JP6761946B2 - 巨大環状ウイルスゲノムｄｎａの単離方法 - Google Patents
巨大環状ウイルスゲノムｄｎａの単離方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6761946B2 JP6761946B2 JP2016017387A JP2016017387A JP6761946B2 JP 6761946 B2 JP6761946 B2 JP 6761946B2 JP 2016017387 A JP2016017387 A JP 2016017387A JP 2016017387 A JP2016017387 A JP 2016017387A JP 6761946 B2 JP6761946 B2 JP 6761946B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- virus
- crispr
- sequence
- cells
- genomic dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 113
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 156
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 124
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 116
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims description 83
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 71
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 70
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 56
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 54
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 47
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 46
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 46
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 35
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims description 20
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 19
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 18
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims description 16
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 16
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 15
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims description 14
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 14
- 241001467058 Murid gammaherpesvirus 4 Species 0.000 claims description 13
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 claims description 12
- 230000034431 double-strand break repair via homologous recombination Effects 0.000 claims description 10
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 claims description 8
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 claims description 8
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 claims description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 claims description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 101150010802 CVC2 gene Proteins 0.000 description 14
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 14
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 14
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 13
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 12
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 12
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 9
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 8
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 7
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 7
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical group ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 7
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 6
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 108091079001 CRISPR RNA Proteins 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 5
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 102100035102 E3 ubiquitin-protein ligase MYCBP2 Human genes 0.000 description 4
- 101150059079 EBNA1 gene Proteins 0.000 description 4
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 208000032420 Latent Infection Diseases 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037771 disease arising from reactivation of latent virus Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 3
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 3
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 3
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 102100032768 Complement receptor type 2 Human genes 0.000 description 2
- 101150113929 EBNA2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150113776 LMP1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108700025784 N-myc downstream-regulated gene 1 Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Chemical group OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000700180 Apodemus sylvaticus Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 101150034762 EBNA3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091033415 Epstein Barr virus miR-BART1 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 206010015108 Epstein-Barr virus infection Diseases 0.000 description 1
- 108010046914 Exodeoxyribonuclease V Proteins 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000029433 Herpesviridae infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 238000007476 Maximum Likelihood Methods 0.000 description 1
- 101100238610 Mus musculus Msh3 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000002454 Nasopharyngeal Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000001894 Nasopharyngeal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010061306 Nasopharyngeal cancer Diseases 0.000 description 1
