WO2004050886A1 - Ｅｂウイルスベクターのためのパッケージング細胞システム - Google Patents

Ｅｂウイルスベクターのためのパッケージング細胞システム Download PDF

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WO2004050886A1
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cells
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Kenzo Takada
Hironori Yoshiyama
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    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16211—Lymphocryptovirus, e.g. human herpesvirus 4, Epstein-Barr Virus
    • C12N2710/16241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/16243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an EB virus vector and a packaging cell system for use in the method.
  • Epstein-Barr virus (hereinafter referred to as “EB virus”) is a kind of herpes virus and has the ability to infect human B lymphocytes and promote their proliferation.
  • EB virus vectors are 1) more stable in cells for long periods of time compared to other virus-based vectors currently in use; 2) can incorporate large foreign genes of 10 Okb or more; 3) Genes can be transfected into B lymphocytes in the stationary phase, especially primary B lymphocytes in primary culture; 4) Genes can be transfected into B lymphocytes, which are antigen-presenting cells; 5) Genes have been transfected B lymphocytes can be expanded in vitro; 6)
  • the use of a system for producing recombinant virus in E. coli makes vector preparation much easier, and has many advantages. I have.
  • Akata cells As EB virus-producing cell lines, Akata cells, B95-8 cells, P3HR-1 cells and the like are known. Among them, Akata cells have approximately 20 copies of the circular EB virus genome in the nucleus, and can induce infectious EB virus production by adding an anti-human immunoglobulin antibody to a liquid medium. It is a cell line suitable for production (Tak ad aK, Int J Cancer 33, 27-32 (1984); Tak ad aK and Ono Y, J Virol 63, 445-449 (1989)).
  • EB virus-negative Ak ata cells Clones from which the EB virus genome has been lost (hereinafter referred to as "EB virus-negative Ak ata cells”) obtained by long-term passage of Aka ta cells are re-infected with EB virus.
  • the virus-producing ability by the treatment with the anti-human immunoglobulin antibody can be shown again (Japanese Patent Laid-Open No. 7-115966).
  • Ak ata cells having only the modified EB virus genome can be produced.
  • These cells have the ability to produce large amounts of recombinant EB virus by treatment with an anti-human immunoglobulin antibody (Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-009971).
  • the EB virus vector production is induced by exogenously introducing and expressing the EB virus early gene BZLF1 and the amplicon plasmid simultaneously into these 293 cells.
  • this system is not suitable for mass production of EB virus vector because the method for producing EB virus vector is complicated and the titer of the produced EB virus vector is very low.
  • a system for efficiently introducing a foreign gene into cells using the EB virus coat (Delecluse HJ, HammerscshmidtW, JClin Pathol: Mo 1 Pathol 2000) 53: 270-279, etc.) and a method of packaging a gene vector DNA containing no helper virus (JP-A-11-221073).
  • An object of the present invention is to provide a system capable of efficiently and efficiently producing an EB virus vector having no virus replication ability. Disclosure of the invention
  • the method of the present invention comprises:
  • the EB virus packaging signal is deleted by homologous recombination by introducing the homologous recombination gene fragment from which the packaging signal has been deleted into EB virus-positive Ak ata cells, and
  • the method of the present invention comprises:
  • An EB virus genome lacking a packaging signal is prepared using Escherichia coli, the EB virus genome is introduced into EB virus-positive Akata cells, and the EB virus genome lacking a packaging signal is retained. Cloning packaging cells that do not carry the wild-type Epstein-Barr virus genome with the signaling
  • the method of the present invention comprises:
  • the present invention relates to an amplicon plasmid-introduced Ak ata packaging for producing an EB virus vector having no viral replication ability.
  • a method for producing a cell includes a step of introducing an amplicon plasmid having a packaging signal but not having a virus replication ability into a packaging cell obtained by any of the methods described above.
  • the present invention provides an EB virus enveloped in a virus coat by inducing lytic infection of Akta packaging cells into which the amplicon plasmid produced by the above-described method of the present invention has been introduced.
  • a method for producing an EB virus vector having no virus replication ability, comprising releasing a vector comprising releasing a vector.
  • the present invention provides a method for releasing an EB virus vector wrapped in a viral envelope by inducing lytic infection of an amplicon plasmid-introduced Akata packaging cell produced by the above-described method of the present invention. And infecting B lymphocytes with the obtained EB virus vector.
  • EB virus vectors having no virus replication ability can be easily and efficiently produced by inducing lytic infection of amplicon plasmid-introduced packaging cells prepared by introducing amplicon plasmids into packaging cells. Can be. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 shows a method for producing a packaging cell of the present invention.
  • FIG. 2 shows the production of the EB virus vector by the Akata packaging cell introduced with the amplicon plasmid.
  • FIG. 3 shows the cloning of the packaging signal gene (TR) and the construction of a targeting plasmid to disrupt the packaging signal.
  • FIG. 4 shows the positions of primers used for confirmation of homologous gene recombination.
  • FIG. 5 shows the positions of primers used for gene amplification to confirm the loss of wild-type EB virus.
  • FIG. 6 shows an example of the structure of a TR deletion present in an amplicon plasmid-introduced packaging cell.
  • FIG. 7 shows EB virus vector production by amplicon plasmid-transfected packaging cells.
  • FIG. 8 shows the production of a virus that cannot replicate the virus genome and the production of an EB virus vector that cannot replicate the virus genome using packaging cells into which the virus genome has been introduced.
  • FIG. 9 shows the construction of a plasmid for overnight get to disrupt and delete the BALF2 gene and the probe used for detection of the homologous recombination virus.
  • FIG. 10 shows the positions of primers used for gene amplification to confirm that the BALF2 gene deleted virus was produced by homologous recombination.
  • the present invention provides a method for producing a packaging cell used for producing a system for producing an EB virus vector having no virus replication ability.
  • a “packaging cell” is a cell that lacks a packaging signal but has an EB virus genomic that is capable of expressing the viral proteins necessary to make virus particles.
  • a packaging signal is a cis-acting sequence necessary for a gene to be packaged in an EB virus particle, and is also called TR (Terminal 1 Repeat).
  • TR Terminal 1 Repeat
  • “deleted” means that all of the packaging signal has been deleted, and that a part of the packaging signal has been deleted or mutated. This includes both cases of loss of function.
  • EB virus vector is meant a virus particle that has the ability to infect human B lymphocytes over the EB virus envelope.
  • the EB virus vector may contain a foreign gene.
  • EB virus vector that does not have the ability to replicate virus is a virus that infects host cells and can replicate the genome in those cells, but when the cells are induced to undergo lytic infection, the virus coats. A vector that is not released as a virus particle in a
  • the Akata cells used in the present invention are known human lymphocytes and have approximately 20 cyclic EB wills in the nucleus.
  • a virus can be produced (Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 8-009971).
  • Akata cells can isolate clones in which the EB virus genome has been eliminated by long-term passage (Japanese Patent Laid-Open Publication No. 7-115966), the same method holds only the recombinant EB virus genome, and the wild-type EB virus genome Dropped cell clones can be isolated.
  • Ak ata cells can produce large amounts of EB virus by treatment with an anti-pytoimmunoglobulin antibody (Takada K, Int J Cancer 33 ,: 27-32 (1984); Takada K and ⁇ no Y, JVirol 63, 445-449 (1989)).
