CN104604799B - 一种鉴定eb病毒对淋巴瘤的诱发性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种鉴定EB病毒对淋巴瘤的诱发性的方法，涉及生物医学技术领域，该方法包括以下步骤：第1步，建立EB病毒诱发正常人淋巴细胞发生肿瘤的动物模型及从所述动物模型中获取肿瘤组织；第2步，鉴定第一步中获取的诱发性肿瘤的诱发源及该诱发性肿瘤的基因特性。本发明提供的鉴定EB病毒对淋巴瘤的诱发性的方法创造性地运用IgH基因重排检测方法，鉴定了动物模型中的诱发瘤的单克隆性，从而有力排除以往因不明确诱发瘤性质而给生物医学及临床研究带来的干扰，客服了现有的鉴定方法结果不可靠、可信度低的缺陷，本发明提供的鉴定方法结果准确、可靠、可信度极高。

Description

一种鉴定EB病毒对淋巴瘤的诱发性的方法

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及一种鉴定EB病毒对淋巴瘤的诱发性的方法。

背景技术

EB病毒（Epstein-Barr virus，EB病毒）是最早发现的人类肿瘤病毒，IARC（International Agency for Research on Cancer)已将其列为I类致癌物。在目前的现场调查、病例对照研究、病原体检测和体外转化试验中，都给出了感染EB病毒与产生淋巴瘤可能相关的提示信息，但要真正确定淋巴瘤的致瘤因素及EB病毒的致瘤危险性，还应当进行动物实验。由于EB病毒易感宿主仅限于人和棉顶狨猴，小鼠虽然是理想的模式实验动物，但是其不能被EB病毒感染，因此，迄今为止，还没有真正合适的用于研究EB病毒感染和肿瘤发生的关系的实验动物模型，并且，在目前所有对EB病毒致瘤性的研究中，还没有一种鉴定方法能准确、可靠地证实EB病毒感染对淋巴瘤的产生存在诱导作用（现有的鉴定方法都只能说明淋巴瘤的产生可能与感染EB病毒相关联，但是并不能可靠、令人信服地证明EB病毒对淋巴瘤具有诱发性）。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能准确、可靠地鉴定B病毒对淋巴瘤的诱发性的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种鉴定EB病毒对淋巴瘤的诱发性的方法，包括以下步骤：

第1步，建立EB病毒诱发正常人淋巴细胞发生肿瘤的动物模型及从所述动物模型中获取肿瘤组织：

1.1. NOD/SCID小鼠的准备；

将3-4周龄的NOD/SCID小鼠在SPF级环境中单只分笼饲养5-10天，将用于饲养所述NOD/SCID小鼠的饮用水、垫料、笼具均经高压蒸汽灭菌，饲养期间，给所述NOD/SCID小鼠投放全价鼠饲料，让其自由进食及饮水；

1.2.人淋巴细胞的准备；

从健康献血员的外周静脉中采血，从采集到的外周静脉血中分离出PBL，并用免疫酶标方法检测献血者血清中EB病毒壳抗原VCA-IgG和VCA-IgA的抗体滴度；

1.3.EB病毒的准备；

体外培养B_95-8细胞，待细胞进入对数生长期后调整细胞浓度至10^6-7个/ml，再将其置于温度37℃，二氧化碳浓度为5％的培养箱中饥饿7-10天，然后收集培养液，并将收集到的培养液在4℃环境下离心30 min，离心速度为4000 rpm/min，离心完成后吸取全部上清液，最后将所述上清液经0.45 um 微孔滤膜过滤后置于-80℃低温冰箱中保存备用；