- 101100058191 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) bcp-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 208000009565 Pharyngeal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010034811 Pharyngeal cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000282695 Saimiri Species 0.000 description 1
- 101800000874 Small capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037230 mobility Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、細胞に潜伏感染した巨大環状ウイルスゲノムDNAの単離方法、並びに、そのような方法に使用するためのターゲティングベクターに関する。
本発明はまた、上記方法によって単離された巨大環状ウイルスゲノムDNAを使って、感染性ウイルス粒子を産生する方法に関する。
ヒトに病気を起こすウイルスとして大きさ約100キロベースを超える巨大なウイルスゲノムDNAをもつウイルスがある。例えばヒトがんウイルスであるエプスタイン・バー（EB）ウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスなどがその代表である。このような巨大なウイルスゲノムは細胞の核内において二本鎖環状DNAとして安定に維持されるが、感染細胞からこのような環状ウイルスゲノムDNAを単離することは一般に非常に困難である。
巨大ウイルスゲノムDNAを細胞から単離する際に使用される方法には相同組換え法がある。具体的には、ターゲティングベクターとウイルスゲノムDNAとの相同組換えによりウイルスゲノムへ外来遺伝子を挿入し、当該外来遺伝子の働きによりウイルスゲノムDNAを大腸菌で増殖可能なクローンとして単離することができる（特許文献１及び非特許文献１）。しかしながら、このような組換えは極めて低効率でしか起こらないため、多くの労力と時間がかかるという難点があった。
さらにまた、後述するように、本発明は、環状ウイルスゲノムをCRISPR/Casで切断することを含む。非特許文献２は、EBウイルス潜伏感染細胞において、CRISPR/Cas9による環状ウイルスゲノム切断が可能であることを記載している。また、非特許文献３は、EBウイルス潜伏感染細胞において、CRISPR/Cas9によるウイルスゲノム切断を応用してウイルスゲノムへの選択マーカー遺伝子を挿入可能であることを記載している。しかしながら、これらの文献のいずれもウイルスゲノムの単離を目的としたものではない。
CRISPR/Casは、ゲノム編集技術の一つであり、近年、次世代型遺伝子改変技術として注目されており、細胞内の遺伝子のノックアウトやノックインを効率よく行うことが可能である（非特許文献４）。
Delecluse HJ, Hilsendegen T, Pich D, Zeidler R, Hammerschmidt W. Propagation and recovery of intact, infectious Epstein-Barr virus from prokaryotic to human cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95(14):8245-8250, 1998
Wang J, Quake SR. RNA-guided endonuclease provides a therapeutic strategy to cure latent herpesviridae infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 111(36):13157-13162, 2014
Yuen KS, Chan CP, Wong NH, Ho CH, Ho TH, Lei T, Deng W, Tsao SW, Chen H, Kok KH, Jin DY. CRISPR/Cas9-mediated genome editing of Epstein-Barr virus in human cells. J Gen Virol. 2015 96(Pt 3):626-636, 2015
実験医学, Vol.32, No.11 (7月号) 2014（羊土社）
上述したように、相同組換え法による外来遺伝子の挿入は極めて低効率であり、これは、標的となる環状ウイルスゲノムDNAとターゲティングベクターとの間の相同組換え効率の低さに起因すると考えられる。
本発明者らは、細胞に感染した巨大環状ウイルスゲノムDNAを効率よく単離する新しい方法を提供することを目的とする。
本発明者らは今回、ゲノム編集と呼ばれる遺伝子改変技術を応用することによって環状ウイルスゲノムDNAの一か所において二本鎖DNAを切断し、ターゲティングベクターによる当該切断部位の相同組換え修復を誘発し、それによって極めて効率よく環状ウイルスゲノムDNAを単離することができることを見出し、本発明を完成した。
本発明は、以下の特徴を含む。
（１）ウイルス感染細胞から、約100kb以上のサイズの環状ウイルスゲノムDNAを単離する方法であって、前記細胞内の前記環状ウイルスゲノムDNAを一か所で切断するCRISPR/Casゲノム編集プラスミドと、前記切断部位両側のそれぞれのDNA塩基配列を相同配列として含むターゲティングベクターとを、前記細胞内に導入し、それによって前記細胞内で前記ウイルスゲノムDNAの相同組換え修復を誘導する工程、並びに、前記修復された組換えウイルスゲノムDNAを回収する工程を含む、上記方法。
（２）前記切断部位両側のそれぞれのDNA塩基配列が200〜1,000塩基対のサイズである、（１）に記載の方法。
（３）前記ターゲティングベクターが少なくとも１種のレポーター蛋白質をコードする塩基配列を含む、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記ターゲティングベクターがプラスミドと大腸菌人工染色体（BAC）ベクターを組み合わせて含む、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記CRISPR/Cas切断部位がCRISPR/Cas切断に耐性を付与する変異配列を含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記CRISPR/Cas切断に耐性を付与する変異配列がウイルス遺伝子配列内に存在する、（５）に記載の方法。
（７）前記CRISPR/CasがCRISPR/Cas9である、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）前記ウイルスが、エプスタイン-バーウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、ヘルペスウイルスサイミリ、またはマウスヘルペスウイルス68(MHV-68)である、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）前記ウイルス感染細胞が正常細胞またはがん細胞である、（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）前記回収された組換えウイルスゲノムDNAの塩基配列を決定する工程をさらに含む、（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法によってウイルス感染細胞から組換え環状ウイルスゲノムDNAを単離する工程、前記組換え環状ウイルスゲノムDNAを細胞に導入して感染性ウイルス粒子を再構成する工程を含む、感染性ウイルス粒子再構成のための方法。
（１２）環状ウイルスゲノムDNAのCRISPR/Cas切断部位両側の200〜1,000塩基対上流配列及び200〜1,000塩基対下流配列、並びに少なくとも１種のレポーター蛋白質をコードする塩基配列を含む、ターゲティングベクター。
（１３）前記CRISPR/CasがCRISPR/Cas9である、（１２）に記載のターゲティングベクター。
（１４）前記ターゲティングベクターがプラスミドと大腸菌人工染色体（BAC）ベクターを組み合わせて含む、（１２）または（１３）に記載のターゲティングベクター。
（１５）前記ウイルスが、エプスタイン-バーウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、ヘルペスウイルスサイミリ、またはマウスヘルペスウイルス68(MHV-68)である、（１２）〜（１４）のいずれかに記載のターゲティングベクター。
（１６）前記CRISPR/Cas切断部位がCRISPR/Cas切断に耐性を付与する変異導入配列を含む、請求項（１２）〜（１５）のいずれかに記載のターゲティングベクター。
（１７）前記CRISPR/Cas切断に耐性を付与する変異導入配列がウイルス遺伝子配列内に存在する、（１６）に記載のターゲティングベクター。
（１８）請求項（１２）〜（１７）のいずれかに記載のターゲティングベクターと、CRISPR/Casゲノム編集プラスミドとを含む、約100kb以上のサイズの環状ウイルスゲノムDNAを単離するためのキット。
（１）ウイルス感染細胞から、約100kb以上のサイズの環状ウイルスゲノムDNAを単離する方法であって、前記細胞内の前記環状ウイルスゲノムDNAを一か所で切断するCRISPR/Casゲノム編集プラスミドと、前記切断部位両側のそれぞれのDNA塩基配列を相同配列として含むターゲティングベクターとを、前記細胞内に導入し、それによって前記細胞内で前記ウイルスゲノムDNAの相同組換え修復を誘導する工程、並びに、前記修復された組換えウイルスゲノムDNAを回収する工程を含む、上記方法。
（２）前記切断部位両側のそれぞれのDNA塩基配列が200〜1,000塩基対のサイズである、（１）に記載の方法。
（３）前記ターゲティングベクターが少なくとも１種のレポーター蛋白質をコードする塩基配列を含む、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記ターゲティングベクターがプラスミドと大腸菌人工染色体（BAC）ベクターを組み合わせて含む、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記CRISPR/Cas切断部位がCRISPR/Cas切断に耐性を付与する変異配列を含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記CRISPR/Cas切断に耐性を付与する変異配列がウイルス遺伝子配列内に存在する、（５）に記載の方法。