  • FIG. 1 A schematic of a first embodiment of the method of the invention is shown in FIG.
  • the packaging signal of the EB virus is deleted by homologous recombination in the EB virus positive Ak ata cells.
  • This step is performed by introducing a gene fragment for homologous recombination having a region flanking the packaging signal and lacking the packaging signal into EB virus-positive Akata cells.
  • the gene fragment for homologous recombination preferably has a length of 3 Okb or less, more preferably 2 Okb or less.
  • Such gene fragments can be generated in E. coli systems based on known EB virus gene sequences.
  • the gene can be introduced by an electroporation method, a calcium phosphate method, a lipofection method, a gene gun method, or the like.
  • an Akata cell clone having both the Akata EB virus genomic genome and the wild-type EB virus genome that lacks the packaging signal is isolated.
  • the neomycin resistance gene is used in FIG. 1 for selection of recombinant viruses, any selection technique that works in Akata cells may be used.
  • the isolated cell clone is treated with hydroxyperea and re-divided into cell clones, whereby the wild-type virus is shed and the packaging cells that retain only the virus that lacks the packaging signal are isolated. Can be. Cloning can also be performed by subculturing and limiting dilution without using hydroxyurea.
  • the step of deleting the packaging signal of the EB virus by homologous recombination comprises: introducing the EB virus DNA into an artificial E. coli chromosome, introducing the DNA into E. coli; Packaged by genetic modification This is performed by preparing an EB virus genome lacking the signaling signal and introducing it into EB virus-positive Akata cells. This is because EB virus-positive Ak ata cells have higher transduction efficiency of exogenous genes than EB virus-negative Akata cells and can grow stably.
  • a gene fragment for homologous recombination was prepared by inserting an E. coli artificial chromosome (BAC) vector fragment derived from pBe1oBAC11 (Genome Systems) into a gene fragment derived from the EB virus genome. This is introduced into Akata cells having a wild-type circular EB virus genome, and clones that have undergone homologous recombination are selected.
  • Escherichia coli is transformed with the genomic DNA prepared from this clone to obtain a plasmid containing BAC and EB virus genome derived from Akata cells.
  • any site of the EB virus genome on this plasmid can be deleted or mutated.
  • the BAC-EB virus DNA having the packaging signal thus deleted, which has been deleted, can be introduced into Akat cells to cause homologous recombination in the Akat cells.
  • the step of deleting the packaging signal of the EB virus by homologous recombination comprises introducing the EB virus DNA into an artificial E. coli chromosome, introducing the EB virus DNA into E. coli, This is performed by creating an EB virus genome from which the packaging signal has been deleted by genetic recombination and introducing it into Akata cells that are EB virus negative and express EBNA1.
  • Aka ta cells expressing EB NA1 are transfected with EB virus-negative A kata cells using linear DNA linked to the EB NA1 gene and an appropriate antibiotic resistance gene, and then selected with this antibiotic. By doing so, it is possible to close.
  • the EBNA1 protein is an essential protein for the EB virus to be replicated and maintained as an episome in the cell nucleus, and it is considered that EBNA1-expressing Akata cells have a high efficiency of episomal formation.
  • the present invention also provides a packaging cell produced by the above method.
  • An amplicon plasmid introduced by introducing a foreign gene (amplicon) containing a packaging signal into the packaging cell of the present invention.
  • a foreign gene amplicon
  • the packaging cell of the present invention has a helper function for producing an EB virus vector containing a foreign gene and having no virus replication ability.
  • the present invention provides a method for producing an amplicon plasmid-introduced Akata cell for producing an EB virus vector having no virus replication ability.
  • the outline of this method is shown in FIG.
  • the amplicon plasmid can be introduced by an electroporation method, a calcium phosphate method, a lipofection method, a gene gun method, or the like.
  • Amplicon plasmid refers to a plasmid (circular DNA) containing a virus-derived gene but lacking virus-producing ability.
  • An amplicon plasmid is a circular DNA that contains a packaging signal and a viral origin of replication and lacks one or more genes encoding proteins essential for viral replication.
  • the amplicon plasmid has a gene for selection.
  • the amplicon plasmid has a packaging signal, an origin of replication in the EB virus latent infection phase, oriP, an origin of replication in the EB virus lytic infection induction phase, oriLyt, and EBNA1. Further, when the EB virus vector is used for introducing a foreign gene, the amplicon plasmid further has a desired foreign gene to be introduced.
  • the amplicon plasmid has a puromycin resistance gene as its primary function, and Amplicon plasmid-introduced Akata packaging cells in which amplicon has been introduced by puromycin are selected.
  • any selection technique that works with this cell may be used.
  • a selection marker different from the selection marker used for preparing the packaging cells is used.
  • the introduction of the amplicon plasmid into the packaging cells may also use a method by infection with a virus that cannot replicate the viral genome. The outline of this method is shown in FIG. In EB virus-positive A kata cells, a gene important for EB virus genome replication is deleted by homologous recombination. In FIG.
  • the hygromycin resistance gene is used for selection of the homologous recombinant virus.
  • Treatment of the isolated A kata cell clone with both the homologous recombinant virus and the wild-type virus with an anti-human immunoglobulin antibody allows the deleted EB virus gene product to be supplied from the wild-type virus and homologated. Both recombinant and wild-type viruses are produced.
  • the produced virus solution is used to infect packaging cells, and selected using the selection marker (neomycin) used to generate the packaging cells and the selection marker used to generate the virus that cannot replicate the viral genome (idalomycin).
  • TR (1) the amplicon plasmid containing only the EB virus gene lacking the packaging signal and the EB virus gene lacking the gene important for replication of the virus genome was introduced. Isolate kata packaging cells. The A-kata packaging cells containing the EB virus gene lacking the gene important for viral genome replication as an amplicon thus obtained are treated with an anti-human immunoglobulin antibody to obtain an EB virus. Only the amplicon plasmid with the virus coat is released as an EB virus vector.
  • the present invention also provides an Akata packaging cell having the introduced amplicon plasmid produced by the method described above.
  • the A kata packaging cell having the amplicon plasmid of the present invention has the ability to produce an amplicon plasmid DNA coated with an EB virus coat as an EB virus vector by treatment with an anti-human immunoglobulin antibody. .
  • the genome of EB virus is extended and replicated in the form of a rolling circle, but is not excised if the packaging signal is deleted, and therefore is not incorporated into the virus particle.
  • the gene of the 7 amplicon plasmid also elongates in a rolling cycle format, and the amplicon forms a concatemer, which is cleaved at the packaging signal, and has a size of about 170 kb, the size of the EB virus genome.
  • Packaged in size See Figure 7). That is, only the amplicon plasmid in which the EB virus coat is covered is released as the EB virus vector.
  • the A kata packaging cell having the amplicon plasmid produced by the method of the present invention can be used to convert an EB virus vector having no virus replication ability at a maximum efficiency of at least 1,000 times that of the conventional method. Produces and does not produce wild-type EB virus.
