CN117701721A - 宫颈癌sox1-septin9-tac1基因甲基化的检测试剂及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因诊断的技术领域，尤其是涉及一种宫颈癌SOX1‑SEPTIN9‑TAC1基因甲基化的检测试剂及试剂盒；本公开通过设计检测宫颈癌SOX1基因、SEPTIN9基因、TAC1基因甲基化的检测引物、探针、检测试剂、试剂盒，用于检测SOX1基因、SEPTIN9基因、TAC1基因的甲基化程度，灵敏度高，特异性强，且适合大规模人群筛查和常规分子诊断；采用本申请设计的检测试剂、试剂盒进行检测的敏感度高于现有报道的宫颈癌标志物，其敏感度有了大幅度的提升，对于宫颈癌的诊断有极大应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及基因诊断的技术领域，尤其是涉及一种宫颈癌SOX1-SEPTIN9-TAC1基因甲基化的检测试剂及试剂盒。
背景技术
宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，近年来大量研究表明，宫颈癌的发病年龄呈年轻化趋势。宫颈癌严重威胁女性的健康，且影响其生活质量；但宫颈癌并不可怕，因为宫颈癌的发生和发展是漫长的，从发生宫颈上皮内瘤变到原位癌需要3-8年，并且这个宫颈上皮内瘤变过程是可逆转的,如果能及时发现癌前病变或早期宫颈癌,其治愈率几乎达100%，因此对宫颈癌及癌前病变的筛查意义重大。
宫颈癌筛查方法主要分2大类：细胞学检查（包括巴氏涂片PAP法和宫颈薄层液基细胞学检测TCT）、人乳头瘤病毒（HPV）DNA检测。另外随着市场需求和技术发展，新的筛查方法还包括HPV和细胞学联合检查、人工智能（AI）和云平台细胞学筛查、甲基化检测。数据显示，人群中ASC-US的发病率为5%左右，细胞学ASC-US中经子宫颈活检诊断CIN2/3的概率在10%以下，浸润癌风险低，为0.1％-0.2％。由于造成ASC-US的原因诸多，对病理医生要求较高，容易发生诊断不足或过度诊断。宫颈细胞学检查目前存在问题包括：1、单一应用敏感性不高（约50%-85%）；2、ASCUS及LSIL的特异性不高；3、对取材和阅片病理医生依赖性大；由此导致细胞学检查容易出现假阴性，具有漏诊率高的特点。HPV检测虽然敏感性较高，但由于HPV感染一过性的特性，其特异性较低，较容易出现误诊现象，容易导致患者过于焦虑、难以接受。
甲基化肿瘤标志物作为一种创新的检测技术，DNA甲基化几乎出现在所有癌症的癌前病变及癌症早期阶段，先于细胞表型变化，故优于细胞学检查，是癌症早筛的理想标志物。尽管现有技术中已经发现了一些甲基化肿瘤标志物，但是其受限于甲基化肿瘤标志物的检测试剂或者检测手段，导致肿瘤标志物的灵敏度和特异性不能满足需求。
因此，如何提高肿瘤标志物检测的灵敏度和特异性，成为亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种宫颈癌SOX1-SEPTIN9-TAC1基因甲基化的检测试剂及试剂盒。
本申请首次发现SOX1-SEPTIN9-TAC1基因进行甲基化联合检测，可以实现高特异性和高灵敏度的对宫颈癌及其癌前病变进行检测。
第一方面，本申请提供一种引物，采用如下的技术方案：
一种引物，所述引物选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50所示氨基酸序列，或与其具有至少80％以上的同源性的氨基酸序列。
所述引物选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ IDNO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50所示的序列或其互补序列中的至少任意一条。
优选的，所述引物选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：43和SEQ IDNO：44、SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50所示的至少一对引物对。
