JP2004536282A - 胃がん患者の血清中の、血中を循環するエプスタイン・バーウイルスｄｎａ - Google Patents
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Abstract
本発明は、患者の血清もしくは血漿中に存在するＥＢＶ ＤＮＡを検出または測定することにより、該患者の胃がん、頭部および頚部以外のリンパ系悪性腫瘍、および胃炎を診断し、検出し、モニターし、予後を判断する方法を特徴とする。本発明は、患者の血清または血漿中のＥＢＶ ＤＮＡを検出するのに適した試薬を備えた診断用キットをも特徴とする。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エプスタイン・バーウイルスが患者の血液由来の細胞を含まない液体に見出されることがあり、そのようなウイルスが見出されかつその患者が胃炎であるときは、その患者は胃炎から胃がんへと進行しやすい傾向を有する、という発見に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん由来のＤＮＡが様々な腫瘍のがん細胞から放出されうることが知られている（アンカーら（Ａｎｋｅｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．第１８巻、６５−７３ページ、１９９９年）。例としては、すい臓がん由来のがん遺伝子突然変異体（アンカーら（Ａｎｋｅｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、第１１２巻、４−１１２０ページ、１９９７年）、肺がんにおけるマイクロサテライトの変化（チェンら（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２巻、３−１０３５ページ、１９９６年）、および肝臓がん由来のエピジェネティックな変化（ウォンら（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５９巻、３ページ、１９９９年）などがある。さらに、ウイルス感染と関連があるとして知られている多くのがんの血液循環中にウイルスＤＮＡが見出されている。例としては、上咽頭がん（マチラングラら（Ｍｕｔｉｒａｎｇｕｒａ ｅｔ ａｌ．）、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第４巻、６６５−９ページ、１９９８年；ローら（Ｌｏ ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５９巻、１１８８−９１ページ、１９９９年）およびある種のリンパ腫（レイら（Ｌｅｉ ｅｔ ａｌ．）、Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．第１１１巻、２３９−４６ページ、２０００年；ガラガーら（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ．第８４巻、４４２−８ページ、１９９９年；ドルーエら（Ｄｒｏｕｅｔ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ．第５７巻、３８３−９ページ、１９９９年）からのエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ＤＮＡ、ならびに頭部および頚部がんからのヒトパピローマウイルスＤＮＡ（カポネら（Ｃａｐｏｎｅ ｅｔ ａｌ．）、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第６巻、４１７１−５ページ、２０００年）などがある。
【０００３】
近年、がん患者の血漿および血清中のがん由来ＤＮＡの存在に非常に注目が集まっている（チェン、エックス キューら（Ｃｈｅｎ，Ｘ．Ｑ．ｅｔ ａｌ．）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．第２巻、１０３３−１０３５ページ、１９９６年；ノウロツ、エイチら（Ｎａｗｒｏｚ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．）、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．第２巻、１０３５−１０３７ページ、１９９６年）。ウイルスに関連のあるがんについては、患者の血漿および血清中に細胞から離れた腫瘍関連ウイルスＤＮＡが検出されている（マチラングラ、エーら（Ｍｕｔｉｒａｎｇｕｒａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第４巻、６６５−６６９ページ、１９９８年；ロー、ワイ エム ディーら（Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５９巻、１１８８−１１９１ページ、１９９９年；カポネ、アール ビーら（Ｃａｐｏｎｅ，Ｒ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第６巻、４１７１−４１７５ページ、２０００年）。多くのタイプの悪性腫瘍に関連付けられてきた１つの重要なウイルスはエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）である（コーエン、ジェイ アイ（Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｉ．）、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．第３４３巻、４８１−４９２ページ、２０００年）。エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）は、ヒト集団の大多数に感染するヒトヘルペスウイルスである。ＥＢＶは通常唾液を介して感染し、Ｂリンパ球に潜伏感染を成立させ、宿主の生存している間はそこに存続する。これについては、上咽頭がん（ＮＰＣ）（マチラングラ、エーら（Ｍｕｔｉｒａｎｇｕｒａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第４巻、６６５−６６９ページ、１９９８年；ロー、ワイ エム ディーら（Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５９巻、１１８８−１１９１ページ、１９９９年）およびある種のリンパ腫（レイ、ケイ アイら（Ｌｅｉ，Ｋ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．）、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．第１１１巻、２３９−２４６ページ、２０００年；ドルーエ、イーら（Ｄｒｏｕｅｔ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．第５７巻、３８３−３８９ページ、１９９９年；ガラガー、エーら（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．第８４巻、４４２−８ページ、１９９９年）の患者の血漿および血清中に、血中を循環している（血中循環）ＥＢＶ ＤＮＡが検出されている。
【０００４】
ＥＢＶ感染が胃がんの一部と関係があるという報告もされている（シバタ、ディーら（Ｓｈｉｂａｔａ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．第１４０巻、７６９−７７４ページ、１９９２年）。香港では、胃がん症例の約１０％についてＥＢＶ感染との関連が見出されている（イェン、エス ティーら（Ｙｕｅｎ，Ｓ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．）、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．第１８巻、１１５８−１１６３ページ、１９９４年）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、胃がん患者の血清中のＥＢＶ ＤＮＡを検出し、そのようにして検出されたＥＢＶ ＤＮＡの量を臨床上の診断または予後の判断に関連付ける方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第１の態様では、本発明は、患者の胃がんを診断し、検出し、モニターし、予後を判断する方法を特徴とする。該方法は胃がん患者の血清もしくは血漿中に存在するエプスタイン・バーウイルスＤＮＡ（ＥＢＶ ＤＮＡ）の量を検出または測定することを特徴とする。従って、本発明は臨床医学において広範な適用性を有する。
【０００７】
本発明の方法を、乳がんをはじめとする、頭部および頚部以外のリンパ系悪性腫瘍を診断し、検出し、モニターし、予後を判断するために適用することも可能である。これらの新生物は、胃がん同様にＥＢＶ感染と関連付けられている。
【０００８】
本発明の方法を、胃炎を診断し、検出し、モニターし、予後を判断するために適用することも可能である。ＥＢＶ ＤＮＡは、胃炎をはじめとする、新生物ではない胃の疾患の患者の血漿および血清中に検出されうる。次には、胃炎は胃がんと関連付けられている。本発明は、胃がんの可能性があるかまたは胃がんと診断された患者、およびＥＢＶの核酸を含まないかまたはＥＢＶを含むがん細胞をさらに含む。
【０００９】
本発明の方法は、通常（１）患者から血液試料を採取するステップと、（２）血液試料からＤＮＡを抽出するステップと、（３）血液試料中に存在する血中循環ＥＢＶ ＤＮＡの量を測定するステップと、（４）血液試料中に存在する血中循環ＥＢＶ ＤＮＡの量を対照と比較するステップとからなる。当然のことであるが、本発明の方法を、患者から血液試料を採取するという作業ステップを伴わず、以前患者から採取された血液試料（またはそのような血液試料から得た液体画分もしくはＤＮＡ）について実施することも可能である。
【００１０】
血液試料は、細胞を含まない液体試料であることが好ましい。細胞を含まないという語は、該試料が、凝血させて残りの液体から細胞を分離することにより細胞を取り出した血清、または凝血を阻害して液体画分を遠心分離することにより細胞を取り出したもの（血漿）のいずれかを意味する。ＥＢＶ ＤＮＡは液体画分に関して測定される。ＥＢＶが細胞を含まない試料の液体中に見出される場合、該感染が活動性であり感染細胞がＥＢＶを放出しているものと考えられる。
【００１１】
第２の態様では、本発明は患者の血清または血漿中のＥＢＶ ＤＮＡを検出するのに適した試薬を備えた診断用キットを特徴とする。本発明のキットは、患者から血液試料を採取するための１つ以上のデバイスと、血液試料からＥＢＶ ＤＮＡを分離するための手段と、血液試料中に存在するＥＢＶ ＤＮＡの量を定量するための手段とをさらに備えても良い。そのようなキットは、胃がんおよび胃炎を診断し、検出し、モニターし、予後を判断するために使用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、患者の胃がんを診断し、検出し、モニターし、予後を判断する方法を特徴とする。該方法は胃がん患者の血清中に存在するＥＢＶ ＤＮＡの量を検出または測定することを特徴とする。本発明の方法は臨床医学において広範な適用性を有する。胃がんは、日本を含む多くの地理的地域において比較的高い罹患率で存在している。一部の胃がんはＥＢＶ感染と関連があることが知られている（シバタら（Ｓｈｉｂａｔａ ｅｔ ａｌ．）、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．第１４０巻、７６９−７４ページ、１９９２年）。本発明の非侵襲的血液検査は、臨床上の大きな進歩を示すものである。
【００１３】
胃炎または消化不良は、胃粘膜の炎症である。胃炎とは、胃粘膜に炎症性の変化をもたらすが、その臨床上の特徴、組織学的特性、および発症機構が異なる一群の関連する障害である。炎症は、慢性の場合、胃腺がんへの進行の指標として知られている。
【００１４】
胃炎には急性も慢性もあり得る。過剰なアルコールを飲んだ後、食べ過ぎた後、香辛料の効いた食物を食べた後、または喫煙の後に胃炎を患う人々がいる。また別の人々は、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）の長期使用または大腸菌、サルモネラ菌、もしくはヘリコバクター・ピロリなどの細菌への感染の後に胃炎を発症する。時により、大手術、外傷、火傷、または重篤な感染の後に胃炎が発症することもある。悪性貧血、自己免疫不全、および慢性の胆汁逆流などのある種の疾患も同様に胃炎の原因となり得る。臨床上、最も共通する症状は胃の不調または痛みである。おくび、腹部膨満、悪心、嘔吐、または胃部の満腹感もしくは灼熱感が患者により報告されている。胃の内面から出血している場合、血液は嘔吐物や大便中にも存在しうる。
【００１５】
胃炎は、胃内視鏡、生検、貧血についての血液検査、および便潜血検査などの１つ以上の医学的検査によって診断される。便潜血検査は、胃炎の兆候である、便の中の血液の存在をチェックする。
【００１６】
胃炎はＥＢＶ感染者に関連するとされているが、胃がんへの進行の増大とは関連付けられていない。胃がんに対する感受性が増大している胃炎患者を特定することが、本発明の目的である。本発明のアッセイは、医師が大きなリスクに直面している患者に注目することを可能にし、より積極的な抗胃炎治療とより高頻度の内視鏡的評価とを用いることにより、患者に利益をもたらすであろう。