（７）前記CRISPR/CasがCRISPR/Cas9である、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）前記ウイルスが、エプスタイン-バーウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、ヘルペスウイルスサイミリ、またはマウスヘルペスウイルス68(MHV-68)である、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）前記ウイルス感染細胞が正常細胞またはがん細胞である、（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）前記回収された組換えウイルスゲノムDNAの塩基配列を決定する工程をさらに含む、（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法によってウイルス感染細胞から組換え環状ウイルスゲノムDNAを単離する工程、前記組換え環状ウイルスゲノムDNAを細胞に導入して感染性ウイルス粒子を再構成する工程を含む、感染性ウイルス粒子再構成のための方法。
（１２）環状ウイルスゲノムDNAのCRISPR/Cas切断部位両側の200〜1,000塩基対上流配列及び200〜1,000塩基対下流配列、並びに少なくとも１種のレポーター蛋白質をコードする塩基配列を含む、ターゲティングベクター。
（１３）前記CRISPR/CasがCRISPR/Cas9である、（１２）に記載のターゲティングベクター。
（１４）前記ターゲティングベクターがプラスミドと大腸菌人工染色体（BAC）ベクターを組み合わせて含む、（１２）または（１３）に記載のターゲティングベクター。
（１５）前記ウイルスが、エプスタイン-バーウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、ヘルペスウイルスサイミリ、またはマウスヘルペスウイルス68(MHV-68)である、（１２）〜（１４）のいずれかに記載のターゲティングベクター。
（１６）前記CRISPR/Cas切断部位がCRISPR/Cas切断に耐性を付与する変異導入配列を含む、請求項（１２）〜（１５）のいずれかに記載のターゲティングベクター。
（１７）前記CRISPR/Cas切断に耐性を付与する変異導入配列がウイルス遺伝子配列内に存在する、（１６）に記載のターゲティングベクター。
（１８）請求項（１２）〜（１７）のいずれかに記載のターゲティングベクターと、CRISPR/Casゲノム編集プラスミドとを含む、約100kb以上のサイズの環状ウイルスゲノムDNAを単離するためのキット。
本発明により、巨大環状ウイルスゲノムとして細胞に潜伏感染する様々な環状ウイルスゲノムDNAを従来法に比べてより効率的に単離することができる。
以下において本発明をさらに詳細に説明する。
１．巨大環状ウイルスゲノムDNAの単離方法
本発明は、第１の態様により、ウイルス感染細胞から、約100kb以上のサイズの環状ウイルスゲノムDNAを単離する方法であって、前記細胞内の前記環状ウイルスゲノムDNAを一か所で切断するCRISPR/Casゲノム編集プラスミドと、前記切断部位両側のそれぞれのDNA塩基配列を相同配列として含むターゲティングベクターとを前記細胞に導入し、それによって前記細胞内で前記ウイルスゲノムDNAの相同組換え修復を誘導する工程、並びに、前記修復された組換えウイルスゲノムDNAを回収する工程を含む、上記方法を提供する。
１．巨大環状ウイルスゲノムDNAの単離方法
本発明は、第１の態様により、ウイルス感染細胞から、約100kb以上のサイズの環状ウイルスゲノムDNAを単離する方法であって、前記細胞内の前記環状ウイルスゲノムDNAを一か所で切断するCRISPR/Casゲノム編集プラスミドと、前記切断部位両側のそれぞれのDNA塩基配列を相同配列として含むターゲティングベクターとを前記細胞に導入し、それによって前記細胞内で前記ウイルスゲノムDNAの相同組換え修復を誘導する工程、並びに、前記修復された組換えウイルスゲノムDNAを回収する工程を含む、上記方法を提供する。
環状ウイルスゲノムDNAの改変法としては、従来、Cre/loxPの部位特異的組換え系、トランスポゾン法などのゲノムのランダムな位置での置換、欠失、挿入などの改変を行う方法が使用されてきたが、上記のとおり、標的となる環状ウイルスゲノムDNAとターゲティングベクターとの間の相同組換え効率の低さに問題があった。これに対して、本発明の方法は、ウイルスゲノムの特定の位置でゲノム編集を可能にするCRISPR/Casシステムを利用する。その意味では、本発明は、CRISPR/Casシステムの新しい応用の一つを提案する。
本明細書で使用する「巨大環状ウイルスゲノムDNA」は、約100kb以上300kb以下のサイズ、或いは、場合により300kbを超すサイズを有する二本鎖DNAである。
DNAウイルスには、ウイルス粒子内では直鎖状二本鎖DNAゲノムをもちながら、細胞核内においてウイルスゲノムが環状化して二本鎖環状DNA（エピゾーム）として安定に維持されるものがある。本発明で対象とするのはこのようなウイルスのうち大きさ100kb以上の巨大な二本鎖環状DNAとして細胞内に維持されるウイルスである。このようなウイルスには、例えばヒトを自然宿主とするエプスタイン-バー(EB)ウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、サルを自然宿主とするヘルペスウイルスサイミリ、マウスを自然宿主とするマウスヘルペスウイルス68(MHV-68)など、すなわち腫瘍ウイルスを含むウイルス、が包含される。
本発明の方法では、環状ウイルスゲノムDNAを該ウイルスが感染した細胞から単離する。このような細胞としては、上記のようなウイルスが特異的に感染する細胞が好ましく、正常細胞又は腫瘍細胞などの疾患細胞が含まれる。
EBウイルスが感染する細胞、とりわけ腫瘍原性に関与する細胞の例は、B細胞（Burkittリンパ腫、移植後リンパ球増殖性疾患、Hodgkinリンパ腫など）、T細胞あるいはNK細胞（鼻性T/NKリンパ腫など）、上皮由来細胞（咽頭癌、胃癌など）などである。本発明を適用可能な細胞株として、胃癌由来細胞株であるSNU719細胞、YCCEL1細胞(以上は実施例として後述)、バーキットリンパ腫由来Akata細胞、P3HR-1細胞、Daudi細胞、NKリンパ腫由来のSNK6細胞、SNK1株、SNT8、上咽頭癌由来細胞であるC666-1、さらに様々な個人由来のリンパ芽球様細胞株などがある。
カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスが感染する細胞の例は、原発性体液性リンパ腫細胞、血管内皮細胞、B細胞などである。本発明を適用可能な細胞株として、原発性体液性リンパ腫細胞株であるBC-1, BC-2, BC-3, BC-5, BCP-1, BCBL-1, BCS-6, JCS-1, PEL-5などがある。
ヘルペスウイルスサイミリが感染した細胞の例は、リスザル(squirrel monkey)のT細胞である。本発明を適用可能な細胞株として、ヒト肺癌細胞株A549にヘルペスウイルスサイミリを潜伏感染させた細胞株が樹立されている。
マウスヘルペスウイルス68が感染した細胞の例は、モリアカネズミの上皮細胞やB細胞である。
本発明の環状ウイルスゲノムDNAの単離方法では、２種類のベクター（好ましくはプラスミド）を使用する。具体的には、一方のベクターは、ウイルス感染細胞内の環状ウイルスゲノムDNAを一か所で切断するCRISPR/Casゲノム編集プラスミドであり、他方のベクターは、前記切断部位両側のそれぞれのDNA塩基配列を相同配列として含むターゲティングベクターである。
もし上記ターゲティングベクターがCRISPR/Cas切断部位を含まざるを得ない場合は、該CRISPR/Cas切断部位に変異を導入してCRISPR/Cas切断に耐性となった変異配列を含むことが可能である。当該CRISPR/Cas切断に耐性を付与する変異配列は、好ましくは上記ウイルス遺伝子配列内に存在する。本発明の方法では環状ウイルスゲノムDNAを単離し、その後感染性ウイルス粒子の産生を行うため、ウイルス遺伝子の機能を破壊することは望ましくないからである。
本明細書で使用する「ターゲティングベクター」なる用語は、相同組換え法において、標的遺伝子との間で組換えを起こすために使われる遺伝子の運び屋（ベクター）のことであり、ドナーベクター（あるいはドナープラスミド）とも称される。このベクターは、外来遺伝子部分と、その両側に配置される標的遺伝子の相同配列とを含む。
本明細書で使用する「相同組換え」なる用語は、相同な塩基配列（すなわち、相同配列）を介して起こる遺伝子組換えを指し、遺伝子の修復に使用されるメカニズムの一つとして知られている。相同組換えによる遺伝子修復を「相同組換え修復」という。
CRISPR/Casゲノム編集プラスミドは、公知のプラスミドであり、好ましくはCRISPR/Cas9ゲノム編集プラスミドである。
「CRISPR」は「Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats」の略であり、細菌類がファージに対する獲得免疫機構として防御的に機能するために本来的にもつDNA領域である。CRISPRはリピート配列とスペーサー配列という２種類のDNA配列の繰り返しによって構成され、CRISPRの上流にはATに富む領域（リーダー配列）が存在し、さらに上流にはCRISPR関連遺伝子(Cas遺伝子群)が存在する。CRISPR領域は一連のpre-crRNAとして転写された後、Cas蛋白質複合体によってリピート配列が切断されてcrRNAとなり、このcrRNAは別のCas蛋白質と複合体を形成し、スペーサー配列と相補的な配列を認識し切断する。
CRISPR/Casゲノム編集プラスミドは、CRISPR-Casシステムとも呼ばれ、ゲノムDNAの二本鎖を平滑末端となるように切断してゲノム配列の特定の場所を欠失、置換又は挿入することを可能にする新しい遺伝子改変技術である（Cong L et al., Science 2013; 339: 819-823; Mali P et al., Science 2013; 339: 823-826）。
CRISPR-Casゲノム編集プラスミドは、DNAに二本鎖切断を導入するために、CRISPR RNA (crRNA)部分とトランス活性化crRNA(tracrRNA; trans-activating crRNA)部分の融合体であるキメラsgRNA(guide RNAもしくはgRNA)の塩基配列、並びにCas蛋白質(好ましくは、Cas9)をコードする塩基配列を含むことができる。例えばEBウイルスなどのウイルスゲノムDNAを切断標的とする場合は、公知のCRISPRdirect（東京大学、http://crispr.dbcls.jp/）、CRISPR design web site（MIT、http://crispr.mit.edu/、Hsu PD et al., Nat. Biotechnol. 31: 827-832, 2013）などを用いて標的DNA配列（例えば図４に示される配列）内に存在するPAMモチーフおよびその上流20塩基対を検索、同定することができる。