优选的，所述引物选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44所示的引物对。
第二方面，本申请提供一种探针，采用如下的技术方案：
一种探针，所述探针选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：48、SEQ IDNO：51所示的序列或其互补序列中的至少任意一条。
优选的，所述探针选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：45所示的序列。
优选的，在探针的3’末端连接有荧光淬灭基团，5’末端连接有荧光报告基团。
优选的，荧光淬灭基团为BHQ、BHQ1、BHQ2、TAMRA或MGB，荧光报告基团为FAM、CY3、CY5、HEX、ROX或TET。
更优选的，荧光淬灭基团为BHQ1，荧光报告基团为FAM。
第三方面，本申请提供上述引物和/或探针在制备宫颈癌检测试剂或试剂盒中的应用，采用如下的技术方案：
一种上述引物、上述探针在制备宫颈癌检测试剂或试剂盒中的应用。
优选的，所述检测试剂或试剂盒用于检测SOX1-SEPTIN9-TAC1基因经转化试剂修饰后的序列。
优选的，所述转化试剂为重亚硫酸盐、肼盐或亚硫酸氢盐中的一种或几种；所述转化试剂包括肼盐、重亚硫酸氢盐(例如重亚硫酸氢钠等)、亚硫酸氢盐(例如偏亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铯、亚硫酸氢铵等)或在适当的反应条件下可产生肼盐、重亚硫酸氢盐、亚硫酸氢盐的化合物中的一种或几种的试剂。
更优选的，所述转化试剂为重亚硫酸盐。
第四方面，本申请提供一种宫颈癌的检测试剂，采用如下的技术方案：
一种宫颈癌的检测试剂，包括上述的引物、上述探针。
优选的，所述检测试剂还包括dNTPs、DNA聚合酶、缓冲液、无核酸酶水中的一种或几种。
优选的，所述检测试剂还包括内参基因的检测试剂。
优选的，内参基因为β-actin或COL2A1；进一步的，内参基因也可以采用现有技术的其他的甲基化检测的内参基因。
优选的，内参基因为β-actin。
优选的，内参基因β-actin的检测试剂含有针对内参基因检测的引物对和探针。
优选的，内参基因β-actin的检测试剂含有引物对为SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：62，探针为SEQ ID NO：63。
优选的，所述试剂的检测区域为SOX1基因基因体或者其启动子区域、SEPTIN9基因基因体或者其启动子区域、TAC1基因基因体或者其启动子区域，具体如下：
检测试剂针对SOX1基因检测区域为SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：65所示的序列；更优选的，检测试剂针对SOX1基因检测区域包含SEQ ID NO：64所示的序列；
检测试剂针对SEPTIN9基因检测区域为SEQ ID NO：66或SEQ ID NO：67所示的序列；更优选的，检测试剂针对SEPTIN9基因检测区域为SEQ ID NO：66所示的序列；
检测试剂针对TAC1基因检测区域为SEQ ID NO：68或SEQ ID NO：69所示的序列；更优选的，检测试剂针对TAC1基因检测区域为SEQ ID NO：68所示的序列。
在一个具体的可实施方案中，本申请提供一种宫颈癌的检测试剂，包括引物探针组合，采用如下的技术方案：
一种宫颈癌的检测试剂，包括针对SOX1基因、SEPTIN9基因、TAC1基因检测的引物对和探针；
其中，针对SOX1基因检测的引物对和探针的序列如下列任意一组所示：
组一：
引物对为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，探针为SEQ ID NO：3；
组二：
引物对为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，探针为SEQ ID NO：6；
组三：
引物对为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，探针为SEQ ID NO：9。
优选的，针对SOX1基因检测的引物对和探针为：