【００１７】
臨床的には、血中循環ＥＢＶ ＤＮＡを、上咽頭がん（ロー、ワイ エム ディーら（Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５９巻、１１８８−１１９１ページ、１９９９年；ロー、ワイ エム ディーら（Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５９巻、５４５２−５４５５ページ、１９９９年）やある種のリンパ腫（レイ、ケイ アイら（Ｌｅｉ，Ｋ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．）、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．第１１１巻、２３９−２４６ページ、２０００年；ドルーエ、イーら（Ｄｒｏｕｅｔ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．第５７巻、３８３−３８９ページ、１９９９年；ガラガー、エーら（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．第８４巻、４４２−４４８ページ、１９９９年）について実現されたのと同様に、ＥＢＥＲ陽性の腫瘍を有する胃がん患者の診断およびモニタリングに適用する。最近示された、上咽頭がんにおける血中循環ＥＢＶ ＤＮＡの予後上の重要性（ロー、ワイ エム ディーら（Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第６０巻、６８７８−６８８１ページ）は、ＥＢＶ ＤＮＡの測定が胃がんに関して予後上の重要性を有することを示唆するものである。
【００１８】
本発明の方法は、いずれもＥＢＶと関連のあるがんである、頭部および頚部以外のリンパ系悪性腫瘍を検出し、モニターし、予後を判断するために適用することも可能である。これらの新生物は、ある種の肝臓がん（スガワラら（Ｓｕｇａｗａｒａ ｅｔ ａｌ．）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２５６巻、１９６−２０２ページ、１９９９年）と同様に、ＥＢＶ感染とも関連付けられている（ボネットら（Ｂｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．第９１巻、１３７６−８１ページ、１９９９年）。
【００１９】
本発明の方法は、胃炎を検出し、モニターし、予後を判断するために適用することも可能である。ＥＢＶ ＤＮＡは、胃炎のような新生物でない胃疾患において検出されうる。あるタイプの胃炎はＥＢＶ感染と関連があることが知られている（ヤナイら（Ｙａｎａｉ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．第２９巻、３９−４３ページ、１９９９年）。あるタイプの胃炎は、患者が腸上皮化生になりやすく、ひいては胃がんにかかりやすくなる素因である（ヨシムラら（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．第５３巻、５３２−６ページ、２０００年）。
【００２０】
日本国のヤナイ（Ｙａｎａｉ）による２０人の患者についての唯一の研究において、ある割合の胃炎患者およびその患者の胃上皮にＥＢＶが存在することが見出されたが、その２つの間の関連は立証されていない。ドイツ国のフンガーマン（Ｈｕｎｇｅｒｍａｎｎ）による、２４２人を超える慢性胃炎（軽いものから重篤なものまで）の患者についての最近の研究から、これらの患者においてＥＢＶ感染は非常に低い罹患率であることが示され、胃上皮細胞のＥＢＶ感染は胃がん形成において重要ではないと結論付けられた。
【００２１】
本発明は、胃上皮組織のＥＢＶ感染を簡単な血液検査によって特定しうるという発見を含むものである。以前は、リンパ系組織および他の非上皮組織へのＥＢＶ感染だけが同様の方法により検出可能であった。上皮細胞がＥＢＶ感染に抵抗性であることはよく知られているので、本発明は、第１にＥＢＶに感染した胃炎患者を特定し、次いで第２にそれらの患者がその後胃がんに対する感受性を増すという可能性について研究するという全く新しい概念と機会とを示すものである。本発明のアッセイは、医師が大きなリスクに直面している患者に注目することを可能にし、より積極的な抗胃炎治療または抗ウイルス治療とより高頻度の内視鏡的評価とを用いることにより、患者に利益をもたらすであろう。
【００２２】
本発明の別の目的は、がんの原因になりうるＥＢＶに感染するリスクの高い患者に向けられている。そのような患者には、上咽頭がんの原因となるＥＢＶに非常に感染しやすいことが証明されている、Ｈ２，ＢＷ４６およびＢ１７タイプのＨＬＡ抗原を有する患者が含まれる。ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）のような疾患のため免疫不全の患者、または臓器移植後に免疫抑制剤を投与されている患者のような他の患者も感染リスクが高い。本発明は、腫瘍細胞内にＥＢＶ ＤＮＡを有する胃がんの症例を簡単に検出可能であることを示す。さらに、腫瘍細胞内にＥＢＶ ＤＮＡがない胃がんの場合でも、すぐ近くの上皮にＥＢＶに感染したリンパ球または他の細胞がありさえすれば検出可能である。全体として、腫瘍のＥＢＶ ＤＮＡが陽性または陰性のいずれかの胃がん患者の約３５％が本発明により検出された。この新しい概念は、ＥＢＶ感染の直接または間接のいずれかの結果として別の種類のがんになるリスクの高い患者をモニターするときに大きな助けとなるであろう。本発明に基づき、リンパ腫のほかに胃がんを調査の必要な疾患のリストに加えることが可能である。
【００２３】
固形組織をＥＢＶ ＤＮＡについて調べる場合、生検標本をパラフィンに包埋し５μｍ厚の切片に切断する。ＤＮＡをＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて製造業者推奨のプロトコールにより抽出する。５０μｌの最終溶出量をＤＮＡの試験に使用する。
【００２４】
従来のＤＮＡ増幅法またはシグナル増幅法のいずれもＥＢＶ ＤＮＡの検出に使用可能である。大抵の場合、標的配列を当技術分野でよく知られた数種の核酸増幅手順のうちのいずれかを用いて増幅することが望ましい。具体的には、核酸増幅は、増幅しようとする核酸配列に相補的な配列を含む核酸のアンプリコン（コピー）を酵素的に合成することである。当技術分野で用いられている核酸増幅手順の例には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、および転写増幅（ＴＡＡ）がある。核酸増幅は、試料中に存在する標的配列の量が非常に少ない場合に特に有用である。試料中の目的の生物またはウイルスの核酸をより確実に検出するためにアッセイ開始時に必要とされる標的配列がより少なくてすむので、標的配列を増幅し、合成されたアンプリコンを検出することによりアッセイの感度を大きく向上させることが可能である。
【００２５】
核酸増幅法は文献に十分な記載がある。例えばＰＣＲ増幅は、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号および第４，８００，１５９号、ならびにＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５５巻、３３５−３５０ページ、１９８７年に、マリスら（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．）により記載されている。ＳＤＡの例は、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、第３巻、２５−３０ページ、１９９３年、ウォーカーら（Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２０巻、１６９１−１９９６ページ、１９９２年、およびＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第８９巻、３９２−３９６ページ、１９９１年に見出すことができる。ＬＣＲは米国特許第５，４２７，９３０号および第５，６８６，２７２号に記載されている。そして種々のＴＡＡ方式は、バーグら（Ｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．）の米国特許第５，４３７，９９０号；カシアンら（Ｋａｃｉａｎ ｅｔ ａｌ．）の米国特許第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号；ならびにギンゲラスら（Ｇｉｎｇｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．）の国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８７／０１９６６および国際公開番号第８８／０１３０２号、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８８／０２１０８および国際公開番号第８８／１０３１５号などの刊行物に示されている。
【００２６】
リアルタイム定量ＰＣＲはＥＢＶ ＤＮＡをモニターするのに好ましい手段であり、蛍光標識を用いるＰＣＲ反応の進行を継続的、光学的にモニターすることに基づいている（ハイデら（Ｈｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．）、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．第６巻、９８６−６９４ページ、１９９６年およびローら（Ｌｏ ｅｔ ａｌ．）、Ａｍ Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．第６２巻、７６８−７７５ページ、１９９８年）。このシステムでは、従来のＰＣＲで用いる２種の増幅プライマーに加えて、二重に標識された蛍光ハイブリダイゼーションプローブも用いられる（リバークら（Ｌｉｖａｋ，ｅｔ ａｌ．）、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．、４３５７−３６２ページ、１９９５年）。一方の蛍光色素がレポーターの役割を果たし（ＦＡＭ）、その発光スペクトルが第２の蛍光色素（ＴＡＭＲＡ）により消光される。ＰＣＲの伸長段階の間は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（９）の５’から３’方向のエキソヌクレアーゼ活性によりレポーターがプローブから離れ、よってレポーターが消光体から離れ、その結果５１８ｎｍの蛍光発光が増大する。
【００２７】
本発明の方法は、一般に（１）患者から血液試料を採取するステップと、（２）血液試料からＤＮＡを抽出するステップと、（３）血液試料中に存在する血中循環ＥＢＶ ＤＮＡの量を測定するステップと、（４）血液試料中に存在する血中循環ＥＢＶ ＤＮＡの量を対照と比較するステップとからなる。血液試料を遠心分離にかけ、液体画分を採取し、液体画分についてＥＢＶ ＤＮＡを測定することが好ましい。
【００２８】
当業者は、当技術分野で知られた多くの手段により血液試料からＤＮＡを抽出しうることを理解するであろう。１つの好ましい手段は、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ Ｋｉｔを用いることである。同様に、血中循環ＥＢＶ ＤＮＡの量を多くの既知または新規なプロトコールのうちの１つを用いて測定することも可能である。リアルタイムＰＣＲ増幅システムを含むプロトコールが特に好ましい。そのようにして検出されたＥＢＶ ＤＮＡレベルを対照と比較するための標準的な手順は、得られた値の有意性を統計的に評価するべく容易に考案可能である。
【００２９】
当業者は、臨床上の進行と試料中に存在する血中循環ＥＢＶ ＤＮＡ量との関係に基づく適切な診断基準を容易に作製することができる。しかしながら、胃がん患者においては一般に血清１ｍｌあたり少なくとも約２００コピー、より好ましくは少なくとも約５００コピー、さらにより好ましくは少なくとも約１０００コピーのＥＢＶ ＤＮＡが存在する。上記の血清１ｍｌあたり５００コピーのＥＢＶ ＤＮＡという境界点は、検査の時点でがんであり、がん細胞内部にＥＢＶ ＤＮＡを含むことが示されている場合にのみ適用する。ＥＢＶ陽性リンパ球の浸潤のみを伴いがん細胞内部にはＥＢＶ ＤＮＡを含まない胃がんの患者については、コピー数のレベルはより低い。このように血清１ｍｌあたりのＥＢＶ ＤＮＡのコピー数がより低いレベルであることは、胃炎のみを有する患者の特性でもある。
【００３０】
ＥＢＶ ＤＮＡのコピー数を長期間測定し、疾患の進行または緩解に関連付けることも可能である。従って、本発明は胃がん、胃炎および他の特定のがんの診断とその後のモニタリングとを可能にする非侵襲的な方法を提供する。５００コピーの境界点は検査の時点ですでにがんである場合にのみ適用されることに注意すべきである。上記のようなリンパ球の浸潤を伴う患者では、コピー数のレベルはより低い。
【００３１】
