CN113186294A - 一种用于检测卵巢癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法 - Google Patents
一种用于检测卵巢癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于检测卵巢癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法，核酸组合物，包括：RASSF1A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针；OPCML基因目的位点的甲基化特异性引物和探针；RUNX3基因目的位点的甲基化特异性引物和探针；TFPI2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针；ACTB内参基因的特异性引物和探针；本发明发现的核酸组合物配置成的试剂盒具有检测检测卵巢癌相关基因甲基化结果准确、操作简单、准确性高及敏感性高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别是一种用于检测卵巢癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法。
背景技术
卵巢癌(Ovarian Cancer)是妇科最常见并严重威胁妇女生命和健康的恶性肿瘤之一，易于转移和广泛播散，其发病率低于子宫颈癌和子宫内膜癌，居妇科恶性肿瘤第3位，但病死率却超过前两者之和，高居妇科癌症之首。其发病十分隐匿，转移前常无症状，手术不能完全清除病灶，再加上术后化疗作用局限，术后复发率高、预后差。世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)发布的2020年全球最新癌症统计数据显示：每年约有31.4万例新发病例，20.7万例死亡病例。卵巢恶性肿瘤组织类型繁多，其中上皮性卵巢癌(EpithelialOvarian Cancer，EOC)最常见，约占80-90％，是目前死亡率最高的妇科恶性肿瘤，高达70％。
目前卵巢癌现有临床筛查、诊断方法可归为三大类：影像学(超声，CT，PET/CT，MRI等)，血清学(血清中肿瘤标志物如CA-125的检测)和病理学(组织活检，细胞学检查等)。但所有这些方法都有不可避免的缺点，例如影像学主要缺陷在于检测结果滞后，对受检者造成放射性伤害；血清学标志物灵敏性及特异性差，细胞学检测和组织活检均有侵入性，造成患者的精神上的紧张和压力，且灵敏度和可重复性都很差，过于依赖医生判断的主观性等。因此，寻找新的无创、精确的检测方法妇科肿瘤的早期诊断和筛查是当前临床上亟待解决的问题。
随着技术上的快速发展，肿瘤分子标志物发展成为继影像诊断、病理诊断之后的肿瘤诊断治疗新的领域，对肿瘤的诊断、监测和治疗产生了重大影响。肿瘤分子标志物可以在体液或组织中检测到，能够反映肿瘤的存在、分化程度、预后估计和判断治疗效果等。目前基因诊断技术不断发展，给卵巢癌的早期诊断带来了希望，其中一个领域就是通过DNA甲基化检测来判断病人是否患有癌症。DNA反常甲基化是肿瘤分子病理改变的一个组成部分，依据DNA反常甲基化的已经成为肿瘤诊断的一个可靠靶标。DNA异常甲基化通常出现在肿瘤发生的早期，因此可以作为肿瘤筛查或诊断的依据。此外，DNA甲基化的“成簇”性出现推动基于液体活检的肿瘤早筛。事实上,目前基于DNA异常甲基化的检测已经成为肿瘤早期诊断、患病风险预测、临床病程监控和疗效评估的最有希望的技术手段。
TFPI-2组织因子途径抑制物-2(Tissue Factor Pathway Inhibitor-2，TFPI-2)，又称胎盘蛋白-5(Placental Protein 5，PP-5)或基质相关性丝氨酸蛋白酶抑制剂(Matrix-associated Serine Protease inhibitor，MSPI)，是一种带有Kunitz型结构域的蛋白酶抑制剂，属于丝氨酸蛋白酶抑制物超家族成员，可能通过影响细胞外基质的重塑参与组织发生、胚胎发育分化、伤口愈合、肿瘤的侵袭转移和动脉粥样硬化斑块破裂等生理病理过程。
RASSF1A(Ras Association Domain Family Member 1)基因编码类似于RAS效应蛋白的蛋白质，是潜在的肿瘤抑制因子。RASSF1A调控的靶基因涉及基因转录、信号转导、细胞骨架、细胞周期、细胞黏附及调亡等多方面内容，具有广泛的生物学作用。而RASSF1A作为一种新型肿瘤抑制基因，其在肿瘤发生及发展过程中的作用尤为重要。目前认为，RASSFIA基因表达失活主要与启动子区异常的高甲基化、杂合性缺失及染色体缺失有关。人类肿瘤中RASSF1A基因失活的频率非常高。例如，RASSF1A基因在70％以上的小细胞肺癌，91％的肾细胞癌，62％的膀胱癌，71％的甲状腺癌，84％的鼻咽癌及70％以上的前列腺癌等中处于高甲基化状态进而失活。
Runx3基因被认为是一个新的抑癌基因，属人runt相关转录因子(human runt-related transcription factor，RUNX)家族成员，是TCF-β信号传导通路中的一个重要环节。RUNX3基因在胃粘膜生长调控中起重要作用，能抵抗TCF-β诱导的生长抑制和细胞凋亡，调控胃粘膜上皮细胞分化，其失活可导致胃粘膜上皮细胞的肠化生，并可由此导致胃癌的发生、发展和转移。
OPCML(Opioid-binding protein/cell adhesion molecule-like)，定位人染色体11q25区域，表达产物属于IgLON家族成员，而IgLON家族在细胞的黏附以及相互识别中发挥重要作用；同时也是黏附因子如E-cadherin，6-cadherin等的重要调节因子，而E-cadherin，6-cadherin等因子已被证实通过wnt信号传导通路并最终促动LEF，TCF以及p-catenin等因子在抑制细胞迁移、扩散中发挥作用。因而OPCML在IgLON家族中，有可能与其它成员一样通过此途径在肿瘤细胞浸润转移中发挥负调节作用。
OPCML基因编码的蛋白广泛存在于正常卵巢上皮，并在在EOC中经常因等位基因丢失和CpG岛甲基化而失活，可能是导致肿瘤的发生诱因之一。RT-PCR显示正常的卵巢均有OPCML的表达，83％的原发性卵巢癌、88％的卵巢癌细胞株、71％非卵巢癌细胞株显示有OPCML mRNA表达的缺失并伴有错义突变和甲基化。