  • the present invention relates to an EB virus vector wrapped in a virus coat by inducing lytic infection of an amplicon plasmid-introduced Akata packaging cell produced by the above-described method of the present invention. And a method for producing an EB virus vector having no virus replication ability, which comprises releasing EB virus. Induction of lysis and infection of the Akata packaging cells into which the amplicon plasmid has been introduced can be easily performed by treatment with an anti-imnoglobulin antibody.
  • the present invention also provides an EB virus vector produced according to the above method.
  • This EB virus vector contains the amplicon plasmid in the EB virus particle and has the ability to infect and immortalize B lymphocytes, but does not have the ability to replicate itself as a virus particle. Therefore, a human antibody can be easily produced by infecting a B lymphocyte producing the desired antibody with the EB virus vector of the present invention, immortalizing it, and growing it in an in vitro mouth. That is, the present invention also provides a method for producing immortalized B lymphocytes using the EB virus vector of the present invention, and an immortalized B lymphocyte produced by the method of the present invention.
  • Example 1
  • the packaging signal of the Akata strain EB virus was disrupted based on the method of FIG.
  • the Bam-Nhet region of the 8 kb Akat strain EB virus was cloned into pUC119 to produce pUC119Net (Fig. 3a).
  • TR packaging signal
  • a neomycin resistance gene neo and red pigment gene (DsRed)
  • TR destroyed the gene disruption.
  • the plasmid pUCNhnetneRed was prepared (Fig. 3b), and this plasmid DNA was transfected into EB virus-positive Akata cells by electroporation.
  • ANC F1 and ANC R2 are primers designed outside the 5 'end and 3' end of the recombination site, respectively, and ANC R1 and ANC F 2 are primers designed inside neo r .
  • Figure 4 shows the approximate position and direction of each primer. If homologous recombination has occurred, a 5.3 kb DNA fragment is amplified by a primer pair of ANCF 1 and ANC R1, and a 10.3 kb DNA fragment is amplified by a primer pair of ANC F2 and ANC R2. DNA fragments are amplified. None is amplified if no homologous recombination has taken place. 12 clones in this way Confirmed that the EBV carried the homologous recombination EB virus.
  • TR (—) After culturing 119 cells, a clone retaining the EB virus genome, in a selection medium (50% EB virus-negative A kata cell culture supernatant, 0.35 mg Zml G418, 50 hydroxyrea) for 10 days Cultivation was further continued for 10 days except for hydroxyperia. Culture is performed by diluting the cells into a 96-well plate so that 0.5 cells are contained in each well, and the amplified clones are subjected to gene amplification using primer pairs designed outside the TR, and the wild-type band (2.
  • a selection medium 50% EB virus-negative A kata cell culture supernatant, 0.35 mg Zml G418, 50 hydroxyrea
  • an amplicon plasmid was prepared.
  • An amplicon plasmid must have a structure with a packaging signal (TR).
  • TR packaging signal
  • having the replication origin ori P at the EB virus latent infection stage and having the EBNA1 gene that activates ori P in trans is important for the maintenance of the plasmid in the transfected cells.
  • Having an origin of replication ⁇ ri Lyt is necessary for the production of an EB virus vector from amplicon plasmid-introduced packaging cells by stimulation with anti-human immunoglobulin.
  • Figure 6b shows the prepared amplicon plasmid.
  • the EB virus gene contains only EBNA-1, oriP, TR, and oriLit, and is used for selection of green fluorescent protein (GFP) gene and amplicon plasmid to be maintained in cells for overnight repo This is a 21 kb amplicon plasmid (pPs i) into which the puromycin resistance gene has been inserted.
  • GFP green fluorescent protein
  • the helper virus genome is extended and replicated in a mouth-to-ring cycle format, but is not excised because it lacks TR. Therefore, it is not incorporated into virus particles.
  • the gene of the amplicon plasmid Elongate in a ring cycle format, the amplicons form concatemers, are cut at the TR, and are packaged at a size of approximately 17 Okb, the size of the EB virus genome ( Figure 7). That is, EB virus having the gene of the amplicon plasmid is released.
  • Example 3 the gene of the amplicon plasmid —Elongate in a ring cycle format, the amplicons form concatemers, are cut at the TR, and are packaged at a size of approximately 17 Okb, the size of the EB virus genome ( Figure 7). That is, EB virus having the gene of the amplicon plasmid is released.
  • the amplicon plasmid pPSi thus prepared was transfected into a packaging cell by electroporation using 0.3 S gZml puromycin, 50% EB virus-negative Akata cell culture supernatant, and 0.35 mgZml G418. Selection culture was performed. The resulting 72 puromycin resistant clones were all GFP positive. One of the clones was treated with an anti-human immunoglobulin antibody, and it was confirmed that the capsid antigen (VCA), which is a constituent protein of the EB virus, was expressed, and that no wild-type virus was present in the supernatant. Furthermore, when the recombinant EB virus in the supernatant was infected to EB virus-negative Daudi cells, it was confirmed that nearly 20% of the cells were infected with the recombinant EB virus and expressed GFP.
  • VCA capsid antigen
  • the BALF2 gene encoding the EB virus single-stranded DNA binding protein of the AK virus strain EB virus was replaced with a hygromycin resistance gene to destroy and delete it, based on the method of FIG.
  • clone the 11,429 base pair EcoR I—Sa1I fragment of the EcoDet and Eco—J regions of the pUCl l ⁇ ; iAkata strain EB virus By removing the C1aI-EcoRV region and inserting and replacing a 1,853-base pair hygromycin resistance gene, a plasmid pUCl19EcoD—JHyg for gene disruption in which the BALF2 gene was disrupted was transformed. It was fabricated (Fig. 9a). A 7,807 base pair SacI-Bg1II fragment of this plasmid DNA was transfected into EB virus-positive AkAta cells by electroporation.
  • F 1 and R 2 are primers designed outside the 5 ′ end and 3 ′ end of the recombination site, respectively, and Hyg F and Hyg R are primers designed inside the hygromycin resistance gene, respectively.
  • Figure 10 shows the approximate position and direction of each primer. If homologous recombination has occurred, the F1 and HygR primer pair will amplify a 4,112 base pair DNA fragment, and the HygF and R2 primer pair will generate a 4,534 base pair DNA fragment. Amplified. If no homologous recombination has occurred, nothing is amplified. By this method, it was confirmed that two clones contained homologous recombinant EB virus.
  • the clone carrying the homologous recombination EB virus was treated with an anti-human immunoglobulin antibody to produce a virus in which both the recombinant type and the wild type were mixed.
  • the produced virus solution was used to infect the packaging cells prepared in Example 1, and the cells were cloned in the presence of neomycin and hygromycin to obtain the EB virus genome lacking the BALF2 gene and TR as a helper.
  • Ak ata packaging cells containing only the EB virus genome and no wild-type virus genome were isolated.
  • the Ak ata packaging cells were treated with an anti-human immunoglobulin antibody, and an EB virus vector consisting of only the BALF 2 gene-deficient EB virus was recovered.