组一：引物对为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，探针为SEQ ID NO：3。
针对SEPTIN9基因检测的引物对和探针的序列如下列任意一组所示：
组四：
引物对为SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23，探针为SEQ ID NO：24；
组五：
引物对为SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26，探针为SEQ ID NO：27；
组六：
引物对为SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29，探针为SEQ ID NO：30；
组七：
引物对为SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32，探针为SEQ ID NO：33。
优选的，针对SEPTIN9基因检测的引物对和探针：
组四：引物对为SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23，探针为SEQ ID NO：24。
针对TAC1基因检测的引物对和探针的序列如下列任意一组所示：
组八：
引物对为SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44，探针为SEQ ID NO：45；
组九：
引物对为SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47，探针为SEQ ID NO：48；
组十：
引物对为SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50，探针为SEQ ID NO：51。
优选的，针对TAC1基因检测的引物对和探针：
组八：引物对为SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44，探针为SEQ ID NO：45。
第五方面，本申请提供一种宫颈癌的检测试剂盒，采用如下的技术方案：
一种宫颈癌的检测试剂盒，包括上述的引物或上述探针或上述的检测试剂。
第六方面，本申请提供一种用于SOX1-SEPTIN9-TAC1基因甲基化检测方法，采用如下的技术方案：
一种用于SOX1-SEPTIN9-TAC1基因甲基化检测方法，所述方法包括使用上述引物、上述探针或上述检测试剂或上述试剂盒进行检测，所述方法不用于疾病诊断和治疗目的。
一种用于SOX1-SEPTIN9-TAC1基因甲基化检测方法，检测方法的步骤如下：
S1、将待测样品提取DNA后，用转化试剂进行处理，获得经修饰的待测样品；
S2、利用上述引物、上述探针、检测试剂或试剂盒，对转化试剂修饰后的待测样品进行目标基因甲基化情况检测。
优选的，对步骤S2获取的检测△Ct值与临界值进行比较分析，当△Ct值小于临界值时为阳性，表明收集的宫颈脱落细胞中含有甲基化的SOX1基因、SEPTIN9基因、TAC1基因中的至少一种。
优选的，所述转化试剂为重亚硫酸盐、肼盐或亚硫酸氢盐中的一种或几种。所述转化试剂包括肼盐、重亚硫酸氢盐(例如重亚硫酸氢钠等)、亚硫酸氢盐(例如偏亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铯、亚硫酸氢铵等)或在适当的反应条件下可产生肼盐、重亚硫酸氢盐、亚硫酸氢盐的化合物中的一种或几种的试剂。
更优选的，所述转化试剂为重亚硫酸盐。
第七方面，本申请提供一种宫颈癌的诊断系统，采用如下的技术方案：
一种宫颈癌的诊断系统，所述诊断系统含有：
a.检测构件：用以检测SOX1-SEPTIN9-TAC1基因的DNA甲基化程度的检测构件；
b.结果判断构件：用于根据检测构件检测的定量检测SOX1-SEPTIN9-TAC1基因的DNA甲基化程度结果，输出宫颈癌的患病的可能性或者风险值。
优选的，所述的定量检测SOX1-SEPTIN9-TAC1基因的DNA甲基化程度的检测构件含有所述的检测试剂或所述的试剂盒。
优选的，所述的患病风险是根据通过结果比较待测样本与正常样本的甲基化结果，当待测样本与正常样本的甲基化具有显著差异或极显著差异时，结果判断待测样本患病风险高。