目前，卵巢癌甲基化早期检测仍然无法找到一种检测快速、高通量、灵敏及特异性好的核酸组合物和试剂盒，本发明解决这样的问题，通过特异性的引物和特异性探针对核酸进行扩增，以达到快速检测卵巢癌相关基因甲基化的目的，最终间接为卵巢癌的早期诊断提供有效的信息，为卵巢癌的早发现早治疗以及治疗效果监控提供一种简便易行的方法。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于检测卵巢癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法，本发明发现的核酸组合物配置成的试剂盒具有检测检测卵巢癌相关基因甲基化结果准确、操作简单、准确性高及敏感性高等优点。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种用于检测卵巢癌相关基因甲基化的核酸组合物，包括：RASSF1A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针；OPCML基因目的位点的甲基化特异性引物和探针；RUNX3基因目的位点的甲基化特异性引物和探针；TFPI2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针；ACTB内参基因的特异性引物和探针；
RASSF1A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
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反向引物：5＇-CCGATTAAATCGTACTTCGC-3＇SEQ ID 02，
检测探针：5＇标记物-TCGCGTTTTTAGCGTTTAAAGT-3＇标记物SEQ ID 03；
OPCML基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
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检测探针：5＇标记物-CGTCGCTTATCGGGTTGGGGATGTTT-3＇标记物SEQ ID 06；
RUNX3基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
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反向引物：5＇-CGACAAAACCCTTCCGTAA-3＇SEQ ID 08，
检测探针：5＇标记物-AGTTTAGGGTTCGAGAGTTTTGGGAGTTCG-3＇标记物SEQ ID 09；
TFPI2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
正向引物：5＇-GTTCGTTGGTAAGGCGTTC-3＇SEQ ID 10，
反向引物：5＇-ATAAAAGAACCCCGAACCG-3＇SEQ ID 11，
检测探针：5＇标记物-AGCGTTGCGGGAGGAGGTGC-3＇标记物SEQ ID 12；
ACTB内参基因特异性引物和探针包括：
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反向引物：5＇-GCACTCTTCCAAACGAAACG-3＇SEQ ID 14，
检测探针：5＇标记物-ACCACCACCACACACAATAACAAACACA-3＇标记物SEQ ID 15。
一种用于检测卵巢癌相关基因甲基化的试剂盒，包括：PCR反应液，阴性质控品，阳性质控品和无模板对照；PCR反应液包括：RASSF1A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，OPCML基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，RUNX3基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，TFPI2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，ACTB内参基因的特异性引物和探针，2X PCR缓冲液，dNTP，无核酸酶水，基因组DNA样本和Taq酶；
RASSF1A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
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OPCML基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
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RUNX3基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
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TFPI2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
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ACTB内参基因特异性引物和探针包括：
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检测探针：5＇标记物-ACCACCACCACACACAATAACAAACACA-3＇标记物SEQ ID 15。
前述的一种用于检测卵巢癌相关基因甲基化的试剂盒，PCR反应液的成分终浓度为：1X PCR缓冲液、0.4～0.6μM RASSF1A正向引物、0.4～0.6μM RASSF1A反向引物、0.2～0.3μM RASSF1A检测探针，0.4～0.6μM OPCML正向引物、0.4～0.6μM OPCML反向引物、0.2～0.3μM OPCML检测探针，0.4～0.6μM RUNX3正向引物、0.4～0.6μM RUNX3反向引物、0.2～0.3μM RUNX3检测探针，0.4～0.6μM TFPI2正向引物、0.4～0.6μM TFPI2反向引物、0.2～0.3μM TFPI2检测探针，0.1～0.3μM ACTB正向引物、0.1～0.3μM ACTB反向引物、0.05～0.15μM ACTB检测探针、0.2～0.5mM dNTP、无核酸酶水、基因组DNA样本、0.05-0.2U/μlTaq酶。
前述的一种用于检测卵巢癌相关基因甲基化的试剂盒，阳性质控品为经SssI甲基化酶处理的Hct116细胞系的基因组DNA。
前述的一种用于检测卵巢癌相关基因甲基化的试剂盒，阴性质控品为敲除了基因DNMT1和DNMT3b后的Hct116细胞系的基因组DNA。
一种用于检测卵巢癌相关基因甲基化的检测方法，包括如下步骤：
步骤一：抽提待检测样本的DNA，经过转化处理后的DNA作为PCR的模板的基因组DNA样本；