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Abstract

パッケージングシグナルを欠失したＥＢウイルス遺伝子を保持するがパッケージングシグナルを有する野生型ＥＢウイルス遺伝子を保持しないパッケージング細胞を用意し、この細胞に、パッケージングシグナルを有するがウイルス複製能力を持たないアンプリコンプラスミドを導入してパッケージング細胞を作製する。このアンプリコン導入パッケージング細胞を溶解感染誘導すると、ウイルス複製能力を持たないＥＢウイルスベクターが産生される。

Description

明細書
EBウィルスベクタ一のためのパッケージング細胞システム 技術分野
本発明は、 EBウィルスベクタ一を産生する方法ならびに該方法に用いるため のパッケ一ジング細胞システムに関する。 背景技術
細胞への遺伝子導入において遺伝子を標的細胞へ運ぶ働きをするものを 「べク 夕一」 という。 ウィルス由来のベクターは、 安全のため可能な限り元になる野生 型ウィルスの遺伝子を除いたものが良い。 ェプスタイン 'バ一 （Ep s t e i n -B a r r) ウィルス （以下 「EBウィルス」 という） は、 ヘルぺスウィルスの 一種であり、 ヒト Bリンパ球に感染してその増殖を促進する能力を有する。 EB ウィルスベクタ一は現在使用されている他のウィルスに基づくベクターと比較し て、 1) 細胞内に長期間安定して維持される； 2) 10 Okb以上の大きな外来 遺伝子を組み込むことができる； 3) 静止期の Bリンパ球、 特に、 初代培養 Bリ ンパ球に高率に遺伝子を導入できる； 4) 抗原提示細胞である Bリンパ球に遺伝 子を導入発現できる； 5) 遺伝子導入された Bリンパ球を生体外で増殖させるこ とができる； 6) 大腸菌の中で組換えウィルスを作製するシステムを使用すれば、 ベクターの調整が大変容易になる、 などの多くの利点を有している。
EBウィルスを産生する細胞株としては、 Aka t a細胞、 B95— 8細胞、 P 3 HR— 1細胞などが知られている。 このうち Aka t a細胞は核内におよそ 20コピーの環状の EBウィルスゲノムを持っており、 抗ヒトイムノグロブリン 抗体を液体培地中に加えることにより感染性 E Bウィルス産生を誘導できるため、 EBウィルスの大量生産に適した細胞株である （Tak ad a K, I n t J Canc e r 33, 27-32 (1984) ； Tak ad a K and O no Y, J V i r o l 63, 445— 449 (1989) ) 。 Aka t a 細胞の長期継代により得られた EBウィルスゲノムが脱落したクローン （以下 「EBウィルス陰性 Ak a t a細胞」 という。 ） は、 EBウィルスを再感染する ことによって、 抗ヒトイムノグロプリン抗体処理によるウィルス産生能を再び示 すことができる （特開平 7— 115966) 。 また、 Ak a t a細胞内で薬剤マ 一力一遺伝子を持つ相同組換え EBウィルスを作製し、 EBウィルス産生を誘導 し、 EBウィルス陰性 Aka t a細胞に再感染させて薬剤選択を行うことにより、 組換え EBウィルスゲノムのみを持つ Ak a t a細胞を作製することができる。 この細胞は抗ヒトイムノグロプリン抗体処理により、 組換え E Bウイルスを大量 に産生する能力を有する （特開平 8— 009971) 。
EBウィルス B 95— 8株の環状 EBウィルスゲノムを大腸菌人工染色体に組 み込んだ形で大腸菌内で増殖させる方法が報告されている （米国特許第 6， 29 1， 246号） 。 このシステムを用いることにより、 EBウィルスの複製増殖に 必須の遺伝子であっても大腸菌内での相同組換えによって効率良く変異を導入で きる。 また、 ドイツの研究グループは大腸菌内でパッケージングシグナルを除去 した EBウィルスゲノムを胎児の腎臓由来の 293細胞に導入し、 EBウィルス ベクターの産生のためのパッケージング細胞として使用する方法を開示している (De l e c l u s e HJ， P i c h D, Hi 1 s ende gen T, B a um C, H a mm e r s chmi d t W. P r o c Na t l A c a d S c i USA 96， 5188— 5193 (1999) ) 。 この 293細 胞に、 EBウィルス初期遺伝子 BZLF 1とアンプリコンプラスミドを同時に外 来性に導入し、 発現させることで E Bウィルスベクター産生を誘導するものであ る。 しかし、 このシステムは EBウィルスベクター産生のための手段が煩雑であ り、 しかも産生された EBウィルスベクターの力価が大変低いため、 EBウィル スべク夕一の大量生産には適していない。
また、 EBウィルスの外被を用いて細胞に外来遺伝子を効率良く導入するため のシステム （De l e c l u s e H. J , H amme r s c hm i d t W, J C l i n Pa t ho l ： Mo 1 Pa t ho l 2000 ; 53 : 270 一 279等） 、 およびへルパ一ウィルスを含まない遺伝子べクタ一 DNAのパッ ケージング方法 （特開平 11— 221073) が報告されている。
本発明の目的は、 ウィルス複製能力を持たない EBウィルスベクターを効率良 く大量に産生できるシステムを提供することである。 発明の開示
ウィルス複製能力を持たない EBウィルスベクターを産生する系を作製するた めに用いられるパッケージング細胞を製造する方法を提供する。
第 1の態様においては、 本発明の方法は、
パッケージングシグナルが欠失した相同組換え用遺伝子断片を EBウィルス陽性 Ak a t a細胞に導入することにより、 EBウィルスのパッケージングシグナル を相同組換えにより欠失させ、 そして
パッケージングシグナルを欠失した E Bウイルスゲノムを保持するがパッケージ ングシグナルを有する野生型 EBウィルスゲノムを保持しないパッケージング細 胞をクロ一ニングする、
の各工程を含む。
第' 2の態様においては、 本発明の方法は、
パッケージングシグナルが欠失した EBウィルスゲノムを大腸菌を用いて作製し、 該 EBウィルスゲノムを EBウィルス陽性 A k a t a細胞に導入し、 そして パッケージングシグナルを欠失した EBウィルスゲノムを保持するがパッケ一ジ ングシグナルを有する野生型 E Bウイルスゲノムを保持しないパッケージング細 胞をクローニングする、
の各工程を含む。
第 3の態様においては、 本発明の方法は、
パッケージングシグナルが欠失した EBウィルスゲノムを大腸菌を用いて作製し、 該 EBウィルスゲノムを EBウィルス陰性であって EBNA1を発現する Ak a t a細胞に導入し、 そして