第２の態様では、本発明は患者の血清または血漿中のＥＢＶ ＤＮＡを検出するのに適した試薬を備えた診断用キットを特徴とする。本発明のキットは、患者から血液試料を採取するための１つ以上のデバイスと、血液試料からＥＢＶ ＤＮＡを分離するための手段と、血液試料中に存在するＥＢＶ ＤＮＡの量を定量するための手段とをさらに備えても良い。そのようなキットは、胃がん、胃炎、および他のある種の頭部および頚部以外のリンパ系悪性腫瘍を診断し、検出し、モニターし、予後を判断するために使用可能である。
【００３２】
本明細書中に記載の全ての刊行物及び特許出願は、各個別の刊行物または特許出願が引用により組み込まれるべく特に個別に表示されてはいても、引用により本願に組み込まれる。
【００３３】
上述の発明は明確な理解のために図面および例示を用いてある程度詳細に記述されているが、請求項の趣旨または範囲を逸脱することなくある種の変更形態および修正形態を上記発明に加えることが可能であることは、本発明の教示に照らせば当業者には直ちに明白であろう。
（実施例）
以下の実施例は例示のためだけに提供するものであり、限定を目的とするものではない。当業者は、本質的に同様の結果をもたらすために変更または修正可能な、種々の重要性の低いパラメータを容易に認識するであろう。
（実施例１）
（材料と方法）
５１人の胃がん患者を、香港所在のプリンス・オブ・ウェールズ病院からインフォームドコンセントを実施して募集した。腫瘍の外科的切除の前に血液試料を採取した。手術後、腫瘍の切片をＥＢＥＲ（ＥＢＶ遺伝子でコードされる小ＲＮＡ）のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析に供した。胃炎で、がん腫の徴候のない３０人の人、および健康そうな１９７人の対照被験者からも血液試料を採取した。
【００３４】
（血漿試料からのＤＮＡ抽出） 各被験者から、血漿単離用のＥＤＴＡチューブ内へ末梢血（５ｍｌ）を採取することができる。血液試料を１６００×ｇで遠心分離し、血漿をＥＤＴＡ入りチューブから注意深く取り出して何も入っていないポリプロピレンチューブ内へ移す。次の処理までの間、試料を−２０℃に保存する。血漿試料由来のＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ Ｋｉｔ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ国ヒルデン所在）を用いて製造業者推奨の血液および体液用プロトコールにより抽出する（２）。血漿試料（１３０−８００μｌ／カラム）をＤＮＡ抽出に使用する。正確な量を、標的ＤＮＡの濃度の算出用に記録する。抽出カラムから得た最終的な溶出量５０μｌを使用する。
【００３５】
血中循環ＥＢＶ ＤＮＡの濃度を、ＥＢＶゲノムのＢａｍＨＩ−Ｗ断片の領域についてのリアルタイム定量ＰＣＲシステム（ロー、ワイ エム ディーら（Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５９巻、１１８８−１１９１ページ、１９９９年）を用いて測定した。リアルタイム定量ＰＣＲの原理および反応の準備手順についてはすでに記載されている（ロー、ワイ エム ディーら（Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５９巻、１１８８−１１９１ページ、１９９９年）。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒを用いてデータを収集し、アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により開発されたＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍソフトウェア（バージョン１．６．３）を用いて解析した。結果を血清１ｍｌあたりのＥＢＶゲノムのコピー数として表した。
【００３６】
全ての血清ＤＮＡ試料を同様にグロビン遺伝子についてのリアルタイム定量ＰＣＲ分析（ロー、ワイ エム ディーら（Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５９巻、１１８８−１１９１ページ、１９９９年）に供し、この分析により全ての被験試料について陽性のシグナルを得たが、これは抽出ＤＮＡの品質が良いことを示すものである。全ての分析について水を用いた多数の陰性ブランクを含めた。
【００３７】
より具体的には、ＥＢＶ ＤＮＡ検出のために２種のリアルタイム定量ＰＣＲシステムを構築した：（ａ）一方はＢａｍＨＩ−Ｗ領域について；（ｂ）他方はＥＢＮＡ−Ｉ領域（ベーアら（Ｂａｅｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ、第３１０巻、２０７−２１１ページ、１９８４年）についてである。ＢａｍＨＩ−Ｗシステムは、増幅プライマー（配列番号１）Ｗ−４４Ｆ（５’−ＣＣＣＡＡＣＡＣＴＣＣＡＣＣＡＣＡＣＣ−３’）および（配列番号２）Ｗ−１１９Ｒ（５’−ＴＣＴＴＡＧＧＡＧＣＴＧＴＣＣＧＡＧＧＧ−３’）と、二重に標識された蛍光プローブ（配列番号３）Ｗ−６７Ｔ（５’−（ＦＡＭ）ＣＡＣＡＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＣＣＣＡＣＣＣＧＴＣＴＣ（ＴＡＭＲＡ）−３’）とから成る。ＥＢＮＡ−Ｉシステムは、増幅プライマー（配列番号４）ＥＢＮＡ−１１６２Ｆ（５’−ＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＣＧＧＧＴＣＴＣＣ−３’）および（配列番号５）ＥＢＮＡ−１２２９Ｒ（５’−ＣＣＴＡＣＡＧＧＧＴＧＧＡＡＡＡＡＴＧＧＣ−３’）と、二重に標識された蛍光プローブ（配列番号６）ＥＢＮＡ−１１８６Ｔ［５’−（ＦＡＭ）ＣＧＣＡＧＧＣＣＣＣＣＴＣＣＡＧＧＴＡＧＡＡ（ＴＡＭＲＡ）−３’］とから成る。蛍光プローブには、ＰＣＲの際にプローブが伸長するのを防ぐために３’側をブロックするリン酸基を含めた。プライマー／プローブの組合せは、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（パーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ．）、カリフォルニア州フォレスターシティ所在）を用いて設計した。ＥＢＶゲノムの配列データはＧｅｎＢａｎｋ配列データベースから入手した（アクセス番号Ｖ０１５５５）。β−グロビン遺伝子についてのリアルタイム定量ＰＣＲは、ローら（Ｌｏ，ｅｔ ａｌ．）、Ａｍ Ｊ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ、第６２巻、７６８−７７５ページ、１９９８年）にすでに記載されているようなプライマーとプローブから成り、血漿ＤＮＡの増幅能についての対照として使用した。
【００３８】
蛍光ＰＣＲ反応を、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（パーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ．））中に提供されている構成要素（蛍光プローブと増幅プライマーを除く）を用いて反応容量５０μｌ中に準備する。蛍光プローブはパーキンエルマーアプライドバイオシステムズ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によるカスタム合成である。ＰＣＲプライマーはライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、メリーランド州ゲイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）所在）により合成された。各反応には、５μｌの１０×緩衝液Ａ；３００ｎＭの各増幅プライマー；２５ｎＭ（ＥＢＶプローブ用）または１００ｎＭ（β−グロビンプローブ用）の対応する蛍光プローブ；４ＭＭ ＭｇＣｌ２；各２００μｍのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ；４００μＭのｄＵＴＰ；１．２５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）；ならびに０．５ユニットのＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）ウラシルＮ−グリコシラーゼを含めた。
【００３９】
ＤＮＡ増幅を、パーキンエルマーアプライドバイオシステムズ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒにおいて９６ウェル反応用プレート方式で実施する。各試料を２連で分析する。全ての分析について水を用いた多数の陰性ブランクを含めた。
【００４０】
ＥＢＶ陽性の細胞株Ｎａｍａｌｗａ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＣＲＬ−１４３２；クラインら（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｉｎｔ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、第１０巻、４４−５７ページ、１９７２年を参照のこと）から抽出したＤＮＡを標準として使用し、検量線を並行して各分析につき２連で作製する。Ｎａｍａｌｗａは、細胞あたり２つ組み込まれたウイルスゲノムを含む二倍体細胞である。二倍体細胞あたり６．６ｐｇ ＤＮＡの換算係数をコピー数算出に使用した（サイキら（Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３９巻、４８７−４９１ページ、１９８８年）。血中を循環している細胞外ＥＢＶ ＤＮＡの濃度を、血漿１ｍｌあたりのＥＢＶゲノムのコピー数として表した。
【００４１】
ＥＢＶ ＢａｍＨＩ−ＷおよびＥＢＮＡ−ＩのＰＣＲシステムに同じ熱プロファイルを使用した。熱サイクリングは、ウラシルＮ−グリコシラーゼを作用させるために５０℃で２分間のインキュベーションを最初に実施し、次に９５℃で１０分間の初期変性ステップとし、次いで９５℃で１５秒間および５６℃で１分間の反応を４０サイクル実施した。
【００４２】
次に、７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒにより収集されマッキントッシュ（Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ）コンピュータ（アップルコンピュータ（Ａｐｐｌｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ）、カリフォルニア州クパチーノ（Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ）所在）に保存された増幅データを、パーキンエルマーアプライドバイオシステムズにより開発されたＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍソフトウェアを用いて解析する。各２連データの平均定量値を用いてさらに濃度を算出する。ＥＢＶ ＤＮＡまたはβ−グロビン遺伝子の血漿中濃度（コピー／ｍｌで表す）を次の式を用いて算出する。
Ｃ＝Ｑ×（ＶＤＮＡ／ＶＰＣＲ）×（１／Ｖｅｘｔ）
式中、Ｃは血漿中の対象物の濃度（コピー／ｍｌ）を表し、ＱはＰＣＲにおいてＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒにより測定された対象物の定量値（コピー数）を表し、ＶＤＮＡは抽出後に得られたＤＮＡの総容量（通常キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）抽出１回あたり５０μｌ）を表し、ＶＰＣＲはＰＣＲに使用されたＤＮＡの容量（通常５μｌ）を表し、Ｖｅｘｔは抽出された血漿／血清の容量（通常０．１３−０．８０ｍｌ）を表す。
【００４３】
腫瘍細胞中のＥＢＶの存在を、すでに記載されているとおりに（ホイ ピー ケーら（Ｈｕｉ，Ｐ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．）、Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．、第２５巻、９４７−９５２ページ、１９９４年）、ＥＢＥＲに対するフルオレセイン結合オリゴヌクレオチドプローブ（ノボカストラ（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ）、英国所在）を用いたパラフィン包埋組織切片のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより評価した。
（結果）
総数５１人の胃がん患者を募集した。この集団中、５例の胃がんはＥＢＥＲ陽性であった（図１Ａ）。１４例については、腫瘍細胞はＥＢＥＲ陰性であったが、部分的にＥＢＥＲ陽性の浸潤リンパ球が認められた（図１Ｂ）。これらの１４例を「バックグラウンド」の陽性を示すものとして分類した。図２は、上記３つの患者群間の血中循環ＥＢＶ ＤＮＡのレベルの差異を示す。血清中のＥＢＶ ＤＮＡはＥＢＥＲ陽性の症例のすべてにおいて検出された（血清中ＥＢＶ ＤＮＡ濃度の中央値：１０６３コピー／ｍＬ；四分位範囲：４８５−５１４１コピー／ｍＬ）。陰性の３２例のいずれにおいても血清中ＥＢＶ ＤＮＡは検出されなかった（図２）。「バックグラウンド」のＥＢＥＲ陽性を示す１４例のうち１３例（９３％）が検出可能な血清中ＥＢＶ ＤＮＡを有していた。これらの症例の血清中ＥＢＶ ＤＮＡ濃度の中間の中央値は５０コピー／ｍＬ（四分位範囲：４２−９８コピー／ｍＬ）であった。これら３群の間の差異は統計的に有意である（ｐ＜０．００１、クラスカル・ウォリス（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）の検定）。多重比較（対比較）分析により、ＥＢＥＲ陽性群とＥＢＥＲ陰性群との間の有意差（ｐ＜０．０５、ダン（Ｄｕｎｎ）の方法）およびＥＢＥＲバックグラウンド群とＥＢＥＲ陰性群との間の有意差（ｐ＜０．０５、ダン（Ｄｕｎｎ）の方法）が示されている。