步骤二：使用用于检测卵巢癌相关基因甲基化检测的试剂盒对基因组DNA样本进行PCR扩增；
试剂盒包括：PCR反应液，阴性质控品，阳性质控品和无模板对照；PCR反应液包括：RASSF1A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，OPCML基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，RUNX3基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，TFPI2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，ACTB内参基因的特异性引物和探针，2X PCR缓冲液，dNTP，无核酸酶水，基因组DNA样本和Taq酶；
RASSF1A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
正向引物：5＇-CGGGGTTCGTTTGTGGTTTC-3＇SEQ ID 01，
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检测探针：5＇标记物-TCGCGTTTTTAGCGTTTAAAGT-3＇标记物SEQ ID 03；
OPCML基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
正向引物：5＇-CGGGCGGCGTTTATTTTAATTT-3＇SEQ ID 04，
反向引物：5＇-GCTAACGCGAATCGAAACGAA-3＇SEQ ID 05，
检测探针：5＇标记物-CGTCGCTTATCGGGTTGGGGATGTTT-3＇标记物SEQ ID 06；
RUNX3基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
正向引物：5＇-TTCGCGGAGGGTTTTAGTGT-3＇SEQ ID 07，
反向引物：5＇-CGACAAAACCCTTCCGTAA-3＇SEQ ID 08，
检测探针：5＇标记物-AGTTTAGGGTTCGAGAGTTTTGGGAGTTCG-3＇标记物SEQ ID 09；
TFPI2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
正向引物：5＇-GTTCGTTGGTAAGGCGTTC-3＇SEQ ID 10，
反向引物：5＇-ATAAAAGAACCCCGAACCG-3＇SEQ ID 11，
检测探针：5＇标记物-AGCGTTGCGGGAGGAGGTGC-3＇标记物SEQ ID 12；
ACTB内参基因特异性引物和探针包括：
正向引物：5＇-GTGATGGAGAGTTTAGTAAGTT-3＇SEQ ID 13，
反向引物：5＇-GCACTCTTCCAAACGAAACG-3＇SEQ ID 14，
检测探针：5＇标记物-ACCACCACCACACACAATAACAAACACA-3＇标记物SEQ ID 15；
步骤三：根据RASSF1A、OPCML、RUNX3、TFPI2和ACTB基因扩增结果的荧光Ct值来确定待测样本是否发生甲基化。
前述的一种用于检测卵巢癌相关基因甲基化的检测方法，步骤一中，转化处理采用的试剂为亚硫酸氢盐或重亚硫酸盐。
前述的一种用于检测卵巢癌相关基因甲基化的检测方法，步骤二中，PCR扩增的反应程序为：95℃，10min,45cycles 95℃15sec，60℃30sec。
本发明的有益之处在于：
本发明发现RASSF1A、OPCML、RUNX3、TFPI2特异性的正向引物、特异性的反向引物以及特异性探针的核酸组合物在检测卵巢癌相关基因甲基化的敏感性和特异性上具有协同作用；
本发明使用基因ACTB作为内参基因对样本的质量进行控制，考虑到管家基因可能甲基化的情况，在设计内参引物和探针时选择不含有CpG位点的位置，针对其亚硫酸氢盐处理后的序列进行设计，保证管家基因对样本的质控；
本发明通过设计特异性高的引物和探针，并配置成使用方便且检测结果可靠的试剂盒，再结合科学合理的PCR反应体系，使得本发明具有快速、高通量、灵敏及特异性好的特点，利用本发明试剂盒进行卵巢癌筛查时，阳性检出率(敏感性)为95％，阴性检出率(特异性)为95％，实现对卵巢癌相关基因甲基化程度快速及准确测量，以便对卵巢癌间接进行及时、有效的诊断和治疗，降低医疗成本，节约社会资源，提升生活品质。
附图说明
图1是本发明RASSF1A基因甲基化阳性样本扩增曲线图；
图2是本发明OPCML基因甲基化阳性样本扩增曲线图；
图3是本发明RUNX3基因甲基化阳性样本扩增曲线图；
图4是本发明TFPI2基因甲基化阳性样本扩增曲线图；
图5是本发明阴性样本扩增曲线图；
图6是本发明目的基因和内参基因均无扩增的曲线示意图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一种用于检测卵巢癌相关基因甲基化的检测方法，包括如下步骤：
步骤一：抽提待检测样本的DNA，经过转化处理后的DNA作为PCR的模板的基因组DNA样本；
转化处理所采用的试剂为亚硫酸氢盐或重亚硫酸盐，采用亚硫酸氢盐处理后的序列进行设计，可以保证管家基因对样本的质控；这里的举例并非穷举，只要是能够对序列进行前处理的均适用于本发明。
步骤二：使用用于检测卵巢癌相关基因甲基化检测的试剂盒对基因组DNA样本进行PCR扩增；作为一种优选，PCR扩增的反应程序为：变性95℃10min；循环45cycles，95℃15sec，60℃30sec；需要说明的是：PCR的扩增程序并不受限制，只要能够对基因组DNA样本进行扩增的程序都适用于本发明。
试剂盒包括：PCR反应液，阴性质控品，阳性质控品和无模板对照；PCR反应液包括：RASSF1A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，OPCML基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，RUNX3基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，TFPI2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，ACTB内参基因的特异性引物和探针，2X PCR缓冲液，dNTP，无核酸酶水，基因组DNA样本和Taq酶；
作为一种优选，阳性质控品为经SssI甲基化酶处理的Hct116细胞系的基因组DNA，可使基因组所有CG序列中的C在C5位置上甲基化，阴性质控品为敲除了基因DNMT1和DNMT3b后的Hct116细胞系的基因组DNA，无模板对照为不含有人类基因组DNA。