パッケ一ジングシグナルを欠失した EBウイルスゲノムを保持するがパッケージ ングシグナルを有する野生型 E Bウイルスゲノムを保持しないパッケージング細 胞をクローニングする、
の各工程を含む。
別の観点においては、 本発明は、 ウィルス複製能力を持たない EBウィルスべ クタ一を産生するためのアンプリコンプラスミド導入 Ak a t aパッケージング 細胞を製造する方法を提供する。 該方法は、 上述のいずれかの方法により得られ たパッケージング細胞に、 パッケージングシグナルを有するがウィルス複製能力 を持たないアンプリコンプラスミドを導入する工程を含む。
さらに別の観点においては、 本発明は、 上述の本発明の方法により製造される アンプリコンプラスミドを導入した A k t aパッケージング細胞を溶解感染誘 導することにより、 ウィルス外被に包まれた E Bウィルスベクターを放出させる ことを含む、 ウイルス複製能力を持たない E Bウィルスべク夕一を産生する方法 を提供する。
さらに別の観点においては、 本発明は、 上述の本発明の方法により製造される アンプリコンプラスミド導入 A k a t aパッケージング細胞を溶解感染誘導する ことにより、 ウィルス外被に包まれた E Bウィルスベクターを放出させ、 そして 得られた E Bウィルスベクターを Bリンパ球に感染させることを含む、 不死ィ匕 B リンパ球を製造する方法を提供する。
本発明にしたがって、 パッケージング細胞にアンプリコンプラスミドを導入し て作製したアンプリコンプラスミド導入パッケージング細胞を溶解感染誘導する ことにより、 ウィルス複製能力を持たない E Bウィルスベクターを簡便かつ効率 よく産生することができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明のパッケージング細胞の作製方法を示す。
図 2は、 アンプリコンプラスミド導入 A k a t aパッケージング細胞による E Bウィルスベクタ一の産生を示す。
図 3は、 パッケージングシグナル遺伝子 （T R) のクローニングとパッケージ ングシグナルを破壊するためのターゲット用のプラスミドの構築を示す。
図 4は、 相同的遺伝子組換えの確認に用いたプライマーの位置を示す。
図 5は、 野生型 E Bウィルス脱落確認のための遺伝子増幅に用いたプライマ一 の位置を示す。
図 6は、 アンプリコンプラスミド導入パッケージング細胞中に存在する TR欠 ドの構造の一例を示す。 図 7は、 アンプリコンプラスミド導入パッケージング細胞による EBウィルス ベクターの産生を示す。
図 8は、 ウィルスゲノムを複製できないウィルスの作製と、 該ウィルスゲノム を感染導入したパッケージング細胞を用いたウィルスゲノムを複製できない EB ウィルスベクタ一の産生を示す。
図 9は、 BALF 2遺伝子を破壊欠失するための夕一ゲット用のプラスミドの 構築と相同組換えウィルスの検出に用いたプローブを示す。
図 10は、 相同組換えにより BALF 2遺伝子欠失ウィルスが作製されたこと を確認するための遺伝子増幅に用いたプライマーの位置を示す。 発明の詳細な説明
本発明は、 ウィルス複製能力を持たない EBウィルスベクターを産生する系を 作製するために用いられるパッケージング細胞を製造する方法を提供する。
「パッケージング細胞」 とは、 パッケージングシグナルを欠失するが、 ウィル ス粒子を作るのに必要なウィルス蛋白質を発現することができる EBウィルスゲ ノムを有する細胞である。 パッケージングシグナルとは、 遺伝子が EBウィルス 粒子中にパッケージされるために必要なシス作用配列であり、 TR (Te rmi n a 1 Re pe a t) とも称される。 ここで、 「欠失している」 とは、 パッケ —ジングシグナルの全部が欠失している場合、 およびパッケ一ジングシグナルの 一部が欠失または変異していることによりパッケージングシグナルとしての機能 を失っている場合の両方を含む。
「EBウィルスベクター」 とは、 EBウィルスの外被をまとい、 ヒト Bリンパ 球に感染する能力を有するウィルス粒子を意味する。 EBウィルスベクターは外 来遺伝子を含んでいてもよい。 「ウィルス複製能力を持たない EBウィルスべク 夕一」 とは、 宿主細胞に感染し、 その細胞中でゲノムの複製をすることはできる が、 その細胞を溶解感染誘導したときに、 ウィルス外被をまとったウィルス粒子 として放出されることがないベクタ一を意味する。
本発明で用いる Aka t a細胞は既知のヒトリンパ球であり、 環状 EBウィル ,を核内におよそ 20個保有しており、 相同組換え法により組換え EBゥ ィルスを作製することができる （特開平 8— 009971) 。 また、 Aka t a 細胞は長期継代により E Bウィルスゲノムが脱落したクローンを分離できる （特 開平 7— 115966) ことより、 同様の方法により組換え EBウィルスゲノム のみを保持し、 野生型 EBウィルスゲノムは脱落した細胞クローンを分離できる。 さらに、 Ak a t a細胞は抗ピトイムノグロブリン抗体で処理することにより、 大量の EBウィルスを産生することができる （T a k a d a K, I n t J C an c e r 33， ： 27 - 32 (1984) ； T a k a d a K and 〇no Y， J V i r o l 63， 445-449 (1989) ) 。
本発明の方法の第 1の態様の概略が図 1に示される。 まず、 EBウィルス陽性 Ak a t a細胞中において EBウィルスのパッケージングシグナルを相同組換え により欠失させる。 この工程は、 パッケージングシグナルを挟む領域を有し、 か つパッケージングシグナルが欠失している相同組換え用遺伝子断片を EBウィル ス陽性 Aka t a細胞に導入することにより行われる。 相同組換え用遺伝子断片 は、 好ましくは 3 Okb以下の長さ、 より好ましくは 2 Okb以下の長さである。 このような遺伝子断片は、 既知の EBウィルス遺伝子配列に基づいて大腸菌系に おいて作成することができる。 遺伝子の導入は、 電気穿孔法、 リン酸カルシウム 法、 リポフエクシヨン法、 遺伝子銃法等により行うことができる。 次に、 薬剤耐 性を利用して、 パッケージングシグナルを欠失した Ak a t a株 EBウィルスゲ ノムと野生型 EBウィルスゲノムの両方を持つ Ak a t a細胞クローンを分離す る。 図 1においては、 組換えウィルスの選択にネオマイシン耐性遺伝子を使用し ているが、 Aka t a細胞で機能するどのような選択マ一力一を利用してもよい。 次に、 分離した細胞クローンをヒドロキシゥレアで処理し、 再び細胞クローンに 分けることにより、 野生型ウィルスが脱落し、 パッケージングシグナルを欠失し たウィルスのみを保持するパッケージング細胞を分離することができる。 ヒドロ キシゥレアを用いずに、 継代培養して限界希釈することによりクローニングする こともできる。