1.4.构建 hu-PBL/SCID嵌合体小鼠；

在无菌条件下给每只NOD/SCID小鼠腹腔注射PBL含量为8×10⁷至10×10⁷个/ml的人PBL悬液1 ml，剩余PBL悬液留存备用；

1.5.EB病毒注射；

对于接受VCA-IgG和VCA-IgA均为阳性的献血员的淋巴细胞移植的NOD/SCID小鼠，不再给其注射EB病毒悬液，对于接受VCA-IgA为阴性的献血员的淋巴细胞移植的NOD/SCID小鼠，在该NOD/SCID小鼠接受淋巴细胞移植后第三天，往该NOD/SCID小鼠腹腔注射0.4 ml由步骤1.3得到的EB病毒悬液；

1.6.肿瘤组织的获取；

将步骤1.5中被EB病毒感染后的NOD/SCID小鼠处死，从处死后的NOD/SCID小鼠体内取出肿瘤组织，一部分用液氮冻存，其余的用10%福尔马林固定；

第2步，鉴定步骤1.6中获取的肿瘤的诱发源及该肿瘤的基因特性：

2.1. 肿瘤组织病理学检查及免疫组织化学染色；

取步骤1.6中已固定的诱发性肿瘤标本，石蜡包埋切片，HE染色，在光学显微镜下进行组织学观察，确诊病变情况，免疫组织化学染色采用链霉菌抗生物素蛋白－过氧化酶法，检测抗原包括：

人类白细胞共同抗原：LCA；

B细胞标记：CD20、CD79a；

T细胞标记：CD3、CD45RO；

2.2. 原位分子杂交检测肿瘤组织中EBER；

2.3.实时定量PCR检测肿瘤组织中LMP-1的表达；

以GADPH基因为内参，用实时荧光定量PCR方法检测并比较移植前正常淋巴细胞与诱发性肿瘤组织中EB病毒LMP-1的表达差异；

2.4.PCR扩增检测人特异性Alu序列；

提取诱发性肿瘤组织的DNA，应用PCR方法扩增221 bp的人特异性Alu序列，PCR反应方式为：

2.4.1.先95℃预变性5 min；

2.4.2.再经94℃变性1 min、57℃退火1 min、72℃延伸1 min；

对上述步骤2.4.2循环30次，再72℃延伸5 min，最后将PCR反应产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳观察，用凝胶成像系统成像；

2.5. PCR分析诱发性肿瘤组织的IgH基因重排；

石蜡包埋肿瘤组织切片至6 um厚，依照DNA FFPE Tissue Kit 操作步骤，提取肿瘤组织切片中的基因组DNA，接着以临床病理学确诊为淋巴瘤的组织标本作为单克隆对照，以反应性增生的淋巴结标本作为多克隆对照，采用BIOMED-2引物系统及PCR仪扩增人免疫球蛋白重链基因片段，PCR反应方式为：

2.5.1.先95℃预变性7 min；

2.5.2.再95℃ 变性45s、60℃ 退火45s、72℃ 延伸90s；

对上述步骤2.5.2循环40次，再72℃ 延伸10 min，得到PCR产物；

2.5.3.将经步骤2.5.2得到的PCR产物的一部分用毛细管电泳分析仪精确作图；

2.5.4.将经步骤2.5.2得到的PCR产物的另一部分进行琼脂糖凝胶电泳观察，用凝胶成像系统成像。

本发明取得的有益效果在于：本发明提供的鉴定EB病毒对淋巴瘤的诱发性的方法通过构建人源化NOD/SCID小鼠，在hu-PBL /SCID嵌合小鼠体内成功建立EB病毒诱导淋巴瘤的实验动物模型，并且创造性地运用IgH基因重排检测方法，鉴定了该诱发瘤的单克隆性，从而有力排除以往因不明确诱发瘤性质而给生物医学及临床研究带来的干扰，客服了现有的鉴定方法结果不可靠、可信度低的缺陷，本发明提供的鉴定方法结果准确、可靠、可信度极高。

附图说明

图1为本发明中人淋巴细胞在SCID小鼠体内移植及成瘤情况的统计图；

图2为本发明中IgH基因重排检测的PCR扩增引物系统中各引物配置的统计图；

图3为诱发淋巴瘤的IgH基因重排检测的毛细管电泳峰图；

图4为PCR扩增诱发淋巴瘤的IgH基因片段的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

为了便于本领域技术人员的理解，下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，实施例提及的内容并非对本发明的限定。