【００４４】
ＥＢＶ ＤＮＡは、胃炎の試料３０例のうち７例（２３％）および健康な対照１９７例のうち７例（３．６％）の血清中に検出可能であった。これら２群間の血清中ＥＢＶ ＤＮＡが陽性である症例の割合は有意に異なっている（カイ二乗検定、ｐ＝０．０２８）。検出可能な血中循環ＥＢＶ ＤＮＡを有する症例であっても、実際の血清中ＥＢＶ ＤＮＡの濃度は一般にＥＢＥＲ陽性の胃がんの症例における濃度よりも低い。
【００４５】
「バックグラウンド」のＥＢＥＲ陽性を示す胃がんの症例、胃炎の症例、および対照被験者における検出可能な血清中ＥＢＶ ＤＮＡを症例間で比較した。これら３群の血清中ＥＢＶ ＤＮＡ濃度は図３にプロットされている。これら３群の間に血中循環ＥＢＶ ＤＮＡレベルの統計的有意差はない（クラスカル・ウォリス（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）の検定、ｐ＝０．２９６）。
（考察）
上記のデータは、細胞外のＥＢＶ ＤＮＡを一部の胃がん患者から採取した血清試料中に検出することができることを示す。さらに、上記データは血清中ＥＢＶ ＤＮＡを検出可能であることと、腫瘍のＥＢＥＲの状態との間の興味深い相関を示している。このように、ＥＢＥＲ陽性の胃がん症例は高レベルな血清中ＥＢＶ ＤＮＡと関連があり；「バックグラウンド」のＥＢＥＲ陽性を示す胃がん症例は中間レベルの血清中ＥＢＶ ＤＮＡと関連があり；ＥＢＥＲ陰性の症例には血清中ＥＢＶ ＤＮＡは認められなかった。これらの知見は、血漿および血清ががんをモニターするための材料の非侵襲的供給源になることをさらに示している（アンカー ピーら（Ａｎｋｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．第１８巻、６５−７３ページ、１９９９年）。
【００４６】
臨床的には、血中循環ＥＢＶ ＤＮＡを、ＮＰＣ（ロー、ワイ エム ディーら（Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５９巻、１１８８−１１９１ページ、１９９９年；ロー、ワイ エム ディーら（Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５９巻、５４５２−５４５５ページ、１９９９年）やある種のリンパ腫（レイ、ケイ アイら（Ｌｅｉ，Ｋ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．）、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．第１１１巻、２３９−２４６ページ、２０００年；ドルーエ、イーら（Ｄｒｏｕｅｔ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．第５７巻、３８３−３８９ページ、１９９９年；ガラガー、エーら（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．第８４巻、４４２−４４８ページ、１９９９年）について実現されたのと同様にＥＢＥＲ陽性の腫瘍を有する一部の胃がん患者の診断およびモニタリングに適用可能である。最近、上咽頭がんの予後における血中循環ＥＢＶ ＤＮＡの重要性が示された。このデータ（ロー、ワイ エム ディーら（Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第６０巻、６８７８−６８８１ページ）は、ＥＢＶ ＤＮＡの測定も胃がんの予後の判定に重要であることを示すものである。
【００４７】
「バックグラウンド」のＥＢＥＲ陽性を示す胃がんにおける血中循環ＥＢＶ ＤＮＡの検出は興味深い。腫瘍組織に浸潤しているＥＢＥＲ陽性のリンパ球が、これらの症例において検出可能な低いレベルの血清中ＥＢＶ ＤＮＡの由来である可能性がある。仮にそれが正しいとすると、さらなる研究によりこれらのＥＢＥＲ陽性のリンパ球によるＥＢＶの放出メカニズムが解明されるかもしれない。可能性のあるメカニズムには、ＤＮＡの積極的な放出（ロジャース ジェイ シーら（Ｒｏｇｅｒｓ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第６９巻、１６８５−１６８９、１９７２年）および上記細胞の一部における溶菌性のＥＢＶ感染の活性化が含まれる。
【００４８】
血中循環ＥＢＶ ＤＮＡとＥＢＥＲ陽性の浸潤リンパ球との間の関連は、低いレベルの血中循環ＥＢＶ ＤＮＡが新生物を伴わない炎症状態においても認められることを示唆する。実際に、血中循環ＥＢＶ ＤＮＡは胃炎患者にも存在する。対照としては、血清中ＥＢＶ ＤＮＡは健康そうな対照の人々の３．６％にも検出された。健康そうな被験者において低いレベルの血中循環ＥＢＶ ＤＮＡが存在するということは他の研究によって報告されている（ロー、ワイ エム ディーら（Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５９巻、１１８８−１１９１ページ、１９９９年；ショーテラスク ケイら（Ｓｈｏｔｅｌｅｒｓｕｋ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第６巻、１０４６−１０５１ページ、２０００年）。検出可能な血清中ＥＢＶ ＤＮＡを伴う胃炎の症例および健康な対照例において、ウイルスＤＮＡの濃度は「バックグラウンド」のＥＢＥＲ陽性を示す胃がんの症例における濃度と非常に似通っている（図３）。この知見は、「バックグラウンドの」ＥＢＥＲ陽性を示す胃がんについて上記に仮定したように、血中循環ＥＢＶ ＤＮＡが胃炎および健康な対照例においてもＥＢＥＲ陽性リンパ球により放出されるということを示唆している。血中循環ＥＢＶ ＤＮＡのレベルについては、検出可能な血清中ＥＢＶ ＤＮＡを伴う上記２７症例のうち２６例が５００コピー／ｍｌ未満であった。これに対して、ＥＢＥＲ陽性の胃がん５例のうち４例（８０％）、および、以前の研究（ロー、ワイ エム ディーら（Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５９巻、１１８８−１１９１ページ、１９９９年）では上咽頭がん５７例のうち４８例（８４％）が、５００コピー／ｍｌを上回る血中循環ＥＢＶ ＤＮＡレベルを有していた。この解析から、血漿／血清のＥＢＶ ＤＮＡ濃度５００コピー／ｍｌは特に明確にこれらのがん患者を特定するための実用的な診断上の境界点となりうることが示唆される。大規模な臨床研究により近々にこの境界値の精度がさらに高まることが期待される。
【００４９】
健康そうな人々の血中に低いレベルの血中循環ＥＢＶ ＤＮＡが存在することの長期的な意義は依然として不明である。何より、今後の研究は、これらの人々がＥＢＶ関連疾患を発症するリスクが大きいかもしれないという可能性について取り組むべきである。この問題は重大な公衆衛生上の問題かつ生物学的に重要な問題である。
【００５０】
生物学的には、ＥＢＥＲ陽性の胃がん患者における血中循環ＥＢＶ ＤＮＡの検出は、血漿中の腫瘍由来ＤＮＡのクリアランス速度に関する重要な情報を提供する可能性がある。腫瘍由来ＤＮＡのクリアランスの速度論に関するこれまでの研究は放射線療法（ロー、ワイ エム ディーら（Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第６０巻、２３５１−２３５５ページ、２０００年）および化学療法（レイ ケイ アイら（Ｌｅｉ，Ｋ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．）、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．第１１１巻、２３９−２４６ページ、２０００年）を受けている患者について実施されているので、クリアランス速度は依然としてほとんど解明されていない問題となっている。上記のこれまでの研究から明らかにされた速度論的パラメータは、（ａ）治療法に起因する腫瘍細胞の死、および（ｂ）血漿からの腫瘍由来ＤＮＡのクリアランスを合わせたものを指す。胃がんはほとんどが外科的切除により治療されるので、この新しいモデル系により、一時点すなわち手術時にがんを除去した後の腫瘍由来ＤＮＡのクリアランスに関する情報が提供されうる。そのような情報は、母親の血漿における胎児のＤＮＡのクリアランスについてすでに為されているように（ロー、ワイ エム ディーら（Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、第６４巻、２１８−２２４ページ、１９９９年）、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血漿中ＤＮＡのクリアランスの解明を推進するであろう。
【００５１】
本明細書中のデータは、血中循環ＥＢＶ ＤＮＡが、ＥＢＶに関連のある他の多くのがんのタイプにおいても有用であることも示唆している。そのようながんの例には、乳がん（ボネット エムら（Ｂｏｎｎｅｔ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．第９１巻、１３７６−１３８１ページ、１９９９年）および肝細胞がん（スガワラ ワイら（Ｓｕｇａｗａｒａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２５６巻、１９６−２０２ページ、１９９９年）が含まれる。一部の腫瘍のタイプとＥＢＶとの関連については議論のあるところであるので、そのような腫瘍を有する患者の血漿からＥＢＶ ＤＮＡを検出可能であるということは、上記の問題を解決するのに貢献する可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１Ａ】ＥＢＶ遺伝子でコードされる小ＲＮＡ（ＥＢＥＲ）陽性の腫瘍細胞を含む胃腺がんを示す図。ＥＢＥＲのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションで、×２００拡大である。
【図１Ｂ】部分的にＥＢＥＲ陽性の腫瘍浸潤リンパ球を含む胃腺がんを示す図。腫瘍細胞は陰性である。ＥＢＥＲのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションで、×４００拡大である。
【図２】３つの患者群間の血中循環ＥＢＶ ＤＮＡのレベルの差異を示す図。血清中のＥＢＶ ＤＮＡはＥＢＥＲ陽性の症例のすべてにおいて検出された（血清中ＥＢＶ ＤＮＡ濃度の中央値：１０６３コピー／ｍＬ；四分位範囲：４８５−５１４１コピー／ｍＬ）。陰性の３２例のいずれにおいても血清中ＥＢＶ ＤＮＡは検出されなかった。「バックグラウンド」のＥＢＥＲ陽性を示す１４例のうち１３例（９３％）が検出可能な血清中ＥＢＶ ＤＮＡを有していた。これらの症例の血清中ＥＢＶ ＤＮＡ濃度の中間の中央値は５０コピー／ｍＬ（四分位範囲：４２−９８コピー／ｍＬ）であった。
【図３】「バックグラウンド」のＥＢＥＲ陽性を示す胃がんの症例、胃炎の症例、および対照被験者における検出可能な血清中ＥＢＶ ＤＮＡの症例間の比較を示す図。これら３群の血清中ＥＢＶ ＤＮＡの濃度を示す。これら３群の間に血中循環ＥＢＶ ＤＮＡレベルの統計的有意差はない（クラスカル・ウォリス（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）の検定、ｐ＝０．２９６）。
【０００１】
本発明は、エプスタイン・バーウイルスが患者の血液由来の細胞を含まない液体に見出されることがあり、そのようなウイルスが見出されかつその患者が胃炎であるときは、その患者は胃炎から胃がんへと進行しやすい傾向を有する、という発見に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん由来のＤＮＡが様々な腫瘍のがん細胞から放出されうることが知られている（アンカーら（Ａｎｋｅｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．第１８巻、６５−７３ページ、１９９９年）。例としては、すい臓がん由来のがん遺伝子突然変異体（アンカーら（Ａｎｋｅｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、第１１２巻、４−１１２０ページ、１９９７年）、肺がんにおけるマイクロサテライトの変化（チェンら（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２巻、３−１０３５ページ、１９９６年）、および肝臓がん由来のエピジェネティックな変化（ウォンら（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５９巻、３ページ、１９９９年）などがある。さらに、ウイルス感染と関連があるとして知られている多くのがんの血液循環中にウイルスＤＮＡが見出されている。例としては、上咽頭がん（マチラングラら（Ｍｕｔｉｒａｎｇｕｒａ ｅｔ ａｌ．）、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第４巻、６６５−９ページ、１９９８年；ローら（Ｌｏ ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５９巻、１１８８−９１ページ、１９９９年）およびある種のリンパ腫（レイら（Ｌｅｉ ｅｔ ａｌ．）、Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．第１１１巻、２３９−４６ページ、２０００年；ガラガーら（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ．第８４巻、４４２−８ページ、１９９９年；ドルーエら（Ｄｒｏｕｅｔ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ．第５７巻、３８３−９ページ、１９９９年）からのエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ＤＮＡ、ならびに頭部および頚部がんからのヒトパピローマウイルスＤＮＡ（カポネら（Ｃａｐｏｎｅ ｅｔ ａｌ．）、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第６巻、４１７１−５ページ、２０００年）などがある。