本発明の方法の第 2の態様においては、 EBウィルスのパッケージングシグナ ルを相同組換えにより欠失させる工程は、 EBウィルス DNAを大腸菌人工染色 体に組み込んで大腸菌に導入し、 大腸菌菌体内で遺伝子組換えによりパッケージ ングシグナルが欠失した E Bウィルスゲノムを作製し、 これを E Bウィルス陽性 Ak a t a細胞に導入することにより行う。 EBウィルス陽性 Ak a t a細胞は EBウィルス陰性 Aka t a細胞より外来性遺伝子の導入効率が高く、 かつ安定 に増殖することができるためである。
具体的には、 まず、 EBウィルスゲノム由来の遺伝子断片に pBe 1 oBAC 11 (Genome Sy s t ems社） 由来の大腸菌人工染色体 (BAC) ベ クタ一断片を挿入した相同組換え用遺伝子断片を作製し、 これを野生型の環状 E Bウィルスゲノムを持つ Ak a t a細胞に導入して、 相同組換えを起こしたクロ —ンを選択する。 次に、 このクロ一ンから調製したゲノム DNAで大腸菌をトラ ンスフォ一ムすることにより、 BACと Ak a t a細胞由来 EBウィルスゲノム とを含むプラスミドを得る。 大腸菌遺伝子組換え系においてこのプラスミド上の EBウィルスゲノムの任意の部位を欠失、 変異させることができる。 このように して作製したパッケージングシグナルを欠失させた B A C— E Bウィルス D N A を Aka t a細胞に導入して、 Aka t a細胞内で相同組換えを生じさせること ができる。
本発明の方法の第 3の態様においては、 EBウィルスのパッケージングシグナ ルを相同組換えにより欠失させる工程は、 E Bウィルス D N Aを大腸菌人工染色 体に組み込んで大腸菌に導入し、 大腸菌菌体内で遺伝子組換えによりパッケージ ングシグナルが欠失した EBウィルスゲノムを作製し、 これを EBウィルス陰性 であって EBNA1を発現する Ak a t a細胞に導入することにより行う。 EB NA1を発現する Aka t a細胞は、 E Bウィルス陰性 A k a t a細胞に、 EB NA 1遺伝子と適当な抗生物質耐性遺伝子とを連結した直鎖状 DNAをトランス フエクシヨンした後、 この抗生物質で選択を行うことによりクロ一ニングするこ とができる。 EBNA1蛋白質は EBウィルスが細胞核内においてェピゾームと して複製 ·維持されるために必須の蛋白質であり、 EBNA1を発現する Aka t a細胞ではェピゾーム形成の効率が高いと考えられる。
本発明はまた、 上述の方法により製造されるパッケージング細胞を提供する。 本発明のパッケージング細胞にパッケージングシグナルを含む外来遺伝子 （アン プリコン） を導入して作製したアンプリコンプラスミド導入 Aka t aパッケ一 ジング細胞において溶解感染誘導すると、 T R (―) E Bウィルスゲノムに由来 する E Bウィルス遺伝子産物を利用して、 アンプリコンの D NAのみがウィルス の外被をまとって E Bウィルスベクターとして産生される。 すなわち、 本発明の パッケージング細胞は、 外来遺伝子を含みウィルス複製能力を持たない E Bウイ ' ルスベクターを産生するためのヘルパー機能を有する。
すなわち、 別の観点においては、 本発明は、 ウィルス複製能力を持たない E B ウィルスベクタ一を産生するためのアンプリコンプラスミド導入 A k a t aパッ ケージング細胞を製造する方法を提供する。 この方法の概略が図 2に示される。 パッケ一ジングシグナルを欠失した E Bウィルスゲノムを保持するがパッケージ ングシグナルを有する野生型 E Bウィルスゲノムを保持しないパッケージング細 胞に、 アンプリコンプラスミドを導入し、 適当な薬剤で選択することにより、 ァ ンプリコンプラスミドを含有する A k a t aパッケージング細胞をクローニング する。 アンプリコンプラスミドの導入は、 電気穿孔法、 リン酸カルシウム法、 リ ポフエクシヨン法、 遺伝子銃法等により行うことができる。
「アンプリコンプラスミド」 とは、 ウィルス由来の遺伝子を含むが、 ウィルス 産生能を欠失したプラスミド （環状 DNA) をいう。 アンプリコンプラスミドは、 パッケージングシグナルおよびウィルスの複製開始点を含み、 ウィルス複製に必 須な蛋白質をコードする遺伝子の 1またはそれ以上を欠失している環状 D N Aで ある。 好ましくは、 アンプリコンプラスミドは選択のためのマ一力一遺伝子を有 する。 特に好ましくは、 アンプリコンプラスミドは、 パッケージングシグナル、 E Bウィルス潜伏感染期の複製開始点 o r i P、 E Bウィルス溶解感染誘導期の 複製開始点 o r i L y t、 E B NA 1を有する。 さらに、 E Bウィルスベクター を外来遺伝子導入の目的で用いる場合には、 アンプリコンプラスミドはさらに導 入すべき所望の外来遺伝子を有する。
図 2においては、 アンプリコンプラスミドはマ一力一としてピューロマイシン 耐性遺伝子を有しており、 ピュー口マイシンによりアンプリコンが導入されたァ ンプリコンプラスミド導入 A k a t aパッケージング細胞の選択を行っているが、 この細胞で機能するどのような選択マ一力一を利用してもよい。 好ましくはパッ ケージング細胞の作製に使用した選択マーカ一とは異なる選択マーカーを用いる。 パッケージング細胞へのアンプリコンプラスミドの導入はまた、 ウィルスゲノ ムを複製できないウィルスの感染による方法を用いてもよい。 この方法の概略が 図 8に示される。 E Bウィルス陽性 A k a t a細胞中において E Bウィルスゲノ ムの複製に重要な遺伝子を相同組換えにより欠失させる。 図 8においては相同組 換えウィルスの選択にハイグロマイシン耐性遺伝子を使用している。 分離した相 同組換えウィルスと野生型ウィルスの両方を持つ A k a t a細胞クローンを抗ヒ トイムノグロプリン抗体で処理することにより、 欠失した E Bウイルス遺伝子産 物が野生型ウィルスから供給されて、 相同組換えウィルスと野生型ウィルスの両 方が産生される。 産生されたウィルス液をパッケージング細胞に感染させ、 パッ ケージング細胞の作製に使用した選択マ一カー （ネオマイシン） とウィルスゲノ ムを複製できないウィルスの作製に使用した選択マーカ一 ひ、イダロマイシン） で選択すると同時に、 細胞をクローニングすることにより、 パッケージングシグ ナルを欠失した T R (一） E Bウィルス遺伝子とウィルスゲノムの複製に重要な 遺伝子を欠失した E Bウィルス遺伝子のみを含有するアンプリコンプラスミド導 入 A k a t aパッケージング細胞を分離する。 このようにして得られた、 ウィル スゲノムの複製に重要な遺伝子を欠失した E Bウィルス遺伝子をアンプリコンと して含有する A k a t aパッケージング細胞を抗ヒトイムノグロプリン抗体で処 理することにより、 E Bウィルスの外被をまとったアンプリコンプラスミドのみ が E Bウィルスベクターとして放出される。