一种鉴定EB病毒对淋巴瘤的诱发性的方法，包括以下步骤：

第1步，建立EB病毒诱发正常人淋巴细胞发生肿瘤的动物模型及从上述动物模型中获取肿瘤组织：

1.1.NOD/SCID小鼠的准备；

本实验所用NOD/SCID小鼠为非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠，该品系小鼠B、T淋巴细胞功能缺失，NK细胞活性低下。

将3-4周龄的NOD/SCID小鼠在SPF级环境中单只分笼饲养5-10天，将用于饲养所述NOD/SCID小鼠的饮用水、垫料、笼具均经高压蒸汽灭菌，饲养期间，给所述NOD/SCID小鼠投放全价鼠饲料，让其自由进食及饮水。

1.2.人淋巴细胞的准备；

本实验中所用的人淋巴细胞分别从6名健康献血员外周静脉血分离获得，每1名献血员采血300-400 ml。

从健康献血员的外周静脉中采血，从采集到的外周静脉血中分离出PBL，并用免疫酶标方法检测献血者血清中EB病毒壳抗原VCA-IgG和VCA-IgA的抗体滴度。

1.3.EB病毒的准备；

体外培养B_95-8细胞，待细胞进入对数生长期后调整细胞浓度至10^6-7个/ml，再将其置于温度37℃，二氧化碳浓度为5％的培养箱中饥饿7-10天，然后收集培养液，并将收集到的培养液在4℃环境下离心30 min，离心速度为4000 rpm/min，离心完成后吸取全部上清液，最后将所述上清液经0.45 um 微孔滤膜过滤后置于-80℃低温冰箱中保存备用。

1.4.构建 hu-PBL/SCID嵌合体小鼠；

从献血员新鲜静脉血中分离出外周血淋巴细胞（PBL），在无菌条件下给每只NOD/SCID小鼠腹腔注射人PBL悬液1 ml，上述1 ml的人PBL悬液中含有（8-10）×10⁷ 个淋巴细胞，每1名献血员的外周血淋巴细胞接种3-4只NOD/SCID小鼠。

1.5.EB病毒注射；

对于接受VCA-IgG和VCA-IgA均为阳性的献血员的淋巴细胞移植的NOD/SCID小鼠，不再给其注射EB病毒悬液，对于接受VCA-IgA为阴性的献血员的淋巴细胞移植的NOD/SCID小鼠，在该NOD/SCID小鼠接受淋巴细胞移植后第三天，往该NOD/SCID小鼠腹腔注射0.4 ml由步骤1.3得到的EB病毒悬液。

1.6.肿瘤组织的获取；

定期观察NOD/SCID小鼠的饮食与活动状况，小鼠在PBL接种后135天时处死，对实验小鼠进行详细的解剖。检查小鼠胸腹腔、纵隔和主要脏器，观察肿瘤的形状、大小、颜色、质地等情况，取部分肿瘤组织，用液氮冻存，其余肿瘤组织用10%福尔马林固定备用。在本步骤中，人淋巴细胞移植在NOD/SCID小鼠体内成瘤具体情况见附图1所示。

需要说明的是，在本步骤中，对处死小鼠的具体时间并无特别要求，只要此时小鼠体内的肿瘤组织已经形成，能够从处死后的小鼠体内获取到实验所需的肿瘤组织即可。

第2步，鉴定步骤1.6中获取的诱发性肿瘤的诱发源及该诱发性肿瘤的基因特性：

2.1. 肿瘤组织病理学检查及免疫组织化学染色；

取步骤1.6中已固定的诱发性肿瘤标本，石蜡包埋切片，HE染色，在光学显微镜下进行组织学观察，确诊病变情况，免疫组织化学染色采用链霉菌抗生物素蛋白－过氧化酶法，检测抗原包括：