Cas9は、CRISPR系によって産生されるエンドヌクレアーゼ酵素であり、crRNAとtracrRNAに導かれて配列特異的にゲノムDNAに結合し、DNAを切断する(Deltcheva, E et al., Nature 2011; 471(7340):602-607)。tracrRNA-crRNAのヘアピン構造を模倣したガイドRNA(sgRNA)を使用することにより、一分子のsgRNAでCas9によるDNA切断を誘起する(Jinek, M M et al., Science 2012; 337:816-821)。Cas9によるDNA切断の特異性はsgRNAによって規定されており、sgRNAはPAMモチーフを必要とする(Marraffini, L A and Sontheimer, E J, Nature 2010; 463: 568)。
CRISPR/Cas9ゲノム編集プラスミドは、sgRNAの5'側の20塩基で標的配列を認識し、標的配列の直下に存在するPAM配列の上流3つ目と4つ目の間をCas9が切断し平滑末端が生じることが知られている。
CRISPR/Cas9ゲノム編集プラスミドは、例えばCas9 SmartNucleaseTM All-in-one Vector (System Biosciences)、pCas-GuideTM (OriGene)、pLV-U6g-EPCG（Sigma-Aldrich）、pGuide-it(TAKARA)などの製品を、切断される標的に適したsgRNAをCRISPR/Cas9システムに挿入するために利用することができる。また、CRISPR/Cas9システムについては、特許文献、例えばEP2764103A2、WO2014/093661A3などにも記載されている。
次に、もう一つのベクターである、すなわち、切断部位両側のそれぞれのDNA塩基配列を相同配列として含むターゲティングベクターは、環状ウイルスゲノムDNAの単離のための後述の実施例1(2)及び図1B（ドナープラスミド）に記載した方法に従って作製可能である。
先ず、上記例示のような環状ウイルスゲノムDNAの（特定の遺伝子の）CRISPR/Cas（好ましくは、CRISPR/Cas9）切断部位を特定する。次いで、当該切断部位を含むDNA断片を好ましくはPCR（polymerase chain reaction）により増幅する。その際、切断部位の両側が好ましくは200〜1,000、さらに好ましくは200〜900塩基対となるようにプライマー（オリゴヌクレオチド）を合成する。当該切断部位を含むDNA断片のサイズは、1,000塩基対を超えてもよい。このとき、プライマー内にあらかじめ制限酵素部位をデザインしておくことで、このDNA断片を各種プラスミドベクターにクローン化することができる。クローン化したDNA断片の塩基配列は公知の塩基配列決定法（例えばSanger法など）を用いて決定することができる。
ドナープラスミド内にCRISPR/Cas切断部位を持つ特定ウイルス遺伝子を持つ場合には、この切断部位のDNA塩基配列内にCRISPR/Cas切断に耐性を付与する変異配列を導入することでドナープラスミドのCRISPR/Casによる切断を回避できる。前記切断部位を含む配列の好ましい変異は、例えばサイレントミューテーションであり、これはコドン内のヌクレオチドを変更するが、コードするアミノ酸を変えないようにする変異である。
本発明のターゲティングベクターは、プラスミドおよび大腸菌人工染色体(BAC)ベクター（大サイズのDNA配列を挿入可能なベクター）を組み合わせて含むものを基本とする。
ターゲティングベクターにはさらに、少なくとも１種のレポーター蛋白質（又は選択マーカー）をコードする塩基配列を含有させることができる。レポーター蛋白質（又は選択マーカー）は、例えば、蛍光蛋白質（例えばGFP、EGFPなど）、抗生物質耐性遺伝子（例えばアンピシリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子など）によりコードされる蛋白質などであるが、これらに限定されない。
ターゲティングベクターの例は、図1Bに示されるドナープラスミドである。このプラスミドは、EBウイルスの環状ゲノムDNA（約175kb）のBVRF1遺伝子およびBVLF1遺伝子にわたる領域内、とりわけBVRF1遺伝子内、のCRISPR/Cas9切断部位の両側の塩基配列と相同である230bp相同配列（BVRF1側）と850bp相同配列（BVLF1側）をpBSベクター（Amprを含む）に挿入し、両者の間にBACベクター配列（Cmrを含む）、Hygr, GFPの各レポーター蛋白質／選択マーカーをコードするDNAを図に示すような配向で挿入して作製したものである。（図1B、および図1の説明参照）。
本発明の方法では、上記のCRISPR/Casゲノム編集プラスミドと、上記のターゲティングベクターとを上記細胞に導入し、それによって上記細胞内で上記ウイルスゲノムDNAの相同組換え修復を誘導し、その後、相同組換え修復により生じた組換えウイルスゲノムDNAを回収する。
細胞内への２つのベクターの導入は、トランスフェクションによって行うことができる。このとき、例えばリポフェクション法、エレクトロポレーションなどの公知の手法を用いて当該ベクターを細胞内に容易に導入することができる（Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press）。
組換えウイルスゲノムDNAの回収は、細胞からエピゾーム分画を濃縮して回収する方法を用いる。すなわち界面活性剤を含むアルカリ溶液で処理した後、強く攪拌することでゲノムDNAを機械的に切断し、その後蛋白質を除去してエタノール沈殿することで、エピゾーム分画を濃縮できる。取得したエピゾーム分画の一部を用いて、エレクトロポレーションにより大腸菌に導入し、クロラムフェニコール耐性のコロニーを取得する。得られたクロラムフェニコール耐性コロニーについて、EBウイルスゲノムDNAの有無をコロニーダイレクトPCR法により調べることで、目的とする組換えウイルスゲノムDNAを保持するコロニーを選別する。その後、該大腸菌からウイルスゲノムDNAを回収し、制限酵素解析を行い、ウイルスゲノムDNAがクローン化されていることを確認する。必要に応じて、さらに組換えウイルスゲノムDNAの塩基配列を決定する。塩基配列を決定するための方法として、例えば次世代シークエンス法（例えばPacBioシークエンサー（Pacific Biosciences社））を挙げることができる。
本発明はさらに、上記１．で説明した方法によってウイルス感染細胞から組換え環状ウイルスゲノムDNAを単離する工程、前記組換え環状ウイルスゲノムDNAを細胞に導入して感染性ウイルス粒子を再構成する工程を含む、感染性ウイルス粒子再構成のための方法を提供する。
具体的には、本発明は、上記１．で説明した方法によってウイルス感染細胞から組換え環状ウイルスゲノムDNAを単離する工程、該組換え環状ウイルスゲノムDNAを細胞に導入し該環状ウイルスゲノムDNAを安定に維持する細胞を樹立する工程、並びに、樹立した細胞においてウイルス産生誘導をかけて感染性ウイルス粒子を産生し、培養上清中に放出された感染性ウイルス粒子を回収する工程を含む、感染性ウイルス粒子を再構成する方法を提供する。
上記細胞は、ウイルス粒子を産生可能であるならばいずれの細胞も使用できる、好ましい細胞は、HEK293細胞、EBウイルス陰性Akata細胞、AGS細胞などである。
２．ターゲティングベクター
本発明はさらに、環状ウイルスゲノムDNAのCRISPR/Cas切断部位両側の200〜1,000塩基対上流配列及び200〜1,000塩基対下流配列、並びに少なくとも１種のレポーター蛋白質をコードする塩基配列を含む、ターゲティングベクターを提供する。
上記CRISPR/Casは、上記のとおり、好ましくはCRISPR/Cas9である。
本発明はさらに、環状ウイルスゲノムDNAのCRISPR/Cas切断部位両側の200〜1,000塩基対上流配列及び200〜1,000塩基対下流配列、並びに少なくとも１種のレポーター蛋白質をコードする塩基配列を含む、ターゲティングベクターを提供する。
上記CRISPR/Casは、上記のとおり、好ましくはCRISPR/Cas9である。
本発明のターゲティングベクターは、好ましくは大腸菌人工染色体（BAC）ベクターを含み、さらに好ましくはプラスミドと大腸菌人工染色体（BAC）ベクターを組み合わせて含む。
上記ウイルスとして、上で説明したようなエプスタイン-バーウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、ヘルペスウイルスサイミリ、またはマウスヘルペスウイルス68(MHV-68)を例示できる。
さらにまた、本発明のターゲティングベクターにおいて、上記CRISPR/Cas切断部位がCRISPR/Cas切断に耐性を付与する変異導入配列を含むことができる。そのような変異導入配列は、ウイルス遺伝子配列内に存在することが好ましい。
具体的には、本発明のターゲティングベクターは、EBウイルスの環状ゲノムDNAのBVRF1遺伝子-BVLF1遺伝子内にあるCRISPR/Cas9切断部位の上流約200塩基対配列及び下流約850塩基対配列、少なくとも１種のレポーター蛋白質好ましくはGFP蛋白質をコードする塩基配列を含み、少なくとも１種の薬剤耐性遺伝子好ましくはハイグロマイシン耐性遺伝子あるいはピューロマイシン耐性遺伝子を含み、さらに大腸菌人工染色体(BAC)ベクター配列を含むターゲティングベクターを提供する。
ターゲティングベクターの具体的な例は、非限定的に、図１Ｂに示されるドナープラスミドである。
このターゲティングベクターは、環状EBVゲノムDNA上において、上記BVRF1遺伝子部位以外の部位をCRISPR/Casの標的とするように構築することもできる。該部位への外来遺伝子の挿入によりウイルス遺伝子の本来の機能を妨げないような部位を選択することが望ましい。こうした候補部位は、ウイルスゲノム上に多数存在し、例えばウイルス遺伝子のコーディング配列以外の部位である。あるいは、上記のとおり、ウイルス遺伝子の本来の機能を妨げないようにするために、上記のCRISPR/Cas切断に耐性を付与する変異をウイルス遺伝子配列に導入することができる。
本発明はさらに、上記のターゲティングベクターと、上記のCRISPR/Casゲノム編集プラスミドとを含む、約100kb以上のサイズの環状ウイルスゲノムDNAを単離するためのキットを包含する。
ターゲティングベクターおよびCRISPR/Casゲノム編集プラスミドについては上で説明したものをキットに含めることができる。キットにはさらに、環状ウイルスゲノムDNAを単離するための使用説明書などを含めることできる。
本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は当該実施例によって制限されるものではない。
[実施例１]実験手順
以下に本発明に関わる実験手順を説明する。
以下に本発明に関わる実験手順を説明する。
（１）細胞培養
SNU719細胞は、10% FBS及びペニシリン-ストレプトマイシン(PC-SM)を補充したRPMI 1640培地中で培養された。
SNU719細胞は、10% FBS及びペニシリン-ストレプトマイシン(PC-SM)を補充したRPMI 1640培地中で培養された。