本発明はまた、 上述の方法により製造される、 導入されたアンプリコンプラス ミドを持つ A k a t aパッケージング細胞を提供する。 本発明のアンプリコンプ ラスミドを持つ A k a t aパッケージング細胞は、 抗ヒトイムノグロブリン抗体 で処理することにより、 E Bウィルスの外被をまとったアンプリコンプラスミド D NAを E Bウィルスベクタ一として産生する能力を有する。 E Bウィルスのゲ ノムはローリングサークル形式で伸長複製されるが、 パッケージングシグナルを 欠失していると切り出されず、 従ってウィルス粒子に取り込まれない。 一方、 7 ンプリコンプラスミドの遺伝子もローリングサ一クル形式で伸長し、 アンプリコ ンはコンカテマ一を作って、 パッケージングシグナルの部分で切断され、 E Bゥ ィルスゲノムの大きさであるおよそ 1 7 0 k bのサイズでパッケージングされる (図 7を参照） 。 すなわち、 E Bウィルスの外被をまとったアンプリコンプラス ミドのみが E Bウィルスベクタ一として放出される。 好ましくは、 本発明の方法 により製造されるアンプリコンプラスミドを持つ A k a t aパッケージング細胞 は、 ウィルス複製能力を持たない E Bウィルスベクタ一を最大で従来の方法の 1 , 0 0 0倍以上の効率で産生し、 かつ野生型 E Bウィルスを産生しない。
すなわち、 別の観点においては、 本発明は、 上述の本発明の方法により製造さ れるアンプリコンプラスミド導入 A k a t aパッケージング細胞を溶解感染誘導 することにより、 ウィルス外被に包まれた E Bウィルスベクタ一を放出させるこ とを含む、 ウィルス複製能力を持たない E Bウィルスベクターを産生する方法を 提供する。 アンプリコンプラスミド導入 A k a t aパッケージング細胞の溶解感 染誘導は、 抗ィムノグロプリン抗体で処理することにより容易に行うことができ る。
さらに、 本発明はまた、 上述の方法にしたがって製造される E Bウィルスべク ターを提供する。 この E Bウィルスベクターは、 E Bウィルス粒子中にアンプリ コンプラスミドを含有しており、 Bリンパ球に感染してこれを不死化する能力を 有するが、 自身をウィルス粒子として複製する能力を有しない。 したがって、 所 望の抗体を産生する Bリンパ球に本発明の E Bウィルスベクタ一を感染させ、 こ れを不死化してインビト口で増殖させることにより、 ヒト抗体を容易に製造する ことができる。 すなわち、 本発明はまた、 本発明の E Bウィルスベクタ一を用い て不死化 Bリンパ球を製造する方法、 ならびに本発明の方法により製造される不 死化 Bリンパ球を提供する。 また、 アンプリコンプラスミドに所望の遺伝子を組 み込んでおくことにより、 従来困難だった末梢血静止期 Bリンパ球への遺伝子導 入が可能となる。 静止期 Bリンパ球においてのみ遺伝子の発現が可能なプロモ一 夕一を使用することにより、 Bリンパ球特異的かつ高レベルな遺伝子発現が期待 できる。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て 本明細書の一部としてここに引用する。 また、 本出願が有する優先権主張の基礎 となる出願である日本特許出願 2 0 0 2 - 3 4 9 4 6 7号の明細書および図面に 記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。 実施例
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、 本発明はこれらの実施例 により限定されるものではない。 実施例 1
本実施例では図 1の方法に基づいて A k a t a株 EBウィルスのパッケージン グシグナルの破壊をおこなった。 まず、 pUC 119に 8 kbの Ak a t a株 E Bウィルスの B am-Nh e t領域をクローニングし、 pUC 119N e tを 作製した （図 3 a) 。 クロ一エングした Bam— Nhe t領域にはパッケージン グシグナル （TR) が 1個のみ存在した。 次に、 pUC 119Nhe tの Bs p H Iと E c o R I制限酵素部位の間にネオマイシン耐性遺伝子 （n e o と赤 色色素遺伝子 （DsRe d) を挿入することにより、 TRが破壊された遺伝子破 壊用のプラスミド pUCNh e t n e oRe dを作製した （図 3 b) 。 このブラ スミド DNAを EBウィルス陽性の Ak a t a細胞に電気穿孔法で遺伝子導入を 打った。
続いて Ak a t a細胞のネオマイシン選択を行い、 耐性となった約 500個の クロ一ンに対して DNAハイブリダィゼーション法を行い、 相同組換えが起こつ た場合に出現するサイズの DNAバンドを持つ Ak a t a細胞クローンをスクリ 一二ングした。 制限酵素 BamHIで消化した DNA断片を、 ネオマイシン耐性 遺伝子をプローブとして反応させ、 予想される 11. 6 kbのバンドを検出した。 次に、 相同組換えが起こっているか否かを遺伝子増幅法で調べた。 ANC F 1および ANC R 2はそれぞれ組換え部位の 5 ' 端おょぴ 3' 端外側で設計し たプライマ一であり、 ANC R1および ANC F 2は n e o rの内部で設計 したプライマーである。 図 4にそれぞれのプライマ一のおおよその位置と方向を 示す。 相同組換えが、起こっている場合は AN C F 1と ANC R 1のプライマ 一ペアによって、 5. 3 k bの DNA断片が増幅され、 ANC F2と ANC R 2のプライマ一ペアによって、 10. 3 kbの DNA断片が増幅される。 相同 組換えが起こっていない場合は何も増幅されない。 この方法で 12個のクローン が相同組換え E Bウィルスを保持していることを確認した。
次に、 相同組換えによってパッケージングシグナルが破壊された TR (-) ゥ ィルスゲノムのみを持つ Ak a t a細胞の分離をおこなった。 TR (—） EBゥ ィルスゲノムを保持しているクロ一ンである 119細胞を選択培地 (50%EB ウィルス陰性 A k a t a細胞培養上清， 0. 35mgZml G418, 50 ヒドロキシゥレア） で 10日培養後、 ヒドロキシゥレアを除いてさらに 10日培 養した。 96穴プレートに 1穴あたり 0. 5個の細胞が入るように希釈して培養 を行い、 増殖してきたクローンから TRの外側で設計したプライマーペアによる 遺伝子増幅を行い、 野生型のパンド （2. 0 kb) が脱落し、 組換え型のバンド (5. 7 k b) のみが認められる Ak a t a細胞クローンを分離した。 さらにサ ザンブロット法による DNA制限酵素切断パターンの変化から、 パッケージング シグナルを欠失した EBウィルスのみを持つパッケージング細胞が分離されたこ とを確認した。 実施例 2 .