【０００３】
近年、がん患者の血漿および血清中のがん由来ＤＮＡの存在に非常に注目が集まっている（チェン、エックス キューら（Ｃｈｅｎ，Ｘ．Ｑ．ｅｔ ａｌ．）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．第２巻、１０３３−１０３５ページ、１９９６年；ノウロツ、エイチら（Ｎａｗｒｏｚ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．）、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．第２巻、１０３５−１０３７ページ、１９９６年）。ウイルスに関連のあるがんについては、患者の血漿および血清中に細胞から離れた腫瘍関連ウイルスＤＮＡが検出されている（マチラングラ、エーら（Ｍｕｔｉｒａｎｇｕｒａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第４巻、６６５−６６９ページ、１９９８年；ロー、ワイ エム ディーら（Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５９巻、１１８８−１１９１ページ、１９９９年；カポネ、アール ビーら（Ｃａｐｏｎｅ，Ｒ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第６巻、４１７１−４１７５ページ、２０００年）。多くのタイプの悪性腫瘍に関連付けられてきた１つの重要なウイルスはエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）である（コーエン、ジェイ アイ（Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｉ．）、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．第３４３巻、４８１−４９２ページ、２０００年）。エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）は、ヒト集団の大多数に感染するヒトヘルペスウイルスである。ＥＢＶは通常唾液を介して感染し、Ｂリンパ球に潜伏感染を成立させ、宿主の生存している間はそこに存続する。これについては、上咽頭がん（ＮＰＣ）（マチラングラ、エーら（Ｍｕｔｉｒａｎｇｕｒａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第４巻、６６５−６６９ページ、１９９８年；ロー、ワイ エム ディーら（Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５９巻、１１８８−１１９１ページ、１９９９年）およびある種のリンパ腫（レイ、ケイ アイら（Ｌｅｉ，Ｋ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．）、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．第１１１巻、２３９−２４６ページ、２０００年；ドルーエ、イーら（Ｄｒｏｕｅｔ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．第５７巻、３８３−３８９ページ、１９９９年；ガラガー、エーら（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．第８４巻、４４２−８ページ、１９９９年）の患者の血漿および血清中に、血中を循環している（血中循環）ＥＢＶ ＤＮＡが検出されている。
【０００４】
ＥＢＶ感染が胃がんの一部と関係があるという報告もされている（シバタ、ディーら（Ｓｈｉｂａｔａ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．第１４０巻、７６９−７７４ページ、１９９２年）。香港では、胃がん症例の約１０％についてＥＢＶ感染との関連が見出されている（イェン、エス ティーら（Ｙｕｅｎ，Ｓ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．）、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．第１８巻、１１５８−１１６３ページ、１９９４年）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、胃がん患者の血清中のＥＢＶ ＤＮＡを検出し、そのようにして検出されたＥＢＶ ＤＮＡの量を臨床上の診断または予後の判断に関連付ける方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第１の態様では、本発明は、患者の胃がんを診断し、検出し、モニターし、予後を判断する方法を特徴とする。該方法は胃がん患者の血清もしくは血漿中に存在するエプスタイン・バーウイルスＤＮＡ（ＥＢＶ ＤＮＡ）の量を検出または測定することを特徴とする。従って、本発明は臨床医学において広範な適用性を有する。
【０００７】
本発明の方法を、乳がんをはじめとする、頭部および頚部以外のリンパ系悪性腫瘍を診断し、検出し、モニターし、予後を判断するために適用することも可能である。これらの新生物は、胃がん同様にＥＢＶ感染と関連付けられている。
【０００８】
本発明の方法を、胃炎を診断し、検出し、モニターし、予後を判断するために適用することも可能である。ＥＢＶ ＤＮＡは、胃炎をはじめとする、新生物ではない胃の疾患の患者の血漿および血清中に検出されうる。次には、胃炎は胃がんと関連付けられている。本発明は、胃がんの可能性があるかまたは胃がんと診断された患者、およびＥＢＶの核酸を含まないかまたはＥＢＶを含むがん細胞をさらに含む。
【０００９】
本発明の方法は、通常（１）患者から血液試料を採取するステップと、（２）血液試料からＤＮＡを抽出するステップと、（３）血液試料中に存在する血中循環ＥＢＶ ＤＮＡの量を測定するステップと、（４）血液試料中に存在する血中循環ＥＢＶ ＤＮＡの量を対照と比較するステップとからなる。当然のことであるが、本発明の方法を、患者から血液試料を採取するという作業ステップを伴わず、以前患者から採取された血液試料（またはそのような血液試料から得た液体画分もしくはＤＮＡ）について実施することも可能である。
【００１０】
血液試料は、細胞を含まない液体試料であることが好ましい。細胞を含まないという語は、該試料が、凝血させて残りの液体から細胞を分離することにより細胞を取り出した血清、または凝血を阻害して液体画分を遠心分離することにより細胞を取り出したもの（血漿）のいずれかを意味する。ＥＢＶ ＤＮＡは液体画分に関して測定される。ＥＢＶが細胞を含まない試料の液体中に見出される場合、該感染が活動性であり感染細胞がＥＢＶを放出しているものと考えられる。
【００１１】
第２の態様では、本発明は患者の血清または血漿中のＥＢＶ ＤＮＡを検出するのに適した試薬を備えた診断用キットを特徴とする。本発明のキットは、患者から血液試料を採取するための１つ以上のデバイスと、血液試料からＥＢＶ ＤＮＡを分離するための手段と、血液試料中に存在するＥＢＶ ＤＮＡの量を定量するための手段とをさらに備えても良い。そのようなキットは、胃がんおよび胃炎を診断し、検出し、モニターし、予後を判断するために使用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、患者の胃がんを診断し、検出し、モニターし、予後を判断する方法を特徴とする。該方法は胃がん患者の血清中に存在するＥＢＶ ＤＮＡの量を検出または測定することを特徴とする。本発明の方法は臨床医学において広範な適用性を有する。胃がんは、日本を含む多くの地理的地域において比較的高い罹患率で存在している。一部の胃がんはＥＢＶ感染と関連があることが知られている（シバタら（Ｓｈｉｂａｔａ ｅｔ ａｌ．）、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．第１４０巻、７６９−７４ページ、１９９２年）。本発明の非侵襲的血液検査は、臨床上の大きな進歩を示すものである。
【００１３】
胃炎または消化不良は、胃粘膜の炎症である。胃炎とは、胃粘膜に炎症性の変化をもたらすが、その臨床上の特徴、組織学的特性、および発症機構が異なる一群の関連する障害である。炎症は、慢性の場合、胃腺がんへの進行の指標として知られている。
【００１４】
胃炎には急性も慢性もあり得る。過剰なアルコールを飲んだ後、食べ過ぎた後、香辛料の効いた食物を食べた後、または喫煙の後に胃炎を患う人々がいる。また別の人々は、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）の長期使用または大腸菌、サルモネラ菌、もしくはヘリコバクター・ピロリなどの細菌への感染の後に胃炎を発症する。時により、大手術、外傷、火傷、または重篤な感染の後に胃炎が発症することもある。悪性貧血、自己免疫不全、および慢性の胆汁逆流などのある種の疾患も同様に胃炎の原因となり得る。臨床上、最も共通する症状は胃の不調または痛みである。おくび、腹部膨満、悪心、嘔吐、または胃部の満腹感もしくは灼熱感が患者により報告されている。胃の内面から出血している場合、血液は嘔吐物や大便中にも存在しうる。
【００１５】
胃炎は、胃内視鏡、生検、貧血についての血液検査、および便潜血検査などの１つ以上の医学的検査によって診断される。便潜血検査は、胃炎の兆候である、便の中の血液の存在をチェックする。
【００１６】
胃炎はＥＢＶ感染者に関連するとされているが、胃がんへの進行の増大とは関連付けられていない。胃がんに対する感受性が増大している胃炎患者を特定することが、本発明の目的である。本発明のアッセイは、医師が大きなリスクに直面している患者に注目することを可能にし、より積極的な抗胃炎治療とより高頻度の内視鏡的評価とを用いることにより、患者に利益をもたらすであろう。
【００１７】
臨床的には、血中循環ＥＢＶ ＤＮＡを、上咽頭がん（ロー、ワイ エム ディーら（Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５９巻、１１８８−１１９１ページ、１９９９年；ロー、ワイ エム ディーら（Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５９巻、５４５２−５４５５ページ、１９９９年）やある種のリンパ腫（レイ、ケイ アイら（Ｌｅｉ，Ｋ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．）、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．第１１１巻、２３９−２４６ページ、２０００年；ドルーエ、イーら（Ｄｒｏｕｅｔ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．第５７巻、３８３−３８９ページ、１９９９年；ガラガー、エーら（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．第８４巻、４４２−４４８ページ、１９９９年）について実現されたのと同様に、ＥＢＥＲ陽性の腫瘍を有する胃がん患者の診断およびモニタリングに適用する。最近示された、上咽頭がんにおける血中循環ＥＢＶ ＤＮＡの予後上の重要性（ロー、ワイ エム ディーら（Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第６０巻、６８７８−６８８１ページ）は、ＥＢＶ ＤＮＡの測定が胃がんに関して予後上の重要性を有することを示唆するものである。
【００１８】
本発明の方法は、いずれもＥＢＶと関連のあるがんである、頭部および頚部以外のリンパ系悪性腫瘍を検出し、モニターし、予後を判断するために適用することも可能である。これらの新生物は、ある種の肝臓がん（スガワラら（Ｓｕｇａｗａｒａ ｅｔ ａｌ．）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２５６巻、１９６−２０２ページ、１９９９年）と同様に、ＥＢＶ感染とも関連付けられている（ボネットら（Ｂｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．第９１巻、１３７６−８１ページ、１９９９年）。