作为一种实施例，PCR反应液的成分终浓度为：1X PCR缓冲液、0.4～0.6μMRASSF1A正向引物、0.4～0.6μM RASSF1A反向引物、0.2～0.3μM RASSF1A检测探针，0.4～0.6μM OPCML正向引物、0.4～0.6μM OPCML反向引物、0.2～0.3μM OPCML检测探针，0.4～0.6μM RUNX3正向引物、0.4～0.6μM RUNX3反向引物、0.2～0.3μM RUNX3检测探针，0.4～0.6μM TFPI2正向引物、0.4～0.6μM TFPI2反向引物、0.2～0.3μM TFPI2检测探针，0.1～0.3μM ACTB正向引物、0.1～0.3μM ACTB反向引物、0.05～0.15μM ACTB检测探针、0.2～0.5mM dNTP、无核酸酶水、基因组DNA样本、0.05-0.2U/μlTaq酶，需要说明的是：反应液的试剂配方不受限制，这里提供的只是一种优选实施例，其他能够配合样本DNA扩增的反应液配方也适用于本发明。
RASSF1A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
正向引物：5＇-CGGGGTTCGTTTGTGGTTTC-3＇SEQ ID 01，
反向引物：5＇-CCGATTAAATCGTACTTCGC-3＇SEQ ID 02，
检测探针：5＇FAM-TCGCGTTTTTAGCGTTTAAAGT-3＇标记物SEQ ID 03，作为一种优选，5＇标记物为FAM，3＇标记物为BHQ1；
OPCML基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
正向引物：5＇-CGGGCGGCGTTTATTTTAATTT-3＇SEQ ID 04，
反向引物：5＇-GCTAACGCGAATCGAAACGAA-3＇SEQ ID 05，
检测探针：5＇ROX-CGTCGCTTATCGGGTTGGGGATGTTT-3＇标记物SEQ ID 06，作为一种优选，5＇标记物为ROX，3＇标记物为BHQ2；
RUNX3基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
正向引物：5＇-TTCGCGGAGGGTTTTAGTGT-3＇SEQ ID 07，
反向引物：5＇-CGACAAAACCCTTCCGTAA-3＇SEQ ID 08，
检测探针：5＇TAMRA-AGTTTAGGGTTCGAGAGTTTTGGGAGTTCG-3＇标记物SEQ ID 09，作为一种优选，5＇标记物为TAMRA，3＇标记物为BHQ2；
TFPI2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
正向引物：5＇-GTTCGTTGGTAAGGCGTTC-3＇SEQ ID 10，
反向引物：5＇-ATAAAAGAACCCCGAACCG-3＇SEQ ID 11，
检测探针：5＇VIC-AGCGTTGCGGGAGGAGGTGC-3＇标记物SEQ ID 12；
ACTB内参基因特异性引物和探针包括：
正向引物：5＇-GTGATGGAGAGTTTAGTAAGTT-3＇SEQ ID 13，
反向引物：5＇-GCACTCTTCCAAACGAAACG-3＇SEQ ID 14，
检测探针：5＇CY5-ACCACCACCACACACAATAACAAACACA-3＇标记物SEQ ID 15，作为一种优选，5＇标记物为CY5，3＇标记物为BHQ2；
备注：引物的纯度应达PAGE或HPLC级。
BHQ1、BHQ2作为淬灭标记基团只是一种优选，荧光标记物也只是一种优选，只要是可以用于标记的产品都可以应用于本发明。
步骤三：根据RASSF1A、OPCML、RUNX3、TFPI2和ACTB基因扩增结果的荧光Ct值来确定待测样本是否发生甲基化。
这里需要强调的是：本发明的检测方法不受限制，只要是运用了本发明的核酸组合物的检测方法都在本发明的保护范围内，这里不一一列举。
以下通过实验验证本发明的技术效果：
(一)先使用以下步骤制备用于实验的试剂盒。
一、材料：用于检测卵巢癌相关基因甲基化的试剂盒，其中包括：RASSF1A基因目的位点的甲基化特异性引物和特异的水解探针；OPCML基因目的位点的甲基化特异性引物和特异的水解探针；RUNX3基因目的位点的甲基化特异性引物和特异的水解探针；TFPI2基因目的位点的甲基化特异性引物和特异的水解探针；ACTB基因目的位点的甲基化特异性引物和特异的水解探针。
RASSF1A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
正向引物：5＇-CGGGGTTCGTTTTGTGGTTTC-3＇(SEQ ID NO.1)
反向引物：5＇-CCGATTAAATCCGTACTTCGC-3＇(SEQ ID NO.2)
检测探针：5＇FAM-TCGCGTTTGTTAGCGTTTAAAGT-3＇BHQ1(SEQ ID NO.3)
OPCML基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
正向引物：5＇-CGGGCGGGCGTTTATTTTAATTT-3＇(SEQ ID NO.4)
反向引物：5＇-GCTAACGCGAATATCGAAACGAA-3＇(SEQ ID NO.5)
检测探针：5＇ROX-CGTCGCGTTTATCGGGTTGGGGATGTTT-3＇BHQ2(SEQ ID NO.6)
RUNX3基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
正向引物：5＇-TTCGCGGAGGAGGTTTTAGTGT-3＇(SEQ ID NO.7)
反向引物：5＇-CGACAAAAACGCCTTCCGTAA-3＇(SEQ ID NO.8)
检测探针：5＇TAMRA-AGTTTAGGGTTTTCGAGAGTTTTGGGAGTTCG-3＇BHQ2(SEQ ID NO.9)
TFPI2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
正向引物：5＇-GTTCGTTGGGTAAGGCGTTC-3＇(SEQ ID NO.10)
反向引物：5＇-ATAAAACGAACACCCGAACCG-3＇(SEQ ID NO.11)
检测探针：5＇VIC-AGCGTTTGGCGGGAGGAGGTGC-3＇BHQ1(SEQ ID NO.12)
ACTB内参基因特异性引物和探针包括：
正向引物：5＇-GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT-3＇(SEQ ID NO.13)
反向引物：5＇-GCACTCTTCCGAAAACGAAACG-3＇(SEQ ID NO.14)
