、
ステップ（１）：被験体に由来の検出サンプルにおけるＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化レベルを検出し、前記検出は、被験体に由来の検出サンプルと、ＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化レベル検出試薬とを接触させることを含み、
ステップ（２）：前記検出サンプルと正常対照サンプルとのＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化レベルを比較し、及び
ステップ（３）：検出サンプルと正常対照サンプルとのメチル化レベルのずれに基づいて、結腸直腸腫瘍を診断し、
好ましくは、メチル化特異的定量ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）によりＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化レベルを検出し、
好ましくは、メチル化蛍光定量のＣｔ値の限界値に基づいて結腸直腸腫瘍サンプル及び正常サンプルを判断し、
好ましくは、Ｃｔ値の限界値の範囲は約３６－３９であり、より好ましくは、Ｃｔ値の限界値は約３８であり、
好ましくは、前記検出サンプルのＣｔ値が前記Ｃｔ値の限界値未満である場合、結腸直腸腫瘍サンプルとして判断され、前記検出サンプルのＣｔ値が前記Ｃｔ値の限界値以上である場合、正常サンプルとして判断され、
好ましくは、前記方法の対象となる検出サンプルは、組織、体液又は排泄物を含み、
好ましくは、前記組織は、腸組織であり、
好ましくは、前記体液は、血液、細胞外液、組織液、リンパ液、脳脊髄液又は房水を含み、
好ましくは、前記血液は、血清、血漿を含み、
好ましくは、前記排泄物は、喀痰、尿液、唾液又は糞便を含み、
より好ましくは、前記排泄物は、糞便であり、
好ましくは、捕捉配列、プライマー及び／又はプローブによりＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化レベルを検出し、
好ましくは、ＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出捕捉配列は、
Ｉ：配列番号１及び２に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＩＩ：前記Ｉに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出捕捉配列は、
ＩＩＩ：配列番号６に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＩＶ：前記ＩＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出捕捉配列は、
Ｖ：配列番号１０に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＶＩ：前記Ｖに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
好ましくは、ＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出プライマーにおける下流プライマーは、
ＶＩＩ：配列番号３に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＶＩＩＩ：前記ＶＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、前記ＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出プライマーにおける下流プライマーは、
ＩＸ：配列番号４に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
Ｘ：前記ＩＸに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プライマーにおける上流プライマーは、
ＸＩ：配列番号７及び配列番号１４に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＩＩ：前記ＸＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プライマーにおける下流プライマーは、
ＸＩＩＩ：配列番号８及び配列番号１５に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＩＶ：前記ＸＩＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
好ましくは、前記ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号７及び配列番号８に示され、
好ましくは、前記ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号１４及び配列番号１５に示され、
及び／又は、ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プライマーにおける上流プライマーは、
ＸＶ：配列番号１１及び配列番号１６に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＶＩ：前記ＸＶに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プライマーにおける下流プライマーは、
ＸＶＩＩ：配列番号１２及び配列番号１７に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＶＩＩＩ：前記ＸＶＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
好ましくは、前記ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号１１及び配列番号１２に示され、
好ましくは、前記ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号１６及び配列番号１７に示され、
好ましくは、ＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出プローブは、
ＸＩＸ：配列番号５に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＸ：前記ＸＩＸに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プローブは、
ＸＸＩ：配列番号９に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＸＩＩ：前記ＸＸＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プローブは、
ＸＸＩＩＩ：配列番号１３に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＸＩＶ：前記ＸＸＩＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、結腸直腸腫瘍の診断方法。 - 以下のステップ（１）から（３）を含む結腸直腸腫瘍の治療方法であって、
ステップ（１）：被験体に由来の検出サンプルにおけるＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化レベルを検出し、
ステップ（２）：検出サンプルと正常対照サンプルとのＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化レベルを比較し、
ステップ（３）：検出サンプルと正常対照サンプルとのメチル化レベルのずれに基づいて、結腸直腸腫瘍を診断し、被験体が結腸直腸腫瘍患者として診断される場合、前記被験体に結腸直腸腫瘍の治療薬を投与して治療を行い、
好ましくは、メチル化特異的定量ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）によりＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化レベルを検出し、
好ましくは、メチル化蛍光定量のＣｔ値の限界値に基づいて結腸直腸腫瘍サンプル及び正常サンプルを判断し、
好ましくは、Ｃｔ値の限界値の範囲は約３６－３９であり、より好ましくは、Ｃｔ値の限界値は約３８であり、
好ましくは、前記検出サンプルのＣｔ値が前記Ｃｔ値の限界値未満である場合、結腸直腸腫瘍サンプルとして判断され、前記検出サンプルのＣｔ値が前記Ｃｔ値の限界値以上である場合、正常サンプルとして判断され、
好ましくは、前記方法の対象となる検出サンプルは、組織、体液又は排泄物を含み、
好ましくは、前記組織は、腸組織であり、
好ましくは、前記体液は、血液、細胞外液、組織液、リンパ液、脳脊髄液又は房水を含み、
好ましくは、前記血液は、血清、血漿を含み、
好ましくは、前記排泄物は、喀痰、尿液、唾液又は糞便を含み、
より好ましくは、前記排泄物は、糞便であり、
好ましくは、捕捉配列、プライマー及び／又はプローブによりＳＤＣ２、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２及びＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化レベルを検出し、
好ましくは、ＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出捕捉配列は、
Ｉ：配列番号１及び２に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＩＩ：前記Ｉに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出捕捉配列は、
ＩＩＩ：配列番号６に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＩＶ：前記ＩＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出捕捉配列は、
Ｖ：配列番号１０に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＶＩ：前記Ｖに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
好ましくは、ＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出プライマーにおける下流プライマーは、
ＶＩＩ：配列番号３に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＶＩＩＩ：前記ＶＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、前記ＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出プライマーにおける下流プライマーは、
ＩＸ：配列番号４に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
Ｘ：前記ＩＸに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プライマーにおける上流プライマーは、
ＸＩ：配列番号７及び配列番号１４に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＩＩ：前記ＸＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プライマーにおける下流プライマーは、
ＸＩＩＩ：配列番号８及び配列番号１５に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＩＶ：前記ＸＩＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
好ましくは、前記ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号７及び配列番号８に示され、
好ましくは、前記ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号１４及び配列番号１５に示され、
及び／又は、ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プライマーにおける上流プライマーは、
ＸＶ：配列番号１１及び配列番号１６に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＶＩ：前記ＸＶに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プライマーにおける下流プライマーは、
ＸＶＩＩ：配列番号１２及び配列番号１７に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＶＩＩＩ：前記ＸＶＩＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
好ましくは、前記ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号１１及び配列番号１２に示され、
好ましくは、前記ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プライマーペアは、配列番号１６及び配列番号１７に示され、
好ましくは、ＳＤＣ２遺伝子のメチル化検出プローブは、
ＸＩＸ：配列番号５に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＸ：前記ＸＩＸに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、ＣＯＬ４Ａ１／ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化検出プローブは、
ＸＸＩ：配列番号９に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＸＩＩ：前記ＸＸＩに示される配列の相補配列；
のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、
及び／又は、ＩＴＧＡ４遺伝子のメチル化検出プローブは、
ＸＸＩＩＩ：配列番号１３に示される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
ＸＸＩＶ：前記ＸＸＩＩＩに示される配列の相補配列；
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