人类白细胞共同抗原：LCA；

B细胞标记：CD20、CD79a；

T细胞标记：CD3、CD45RO。

在本步骤中，对NOD/SCID小鼠体内诱发性肿瘤进行病理检查时，光学显微镜下观察肿瘤细胞体积较大，呈浆母细胞样淋巴细胞、中心母细胞和免疫母细胞样形态；抗原检测结果显示LCA阳性，B细胞标记阳性，T细胞标记阴性。有上述结果可知，本实验过程中产生的诱发性肿瘤其病理学特征与临床上弥漫性大B细胞淋巴瘤的病理学特征相符合。

2.2. 原位分子杂交检测肿瘤组织中EBER。

EBER原位分子杂交检测结果显示几乎所有肿瘤细胞核都呈阳性棕褐色，而荷瘤小鼠组织及肿瘤邻近的宿主脏器细胞均为阴性，由上述结果可以得出以下提示：肿瘤细胞存在EB病毒编码的小分子RNA（EBER）。

2.3. 实时定量PCR检测肿瘤组织中LMP-1的表达；

以GADPH基因为内参，用实时荧光定量PCR方法检测并比较移植前正常淋巴细胞与诱发性肿瘤组织中EB病毒LMP-1的表达差异。

该步骤的实验结果显示在诱发性肿瘤组织中LMP-1的表达比在移植前的正常人淋巴细胞中明显增加。

需要说明的是，在本实施例中，为提高实验的准确性及成功率，可以将每例实时荧光定量PCR实验重复3次。

至此，对于本领域普通技术人员来说，结合上述步骤2.2和步骤2.3的实验结果可以得出以下结论：诱发性肿瘤组织中确有EB病毒感染存在。

2.4. PCR扩增检测人特异性Alu序列；

提取诱发性肿瘤组织的DNA，应用PCR方法扩增221 bp的人特异性Alu序列，PCR反应方式为：

2.4.1.先95℃预变性5 min；

2.4.2.再经94℃变性1 min、57℃退火1 min、72℃延伸1 min；

对上述步骤2.4.2循环30次，再72℃延伸5 min，最后将PCR反应产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳观察，用凝胶成像系统成像。

在本步骤中，成像结果显示6例诱发瘤均有221 bp的Alu序列扩增条带，与阳性对照一致，由此可以确定，hu-PBL/SCID嵌合小鼠体内诱发性肿瘤是人源性的，而非鼠源性。

2.5. PCR分析诱发性肿瘤组织的IgH基因重排；

石蜡包埋肿瘤组织切片至6 um厚，在本具体实施例中，每个组织块切取12张连续组织切片，然后依照DNA FFPE Tissue Kit 操作步骤，提取肿瘤组织切片中的基因组DNA，接着以临床病理学确诊为淋巴瘤的组织标本作为单克隆对照，以反应性增生的淋巴结标本作为多克隆对照，采用BIOMED-2引物系统及PCR仪扩增人免疫球蛋白重链（IgH）基因片段，PCR反应方式为：

2.5.1.先95℃预变性7 min；

2.5.2.再95℃ 变性45s、60℃ 退火45s、72℃ 延伸90s；

对上述步骤2.5.2循环40次，再72℃ 延伸10 min，得到PCR产物；

2.5.3.将经步骤2.5.2得到的PCR产物的一部分用毛细管电泳分析仪精确作图；

2.5.4.将经步骤2.5.2得到的PCR产物的另一部分进行琼脂糖凝胶电泳观察，用凝胶成像系统成像。

需要说明的是，本实施例提及的“BIOMED-2引物系统”及该引物系统的碱基序列在期刊Leukemia, 2003,17(12):2257-317，第2270页Figure.4b 和2274页Figure.5a中有详细记载，为简便表述，在此不再赘述，上述参考文献的作者为：van Dongen JJ, LangerakAW, Bruggemann M,et al.，文章名称为：Design and standardization of PCR primersand protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor generecombinations in suspect lymphoproliferations: report of the BIOMED-2Concerted Action BMH4-CT98-3936；本实施例用到的PCR仪为美国Applied Biosystems公司生产的型号为PE 9700的PCR仪。