检测探针：5＇CY5-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3＇BHQ2(SEQ ID NO.15)
二、阳性质控品和阴性质控品选择：
阳性质控品、阴性质控品。阳性质控品为经SssI甲基化酶处理的Hct116细胞系的基因组DNA，可使基因组中所有CpG序列中的C在C5位置山甲基化；阴性质控品为敲除了基因DNMT1和DNMT3b后的Hct116细胞系的基因组DNA；无模板对照表示不含有人类基因组DNA。
三、PCR反应液组成：
包括含有上述特异性引物及探针的PCR反应液，PCR反应液包括：
RASSF1A正向引物：5＇-CGGGGTTCGTTTTGTGGTTTC-3＇
RASSF1A反向引物：5＇-CCGATTAAATCCGTACTTCGC-3＇
RASSF1A检测探针：5＇FAM-TCGCGTTTGTTAGCGTTTAAAGT-3＇BHQ1
OPCML正向引物：5＇-CGGGCGGGCGTTTATTTTAATTT-3＇
OPCML反向引物：5＇-GCTAACGCGAATATCGAAACGAA-3＇
OPCML检测探针：5＇ROX-CGTCGCGTTTATCGGGTTGGGGATGTTT-3＇BHQ2
RUNX3正向引物：5＇-TTCGCGGAGGAGGTTTTAGTGT-3＇
RUNX3反向引物：5＇-CGACAAAAACGCCTTCCGTAA-3＇
RUNX3检测探针：5＇TAMRA-AGTTTAGGGTTTTCGAGAGTTTTGGGAGTTCG-3＇BHQ2
TFPI2正向引物：5＇-GTTCGTTGGGTAAGGCGTTC-3＇
TFPI2反向引物：5＇-ATAAAACGAACACCCGAACCG-3＇
TFPI2检测探针：5＇VIC-AGCGTTTGGCGGGAGGAGGTGC-3＇BHQ1
ACTB正向引物：5＇-GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT-3＇
ACTB反向引物：5＇-GCACTCTTCCGAAAACGAAACG-3＇
ACTB检测探针：5＇CY5-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3＇BHQ2
2X PCR缓冲液，Taq酶，dNTP及无核酸酶水。均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。
PCR反应液成分的终浓度为：
1X PCR缓冲液、0.6μM(μmol/L)RASSF1A正向引物、0.6μM(μmol/L)RASSF1A反向引物、0.3μM(μmol/L)RASSF1A检测探针，0.6μM(μmol/L)OPCML正向引物、0.6μM(μmol/L)OPCML反向引物、0.3μM(μmol/L)OPCML检测探针，0.6μM(μmol/L)RUNX3正向引物、0.6μM(μmol/L)RUNX3反向引物、0.3μM(μmol/L)RUNX3检测探针，0.6μM(μmol/L)TFPI2正向引物、0.6μM(μmol/L)TFPI2反向引物、0.3μM(μmol/L)TFPI2检测探针，0.2μM(μmol/L)ACTB正向引物、0.2μM(μmol/L)ACTB反向引物、0.1μM(μmol/L)ACTB检测探针，0.25mM(mmol/L)dNTP；
(二)利用上文制备得到的试剂盒样品进行卵巢癌相关基因甲基化的检测：
一、技术原理
通过在人基因组中卵巢癌相关基因和内参基因的启动子区设计一对特异性引物和探针。然后使用该引物及探针去扩增经亚硫酸氢盐转化的样本DNA,根据相关基因的PCR扩增结果的相对荧光值Ct值来确定待测样本的是否发生甲基化，根据甲基化来间接判定卵巢癌的风险。
二、检测方法
步骤一：待测样本DNA的抽提，并对其进行亚硫酸氢盐转化处理，转化后的DNA作为PCR的模板进行qPCR扩增。
其中，转化处理所采用的试剂为亚硫酸氢盐或重亚硫酸盐，及其他辅助试剂(相应试剂购自于德国QIAGEN公司的Epitect Fast Bisμlfite Conversion Kit)；
步骤二：提供上述用于卵巢癌相关基因甲基化检测的试剂盒，并对模板进行PCR扩增；
步骤三：根据相关基因的PCR扩增结果的相对荧光值Ct来确定待检测样本是否发生甲基化；
具体的检测方法，如下：
一)血浆分离
1、利用游离DNA采样管抽取10ml外周血，到达实验室后第一时间进行血浆分离工作。
2、4℃，1600rpm离心力离心20min，取血浆分装到无菌离心管内。
3、初步分离后的血浆在4℃条件下以16,000rpm离心10min，以去除残余细胞。离心结束后将血浆分装到无菌离心管内。
二)提取血浆DNA：
DNA抽提试剂盒购自于济凡生物科技(北京)有限公司:
1、取2ml的血浆样本，按照以下体系加入相应的试剂量如表1所示：
表1
| 血浆体积 | 蛋白酶 | 缓冲液GHP | FineMag Particles K |
| 2ml | 200μl | 3.0ml | 30μl |
2、样本和试剂充分混匀后，室温孵育20min，期间每3-5min上下颠倒混匀10sec，使磁珠和核酸充分结合。孵育结束后简短离心去除管壁内壁的液滴；
3、离心管放置于磁力加上静置2min，待磁珠完全吸附时小心去除液体，取下离心管；
4、加入1ml缓冲液RBP，振荡混匀1min，使磁珠充分悬浮，简短离心以去除内壁的滴液；
5、将离心管放置于磁力加上静置1min，待磁珠完全吸附时小心去除液体，取下离心管；
6、加入1ml的80％的乙醇(现配现用)，每次振荡混匀1min，使磁珠充分悬浮，简短离心以去除内壁的滴液。
7、将离心管放置于磁力加上静置1min，待磁珠完全吸附时小心去除液体，取下离心管。
8、重复步骤6-7一次，共计2次乙醇洗脱。
9、将离心管放置于磁力加上，室温晾干5–10min。
10、将离心管从磁力加上取下，加入45μl缓冲液EB，震荡混匀使磁珠悬浮，56℃孵育5min，期间每2min轻轻晃动离心管，使核酸充分吸脱，后可短暂离心以去除管壁及管盖上的液体。
11、将离心管放置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附时小心将DNA溶液转移至1.5ml收集管中，并于适当条件保存。
12、取1μl的DNA洗脱液进行Qubit HS浓度测定，并记录数据结果，剩余样本如不继续进行实验保存在-20℃冰箱。
三)DNA转化流程：
1、将提取的DNA按照以下配方配置亚硫酸氢盐的转化体系如表2所示：
表2
| 试剂成分 | 反应体积(μl) |
| 提取的DNA | 40 |
| Bisulfite Solution | 85 |
| DNA protect缓冲液 | 15 |
| 总计 | 140 |