【００１９】
本発明の方法は、胃炎を検出し、モニターし、予後を判断するために適用することも可能である。ＥＢＶ ＤＮＡは、胃炎のような新生物でない胃疾患において検出されうる。あるタイプの胃炎はＥＢＶ感染と関連があることが知られている（ヤナイら（Ｙａｎａｉ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．第２９巻、３９−４３ページ、１９９９年）。あるタイプの胃炎は、患者が腸上皮化生になりやすく、ひいては胃がんにかかりやすくなる素因である（ヨシムラら（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．第５３巻、５３２−６ページ、２０００年）。
【００２０】
日本国のヤナイ（Ｙａｎａｉ）による２０人の患者についての唯一の研究において、ある割合の胃炎患者およびその患者の胃上皮にＥＢＶが存在することが見出されたが、その２つの間の関連は立証されていない。ドイツ国のフンガーマン（Ｈｕｎｇｅｒｍａｎｎ）による、２４２人を超える慢性胃炎（軽いものから重篤なものまで）の患者についての最近の研究から、これらの患者においてＥＢＶ感染は非常に低い罹患率であることが示され、胃上皮細胞のＥＢＶ感染は胃がん形成において重要ではないと結論付けられた。
【００２１】
本発明は、胃上皮組織のＥＢＶ感染を簡単な血液検査によって特定しうるという発見を含むものである。以前は、リンパ系組織および他の非上皮組織へのＥＢＶ感染だけが同様の方法により検出可能であった。上皮細胞がＥＢＶ感染に抵抗性であることはよく知られているので、本発明は、第１にＥＢＶに感染した胃炎患者を特定し、次いで第２にそれらの患者がその後胃がんに対する感受性を増すという可能性について研究するという全く新しい概念と機会とを示すものである。本発明のアッセイは、医師が大きなリスクに直面している患者に注目することを可能にし、より積極的な抗胃炎治療または抗ウイルス治療とより高頻度の内視鏡的評価とを用いることにより、患者に利益をもたらすであろう。
【００２２】
本発明の別の目的は、がんの原因になりうるＥＢＶに感染するリスクの高い患者に向けられている。そのような患者には、上咽頭がんの原因となるＥＢＶに非常に感染しやすいことが証明されている、Ｈ２，ＢＷ４６およびＢ１７タイプのＨＬＡ抗原を有する患者が含まれる。ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）のような疾患のため免疫不全の患者、または臓器移植後に免疫抑制剤を投与されている患者のような他の患者も感染リスクが高い。本発明は、腫瘍細胞内にＥＢＶ ＤＮＡを有する胃がんの症例を簡単に検出可能であることを示す。さらに、腫瘍細胞内にＥＢＶ ＤＮＡがない胃がんの場合でも、すぐ近くの上皮にＥＢＶに感染したリンパ球または他の細胞がありさえすれば検出可能である。全体として、腫瘍のＥＢＶ ＤＮＡが陽性または陰性のいずれかの胃がん患者の約３５％が本発明により検出された。この新しい概念は、ＥＢＶ感染の直接または間接のいずれかの結果として別の種類のがんになるリスクの高い患者をモニターするときに大きな助けとなるであろう。本発明に基づき、リンパ腫のほかに胃がんを調査の必要な疾患のリストに加えることが可能である。
【００２３】
固形組織をＥＢＶ ＤＮＡについて調べる場合、生検標本をパラフィンに包埋し５μｍ厚の切片に切断する。ＤＮＡをＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて製造業者推奨のプロトコールにより抽出する。５０μｌの最終溶出量をＤＮＡの試験に使用する。
【００２４】
従来のＤＮＡ増幅法またはシグナル増幅法のいずれもＥＢＶ ＤＮＡの検出に使用可能である。大抵の場合、標的配列を当技術分野でよく知られた数種の核酸増幅手順のうちのいずれかを用いて増幅することが望ましい。具体的には、核酸増幅は、増幅しようとする核酸配列に相補的な配列を含む核酸のアンプリコン（コピー）を酵素的に合成することである。当技術分野で用いられている核酸増幅手順の例には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、および転写増幅（ＴＡＡ）がある。核酸増幅は、試料中に存在する標的配列の量が非常に少ない場合に特に有用である。試料中の目的の生物またはウイルスの核酸をより確実に検出するためにアッセイ開始時に必要とされる標的配列がより少なくてすむので、標的配列を増幅し、合成されたアンプリコンを検出することによりアッセイの感度を大きく向上させることが可能である。
【００２５】
核酸増幅法は文献に十分な記載がある。例えばＰＣＲ増幅は、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号および第４，８００，１５９号、ならびにＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５５巻、３３５−３５０ページ、１９８７年に、マリスら（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．）により記載されている。ＳＤＡの例は、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、第３巻、２５−３０ページ、１９９３年、ウォーカーら（Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２０巻、１６９１−１９９６ページ、１９９２年、およびＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第８９巻、３９２−３９６ページ、１９９１年に見出すことができる。ＬＣＲは米国特許第５，４２７，９３０号および第５，６８６，２７２号に記載されている。そして種々のＴＡＡ方式は、バーグら（Ｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．）の米国特許第５，４３７，９９０号；カシアンら（Ｋａｃｉａｎ ｅｔ ａｌ．）の米国特許第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号；ならびにギンゲラスら（Ｇｉｎｇｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．）の国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８７／０１９６６および国際公開番号第８８／０１３０２号、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８８／０２１０８および国際公開番号第８８／１０３１５号などの刊行物に示されている。
【００２６】
リアルタイム定量ＰＣＲはＥＢＶ ＤＮＡをモニターするのに好ましい手段であり、蛍光標識を用いるＰＣＲ反応の進行を継続的、光学的にモニターすることに基づいている（ハイデら（Ｈｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．）、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．第６巻、９８６−６９４ページ、１９９６年およびローら（Ｌｏ ｅｔ ａｌ．）、Ａｍ Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．第６２巻、７６８−７７５ページ、１９９８年）。このシステムでは、従来のＰＣＲで用いる２種の増幅プライマーに加えて、二重に標識された蛍光ハイブリダイゼーションプローブも用いられる（リバークら（Ｌｉｖａｋ，ｅｔ ａｌ．）、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．、４３５７−３６２ページ、１９９５年）。一方の蛍光色素がレポーターの役割を果たし（ＦＡＭ）、その発光スペクトルが第２の蛍光色素（ＴＡＭＲＡ）により消光される。ＰＣＲの伸長段階の間は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（９）の５’から３’方向のエキソヌクレアーゼ活性によりレポーターがプローブから離れ、よってレポーターが消光体から離れ、その結果５１８ｎｍの蛍光発光が増大する。
【００２７】
本発明の方法は、一般に（１）患者から血液試料を採取するステップと、（２）血液試料からＤＮＡを抽出するステップと、（３）血液試料中に存在する血中循環ＥＢＶ ＤＮＡの量を測定するステップと、（４）血液試料中に存在する血中循環ＥＢＶ ＤＮＡの量を対照と比較するステップとからなる。血液試料を遠心分離にかけ、液体画分を採取し、液体画分についてＥＢＶ ＤＮＡを測定することが好ましい。
【００２８】
当業者は、当技術分野で知られた多くの手段により血液試料からＤＮＡを抽出しうることを理解するであろう。１つの好ましい手段は、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ Ｋｉｔを用いることである。同様に、血中循環ＥＢＶ ＤＮＡの量を多くの既知または新規なプロトコールのうちの１つを用いて測定することも可能である。リアルタイムＰＣＲ増幅システムを含むプロトコールが特に好ましい。そのようにして検出されたＥＢＶ ＤＮＡレベルを対照と比較するための標準的な手順は、得られた値の有意性を統計的に評価するべく容易に考案可能である。
【００２９】
当業者は、臨床上の進行と試料中に存在する血中循環ＥＢＶ ＤＮＡ量との関係に基づく適切な診断基準を容易に作製することができる。しかしながら、胃がん患者においては一般に血清１ｍｌあたり少なくとも約２００コピー、より好ましくは少なくとも約５００コピー、さらにより好ましくは少なくとも約１０００コピーのＥＢＶ ＤＮＡが存在する。上記の血清１ｍｌあたり５００コピーのＥＢＶ ＤＮＡという境界点は、検査の時点でがんであり、がん細胞内部にＥＢＶ ＤＮＡを含むことが示されている場合にのみ適用する。ＥＢＶ陽性リンパ球の浸潤のみを伴いがん細胞内部にはＥＢＶ ＤＮＡを含まない胃がんの患者については、コピー数のレベルはより低い。このように血清１ｍｌあたりのＥＢＶ ＤＮＡのコピー数がより低いレベルであることは、胃炎のみを有する患者の特性でもある。
【００３０】
ＥＢＶ ＤＮＡのコピー数を長期間測定し、疾患の進行または緩解に関連付けることも可能である。従って、本発明は胃がん、胃炎および他の特定のがんの診断とその後のモニタリングとを可能にする非侵襲的な方法を提供する。５００コピーの境界点は検査の時点ですでにがんである場合にのみ適用されることに注意すべきである。上記のようなリンパ球の浸潤を伴う患者では、コピー数のレベルはより低い。
【００３１】
第２の態様では、本発明は患者の血清または血漿中のＥＢＶ ＤＮＡを検出するのに適した試薬を備えた診断用キットを特徴とする。本発明のキットは、患者から血液試料を採取するための１つ以上のデバイスと、血液試料からＥＢＶ ＤＮＡを分離するための手段と、血液試料中に存在するＥＢＶ ＤＮＡの量を定量するための手段とをさらに備えても良い。そのようなキットは、胃がん、胃炎、および他のある種の頭部および頚部以外のリンパ系悪性腫瘍を診断し、検出し、モニターし、予後を判断するために使用可能である。
【００３２】
本明細書中に記載の全ての刊行物及び特許出願は、各個別の刊行物または特許出願が引用により組み込まれるべく特に個別に表示されてはいても、引用により本願に組み込まれる。
【００３３】
上述の発明は明確な理解のために図面および例示を用いてある程度詳細に記述されているが、請求項の趣旨または範囲を逸脱することなくある種の変更形態および修正形態を上記発明に加えることが可能であることは、本発明の教示に照らせば当業者には直ちに明白であろう。
（実施例）
以下の実施例は例示のためだけに提供するものであり、限定を目的とするものではない。当業者は、本質的に同様の結果をもたらすために変更または修正可能な、種々の重要性の低いパラメータを容易に認識するであろう。
（実施例１）
（材料と方法）
５１人の胃がん患者を、香港所在のプリンス・オブ・ウェールズ病院からインフォームドコンセントを実施して募集した。腫瘍の外科的切除の前に血液試料を採取した。手術後、腫瘍の切片をＥＢＥＲ（ＥＢＶ遺伝子でコードされる小ＲＮＡ）のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析に供した。胃炎で、がん腫の徴候のない３０人の人、および健康そうな１９７人の対照被験者からも血液試料を採取した。
【００３４】
（血漿試料からのＤＮＡ抽出） 各被験者から、血漿単離用のＥＤＴＡチューブ内へ末梢血（５ｍｌ）を採取することができる。血液試料を１６００×ｇで遠心分離し、血漿をＥＤＴＡ入りチューブから注意深く取り出して何も入っていないポリプロピレンチューブ内へ移す。次の処理までの間、試料を−２０℃に保存する。血漿試料由来のＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ Ｋｉｔ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ国ヒルデン所在）を用いて製造業者推奨の血液および体液用プロトコールにより抽出する（２）。血漿試料（１３０−８００μｌ／カラム）をＤＮＡ抽出に使用する。正確な量を、標的ＤＮＡの濃度の算出用に記録する。抽出カラムから得た最終的な溶出量５０μｌを使用する。