本申请提供了一种宫颈癌SOX1-SEPTIN9-TAC1基因甲基化的检测试剂及试剂盒，所述的甲基化DNA位于SOX1基因及其启动子区域、SEPTIN9基因及其启动子区域和TAC1基因及其启动子区域。本申请不仅在组织样本中验证了SOX1基因、SEPTIN9基因、TAC1基因的检出率，同时验证了SOX1基因、SEPTIN9基因、TAC1基因在TCT样本中具有同样高的特异性和灵敏性，并且通过对SOX1基因、SEPTIN9基因、TAC1基因组合，可以明显提高宫颈癌的检出率，本申请还通过对SOX1基因、SEPTIN9基因、TAC1基因进行引探的优化，进一步提高了检测性能。
发明人经过检索和查阅大量文献以及对The Cancer Genome Atlas（TCGA）平台的数据分析，并且基于Reduced representation bisulfite sequencing（RRBS）高通量二代测序的甲基化DNA检测技术，对宫颈石蜡样本进行检测及深入分析，获取宫颈癌及癌前病变具有临床诊断意义的标志物，同时采用qPCR方法先后经过宫颈石蜡样本以及TCT宫颈脱落细胞样本进行验证，最终发现SOX1基因、SEPTIN9基因、TAC1基因这3个基因进行联合检测，实现高特异性和高灵敏度的对宫颈癌及癌前病变患者进行识别。
综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：
本申请公开了一种宫颈癌SOX1-SEPTIN9-TAC1基因甲基化的检测试剂及试剂盒，本申请不仅在组织样本中验证了SOX1基因、SEPTIN9基因、TAC1基因的检出率，同时验证了SOX1基因、SEPTIN9基因、TAC1基因在TCT样本中具有同样高的特异性和灵敏性，并且通过对SOX1基因、SEPTIN9基因、TAC1基因组合，可以明显提高宫颈癌的检出率；尤其是针对鳞状上皮内病变（HSIL）的高灵敏度检出对宫颈癌的早诊早发现有重要的意义。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制；其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
实施例1：引物探针组合的设计
各种研究资料表明，同一个基因的甲基化状态和分布并不均匀，因此对于同一个基因来说，选择不同的区域设计的甲基化引物、探针检测体系对同一样本，同一肿瘤的诊断检测效能并不一样，甚至有时候选择的区域不合适造成对肿瘤完全没有诊断效果，本发明人经过反复的研究和比较后，选择SOX1、SEPT9和TAC1优选区域如下：
SOX1基因检测区域优选序列如SEQ ID NO：64所示的序列；SEPTIN9基因检测区域优选序列如SEQ ID NO：66所示的序列；TAC1基因检测区域优选序列如SEQ ID NO：68所示的序列。
为了完成本发明，发明人筛选了大量基因，最终确认SOX1、SEPTIN9、TAC1基因为优选待测基因，β-actin基因作为内参基因，研究各个基因甲基化位点分布情况，设计检测的引物探针分别用于检测。
各基因检测引物探针如下：
表1 引物对和探针序列表
实施例2：SOX1、SEPTIN9、TAC1基因在石蜡样本中的检测
为了完成本发明，发明人筛选了大量基因，最终确认SOX1、SEPTIN9、TAC1基因为优选待测基因，β-actin基因作为内参基因，研究各个基因甲基化位点分布情况，设计检测的引物探针分别用于检测。
本实施例中各基因检测引物探针如下：
SOX1的检测引物和探针为：
SOX1-MF2：SEQ ID NO：1所示的序列；
SOX1-MR2：SEQ ID NO：2所示的序列；
SOX1-P2：SEQ ID NO：3所示的序列；
SEPT9的检测引物和探针为：
SEPT9-MF1：SEQ ID NO：22所示的序列；
SEPT9-MR1：SEQ ID NO：23所示的序列；
SEPT9-P1：SEQ ID NO：24所示的序列；
TAC1的检测引物和探针为：
TAC1-MF2：SEQ ID NO：43所示的序列；
TAC1-MR2：SEQ ID NO：44所示的序列；
TAC1-P2：SEQ ID NO：45所示的序列；
β-actin的检测引物和探针为：
ACTB-MF：SEQ ID NO：61所示的序列；