2、转化体系配置完成后，按照以下反应条件，置于PCR仪中反应，反应程序如表3所示：
表3
3、亚硫酸氢盐转化后的DNA纯化：
4、瞬离PCR管，将亚硫酸氢盐转化后的产物转移至1.5ml的EP管中。
5、向每个样品中加310μl的缓冲液BL试剂
6、向每个样品中加250μl的无水乙醇，涡旋混匀溶液15秒，并短暂离心
7、将混合物转移到离心柱中,14000rpm离心1min
8、弃滤液，加500μl的缓冲液BW,14000rpm离心1min
9、弃滤液，加500μl的缓冲液BD静止孵育15min，14000rpm离心1min
10、弃滤液，加500μl的缓冲液BW，14000rpm离心1min
11、重复步骤10
12、弃滤液，加250μl的无水乙醇，14000rpm离心1min
13、弃滤液，14000rpm空离1min
14、室温下干燥3-5min去除残留乙醇；
15、加15μl缓冲液EB室温孵育洗脱1min，14000rpm离心1min，收集的DNA保存于-20℃。
四)qPCR反应配置
1、qPCR仪器为美国ABI 7500型实时荧光定量PCR系统(购自于life technology公司)，反应体系为20μl
2、qPCR反应体系配置及条件，如下表4所示：
表4
| 成分 | 反应体积(μl) |
| 亚硫酸氢盐转化后的DNA | 2.0 |
| Primer | 5.6 |
| Probe | 1.4 |
| RNAse-free Water | 1.0 |
| 2X PCR Mix | 10.0 |
| 总计 | 20 |
3、PCR反应加样布局：
待测DNA样本、阳性质控品、阴性质控品和无模板对照均进行3个平行检测，PCR仪的96孔加样布局见下表5。表5中PC代表阳性质控品(Positive Control)，NC代表阴性质控品(Negative Control)，NTC代表无模板对照(No Template Control)，S代表检测样本(sample)
表5
4、PCR反应程序如下表6：
表6
5、检测结果分析
1)运行无模板对照(NTC)的扩增曲线分析，应无扩增曲线，说明实验无污染，可以继续分析；
2)质控品的内参基因(ACTB)应均有扩增信号，且呈S型扩增曲线，内参Ct值应符合下表7结果；阴性质控品的目的基因应无扩增曲线升起，阳性质控品目的基因的Ct值应符合下表7，质控品检测满足以下条件时，证明实验有效，可继续分析；
表7
3)样品的内参基因均有扩增信号，且呈S型扩增曲线，样品PCR检测结果应按照下表8进行判读；
表8
| 样品结果 | 目的基因 | ACTB |
| 甲基化阳性 | Ct≤40 | Ct≤40 |
| 甲基化阴性 | 无扩增，或Ct＞40 | Ct≤40 |
| 实验无效 | 任何结果 | Ct＞40 |
基于本发明的具体实验数据参见图1-图6，其中，图1为RASSF1A基因甲基化阳性样本扩增曲线图，图2为OPCML基因甲基化阳性样本扩增曲线图，图3为RUNX3基因甲基化阳性样本扩增曲线图，图4为TFPI2基因甲基化阳性样本扩增曲线图，图5为阴性样本扩增曲线图，可以看出不同甲基化样本卵巢癌相关甲基化基因与ACTB内参基因的扩增曲线关系，如果目的基因和内参基因均无扩增曲线,见图6，表示该样本不合格需要重复检测或者重新采样。
(三)利用上文的试剂盒样品进行卵巢癌、正常人血浆的灵敏度和特异性检测：
以20例正常人和20例卵巢癌患者的血浆样本为监测对象。提取各样本的游离DNA。DNA的提取可以采用现有技术中的任何标准手段进行，具体而言，在本案例中，所用的样本DNA是通过使用具体的提取方案按照案例2中的检测体系进行提取。
然后将DNA样本进行预处理使得5’位未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。在本实验案例中，通过亚硫酸氢盐试剂处理来实现该预处理。亚硫酸氢盐DNA的修饰是通过使用案例2中的检测体系进行转化预处理的。
然后，将上述的预处理的20正常人和20例卵巢癌的DNA样本中加入上述案例2中的检测体系，多元化的检测RASSF1A、OPCML、TFPI2、RUNX3和内参基因ACTB。在亚硫酸氢盐转化的DNA上进行实时PCR。
其中，在实验案例中采用的PCR条件按照案例2中的qPCR条件进行。
最后，下表9和表10显示的是使用本发明的多重测定对20例正常人和20例卵巢癌患者样本进行检测的结果。由表9和表10可见，本方案的阳性检测率和阴性检测率很高。
表9利用本发明试剂盒对卵巢癌患者血浆样本的检测结果
| 样本阳性判定方法 | 检测样本数 | 阳性样本数 | 阳性率 |
| 至少一个靶点阳性 | 20 | 19 | 95％ |
表10利用本发明试剂盒对正常人血浆样本的检测结果
| 样本阳性判定方法 | 检测样本数 | 阴性样本数 | 阴性率 |
| 至少一个靶点阳性 | 20 | 19 | 95％ |
根据上表的检测结果，利用本发明试剂盒进行卵巢癌筛查时，其阳性检出率(敏感性)为95％，阴性检出率(特异性)为95％。
由以上验证实验可知：RASSF1A、OPCML、RUNX3、TFPI2特异性的正向引物、特异性的反向引物以及特异性探针的核酸组合物在检测卵巢癌相关基因甲基化的敏感性和特异性上具有协同作用，将RASSF1A、OPCML、RUNX3、TFPI2的特异性的正向引物、特异性的反向引物以及特异性探针组合在一起进行检测卵巢癌甲基化是一个创新性的发现，并非机械化的实验可以得到的结果。
本发明并非以诊断疾病为目的，且得到的检测也无法直接判断是否具有疾病，间接为人卵巢癌的早期诊断提供有效信息，为人卵巢癌早发现早治疗提供一种简便易行的方法。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 杭州圣庭医疗科技有限公司
<120> 一种用于检测卵巢癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法 申报文件
<141> 2021-06-04
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
cggggttcgt ttgtggtttc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ccgattaaat cgtacttcgc 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tcgcgttttt agcgtttaaa gt 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
cgggcggcgt ttattttaat tt 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gctaacgcga atcgaaacga a 21