在本步骤中，PCR反应优选为分5管进行，分别标记为A、B、C、D、E，相应的引物配制见附图2所示。

在本步骤中，PCR产物经毛细管电泳分析仪精确作图结果显示, 6例诱发瘤均检测到单克隆的峰，表明这些诱发瘤都是单克隆增殖。为简化表示，本实施例只通过附图3展示了1例诱发瘤PCR扩增IgH的FR1-JH区间327.28bp处（Tube A）检测到单克隆的扩增产物峰。

需要强调的是，在附图3中，横坐标代表各目的引物PCR扩增产物的大小（bp），纵坐标代表各个扩增产物的相对荧光信号强度。Tube A在327.28 bp处显示出一条特异性扩增峰。Control（对照）呈现不规则分布的多个扩增峰。

在本步骤中，本实施例选择了6例诱发性肿瘤的IgH基因的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，最终的电泳照片上都可观察到清晰的单一条带，因而证实上述诱发瘤皆为单克隆增生的肿瘤。为简化表述，本实施例只通过附图4展示了1例诱发淋巴瘤的IgH基因片段的琼脂糖凝胶电泳照片，如附图4所示，A泳道在300bp附近可见清晰的单一条带（与附图3中Tube A在327.28 bp处显示出一条特异性扩增峰相对应）。

综合以上检测结果，本领域技术人员可以确定，在hu-PBL /SCID嵌合小鼠体内产生的EB病毒感染相关淋巴瘤，不是多克隆的淋巴细胞增生形成的肿块，而是单克隆的肿瘤。由此，通过上述鉴定步骤可以确定EB病毒的感染对淋巴瘤的产生具有诱发性。

上述实施方式中提供的鉴定EB病毒对淋巴瘤的诱发性的方法通过构建人源化NOD/SCID小鼠，在hu-PBL /SCID嵌合小鼠体内成功建立EB病毒诱导淋巴瘤的实验动物模型，并且创造性地运用IgH基因重排检测方法，鉴定了该诱发瘤的单克隆性，从而有力排除以往因不明确诱发瘤性质而给生物医学及临床研究带来的干扰，客服了现有的鉴定方法结果不可靠、可信度低的缺陷，本发明提供的鉴定方法程序严谨，经该方法得出的鉴定结果准确、可靠、可信度极高。

最后需要强调的是，在以上实施例中，鉴定过程中的样本数量并非是唯一固定的，之所以选择上述数量的样本是出于保证鉴定实验的成功率（避免因人为操作原因导致实验失败）及操作方便的考虑，实际应用时可以根据需要设定不同的样本数量，本发明提供的鉴定方法对于样本的具体数量并无特别要求。

上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本技术方案构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。

最后，应该强调的是，为了让本领域普通技术人员更方便地理解本发明相对于现有技术的改进之处，本发明的一些描述已经被简化，并且为了清楚起见，本申请文件还省略了一些其它元素，本领域普通技术人员应该意识到这些省略的元素也可构成本发明的内容。

Claims (1)

1.一种鉴定EB病毒对淋巴瘤的诱发性的方法，包括以下步骤：

第1步，建立EB病毒诱发正常人淋巴细胞发生肿瘤的动物模型及从所述动物模型中获取肿瘤组织：

1.1.NOD/SCID小鼠的准备；

将3-4周龄的NOD/SCID小鼠在SPF级环境中单只分笼饲养5-10天，将用于饲养所述NOD/SCID小鼠的饮用水、垫料、笼具均经高压蒸汽灭菌，饲养期间，给所述NOD/SCID小鼠投放全价鼠饲料，让其自由进食及饮水；