ACTB-MR：SEQ ID NO：62所示的序列；
ACTB-P：SEQ ID NO：63所示的序列。
样本检测：
样本信息：测试宫颈石蜡样本共计50例，其中对照组样本20例；阳性样本（病理≥CIN2，后续简写为CIN2+）30例，阳性样本中包含10例HSIL样本，20例鳞癌样本（包含14例Ⅰ/Ⅱ期宫颈癌样本和6例Ⅲ/Ⅳ期宫颈癌样本）。
试验过程：
1、提取DNA
收集确诊宫颈癌及高级别鳞状上皮内病变（HSIL）患者的标本和非肿瘤患者石蜡组织标本，按美基生物公司试剂盒HiPureFFPE DNA Kit(D3126-03)说明书进行DNA提取。
2、DNA修饰
以ZYMO RESEARCH生物公司试剂盒EZDNAMethylationTMKIT(D5002)说明书进行重亚硫酸盐修饰。
3、扩增与检测
配液体系：
表2 配液体系
扩增程序：
表3 扩增程序
4、检测结果
以△Ct值（△Ct=标志物Ct值-ACTB Ct值）作为样本阳性判断标准，其中SOX1的阳性判断值△Ct为7.5，SEPT9的阳性判断值△Ct为7，TAC1的阳性判断值△Ct为7，当检测结果△Ct值小于相应阳性判断值时，则判断该标志物对样本检测结果为阳性，否则为阴性，50例宫颈石蜡样本检测结果如下：
表4 检测结果
注意：当无扩增曲线时，Ct值统一赋值为45进行△Ct值计算。
对检测结果进行分析，分析结果如下：
表5 分析结果
从以上结果可以看出，在宫颈石蜡样本中，无论将CIN2+作为一个整体还是分别按照HSIL和宫颈癌组进行分析，在特异性为100%的情况下，均具有较高的灵敏度。特别是对HSIL组，单基因检测灵敏度均为80%以上，3组基因联合检测可以100%检出，由于宫颈癌的发展历程是由鳞状上皮内病变（HSIL）向宫颈癌发展，对HSIL的高灵敏度检出对宫颈癌的早诊早发现有重要的意义。
实施例3：SOX1、SEPTIN9、TAC1基因在宫颈脱落细胞样本中的检测
通过在宫颈石蜡样本中进行甲基化检测，确认SOX1基因、SEPTIN9基因、TAC1基因无论单一检测或联合检测，均有很高的特异性和灵敏度，为验证这3个基因在实际临床样本，即宫颈脱落细胞样本（以下简称TCT样本）中的检测性能，本发明人收集了200例不同疾病类型含病理信息的TCT样本，以β-actin基因作为内参基因，研究SOX1基因、SEPTIN9基因、TAC1基因在上述TCT样本中的检测情况。
本实施例中各基因检测引物探针如下：
SOX1的检测引物和探针为：
SOX1-MF2：SEQ ID NO：1所示的序列；
SOX1-MR2：SEQ ID NO：2所示的序列；
SOX1-P2：SEQ ID NO：3所示的序列；
SEPT9的检测引物和探针为：
SEPT9-MF1：SEQ ID NO：22所示的序列；
SEPT9-MR1：SEQ ID NO：23所示的序列；
SEPT9-P1：SEQ ID NO：24所示的序列；
TAC1的检测引物和探针为：
TAC1-MF2：SEQ ID NO：43所示的序列；
TAC1-MR2：SEQ ID NO：44所示的序列；
TAC1-P2：SEQ ID NO：45所示的序列；
β-actin的检测引物和探针为：
ACTB-MF:SEQ ID NO：61所示的序列；
ACTB-MR:SEQ ID NO：62所示的序列；
ACTB-P:SEQ ID NO：63所示的序列。
样本检测：
样本信息：测试200例不同疾病类型含病理信息的TCT样本，其中包括99例阴性对照样本（≤CIN1）和101例阳性对照样本（≥CIN2），阴性对照样本包括59例非宫颈癌及其癌前病变的患其他宫颈疾病的样本，40例低级别鳞状上皮内病变（LSIL）；阳性对照样本包括59例高级别鳞状上皮内病变（HSIL），42例宫颈癌样本，其中宫颈癌样本包括34例鳞癌、4例腺癌、2例腺鳞癌、1例小细胞癌、1例未明确类型宫颈癌样本。
试验过程：
1、提取DNA
取一定量的TCT临床样本离心分离细胞取沉淀，按美基生物公司试剂盒HiPureFFPE DNA Kit(D3126-03)说明书进行DNA提取。
2、DNA修饰
以ZYMO RESEARCH 生物公司试剂盒EZDNAMethylationTMKIT(D5002)说明书进行重亚硫酸盐修饰。
3、扩增与检测
配液体系：