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
cgtcgcttat cgggttgggg atgttt 26
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
ttcgcggagg gttttagtgt 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
cgacaaaacc cttccgtaa 19
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
agtttagggt tcgagagttt tgggagttcg 30
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
ttcgttggta aggcgttc 18
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
ataaaagaac cccgaaccg 19
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
agcgttgcgg gaggaggtgc 20
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
gtgatggaga gtttagtaag tt 22
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
gcactcttcc aaacgaaacg 20
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
accaccacca cacacaataa caaacaca 28
Claims (8)
1.一种用于检测卵巢癌相关基因甲基化的核酸组合物，其特征在于，包括：RASSF1A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针；OPCML基因目的位点的甲基化特异性引物和探针；RUNX3基因目的位点的甲基化特异性引物和探针；TFPI2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针；ACTB内参基因的特异性引物和探针；
所述RASSF1A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
正向引物：5＇-CGGGGTTCGTTTGTGGTTTC-3＇SEQ ID 01，
反向引物：5＇-CCGATTAAATCGTACTTCGC-3＇SEQ ID 02，
检测探针：5＇标记物-TCGCGTTTTTAGCGTTTAAAGT-3＇标记物SEQ ID 03；
所述OPCML基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
正向引物：5＇-CGGGCGGCGTTTATTTTAATTT-3＇SEQ ID 04，
反向引物：5＇-GCTAACGCGAATCGAAACGAA-3＇SEQ ID 05，
检测探针：5＇标记物-CGTCGCTTATCGGGTTGGGGATGTTT-3＇标记物SEQ ID 06；
所述RUNX3基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
正向引物：5＇-TTCGCGGAGGGTTTTAGTGT-3＇SEQ ID 07，
反向引物：5＇-CGACAAAACCCTTCCGTAA-3＇SEQ ID 08，
检测探针：5＇标记物-AGTTTAGGGTTCGAGAGTTTTGGGAGTTCG-3＇标记物SEQ ID 09；
所述TFPI2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
正向引物：5＇-GTTCGTTGGTAAGGCGTTC-3＇SEQ ID 10，
反向引物：5＇-ATAAAAGAACCCCGAACCG-3＇SEQ ID 11，
检测探针：5＇标记物-AGCGTTGCGGGAGGAGGTGC-3＇标记物SEQ ID 12；
所述ACTB内参基因特异性引物和探针包括：
正向引物：5＇-GTGATGGAGAGTTTAGTAAGTT-3＇SEQ ID 13，
反向引物：5＇-GCACTCTTCCAAACGAAACG-3＇SEQ ID 14，
检测探针：5＇标记物-ACCACCACCACACACAATAACAAACACA-3＇标记物SEQ ID 15。
2.一种用于检测卵巢癌相关基因甲基化的试剂盒，其特征在于，包括：PCR反应液，阴性质控品，阳性质控品和无模板对照；PCR反应液包括：RASSF1A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，OPCML基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，RUNX3基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，TFPI2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，ACTB内参基因的特异性引物和探针，2X PCR缓冲液，dNTP，无核酸酶水，基因组DNA样本和Taq酶；
所述RASSF1A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
正向引物：5＇-CGGGGTTCGTTTGTGGTTTC-3＇SEQ ID 01，
反向引物：5＇-CCGATTAAATCGTACTTCGC-3＇SEQ ID 02，
检测探针：5＇标记物-TCGCGTTTTTAGCGTTTAAAGT-3＇标记物SEQ ID 03；
所述OPCML基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
正向引物：5＇-CGGGCGGCGTTTATTTTAATTT-3＇SEQ ID 04，
反向引物：5＇-GCTAACGCGAATCGAAACGAA-3＇SEQ ID 05，
检测探针：5＇标记物-CGTCGCTTATCGGGTTGGGGATGTTT-3＇标记物SEQ ID 06；
所述RUNX3基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
正向引物：5＇-TTCGCGGAGGGTTTTAGTGT-3＇SEQ ID 07，