1.2.人淋巴细胞的准备；

从健康献血员的外周静脉中采血，从采集到的外周静脉血中分离出PBL，并用免疫酶标方法检测献血者血清中EB病毒壳抗原VCA-IgG和VCA-IgA的抗体滴度；

1.3.EB病毒的准备；

体外培养B95-8细胞，待细胞进入对数生长期后调整细胞浓度至10^6-7个/ml，再将其置于温度37℃，二氧化碳浓度为5％的培养箱中饥饿7-10天，然后收集培养液，并将收集到的培养液在4℃环境下离心30min，离心速度为4000rpm/min，离心完成后吸取全部上清液，最后将所述上清液经0.45um微孔滤膜过滤后置于-80℃低温冰箱中保存备用；

1.4.构建hu-PBL/SCID嵌合体小鼠；

在无菌条件下给每只NOD/SCID小鼠腹腔注射PBL含量为8×10⁷至10×10⁷个/ml的人PBL悬液1ml，剩余PBL悬液留存备用；

1.5.EB病毒注射；

对于接受VCA-IgG和VCA-IgA均为阳性的献血员的淋巴细胞移植的NOD/SCID小鼠，不再给其注射EB病毒悬液，对于接受VCA-IgA为阴性的献血员的淋巴细胞移植的NOD/SCID小鼠，在该NOD/SCID小鼠接受淋巴细胞移植后第三天，往该NOD/SCID小鼠腹腔注射0.4ml由步骤1.3得到的EB病毒悬液；

1.6.肿瘤组织的获取；

将步骤1.5中接受EB病毒感染后的NOD/SCID小鼠处死，从处死后的NOD/SCID小鼠体内取出诱发性肿瘤组织，一部分用液氮冻存，其余的用10％福尔马林固定；

第2步，鉴定步骤1.6中获取的诱发性肿瘤的诱发源及该诱发性肿瘤的基因特性：

2.1.肿瘤组织病理学检查及免疫组织化学染色；

取步骤1.6中已固定的诱发性肿瘤标本，石蜡包埋切片，HE染色，在光学显微镜下进行组织学观察，确诊病变情况，免疫组织化学染色采用链霉菌抗生物素蛋白－过氧化酶法，检测抗原包括：

人类白细胞共同抗原：LCA；

B细胞标记：CD20、CD79a；

T细胞标记：CD3、CD45RO；

2.2.原位分子杂交检测肿瘤组织中EBER；

2.3.实时定量PCR检测肿瘤组织中LMP-1的表达；

以GADPH基因为内参，用实时荧光定量PCR方法检测并比较移植前正常淋巴细胞与诱发性肿瘤组织中EB病毒LMP-1的表达差异；

2.4.PCR扩增检测人特异性Alu序列；

提取诱发性肿瘤组织的DNA，应用PCR方法扩增221bp的人特异性Alu序列，PCR反应方式为：

2.4.1.先95℃预变性5min；

2.4.2.再经94℃变性1min、57℃退火1min、72℃延伸1min，循环30次，再72℃延伸5min，最后将PCR反应产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳观察，用凝胶成像系统成像；

2.5.PCR分析诱发性肿瘤组织的IgH基因重排；

石蜡包埋肿瘤组织切片至6um厚，依照DNA FFPE Tissue Kit操作步骤，提取肿瘤组织切片中的基因组DNA，接着以临床病理学确诊为淋巴瘤的组织标本作为单克隆对照，以反应性增生的淋巴结标本作为多克隆对照，采用BIOMED-2引物系统及PCR仪扩增人免疫球蛋白重链基因片段，PCR反应方式为：

2.5.1.先95℃预变性7min；

2.5.2.再95℃变性45s、60℃退火45s、72℃延伸90s，循环40次，再72℃延伸10min，得到PCR产物；

2.5.3.将经步骤2.5.2得到的PCR产物的一部分用毛细管电泳分析仪精确作图；

2.5.4.将经步骤2.5.2得到的PCR产物的另一部分进行琼脂糖凝胶电泳观察，用凝胶成像系统成像。