表6 配液体系
扩增程序：
表7 扩增程序
4、检测结果
以△Ct值（△Ct=标志物Ct值-ACTB Ct值）作为样本阳性判断标准，其中SOX1的阳性判断值△Ct为4，SEPT9的阳性判断值△Ct为10，TAC1的阳性判断值△Ct为6，当检测结果△Ct值小于相应阳性判断值时，则判断该标志物对样本检测结果为阳性，否则为阴性，200例TCT样本检测结果如下：
表8 200例TCT样本检测结果
注意：当无扩增曲线时，Ct值统一赋值为45进行△Ct值计算。
对检测结果进行分析，分析结果如下：
表9 分析结果
从以上结果可以看出，在TCT样本中，在特异性≥97%的情况下，各基因在宫颈癌中灵敏度均＞80%，TAC1甚至可以达到100%检出；但在HSIL组中，各基因表现与石蜡样本检测结果表现差异较大（灵敏度在54-72%），从而导致各基因在整体上性能上降低有所下降，但灵敏度可达到70%以上；3个基因联合检测在保持97%的高特异性情况下，整体灵敏度达到88.1%，对于HSIL组，灵敏度也高达79.7%，宫颈癌组可以100%检出。由于宫颈癌的发展历程是由鳞状上皮内病变（HSIL）向宫颈癌发展，对HSIL的高灵敏度检出对宫颈癌的早诊早发现有重要的意义。
实施例4：SOX1、SEPT9和TAC1的引物设计与优化
引物和探针也对肿瘤标志物的检测效果有极大的影响，发明人在研究过程中，设计了多对引物及其对应的探针，以寻找到尽可能提高检测灵敏度和特异性的探针和引物，以使本发明的检测试剂能够实际应用到临床检测中。
表10 引物探针组合
以上引物对和探针组合在50例宫颈石蜡样本中进行筛选检测，其中对照组样本20例；阳性样本（病理≥CIN2，后续简写为CIN2+）30例，阳性样本中包含10例HSIL样本，20例鳞癌样本（包含14例Ⅰ/Ⅱ期宫颈癌样本和6例Ⅲ/Ⅳ期宫颈癌样本）。
试验过程、扩增程序与实施例2相同。
检测结果如下：
表11 针对SOX1基因不同引物探针对检测结果
在SOX1基因多对引物探针检测结果中，结果显示，组合2检测性能（特异性、灵敏性）最优，组合1和组合6次之，组合3、组合4、组合5和组合7性能较差。
表12 针对SEPT9基因不同引物探针对检测结果
在SEPT9多对引物探针检测结果中，结果显示，组合1检测性能最优，组合2、组合3和组合4次之，组合5、组合6和组合7性能较差。
表13 针对TAC1基因不同引物探针对检测结果
在TAC1基因多对引物探针检测结果中，结果显示，组合2检测性能最优，组合1和组合5次之，组合3、组合4和组合6性能较差。
结合表11、表12、表13可知，针对同一区域的不同引物对，对检测结果会产生影响。
Claims (10)
1.一种引物对，其特征在于：包括针对SOX1基因、SEPTIN9基因、TAC1基因检测的引物对，其中，
针对SOX1基因检测的引物对的序列如下列任意一组所示：
组一：引物对为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；
组二：引物对为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5；
组三：引物对为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8；
针对SEPTIN9基因检测的引物对的序列如下列任意一组所示：
组四：引物对为SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23；
组五：引物对为SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26；
组六：引物对为SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29；
组七：引物对为SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32；
针对TAC1基因检测的引物对的序列如下列任意一组所示：
组八：引物对为SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44；
组九：引物对为SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47；