【００３５】
血中循環ＥＢＶ ＤＮＡの濃度を、ＥＢＶゲノムのＢａｍＨＩ−Ｗ断片の領域についてのリアルタイム定量ＰＣＲシステム（ロー、ワイ エム ディーら（Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５９巻、１１８８−１１９１ページ、１９９９年）を用いて測定した。リアルタイム定量ＰＣＲの原理および反応の準備手順についてはすでに記載されている（ロー、ワイ エム ディーら（Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５９巻、１１８８−１１９１ページ、１９９９年）。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒを用いてデータを収集し、アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により開発されたＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍソフトウェア（バージョン１．６．３）を用いて解析した。結果を血清１ｍｌあたりのＥＢＶゲノムのコピー数として表した。
【００３６】
全ての血清ＤＮＡ試料を同様にグロビン遺伝子についてのリアルタイム定量ＰＣＲ分析（ロー、ワイ エム ディーら（Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５９巻、１１８８−１１９１ページ、１９９９年）に供し、この分析により全ての被験試料について陽性のシグナルを得たが、これは抽出ＤＮＡの品質が良いことを示すものである。全ての分析について水を用いた多数の陰性ブランクを含めた。
【００３７】
より具体的には、ＥＢＶ ＤＮＡ検出のために２種のリアルタイム定量ＰＣＲシステムを構築した：（ａ）一方はＢａｍＨＩ−Ｗ領域について；（ｂ）他方はＥＢＮＡ−Ｉ領域（ベーアら（Ｂａｅｒ ｅｔ ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ、第３１０巻、２０７−２１１ページ、１９８４年）についてである。ＢａｍＨＩ−Ｗシステムは、増幅プライマー（配列番号１）Ｗ−４４Ｆ（５’−ＣＣＣＡＡＣＡＣＴＣＣＡＣＣＡＣＡＣＣ−３’）および（配列番号２）Ｗ−１１９Ｒ（５’−ＴＣＴＴＡＧＧＡＧＣＴＧＴＣＣＧＡＧＧＧ−３’）と、二重に標識された蛍光プローブ（配列番号３）Ｗ−６７Ｔ（５’−（ＦＡＭ）ＣＡＣＡＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＣＣＣＡＣＣＣＧＴＣＴＣ（ＴＡＭＲＡ）−３’）とから成る。ＥＢＮＡ−Ｉシステムは、増幅プライマー（配列番号４）ＥＢＮＡ−１１６２Ｆ（５’−ＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＣＧＧＧＴＣＴＣＣ−３’）および（配列番号５）ＥＢＮＡ−１２２９Ｒ（５’−ＣＣＴＡＣＡＧＧＧＴＧＧＡＡＡＡＡＴＧＧＣ−３’）と、二重に標識された蛍光プローブ（配列番号６）ＥＢＮＡ−１１８６Ｔ［５’−（ＦＡＭ）ＣＧＣＡＧＧＣＣＣＣＣＴＣＣＡＧＧＴＡＧＡＡ（ＴＡＭＲＡ）−３’］とから成る。蛍光プローブには、ＰＣＲの際にプローブが伸長するのを防ぐために３’側をブロックするリン酸基を含めた。プライマー／プローブの組合せは、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（パーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ．）、カリフォルニア州フォレスターシティ所在）を用いて設計した。ＥＢＶゲノムの配列データはＧｅｎＢａｎｋ配列データベースから入手した（アクセス番号Ｖ０１５５５）。β−グロビン遺伝子についてのリアルタイム定量ＰＣＲは、ローら（Ｌｏ，ｅｔ ａｌ．）、Ａｍ Ｊ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ、第６２巻、７６８−７７５ページ、１９９８年）にすでに記載されているようなプライマーとプローブから成り、血漿ＤＮＡの増幅能についての対照として使用した。
【００３８】
蛍光ＰＣＲ反応を、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（パーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ．））中に提供されている構成要素（蛍光プローブと増幅プライマーを除く）を用いて反応容量５０μｌ中に準備する。蛍光プローブはパーキンエルマーアプライドバイオシステムズ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によるカスタム合成である。ＰＣＲプライマーはライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、メリーランド州ゲイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）所在）により合成された。各反応には、５μｌの１０×緩衝液Ａ；３００ｎＭの各増幅プライマー；２５ｎＭ（ＥＢＶプローブ用）または１００ｎＭ（β−グロビンプローブ用）の対応する蛍光プローブ；４ＭＭ ＭｇＣｌ２；各２００μｍのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ；４００μＭのｄＵＴＰ；１．２５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）；ならびに０．５ユニットのＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）ウラシルＮ−グリコシラーゼを含めた。
【００３９】
ＤＮＡ増幅を、パーキンエルマーアプライドバイオシステムズ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒにおいて９６ウェル反応用プレート方式で実施する。各試料を２連で分析する。全ての分析について水を用いた多数の陰性ブランクを含めた。
【００４０】
ＥＢＶ陽性の細胞株Ｎａｍａｌｗａ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＣＲＬ−１４３２；クラインら（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｉｎｔ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、第１０巻、４４−５７ページ、１９７２年を参照のこと）から抽出したＤＮＡを標準として使用し、検量線を並行して各分析につき２連で作製する。Ｎａｍａｌｗａは、細胞あたり２つ組み込まれたウイルスゲノムを含む二倍体細胞である。二倍体細胞あたり６．６ｐｇ ＤＮＡの換算係数をコピー数算出に使用した（サイキら（Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３９巻、４８７−４９１ページ、１９８８年）。血中を循環している細胞外ＥＢＶ ＤＮＡの濃度を、血漿１ｍｌあたりのＥＢＶゲノムのコピー数として表した。
【００４１】
ＥＢＶ ＢａｍＨＩ−ＷおよびＥＢＮＡ−ＩのＰＣＲシステムに同じ熱プロファイルを使用した。熱サイクリングは、ウラシルＮ−グリコシラーゼを作用させるために５０℃で２分間のインキュベーションを最初に実施し、次に９５℃で１０分間の初期変性ステップとし、次いで９５℃で１５秒間および５６℃で１分間の反応を４０サイクル実施した。
【００４２】
次に、７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒにより収集されマッキントッシュ（Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ）コンピュータ（アップルコンピュータ（Ａｐｐｌｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ）、カリフォルニア州クパチーノ（Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ）所在）に保存された増幅データを、パーキンエルマーアプライドバイオシステムズにより開発されたＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍソフトウェアを用いて解析する。各２連データの平均定量値を用いてさらに濃度を算出する。ＥＢＶ ＤＮＡまたはβ−グロビン遺伝子の血漿中濃度（コピー／ｍｌで表す）を次の式を用いて算出する。
Ｃ＝Ｑ×（ＶＤＮＡ／ＶＰＣＲ）×（１／Ｖｅｘｔ）
式中、Ｃは血漿中の対象物の濃度（コピー／ｍｌ）を表し、ＱはＰＣＲにおいてＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒにより測定された対象物の定量値（コピー数）を表し、ＶＤＮＡは抽出後に得られたＤＮＡの総容量（通常キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）抽出１回あたり５０μｌ）を表し、ＶＰＣＲはＰＣＲに使用されたＤＮＡの容量（通常５μｌ）を表し、Ｖｅｘｔは抽出された血漿／血清の容量（通常０．１３−０．８０ｍｌ）を表す。
【００４３】
腫瘍細胞中のＥＢＶの存在を、すでに記載されているとおりに（ホイ ピー ケーら（Ｈｕｉ，Ｐ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．）、Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．、第２５巻、９４７−９５２ページ、１９９４年）、ＥＢＥＲに対するフルオレセイン結合オリゴヌクレオチドプローブ（ノボカストラ（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ）、英国所在）を用いたパラフィン包埋組織切片のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより評価した。
（結果）
総数５１人の胃がん患者を募集した。この集団中、５例の胃がんはＥＢＥＲ陽性であった（図１Ａ）。１４例については、腫瘍細胞はＥＢＥＲ陰性であったが、部分的にＥＢＥＲ陽性の浸潤リンパ球が認められた（図１Ｂ）。これらの１４例を「バックグラウンド」の陽性を示すものとして分類した。図２は、上記３つの患者群間の血中循環ＥＢＶ ＤＮＡのレベルの差異を示す。血清中のＥＢＶ ＤＮＡはＥＢＥＲ陽性の症例のすべてにおいて検出された（血清中ＥＢＶ ＤＮＡ濃度の中央値：１０６３コピー／ｍＬ；四分位範囲：４８５−５１４１コピー／ｍＬ）。陰性の３２例のいずれにおいても血清中ＥＢＶ ＤＮＡは検出されなかった（図２）。「バックグラウンド」のＥＢＥＲ陽性を示す１４例のうち１３例（９３％）が検出可能な血清中ＥＢＶ ＤＮＡを有していた。これらの症例の血清中ＥＢＶ ＤＮＡ濃度の中間の中央値は５０コピー／ｍＬ（四分位範囲：４２−９８コピー／ｍＬ）であった。これら３群の間の差異は統計的に有意である（ｐ＜０．００１、クラスカル・ウォリス（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）の検定）。多重比較（対比較）分析により、ＥＢＥＲ陽性群とＥＢＥＲ陰性群との間の有意差（ｐ＜０．０５、ダン（Ｄｕｎｎ）の方法）およびＥＢＥＲバックグラウンド群とＥＢＥＲ陰性群との間の有意差（ｐ＜０．０５、ダン（Ｄｕｎｎ）の方法）が示されている。
【００４４】
ＥＢＶ ＤＮＡは、胃炎の試料３０例のうち７例（２３％）および健康な対照１９７例のうち７例（３．６％）の血清中に検出可能であった。これら２群間の血清中ＥＢＶ ＤＮＡが陽性である症例の割合は有意に異なっている（カイ二乗検定、ｐ＝０．０２８）。検出可能な血中循環ＥＢＶ ＤＮＡを有する症例であっても、実際の血清中ＥＢＶ ＤＮＡの濃度は一般にＥＢＥＲ陽性の胃がんの症例における濃度よりも低い。
【００４５】
「バックグラウンド」のＥＢＥＲ陽性を示す胃がんの症例、胃炎の症例、および対照被験者における検出可能な血清中ＥＢＶ ＤＮＡを症例間で比較した。これら３群の血清中ＥＢＶ ＤＮＡ濃度は図３にプロットされている。これら３群の間に血中循環ＥＢＶ ＤＮＡレベルの統計的有意差はない（クラスカル・ウォリス（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）の検定、ｐ＝０．２９６）。
（考察）
上記のデータは、細胞外のＥＢＶ ＤＮＡを一部の胃がん患者から採取した血清試料中に検出することができることを示す。さらに、上記データは血清中ＥＢＶ ＤＮＡを検出可能であることと、腫瘍のＥＢＥＲの状態との間の興味深い相関を示している。このように、ＥＢＥＲ陽性の胃がん症例は高レベルな血清中ＥＢＶ ＤＮＡと関連があり；「バックグラウンド」のＥＢＥＲ陽性を示す胃がん症例は中間レベルの血清中ＥＢＶ ＤＮＡと関連があり；ＥＢＥＲ陰性の症例には血清中ＥＢＶ ＤＮＡは認められなかった。これらの知見は、血漿および血清ががんをモニターするための材料の非侵襲的供給源になることをさらに示している（アンカー ピーら（Ａｎｋｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．第１８巻、６５−７３ページ、１９９９年）。