反向引物：5＇-CGACAAAACCCTTCCGTAA-3＇SEQ ID 08，
检测探针：5＇标记物-AGTTTAGGGTTCGAGAGTTTTGGGAGTTCG-3＇标记物SEQ ID 09；
所述TFPI2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
正向引物：5＇-GTTCGTTGGTAAGGCGTTC-3＇SEQ ID 10，
反向引物：5＇-ATAAAAGAACCCCGAACCG-3＇SEQ ID 11，
检测探针：5＇标记物-AGCGTTGCGGGAGGAGGTGC-3＇标记物SEQ ID 12；
所述ACTB内参基因特异性引物和探针包括：
正向引物：5＇-GTGATGGAGAGTTTAGTAAGTT-3＇SEQ ID 13，
反向引物：5＇-GCACTCTTCCAAACGAAACG-3＇SEQ ID 14，
检测探针：5＇标记物-ACCACCACCACACACAATAACAAACACA-3＇标记物SEQ ID 15。
3.根据权利要求2所述的一种用于检测卵巢癌相关基因甲基化的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液的成分终浓度为：1X PCR缓冲液、0.4～0.6μM RASSF1A正向引物、0.4～0.6μM RASSF1A反向引物、0.2～0.3μM RASSF1A检测探针，0.4～0.6μM OPCML正向引物、0.4～0.6μM OPCML反向引物、0.2～0.3μM OPCML检测探针，0.4～0.6μM RUNX3正向引物、0.4～0.6μM RUNX3反向引物、0.2～0.3μM RUNX3检测探针，0.4～0.6μM TFPI2正向引物、0.4～0.6μM TFPI2反向引物、0.2～0.3μM TFPI2检测探针，0.1～0.3μM ACTB正向引物、0.1～0.3μM ACTB反向引物、0.05～0.15μM ACTB检测探针、0.2～0.5mM dNTP、无核酸酶水、基因组DNA样本、0.05-0.2U/μlTaq酶。
4.根据权利要求2所述的一种用于检测卵巢癌相关基因甲基化的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为经SssI甲基化酶处理的Hct116细胞系的基因组DNA。
5.根据权利要求2所述的一种用于检测卵巢癌相关基因甲基化的试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品为敲除了基因DNMT1和DNMT3b后的Hct116细胞系的基因组DNA。
6.一种用于检测卵巢癌相关基因甲基化的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：抽提待检测样本的DNA，经过转化处理后的DNA作为PCR的模板的基因组DNA样本；
步骤二：使用用于检测卵巢癌相关基因甲基化检测的试剂盒对基因组DNA样本进行PCR扩增；
试剂盒包括：PCR反应液，阴性质控品，阳性质控品和无模板对照；PCR反应液包括：RASSF1A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，OPCML基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，RUNX3基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，TFPI2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，ACTB内参基因的特异性引物和探针，2X PCR缓冲液，dNTP，无核酸酶水，基因组DNA样本和Taq酶；
所述RASSF1A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
所述RASSF1A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
正向引物：5＇-CGGGGTTCGTTTGTGGTTTC-3＇SEQ ID 01，
反向引物：5＇-CCGATTAAATCGTACTTCGC-3＇SEQ ID 02，
检测探针：5＇标记物-TCGCGTTTTTAGCGTTTAAAGT-3＇标记物SEQ ID 03；
所述OPCML基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
正向引物：5＇-CGGGCGGCGTTTATTTTAATTT-3＇SEQ ID 04，
反向引物：5＇-GCTAACGCGAATCGAAACGAA-3＇SEQ ID 05，
检测探针：5＇标记物-CGTCGCTTATCGGGTTGGGGATGTTT-3＇标记物SEQ ID 06；
所述RUNX3基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
正向引物：5＇-TTCGCGGAGGGTTTTAGTGT-3＇SEQ ID 07，
反向引物：5＇-CGACAAAACCCTTCCGTAA-3＇SEQ ID 08，
检测探针：5＇标记物-AGTTTAGGGTTCGAGAGTTTTGGGAGTTCG-3＇标记物SEQ ID 09；
所述TFPI2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
正向引物：5＇-GTTCGTTGGTAAGGCGTTC-3＇SEQ ID 10，
反向引物：5＇-ATAAAAGAACCCCGAACCG-3＇SEQ ID 11，
检测探针：5＇标记物-AGCGTTGCGGGAGGAGGTGC-3＇标记物SEQ ID 12；
所述ACTB内参基因特异性引物和探针包括：
正向引物：5＇-GTGATGGAGAGTTTAGTAAGTT-3＇SEQ ID 13，
反向引物：5＇-GCACTCTTCCAAACGAAACG-3＇SEQ ID 14，
检测探针：5＇标记物-ACCACCACCACACACAATAACAAACACA-3＇标记物SEQ ID 15；
步骤三：根据RASSF1A、OPCML、RUNX3、TFPI2和ACTB基因扩增结果的荧光Ct值来确定待测样本是否发生甲基化。
7.根据权利要求6所述的一种用于检测卵巢癌相关基因甲基化的检测方法，其特征在于，所述步骤一中，转化处理采用的试剂为亚硫酸氢盐或重亚硫酸盐。
8.根据权利要求6所述的一种用于检测卵巢癌相关基因甲基化的检测方法，其特征在于，所述步骤二中，PCR扩增的反应程序为：95℃，10min,45cycles 95℃15sec，60℃30sec。
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