本実施例ではアンプリコンプラスミドを作製した。 アンプリコンプラスミドと してはパッケージングシグナル （TR) を持った構造が必要である。 さらに、 E Bウィルス潜伏感染期の複製開始点 o r i Pと o r i Pをトランスに活性化する EBNA1遺伝子を持つていることが導入細胞内でのプラスミドの維持に重要で あり、 EBウィルス溶解感染誘導期の複製開始点 ο r i Ly tを持っていること が、 抗ヒトイムノグロブリンお体刺激によるアンプリコンプラスミド導入パッケ 一ジング細胞からの EBウィルスベクターの産生に必要である。 図 6 bに作製し たアンプリコンプラスミドを示す。 EBウィルスの遺伝子としては EBNA— 1， o r i P， TR, o r i Ly tのみを含み、 さらにレポ一夕一として用いる緑色 蛍光蛋白質 （GFP) 遺伝子とアンプリコンプラスミドが細胞で維持されるため の選択用のピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んだ 21 kbのアンプリコンプ ラスミド （pPs i ) である。 ヘルパーウィルスのゲノムは口一リングサ一クル 形式で伸長複製されるが、 TRを欠いているので切り出されない。 従ってウィル ス粒子に取り込まれることはない。 一方、 アンプリコンプラスミドの遺伝子も口 —リングサ一クル形式で伸長し、 アンプリコンはコンカテマ一を作って、 TRの 部分で切断され、 EBウィルスゲノムの大きさであるおよそ 17 Okbのサイズ でパッケージングされる （図 7) 。 すなわち、 アンプリコンプラスミドの遺伝子 を持つ EBウィルスが放出される。 実施例 3
本実施例では作製したアンプリコンプラスミド pP s iをパッケージング細胞 に電気穿孔法により遺伝子導入し、 0. 3 S gZmlピューロマイシン， 5 0%EBウィルス陰性 Ak a t a細胞培養上清， 0. 35mgZml G418で 選択培養を行った。 その結果得られた 72個のピューロマイシン耐性クローンは すべて GFP陽性であった。 そのうち 1個のクローンを抗ヒトイムノグロブリン 抗体で処理し、 EBウィルスの構成蛋白質であるキヤプシド抗原 （VCA) が発 現していること、 その上清に野生型ウィルスが存在しないことを確認した。 さら に、 上清中の組換え EBウィルスを EBウィルス陰性 D aud i細胞に感染させ たところ、 20%弱の細胞が組換え EBウィルスに感染して、 GFPを発現する ことが確認された。 実施例 4
本実施例では図 8の方法に基づいて A k a t a株 EBウィルスの EBウィルス 一本鎖 DNA結合蛋白質をコードする BALF 2遺伝子をハイグロマイシン耐性 遺伝子で置換することにより破壊欠失させた。 まず、 pUCl l ^;iAka t a 株 EBウィルスの Ec o-D e tおよび Ec o— J領域の 11， 429塩基対 の E c oR I— S a 1 I断片をクロ一ニングし、 2， 500塩基対の C 1 a I -Ec o R V領域を除去し、 1 , 853塩基対のハイグロマイシン耐性遺伝子 を挿入置換することにより、 BALF 2遺伝子が破壊された遺伝子破壊用のブラ スミド pUCl 19 Ec oD— JHygを作製した （図 9 a) 。 このプラスミ ド DNAの 7， 807塩基対の S ac I -Bg 1 I I断片を EBウィルス陽 性 Ak a t a細胞に電気穿孔法で遺伝子導入を行った。
続いて Ak a t a細胞のハイグロマイシン選択を行い、 耐性となった約 1， 0 00個のクロ一ンに対して DNAハイブリダィゼイシヨン法を行い、 相同組換え が起こった場合に出現するサイズの DNAバンドを持つ Ak a t a細胞クローン をスクリーニングした。 制限酵素 Nc o Iで消化した DNA断片を、 図 9 bに示 したハイグロマイシン耐性遺伝子をプローブとして反応させ、 予想される 4. 8 kbのバンドを 5個の Ak a t a細胞クロ一ンから分離した DNAで検出した。 次に、 遺伝子増幅法を用いて相同組換えが起こっていることを確認した。 F 1 および R 2はそれぞれ組換え部位の 5' 端および 3' 端外側で設計したプライマ 一であり、 H y g Fおよび H y g Rはそれぞれハイグロマイシン耐性遺伝子の内 部で設計したプライマーである。 ¾10にそれぞれのプライマーのおおよその位 置と方向を示す。 相同組換えが起こっている場合は F 1と HygRのプライマー ペアによって、 4， 112塩基対の DN A断片が増幅され、 HygFと R2のプ ライマ一ペアによって、 4， 534塩基対の DNA断片が増幅される。 相同組換 えが起こっていない場合は何も増幅されない。 この方法で 2個のクローンが相同 組換え E Bウイルスを保持していることを確認した。
次に、 相同組換え EBウィルスを保持しているクローンを抗ヒトイムノグロブ リン抗体で処理し、 組換え型と野生型の両方が混合したウィルスを産生させた。 産生されたウィルス液を実施例 1で作製したパッケージング細胞に感染させ、 ネ ォマイシンとハイグロマイシンの存在下に細胞をクローニングすることにより、 BALF 2遺伝子を欠失した EBウィルスゲノムとヘルパーである TR (—） E Bウィルスゲノムのみを含有し、 野生型ウィルスゲノムを持たない Ak a t aパ ッケ一ジング細胞を分離した。 この Ak a t aパッケージング細胞を抗ヒトイム ノグロブリン抗体で処理し、 BALF 2遺伝子欠損 EBウィルスのみからなる E Bウィルスベクタ一を回収した。 産生された BALF 2遺伝子欠損 EBウィルス の 10倍段階希釈液をそれぞれ 100 1ずつ 5 X 105個の臍帯血由来リンパ 球に感染させ 4週間培養した。 その結果、 およそ 105TD50Zmlのトランス フォーミング活性を持つが、 増殖不能な E Bウィルスべクターが産生されたこと を確認した。

Claims

請求の範囲
1. ウィルス複製能力を持たない EBウィルスベクタ一を産生する系を作製す るために用いられるパッケージング細胞を製造する方法であって、
パッケージングシグナルが欠失した相同組換え用遺伝子断片を Ak a t a細胞に 導入することにより、 E Bウィルスのパッケージングシグナルを相同組換えによ り欠失させ、 そして
パッケージングシグナルを欠失した EBウィルスゲノムを保持するがパッケ一ジ ングシグナルを有する野生型 E Bウィルスゲノムを保持しないパッケ一ジング細 胞をクロ一ニングする、
の各工程を含む方法。
2. ウィルス複製能力を持たない EBウィルスベクターを産生する系を作製す るために用いられるパッケージング細胞を製造する方法であって、
パッケージングシグナルが欠失した EBウィルスゲノムを大腸菌を用いて作製し、 該 EBウィルスゲノムを EBウィルス陽性 Ak a t a細胞に導入し、 そして パッケージングシグナルを欠失した EBウィルスゲノムを保持するがパッケージ ングシグナルを有する野生型 EBウィルスゲノムを保持しないパッケージング細 胞をクローニングする、
の各工程を含む方法。
3. ウィルス複製能力を持たない EBウィルスベクターを産生する系を作製す るために用いられるパッケージング細胞を製造する方法であって、
パッケージングシグナルが欠失した EBウィルスゲノムを大腸菌を用いて作製し、 該 EBウィルスゲノムを EBウィルス陰性であって EBNA1を発現する Ak a t a細胞に導入し、 そして
パッケージングシグナルを欠失した EBウィルスゲノムを保持するがパッケージ ングシグナルを有する野生型 EBウィルスゲノムを保持しないパッケージング細 胞をクローニングする、
の各工程を含む方法。
4. ウィルス複製能力を持たない EBウィルスベクタ一を産生するためのアン ίド導入 A k a t aパッケージング細胞を製造する方法であって、 請求項 1一 3のいずれかに記載の方法により得られたパッケージング細胞に、 パ ッケ一ジングシグナルを有するがウィルス複製能力を持たないアンプリコンプラ スミドを導入する工程を含む方法。
5 . ウィルス複製能力を持たない E Bウィルスベクタ一を産生する方法であつ て、 請求項 4記載の方法により製造されるアンプリコンプラスミド導入 A k a t aパッケージング細胞を溶解感染誘導することにより、 ウィルス外被に包まれた E Bウィルスベクターを放出させることを含む方法。
6 . 不死化 Bリンパ球を製造する方法であって、 請求項 4記載の方法により製 造されるアンプリコンプラスミド導入 A k a t aパッケージング細胞を溶解感染 誘導することにより、 ウィルス外被に包まれた E Bウィルスベクタ一を放出させ、 そして得られた E Bウィルスベクタ一を Bリンパ球に感染させることを含む方法。
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