YCCEL1細胞は、10% FBS、非必須アミノ酸及びPC-SMを補充した最少必須培地中で培養された。
HEK293細胞は、組換えウイルス産生のために使用されたが、この細胞は、公知の手法（Kanda T, et al. (2015) J Virol 89(5):2684-2697）によって培養された。
HDK1-K4DT細胞は、補充成分(Invitrogen 17005-042)を含むケラチノサイトSFM中で培養された。
（２）CRISPR/Cas9及びドナープラスミドの構築
野生型EBV（EBV-wt）の134,663ヌクレオチド番号に相当するBssHII部位をCRISPR/Cas9切断部位として選択した(図4)。この部位は、本発明者らがこれまでEBVゲノム標的の中でトランスジーン標的部位として使用したものである（Kanda T, et al. (2015) J Virol 89(5):2684-2697）。アニール化されたオリゴヌクレオチド(sgEBV top(配列番号1）及びsgEBV bottom(配列番号2）)をpX330のBbsI部位にクローン化しpX330-sgEBVを得た。
野生型EBV（EBV-wt）の134,663ヌクレオチド番号に相当するBssHII部位をCRISPR/Cas9切断部位として選択した(図4)。この部位は、本発明者らがこれまでEBVゲノム標的の中でトランスジーン標的部位として使用したものである（Kanda T, et al. (2015) J Virol 89(5):2684-2697）。アニール化されたオリゴヌクレオチド(sgEBV top(配列番号1）及びsgEBV bottom(配列番号2）)をpX330のBbsI部位にクローン化しpX330-sgEBVを得た。
EBV SacI upプライマー（配列番号3）とEBV SacI downプライマー（配列番号4）を用いて標的領域に亘るSNU719 EBV (又は、YCCEL1 EBV)の SacI断片(1088 bp)をPCR増幅した(図4)。PCR産物をBamHI及びEcoRIによって消化し、pCAG-EGxxFP中にクローン化してレポータープラスミドpCAG-EG-ebv-FPを得た。mBVRF forプライマー（配列番号5）とmBVRF revプライマー（配列番号6）を用いてPCR法による変異導入法（Shimada A, et al. (2009) Genes Dev 23(1):18-23）によりBVRF1コード配列にサイレントミューテーションを導入して pCAG-EG-mebv-FPを得た。
PCR増幅されたSacI断片をpBluescript II-SKにクローン化してpBS-SNU719 (EBV上流側をベクターのKpnI側に配置した)を作製した。BssHII inv upプライマー（配列番号7）及びBssHII inv downプライマー（配列番号8）を用いて、単一のPacI部位をCRISPR/Cas9標的部位のところに作製し、pBS-SNU719-PacIを得た。M13-20プライマー（配列番号9）、mBVRF1 revプライマー（配列番号6）、mBVRF1 forプライマー（配列番号5）及びPacI revプライマー（配列番号10）、並びにpBS-SNU719 (鋳型)を用いてBVRF1サイレントミューテーションを有するPCR産物を得た。この後、PCR産物をSpeIとPacIによって消化し、pBS-SNU719-PacIの対応する部位にクローン化してpBS-SNU719-BVRF1(+)-PacIを得た。PacI断片（これは、BACベクター配列、EGFP遺伝子及びハイグロマイシン耐性遺伝子からなる（Kanda T, et al. (2015) J Virol 89(5):2684-2697））をpBS-SNU719-BVRF1(+)-PacIのPacI部位にクローン化してSNU719 EBVを標的とするドナープラスミドを作製した。
YCCEL1 EBVの上流相同領域はSNU719 EBVの相同領域と同じであるが、一方、その下流相同領域は同じではない (図4（配列番号17及び18)）。pBS-SNU-PacIの上流相同領域をYCCEL1 EBV DNAと置換するために、pBS-SNU-PacIのTth111I-HpaI断片を、対応するYCCEL1 EBV断片と置換してpBS-YCCEL1-PacIを得た。YCCEL1 EBVを標的とするドナープラスミドを上記の方法に従って構築した。
（３）EBVゲノム標的化と大腸菌コロニースクリーニング
6ウエルディッシュのウエル内でSNU719細胞(又は、YCCEL1細胞)を平板培養し、Viafect(登録商標)試薬(Promega)を用いて、0.4μgのドナープラスミドと4μgのpX330-sgRNA(+) (YCCEL1細胞については各2μg)でトランスフェクションした。トランスフェクション後２日目に、得られた細胞を10cmディッシュ上にまきなおし、その後、ハイグロマイシン（SNU719細胞の場合30μg/ml、YCCEL1細胞の場合50μg/ml)による選択を行った。トランスフェクションして３週間後にハイグロマイシン耐性細胞を集めて、その細胞から既に報告した方法により（Kanda T et al. (2004) J Virol 78(13):7004-7015）エピゾームDNAを調製した。
6ウエルディッシュのウエル内でSNU719細胞(又は、YCCEL1細胞)を平板培養し、Viafect(登録商標)試薬(Promega)を用いて、0.4μgのドナープラスミドと4μgのpX330-sgRNA(+) (YCCEL1細胞については各2μg)でトランスフェクションした。トランスフェクション後２日目に、得られた細胞を10cmディッシュ上にまきなおし、その後、ハイグロマイシン（SNU719細胞の場合30μg/ml、YCCEL1細胞の場合50μg/ml)による選択を行った。トランスフェクションして３週間後にハイグロマイシン耐性細胞を集めて、その細胞から既に報告した方法により（Kanda T et al. (2004) J Virol 78(13):7004-7015）エピゾームDNAを調製した。
エピゾームDNAの一部をPCR分析に供した。上流領域を増幅するためにrt recom forプライマー（配列番号11）及びBAC vec downプライマー（配列番号12）を用いた。一方、下流領域を増幅するために、lt recom forプライマー（配列番号13）及びlt recom downプライマー（配列番号14）を用いた。エピソームDNAの残りの一部を用いてDH10B ElectroMaxコンピテント細胞 (Invitrogen)を形質転換してクロラムフェニコール耐性大腸菌コロニーを得た。このコロニーを、BamW upプライマー（配列番号15）及びBamW downプライマー（配列番号16）を用いたコロニーダイレクトPCR法によってスクリーニングし、EBV BamHI W断片の存在を調べた。PCR産物が得られた大腸菌コロニーを増殖し、BACmid DNAをミニプレパレーション法によって抽出した（Kanda T et al. (2004) J Virol 78(13):7004-7015））。
（４）EBV-BAC DNAの配列決定
EBV-BACクローンDNAをNucleobond BAC100 kit (Macherey-Nagel,ドイツ)を用いて調製した。混在している大腸菌ゲノムDNAは、Plasmid-Safe ATP-dependent DNase (Epicentre)を用いて説明書に従って酵素消化して除去した。PacBio配列決定法によって得られたコンティグ配列をトリミングして重複配列とトランスジーン配列を除去し、SNU719 EBVゲノム及びYCCEL1 EBVゲノムの配列を得た。EBV-wtのオープンリーディングフレーム（ORF）に相当するほぼすべてのORFが決定された。2個のORFにおいて配列決定エラーによると推定される内部終止コドンが認められたが、Sanger配列決定の結果を参照することによって修復された。
EBV-BACクローンDNAをNucleobond BAC100 kit (Macherey-Nagel,ドイツ)を用いて調製した。混在している大腸菌ゲノムDNAは、Plasmid-Safe ATP-dependent DNase (Epicentre)を用いて説明書に従って酵素消化して除去した。PacBio配列決定法によって得られたコンティグ配列をトリミングして重複配列とトランスジーン配列を除去し、SNU719 EBVゲノム及びYCCEL1 EBVゲノムの配列を得た。EBV-wtのオープンリーディングフレーム（ORF）に相当するほぼすべてのORFが決定された。2個のORFにおいて配列決定エラーによると推定される内部終止コドンが認められたが、Sanger配列決定の結果を参照することによって修復された。
（５）系統学的解析
EBVゲノム配列は、GenBank: GD1 (accession number AY961628.3), Akata (KC207813.1), wt (NC_007605.1), M81 (KF373730), Mutu (KC207814.1)から取得した。ゲノムDNAの整列比較を行う際は、EBVゲノム上の反復配列(すなわち、Family of Repeats配列、インターナルリピート1-4、及びターミナルリピート)は除外した。系統樹は、Tamura-Neiモデル（Tamura K & Nei M (1993) Mol Biol Evol 10(3):512-526）をベースにしたMaximum Likelihood法とGamma distribution法（部位間の進化率の差をモデル化するために使用される。）により作製した。
EBVゲノム配列は、GenBank: GD1 (accession number AY961628.3), Akata (KC207813.1), wt (NC_007605.1), M81 (KF373730), Mutu (KC207814.1)から取得した。ゲノムDNAの整列比較を行う際は、EBVゲノム上の反復配列(すなわち、Family of Repeats配列、インターナルリピート1-4、及びターミナルリピート)は除外した。系統樹は、Tamura-Neiモデル（Tamura K & Nei M (1993) Mol Biol Evol 10(3):512-526）をベースにしたMaximum Likelihood法とGamma distribution法（部位間の進化率の差をモデル化するために使用される。）により作製した。
（６）不死化ケラチノサイトへのEBV感染
文献記載の方法に従ってHDK1-K4DT細胞にEBVレセプターであるCR2をレトロウイルスベクターで発現させた（Kanda T et al. (2015) J Virol 89(5):2684-2697）。次いで、得られたHDK1-CR2細胞にSNU719-BACウイルス又はYCCEL1-BACウイルスを感染させた。EBVの安定感染したHDK1-CR2細胞集団をハイグロマイシン選択 (5μg/ml)によって得た。