【００４６】
臨床的には、血中循環ＥＢＶ ＤＮＡを、ＮＰＣ（ロー、ワイ エム ディーら（Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５９巻、１１８８−１１９１ページ、１９９９年；ロー、ワイ エム ディーら（Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５９巻、５４５２−５４５５ページ、１９９９年）やある種のリンパ腫（レイ、ケイ アイら（Ｌｅｉ，Ｋ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．）、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．第１１１巻、２３９−２４６ページ、２０００年；ドルーエ、イーら（Ｄｒｏｕｅｔ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．第５７巻、３８３−３８９ページ、１９９９年；ガラガー、エーら（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．第８４巻、４４２−４４８ページ、１９９９年）について実現されたのと同様にＥＢＥＲ陽性の腫瘍を有する一部の胃がん患者の診断およびモニタリングに適用可能である。最近、上咽頭がんの予後における血中循環ＥＢＶ ＤＮＡの重要性が示された。このデータ（ロー、ワイ エム ディーら（Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第６０巻、６８７８−６８８１ページ）は、ＥＢＶ ＤＮＡの測定も胃がんの予後の判定に重要であることを示すものである。
【００４７】
「バックグラウンド」のＥＢＥＲ陽性を示す胃がんにおける血中循環ＥＢＶ ＤＮＡの検出は興味深い。腫瘍組織に浸潤しているＥＢＥＲ陽性のリンパ球が、これらの症例において検出可能な低いレベルの血清中ＥＢＶ ＤＮＡの由来である可能性がある。仮にそれが正しいとすると、さらなる研究によりこれらのＥＢＥＲ陽性のリンパ球によるＥＢＶの放出メカニズムが解明されるかもしれない。可能性のあるメカニズムには、ＤＮＡの積極的な放出（ロジャース ジェイ シーら（Ｒｏｇｅｒｓ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第６９巻、１６８５−１６８９、１９７２年）および上記細胞の一部における溶菌性のＥＢＶ感染の活性化が含まれる。
【００４８】
血中循環ＥＢＶ ＤＮＡとＥＢＥＲ陽性の浸潤リンパ球との間の関連は、低いレベルの血中循環ＥＢＶ ＤＮＡが新生物を伴わない炎症状態においても認められることを示唆する。実際に、血中循環ＥＢＶ ＤＮＡは胃炎患者にも存在する。対照としては、血清中ＥＢＶ ＤＮＡは健康そうな対照の人々の３．６％にも検出された。健康そうな被験者において低いレベルの血中循環ＥＢＶ ＤＮＡが存在するということは他の研究によって報告されている（ロー、ワイ エム ディーら（Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５９巻、１１８８−１１９１ページ、１９９９年；ショーテラスク ケイら（Ｓｈｏｔｅｌｅｒｓｕｋ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第６巻、１０４６−１０５１ページ、２０００年）。検出可能な血清中ＥＢＶ ＤＮＡを伴う胃炎の症例および健康な対照例において、ウイルスＤＮＡの濃度は「バックグラウンド」のＥＢＥＲ陽性を示す胃がんの症例における濃度と非常に似通っている（図３）。この知見は、「バックグラウンドの」ＥＢＥＲ陽性を示す胃がんについて上記に仮定したように、血中循環ＥＢＶ ＤＮＡが胃炎および健康な対照例においてもＥＢＥＲ陽性リンパ球により放出されるということを示唆している。血中循環ＥＢＶ ＤＮＡのレベルについては、検出可能な血清中ＥＢＶ ＤＮＡを伴う上記２７症例のうち２６例が５００コピー／ｍｌ未満であった。これに対して、ＥＢＥＲ陽性の胃がん５例のうち４例（８０％）、および、以前の研究（ロー、ワイ エム ディーら（Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第５９巻、１１８８−１１９１ページ、１９９９年）では上咽頭がん５７例のうち４８例（８４％）が、５００コピー／ｍｌを上回る血中循環ＥＢＶ ＤＮＡレベルを有していた。この解析から、血漿／血清のＥＢＶ ＤＮＡ濃度５００コピー／ｍｌは特に明確にこれらのがん患者を特定するための実用的な診断上の境界点となりうることが示唆される。大規模な臨床研究により近々にこの境界値の精度がさらに高まることが期待される。
【００４９】
健康そうな人々の血中に低いレベルの血中循環ＥＢＶ ＤＮＡが存在することの長期的な意義は依然として不明である。何より、今後の研究は、これらの人々がＥＢＶ関連疾患を発症するリスクが大きいかもしれないという可能性について取り組むべきである。この問題は重大な公衆衛生上の問題かつ生物学的に重要な問題である。
【００５０】
生物学的には、ＥＢＥＲ陽性の胃がん患者における血中循環ＥＢＶ ＤＮＡの検出は、血漿中の腫瘍由来ＤＮＡのクリアランス速度に関する重要な情報を提供する可能性がある。腫瘍由来ＤＮＡのクリアランスの速度論に関するこれまでの研究は放射線療法（ロー、ワイ エム ディーら（Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．第６０巻、２３５１−２３５５ページ、２０００年）および化学療法（レイ ケイ アイら（Ｌｅｉ，Ｋ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．）、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．第１１１巻、２３９−２４６ページ、２０００年）を受けている患者について実施されているので、クリアランス速度は依然としてほとんど解明されていない問題となっている。上記のこれまでの研究から明らかにされた速度論的パラメータは、（ａ）治療法に起因する腫瘍細胞の死、および（ｂ）血漿からの腫瘍由来ＤＮＡのクリアランスを合わせたものを指す。胃がんはほとんどが外科的切除により治療されるので、この新しいモデル系により、一時点すなわち手術時にがんを除去した後の腫瘍由来ＤＮＡのクリアランスに関する情報が提供されうる。そのような情報は、母親の血漿における胎児のＤＮＡのクリアランスについてすでに為されているように（ロー、ワイ エム ディーら（Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、第６４巻、２１８−２２４ページ、１９９９年）、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血漿中ＤＮＡのクリアランスの解明を推進するであろう。
【００５１】
本明細書中のデータは、血中循環ＥＢＶ ＤＮＡが、ＥＢＶに関連のある他の多くのがんのタイプにおいても有用であることも示唆している。そのようながんの例には、乳がん（ボネット エムら（Ｂｏｎｎｅｔ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．第９１巻、１３７６−１３８１ページ、１９９９年）および肝細胞がん（スガワラ ワイら（Ｓｕｇａｗａｒａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２５６巻、１９６−２０２ページ、１９９９年）が含まれる。一部の腫瘍のタイプとＥＢＶとの関連については議論のあるところであるので、そのような腫瘍を有する患者の血漿からＥＢＶ ＤＮＡを検出可能であるということは、上記の問題を解決するのに貢献する可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１Ａ】ＥＢＶ遺伝子でコードされる小ＲＮＡ（ＥＢＥＲ）陽性の腫瘍細胞を含む胃腺がんを示す図。ＥＢＥＲのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションで、×２００拡大である。
【図１Ｂ】部分的にＥＢＥＲ陽性の腫瘍浸潤リンパ球を含む胃腺がんを示す図。腫瘍細胞は陰性である。ＥＢＥＲのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションで、×４００拡大である。
【図２】３つの患者群間の血中循環ＥＢＶ ＤＮＡのレベルの差異を示す図。血清中のＥＢＶ ＤＮＡはＥＢＥＲ陽性の症例のすべてにおいて検出された（血清中ＥＢＶ ＤＮＡ濃度の中央値：１０６３コピー／ｍＬ；四分位範囲：４８５−５１４１コピー／ｍＬ）。陰性の３２例のいずれにおいても血清中ＥＢＶ ＤＮＡは検出されなかった。「バックグラウンド」のＥＢＥＲ陽性を示す１４例のうち１３例（９３％）が検出可能な血清中ＥＢＶ ＤＮＡを有していた。これらの症例の血清中ＥＢＶ ＤＮＡ濃度の中間の中央値は５０コピー／ｍＬ（四分位範囲：４２−９８コピー／ｍＬ）であった。
【図３】「バックグラウンド」のＥＢＥＲ陽性を示す胃がんの症例、胃炎の症例、および対照被験者における検出可能な血清中ＥＢＶ ＤＮＡの症例間の比較を示す図。これら３群の血清中ＥＢＶ ＤＮＡの濃度を示す。これら３群の間に血中循環ＥＢＶ ＤＮＡレベルの統計的有意差はない（クラスカル・ウォリス（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）の検定、ｐ＝０．２９６）。
Claims (22)
- （ａ）胃炎を患っている患者から細胞を含まない血液由来の液体試料を採取すること、および
（ｂ）前記液体についてエプスタイン・バーウイルスが存在するか存在しないかをアッセイすることと、ウイルスの存在が、該患者が胃がんに進行しつつある可能性の増大の指標であることと、
により、胃炎を患っている患者が胃がんに進行しつつある可能性の増大を判断する方法。 - （１）患者から血液試料を採取するステップと、
（２）前記血液試料から液体画分を採取するステップと、
（３）前記液体画分からＤＮＡを抽出するステップと、
（４）前記液体画分中に存在する血中循環ＥＢＶ ＤＮＡの量を測定するステップと
からなる請求項１に記載の方法。 - （５）前記液体画分中に存在する血中循環ＥＢＶ ＤＮＡの量を対照と比較するステップ
からさらになる請求項２に記載の方法。 - 液体画分１ミリリットルあたり少なくとも約５００コピーのＥＢＶ ＤＮＡが存在する請求項１に記載の方法。
- 液体画分１ミリリットルあたり少なくとも１コピーのＥＢＶ ＤＮＡが存在する請求項１に記載の方法。
- 血液は血漿試料である請求項１に記載の方法。
- アッセイは核酸プローブを用いたＥＢＶウイルス核酸のハイブリダイゼーションを含む請求項１に記載の方法。
- アッセイはポリメラーゼ連鎖反応に基づくアッセイである請求項１に記載の方法。
- 患者は慢性胃炎と診断されている請求項１に記載の方法。
- 患者は胃がんであると診断可能であり、がん細胞はＥＢＶ核酸を含まない請求項１に記載の方法。
- 患者は胃がんであると診断可能であり、がん細胞がＥＢＶ核酸を含んでいる請求項１に記載の方法。
- 患者の血清または血漿中に存在するＥＢＶ ＤＮＡを検出するステップからなる、患者における頭部および頚部以外の悪性腫瘍、もしくはリンパ系悪性腫瘍を診断し、検出し、モニターし、または予後を判断する方法。
- （１）患者から血液試料を採取するステップと、
（２）前記血液試料から液体画分を採取するステップと、
（３）前記液体画分からＤＮＡを抽出するステップと、
（４）前記液体画分中に存在する血中循環ＥＢＶ ＤＮＡの量を測定するステップと
からなる請求項１２に記載の方法。 - （５）前記液体画分中に存在する血中循環ＥＢＶ ＤＮＡの量を対照と比較するステップ
からさらになる請求項１３に記載の方法。 - 患者の血清または血漿中に存在するＥＢＶ ＤＮＡを検出するステップからなる、患者の胃炎を診断し、検出し、モニターし、または予後を判断する方法。
- （１）患者から血液試料を採取するステップと、
（２）前記血液試料から液体画分を採取するステップと、
（３）前記液体画分からＤＮＡを抽出するステップと、
（４）前記液体画分中に存在する血中循環ＥＢＶ ＤＮＡの量を測定するステップと
からなる請求項１５に記載の方法。 - （５）前記血液試料中に存在する血中循環ＥＢＶ ＤＮＡの量を対照と比較するステップ
からさらになる請求項１６に記載の方法。 - 胃炎を患っている患者が胃がんに進行しつつある可能性の増大を判断するためのキットであって、単一のキット製品中に
（ａ）患っている患者の血液中のエプスタイン・バーウイルスを検出するための核酸、および
（ｂ）エプスタイン・バーウイルスが存在するか存在しないかを判断するための核酸の使用に関する指示書、およびウイルスが血液中に存在する場合の患者が胃がんに進行しつつある可能性の増大についての説明書
を備えたキット。 - 血清または血漿中のＥＢＶ ＤＮＡを検出するのに適した試薬を備えた、患者の血清または血漿中のＥＢＶ ＤＮＡを検出するための診断用キット。
- 患者から血液試料を採取するためのデバイスを備えた請求項１９に記載の診断用キット。
- 血液試料からＥＢＶ ＤＮＡを分離するための手段を備えた請求項１９に記載の診断用キット。
- 血液試料中に存在するＥＢＶ ＤＮＡの量を定量するための手段を備えた請求項１９に記載の診断用キット。
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