组十：引物对为SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50。
2.根据权利要求1所述的一种引物对，其特征在于：
针对SOX1基因检测的引物对序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；
针对SEPTIN9基因检测的引物对序列如SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23所示；
针对TAC1基因检测的引物对序列如SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44所示。
3.一种探针，其特征在于：包括针对SOX1基因、SEPTIN9基因、TAC1基因检测的探针，其中，
针对SOX1基因检测的探针的序列如下列任意一组所示：
组一：探针为SEQ ID NO：3；
组二：探针为SEQ ID NO：6；
组三：探针为SEQ ID NO：9；
针对SEPTIN9基因检测的探针的序列如下列任意一组所示：
组四：探针为SEQ ID NO：24；
组五：探针为SEQ ID NO：27；
组六：探针为SEQ ID NO：30；
组七：探针为SEQ ID NO：33；
针对TAC1基因检测的探针的序列如下列任意一组所示：
组八：探针为SEQ ID NO：45；
组九：探针为SEQ ID NO：48；
组十：探针为SEQ ID NO：51。
4.根据权利要求3所述的一种探针，其特征在于：
针对SOX1基因检测的探针序列如SEQ ID NO：3所示；
针对SEPTIN9基因检测的探针序列如SEQ ID NO：24所示；
针对TAC1基因检测的探针序列如SEQ ID NO：45所示；
在探针的3’末端连接有荧光淬灭基团，5’末端连接有荧光报告基团；荧光淬灭基团为BHQ、BHQ1、BHQ2、TAMRA或MGB，荧光报告基团为FAM、CY3、CY5、HEX、ROX或TET。
5.权利要求1所述引物对或权利要求3所述探针在制备宫颈癌检测试剂或试剂盒中的应用。
6.一种宫颈癌检测试剂，其特征在于：所述检测试剂包括权利要求1所述引物对或权利要求3所述探针。
7.根据权利要求6所述的一种宫颈癌检测试剂，其特征在于：所述检测试剂还包括dNTPs、DNA聚合酶、缓冲液、无核酸酶水、内参基因中的一种或几种；
其中，内参基因为β-actin；
内参基因β-actin检测试剂含有针对内参基因检测的引物对和探针；引物对为SEQ IDNO：61和SEQ ID NO：62，探针为SEQ ID NO：63。
8.一种宫颈癌的检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求6或7所述的检测试剂。
9.一种非疾病诊断目的的SOX1-SEPTIN9-TAC1基因甲基化检测方法，其特征在于，所述检测方法的步骤如下：
S1、将待测样品提取DNA后，用转化试剂进行处理，获得经修饰的待测样品；
S2、利用权利要求6或7所述的检测试剂或权利要求8所述试剂盒，对转化试剂修饰后的待测样品进行SOX1-SEPTIN9-TAC1甲基化情况检测；
其中，对步骤S2获取的检测△Ct值与临界值进行比较分析，当△Ct值小于临界值时为阳性，表明收集的待测样品中含有甲基化的SOX1基因、SEPTIN9基因、TAC1基因中的至少一种；
所述转化试剂为重亚硫酸盐、肼盐或亚硫酸氢盐中的一种或几种。
10.一种宫颈癌的诊断系统，其特征在于，所述诊断系统含有：
a.检测构件：用以定量检测SOX1-SEPTIN9-TAC1基因的DNA甲基化程度的检测构件；
b.结果判断构件：用于根据检测构件检测的定量检测SOX1-SEPTIN9-TAC1基因的DNA甲基化程度结果，输出宫颈癌的患病的可能性或者风险值；
其中，所述的定量检测SOX1-SEPTIN9-TAC1基因的DNA甲基化程度的检测构件含有权利要求6或7所述的检测试剂或权利要求8所述试剂盒。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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