文献記載の方法に従ってHDK1-K4DT細胞にEBVレセプターであるCR2をレトロウイルスベクターで発現させた（Kanda T et al. (2015) J Virol 89(5):2684-2697）。次いで、得られたHDK1-CR2細胞にSNU719-BACウイルス又はYCCEL1-BACウイルスを感染させた。EBVの安定感染したHDK1-CR2細胞集団をハイグロマイシン選択 (5μg/ml)によって得た。
[実施例２]CRISPR/Cas9によるウイルスエピゾームの切断
この実施例では、CRISPR/Cas9によるウイルスエピソームDNAの切断によってその切断部位に高効率でトランスジーンを挿入できることを示す。
この実施例では、CRISPR/Cas9によるウイルスエピソームDNAの切断によってその切断部位に高効率でトランスジーンを挿入できることを示す。
SNU719及びYCCEL1は、韓国胃がん患者から樹立されたEBV陽性胃がん細胞株である（Oh ST, et al. (2004) Virology 320(2):330-336、Kim do N, et al. (2013) J Gen Virol 94(Pt 3):497-506）。蛍光in situハイブリダイゼーション (FISH)により、 EBVゲノム由来のシグナルが間期核内に点在すること、またシグナルが細胞分裂期染色体に付着していることから(図1A)、EBVゲノムが二本鎖環状DNAすなわちエピゾームとして維持されていることが考えられた。SNU719細胞のEBVエピゾームを従来の相同組換え法によりBACベクターにクローン化することを試みたが、不成功に終わった（データ示さず）。これは相同組換えの効率が低すぎたためと考えられた。
従って、本発明者らは、CRISPR/Cas9によるゲノム編集技術を使用して相同組換えの効率の向上を図った。BVRF1のORF内のDNA配列を標的部位として選択した (図1B及び図6)。まずhCas9発現カセット、及びEBV DNAを標的とするガイドRNAとを組み込んだプラスミド(pX330-sgEBV)を構築した。最初にpX330-sgEBV がEBVゲノム内の標的配列を切断する効率を、標的EBV配列をGFP ORF間に組み込んだGFPレポータープラスミド（Mashiko D et al. (2013) Sci Rep 3:3355）(図1C)を用いて確認した。レポータープラスミドとpX330-sgEBVとをHEK293細胞内にトランスフェクションすると、48時間後に強いEGFP発現が観察された。このことは、EBV標的配列の切断が、相同組換え修復によるGFPコーディング配列の再構成を惹起したことを示す(図1C)。同じレポーター遺伝子系を用いて、CRISPR/Cas9系がSNU719細胞及びYCCEL1細胞内でも同様に機能することが実証された（データ示さず）。
本発明者らは、次いでBACベクター配列、ハイグロマイシン耐性遺伝子、並びにGFP遺伝子をEBVゲノム切断部位に挿入するためのドナープラスミドを構築した(図1B)。短い上流及び下流相同領域(図1B中の230bp及び850bp DNA断片)をドナープラスミド中に組み込んだ。EBV DNA切断部位はBVRF1遺伝子（ウイルス産生において必須である小カプシド蛋白質をコードする。）の内部に位置する(図1B)ため、本発明者らは、サイレントミューテーションを導入することによってCRISPR/Cas9耐性BVRF1遺伝子を構築し、当該遺伝子をドナープラスミドの上流相同領域に組み込んだ。この変異導入されたDNA断片は実際にCRISPR/Cas9によるDNA切断に対し耐性になることが証明された(図1C)。
上記のドナープラスミドとpX330 (sgRNAを含まない。)又はpX330-sgEBVのいずれかを SNU719細胞内に同時にトランスフェクションし、得られた細胞を３週間ハイグロマイシン選択した。細胞に上記ドナープラスミドとpX330-sgEBV の両者をトランスフェクションすると、ハイグロマイシン耐性、かつGFP陽性である細胞コロニーが現れた(図1D)が、一方、pX330とトランスフェクションした時にはGFP陽性細胞はほとんど出現しなかった。ディッシュ上に出現したハイグロマイシン耐性細胞コロニーを集めて、エピゾームDNAを調製した。エピゾームDNAサンプルをPCRで解析した結果、ドナープラスミドとpX330-sgEBVの両者をトランスフェクションした時のみ相同組換え修復が起きることが確認され、pX330を用いた場合には修復が起きないことが判明した(図1E)。また、直鎖状ドナープラスミドでなく、環状ドナープラスミドのみが相同組換え修復を誘導することが判明した(図5)。エピゾームDNAの一部を用いて大腸菌を形質転換し、得られたクロラムフェニコール耐性大腸菌コロニーを、EBVインターナルリピート1(IR1)配列の存在についてPCRにより選抜した。その結果、SNU719由来のEBV-BACクローンが容易に同定された(図6A)。全クロラムフェニコール耐性コロニーの中からEBV-BACクローンを得る頻度は8.8%(3/34)から47.8%(22/46)であった。得られたEBV-BACクローンのほとんどが同じBamHI及びEcoRI消化パターンを示したが、一方、異なる消化パターンのクローンも少し例外的に存在した(図6A,B)。これらの例外的なクローンは人工的に再構成されたものであるのか、或いは生物学的な意味のあるマイナーなEBV集団を表すのかは、今のところ不明である。
同様の実験手法によりYCCEL1由来のEBV-BACクローンを得た(図1D、図1E及び図6B)。このことは、当該実験方法の汎用性の高さを示している。
[実施例３]胃がん由来EBVゲノムのPacBio単一分子リアルタイム配列決定法による全塩基配列決定
本発明者らは、代表的な制限酵素消化パターンを示すEBV-BAC クローンをそれぞれSNU719 EBV-BAC (SNU719-BAC)及びYCCEL1 EBV-BAC (YCCEL1-BAC)として選択し、各クローンをさらに詳細に解析した(図2A)。BamHI及びEcoRI消化バンドをサザンブロットにより分析し（データ示さず）、各バンドがEBV B95-8株DNAから得られるBamHI及びEcoRI消化バンドのどのバンドに対応するのか確定した(図2A及び図6A,B)。SNU719-BAC及びYCCEL1-BACは有意に異なる制限酵素消化パターンを示すことが分かった。精製されたEBV-BACクローンのDNAをDNA配列決定に供した(図2B)。EBV株YCCEL1のゲノム配列はこれまでハイブリッド捕捉法によって決定されている(GenBankアクセッションno. LN827561.1)が、このゲノム内に存在する数多くの反復領域の塩基配列は依然決定されていない。そこで本発明者らは、従来採用されていたシークエンス法とは異なる方法としてPacBio単一分子リアルタイム配列決定法を採用した（Eid J et al. (2009) Science 323(5910):133-138；Tombacz D et al. (2014) Genome Announc 2(4)）。その結果、平均長13 kbの長いリード（read、塩基配列情報）が得られ(図7)、SNU719 EBV-BACクローン及びYCCEL1 EBV-BACクローンの両方について全長180kb以上のコンティグ（contig）を構築することができた。EBV-BAC クローンのBamHI及びEcoRI消化DNA断片の実際のサイズは、得られたコンティグ配列と非常によく対応していた(図2A及び図6A,6B)。
本発明者らは、代表的な制限酵素消化パターンを示すEBV-BAC クローンをそれぞれSNU719 EBV-BAC (SNU719-BAC)及びYCCEL1 EBV-BAC (YCCEL1-BAC)として選択し、各クローンをさらに詳細に解析した(図2A)。BamHI及びEcoRI消化バンドをサザンブロットにより分析し（データ示さず）、各バンドがEBV B95-8株DNAから得られるBamHI及びEcoRI消化バンドのどのバンドに対応するのか確定した(図2A及び図6A,B)。SNU719-BAC及びYCCEL1-BACは有意に異なる制限酵素消化パターンを示すことが分かった。精製されたEBV-BACクローンのDNAをDNA配列決定に供した(図2B)。EBV株YCCEL1のゲノム配列はこれまでハイブリッド捕捉法によって決定されている(GenBankアクセッションno. LN827561.1)が、このゲノム内に存在する数多くの反復領域の塩基配列は依然決定されていない。そこで本発明者らは、従来採用されていたシークエンス法とは異なる方法としてPacBio単一分子リアルタイム配列決定法を採用した（Eid J et al. (2009) Science 323(5910):133-138；Tombacz D et al. (2014) Genome Announc 2(4)）。その結果、平均長13 kbの長いリード（read、塩基配列情報）が得られ(図7)、SNU719 EBV-BACクローン及びYCCEL1 EBV-BACクローンの両方について全長180kb以上のコンティグ（contig）を構築することができた。EBV-BAC クローンのBamHI及びEcoRI消化DNA断片の実際のサイズは、得られたコンティグ配列と非常によく対応していた(図2A及び図6A,6B)。
その後、トランスジーン配列をEBV-BAC配列から除き、SNU719及びYCCEL1 EBVゲノムの配列を得た(アクセッションno. AP015015及び AP015016)。SNU719 EBV及び YCCEL1 EBVのゲノムサイズはそれぞれ169425 bp、177320 bpであった。このサイズの違いは、主にWリピート(インターナルリピート1, IR1)及びターミナルリピートのコピー数の違い（すなわちSNU719 EBV及び YCCEL1 EBV についてそれぞれ6コピー対7.6コピーのWリピート、5コピー対12コピーのターミナルリピート）に起因している(図2C)。また30 bpのパリンドロームリピートの集積配列であるFamily of repeatsは、サンガー法で配列決定することが困難であることが知られている(Kanda T et al. (2011) PLoS One 6(11):e27758)が、PacBio配列決定法によりFamily of repeatsの一次塩基配列も決定することができた。この結果により、SNU719株及びYCCEL1株EBVのFamily of repeats領域も、30 bpユニットが反対方向に並ぶ亜領域に分割できることを示した(図8)。
SNU719 EBV及びYCCEL1 EBVのDNA配列を系統分類分析に供した。GenBankに寄託された５つの代表的EBVゲノム配列 [EBV-wt（de Jesus O, et al. (2003) J Gen Virol 84(Pt 6):1443-1450）、GD1（Zeng MS et al. (2005) J Virol 79(24):15323-15330）、M81（Tsai MH et al. (2013) Cell Rep 5(2):458-470）、Akata and Mutu（Lin Z, et al. (2013) J Virol 87(2):1172-1182）] を参照配列として使用した。SNU719 EBV及びYCCEL1 EBV（ともに韓国の胃がん患者に由来する。）は、GD1, M81(ともに中国のNPC患者に由来する。)及びAkata (日本のバーキットリンパ腫患者に由来する。)に近縁であるが、EBV-wt[B95.8 (US起源)及びRaji(アフリカのバーキットリンパ腫患者に由来する。)の配列の組み合せ]及びMutu (アフリカのバーキットリンパ腫患者に由来する。)と異なる(図2D)。これらの結果は、異なるEBV株が地理的に異なる地域 (東アジア、アフリカ諸国、及び西側諸国) に分布しているというこれまでの見方と一致する（Palser AL et al. (2015) J Virol 89(10):5222-5237；Tsai MH et al. (2013) Cell Rep 5(2):458-470；Feederle R et al. (2015) Curr Top Microbiol Immunol 390:119-148）。
ウイルスゲノムDNAの蛋白質読み取り枠の解析（アノテーション解析）により、SNU719 EBV及び YCCEL1 EBVによってコードされるウイルス後期蛋白質のアミノ酸(a.a.)数がEBV-wtによってコードされるものとかなり異なることが示された(表1)。SNU719 EBV及びYCCEL1 EBV間のアミノ酸配列の比較により、LMP1 a.a.配列(100%同一)とEBNA2 a.a.配列(N末端のプロリンに富むドメインを除くと100%同一)が高度に保存されていることが示された。LMP2A a.a.配列(99.7%同一)及びEBNA1 a.a配列(インターナルグリシン-アラニンリピートを除くと99.7%同一)もまた株間で非常によく保存されているが、EBNA3類のa.a.配列は非常に異なっている。LF3読取り枠は、これまでの研究で指摘されてきたように保存されていなかった（Lin Z, et al. (2013) J. Virol. 87(2): 1172-1182）。
これらの結果は、EBVエピゾームのBACクローニングと、その後のPacBio単一分子配列決定法が、種々のEBV株の完全配列を得るための強力なツールであることを示している。
[実施例４]再構成されたウイルスによる細胞感染
本実施例では、上記の再構成ウイルスをB細胞及び上皮細胞に感染させることを示す。
親株である胃がん細胞SNU719及び YCCEL1細胞はウイルス産生できない。これに対して、本発明者らは、SNU719由来の、又は、YCCEL1由来のEBV-BACクローンのいずれかで安定的にトランスフェクションされたHEK293細胞が、感染性子孫ウイルスを産生できることを見出した(図3A)。初代Bリンパ球を上記組換えウイルスに感染させて、GFPを発現するリンパ芽球細胞系を樹立した(図3B)。50%形質転換濃度は、SNU719ウイルスの場合およそ104.5 TD50/ml、YCCEL1ウイルスの場合およそ104.3 TD50/mlであった。SNU719及びYCCEL1細胞は、EBNA1蛋白質のみを発現する１型潜伏感染状態（Oh ST et al. (2004) Virology 320(2):330-336；Kim do N et al. (2013) J Gen Virol 94(Pt 3):497-506）にあったが、樹立されたリンパ芽球様細胞株は３型潜伏感染状態となり、この細胞株はEBNA1, EBNA2, EBNA3A, EBNA3C, LMP1及びLMP2Aを発現した(図3C)。異なるウイルス株のウイルス潜伏感染蛋白質は電気泳動上異なるバンド移動度を示し、またこの結果は塩基配列から推定された蛋白質のサイズと非常によく対応していた(図3C及び表1)。
本実施例では、上記の再構成ウイルスをB細胞及び上皮細胞に感染させることを示す。
親株である胃がん細胞SNU719及び YCCEL1細胞はウイルス産生できない。これに対して、本発明者らは、SNU719由来の、又は、YCCEL1由来のEBV-BACクローンのいずれかで安定的にトランスフェクションされたHEK293細胞が、感染性子孫ウイルスを産生できることを見出した(図3A)。初代Bリンパ球を上記組換えウイルスに感染させて、GFPを発現するリンパ芽球細胞系を樹立した(図3B)。50%形質転換濃度は、SNU719ウイルスの場合およそ104.5 TD50/ml、YCCEL1ウイルスの場合およそ104.3 TD50/mlであった。SNU719及びYCCEL1細胞は、EBNA1蛋白質のみを発現する１型潜伏感染状態（Oh ST et al. (2004) Virology 320(2):330-336；Kim do N et al. (2013) J Gen Virol 94(Pt 3):497-506）にあったが、樹立されたリンパ芽球様細胞株は３型潜伏感染状態となり、この細胞株はEBNA1, EBNA2, EBNA3A, EBNA3C, LMP1及びLMP2Aを発現した(図3C)。異なるウイルス株のウイルス潜伏感染蛋白質は電気泳動上異なるバンド移動度を示し、またこの結果は塩基配列から推定された蛋白質のサイズと非常によく対応していた(図3C及び表1)。
本発明者らは、さらに組換えウイルスSNU719-BAC及びYCCEL1-BACが上皮細胞への安定な感染を達成できるかどうかを試験した。初代上皮細胞又はその不死化細胞にCR2を強制発現し、被感染細胞として使用した。初代上皮細胞は、上記ウイルスに一時的に感染してGFP蛋白質を発現したが、GFP陽性細胞は増殖しなかった（データ示さず）。これに対して、不死化したヒト皮膚ケラチノサイトHDK1-K4DT細胞（Egawa N, et al. (2012) J Virol 86(6):3276-3283）を被感染細胞として使用した場合は、GFP陽性細胞がハイグロマイシン選択下で増殖し、その結果として100% GFP陽性の細胞集団が樹立された(図3D)。感染したHDK1細胞は微量のEBNA1蛋白質のみを発現し、他のウイルス潜伏感染蛋白質を発現しなかった。このことは、当該細胞が１型潜伏感染状態にあることを示している(図3C)。この細胞はまたBARTマイクロRNA群を発現したが、それらの発現量は、親株である胃がん細胞株と比べてかなり低レベルであった(図3E)。しかしながらBARTマイクロRNAの標的遺伝子として同定されているNDRG1(N-myc downstream regulated gene 1)（Kanda T et al. (2015) J Virol 89(5):2684-2697）遺伝子の発現抑制がEBV感染細胞で観察されたことから(図3C)、発現されたマイクロRNAは機能していることが証明された。また完全なBACクローンがEBV感染ケラチノサイト細胞から回収されたことから、SNU719-BACウイルス及びYCCEL1-BACウイルスがエピゾームとして保持されていることが判明した（データ示さず）。
上記の実施例で使用したプライマーをまとめて以下の表２に示す。
上記の実施例で使用したプライマーをまとめて以下の表２に示す。
本発明により、巨大環状ウイルスゲノムとして細胞に潜伏感染する様々なウイルスゲノムDNAを従来法に比べてより効率的に単離することができる。その結果、単離されたウイルスゲノムDNAの塩基配列を決定し、組換えウイルス粒子を再構成することによって、ウイルス感染能力、細胞形質転換能など様々な性質について解析できるようになる。また、例えばEBウイルスによる発がんメカニズムの解明に応用できるし、さらにまた、特殊な性質をもつウイルス株を単離し、ワクチン株として使用することによってウイルス感染防御に役立てることが可能である。
配列番号１〜16：プライマー
Claims (14)
- ウイルス感染細胞から、約１００ｋｂ以上のサイズの環状ウイルスゲノムＤＮＡを単離する方法であって、前記細胞内の前記環状ウイルスゲノムＤＮＡを一か所で切断するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓゲノム編集プラスミドと、前記切断部位両側のそれぞれの２００〜１，０００塩基対のＤＮＡ塩基配列を相同配列として含むターゲティングベクターとを、前記細胞内に導入し、それによって前記細胞内で前記ウイルスゲノムＤＮＡの切断及び相同組換え修復を誘導する工程、並びに、前記修復された組換えウイルスゲノムＤＮＡを回収する工程を含む、上記方法。
- 前記ターゲティングベクターが少なくとも１種のレポーター蛋白質をコードする塩基配列を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記ターゲティングベクターが大腸菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクターを含む、請求項１または２に記載の方法。
- 前記ターゲティングベクターが、前記相同配列のいずれかに、該相同配列内にあるウイルス遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ切断を回避するためのサイレントミューテーション配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ウイルスが、エプスタイン−バーウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、ヘルペスウイルスサイミリ、またはマウスヘルペスウイルス６８（ＭＨＶ−６８）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ウイルス感染細胞が正常細胞またはがん細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記回収された組換えウイルスゲノムＤＮＡの塩基配列を決定する工程をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
- 請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法によってウイルス感染細胞から組換え環状ウイルスゲノムＤＮＡを単離する工程、前記組換え環状ウイルスゲノムＤＮＡを細胞に導入して感染性ウイルス粒子を再構成する工程を含む、感染性ウイルス粒子再構成のための方法。
- （１）環状ウイルスゲノムＤＮＡのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ切断部位両側の２００〜１，０００塩基対の上流相同配列及び２００〜１，０００塩基対の下流相同配列、並びに少なくとも１種のレポーター蛋白質をコードする塩基配列を含み、かつ大腸菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクターを含むターゲティングベクターと、（２）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓゲノム編集プラスミドとを含む、約１００ｋｂ以上のサイズの環状ウイルスゲノムＤＮＡを単離するためのキット。
- 前記ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９である、請求項１０に記載のキット。
- 前記ウイルスが、エプスタイン−バーウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、ヘルペスウイルスサイミリ、またはマウスヘルペスウイルス６８（ＭＨＶ−６８）である、請求項１０または１１に記載のキット。
- 前記ターゲッティングベクターが、前記上流相同配列または下流相同配列のいずれかに、該相同配列内にあるウイルス遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ切断を回避するためのサイレントミューテーション配列を含む、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のキット。
- 請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法で使用するための、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2016017387A JP6761946B2 (ja) | 2016-02-01 | 2016-02-01 | 巨大環状ウイルスゲノムｄｎａの単離方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2016017387A JP6761946B2 (ja) | 2016-02-01 | 2016-02-01 | 巨大環状ウイルスゲノムｄｎａの単離方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2017135992A JP2017135992A (ja) | 2017-08-10 |
| JP6761946B2 true JP6761946B2 (ja) | 2020-09-30 |
Family
ID=59564376
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2016017387A Expired - Fee Related JP6761946B2 (ja) | 2016-02-01 | 2016-02-01 | 巨大環状ウイルスゲノムｄｎａの単離方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6761946B2 (ja) |
-
2016
- 2016-02-01 JP JP2016017387A patent/JP6761946B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2017135992A (ja) | 2017-08-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yuen et al. | CRISPR/Cas9-mediated genome editing of Epstein–Barr virus in human cells | |
| Kanda et al. | Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated cloning and functional characterization of gastric cancer-derived Epstein-Barr virus strains | |
| Tanaka et al. | Construction of an excisable bacterial artificial chromosome containing a full-length infectious clone of herpes simplex virus type 1: viruses reconstituted from the clone exhibit wild-type properties in vitro and in vivo | |
| Adler et al. | Cloning and mutagenesis of the murine gammaherpesvirus 68 genome as an infectious bacterial artificial chromosome | |
| Chang et al. | Cloning of the full-length rhesus cytomegalovirus genome as an infectious and self-excisable bacterial artificial chromosome for analysis of viral pathogenesis | |
| Tischer et al. | A self-excisable infectious bacterial artificial chromosome clone of varicella-zoster virus allows analysis of the essential tegument protein encoded by ORF9 | |
| Nagaike et al. | Cloning of the varicella-zoster virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome in Escherichia coli | |
| Borst et al. | Genetic evidence of an essential role for cytomegalovirus small capsid protein in viral growth | |
| Wang et al. | A herpes simplex virus 2 glycoprotein D mutant generated by bacterial artificial chromosome mutagenesis is severely impaired for infecting neuronal cells and infects only Vero cells expressing exogenous HVEM | |
| WO2015115903A1 (en) | Site-specific dna break-induced genome editing using engineered nucleases | |
| Niikura et al. | Direct evidence of host genome acquisition by the alphaherpesvirus Marek’s disease virus | |
| Guo et al. | Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination promotes the rapid generation of bacterial artificial chromosomes of pseudorabies virus | |
| Wu et al. | Construction and Characterization of an Infectious Murine Gammaherpesivrus‐68 Bacterial Artificial Chromosome | |
| Nagel et al. | Construction and characterization of bacterial artificial chromosomes (BACs) containing herpes simplex virus full-length genomes | |
| Zhou et al. | Autoexcision of bacterial artificial chromosome facilitated by terminal repeat-mediated homologous recombination: a novel approach for generating traceless genetic mutants of herpesviruses | |
| EP2460878A1 (en) | Orf7 deficient varicella virus, vaccine comprising the virus and use thereof | |
| Hettich et al. | Genetic design of an optimized packaging cell line for gene vectors transducing human B cells | |
| JP6761946B2 (ja) | 巨大環状ウイルスゲノムｄｎａの単離方法 | |
| Cui et al. | The impact of genome length on replication and genome stability of the herpesvirus guinea pig cytomegalovirus | |
| JP2023543291A (ja) | ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ媒介ｉｎ ｖｉｖｏ末端分離による組換えアデノウイルスのレスキュー | |
| Logvinoff et al. | Intracellular Cre-mediated deletion of the unique packaging signal carried by a herpes simplex virus type 1 recombinant and its relationship to the cleavage-packaging process | |
| Oh et al. | CRISPR-Cas9 expressed in stably transduced cell lines promotes recombination and selects for herpes simplex virus recombinants | |
| AU747831B2 (en) | DNA virus vectors and methods for their preparation | |
| JP6775728B2 (ja) | 遺伝子組換型細胞、並びにワクチン製造方法 | |
| JP6708636B2 (ja) | Ｂｓｔ２遺伝子の機能が喪失された細胞株を利用したウィルス感染促進及び産生増進方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20181009 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20191015 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20191216 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200213 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200714 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200811 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6761946 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |