JP6708636B2 - Ｂｓｔ２遺伝子の機能が喪失された細胞株を利用したウィルス感染促進及び産生増進方法 - Google Patents

Ｂｓｔ２遺伝子の機能が喪失された細胞株を利用したウィルス感染促進及び産生増進方法 Download PDF

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Description

本発明は、Ｂｓｔ２遺伝子の機能が喪失された細胞株を利用したウィルス感染促進及び産生増進方法に関し、より詳細にはウィルス産生能のある細胞株でＢｓｔ２遺伝子を除去してウィルスの放出促進及び宿主細胞の死滅抑制効果以外に目的ウィルスの感染を促進させて産生を増加させる方法に関する。
ウィルスが体内に感染すると、感染細胞でウィルスの増殖が起きて、増殖したウィルス粒子は再び細胞膜を介して放出（ｂｕｄｄｉｎｇ ｏｕｔ）されて周辺の他の細胞を再感染させる。ウィルスの感染に対応する生体の防御メカニズムの一環として、細胞は細胞膜にＢｓｔ２（ｔｅｔｈｅｒｉｎ）というタンパク質を発現している。このタンパク質は、Ｎ末端とＣ末端の両側に細胞膜と結合する部位を有していて、あたかも細胞膜に脚のように中が上げられた形態で発現するが、Ｃ末端は、細胞膜中受容体活性化が起きる特定部位である脂質ラフト（ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔ）に位置し、Ｎ末端は、脂質ラフト（ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔ）部位の外に存在する。ウィルスが細胞の内部から細胞の外部に出芽するために、脂質ラフト部位から抜け出る時Ｂｓｔ２（ｔｅｔｈｅｒｉｎ）タンパク質は、脂質ラフト部位の外に固定された部分を介してウィルス粒子が細胞膜を突き破って出るのを抑制する。ほ乳動物の細胞におけるこのような防御機序に対して、一部のウィルスはこれを回避するための機序でＢｓｔ２タンパク質の分解を促進するタンパク質を産生して宿主細胞の抑制機能を迂回したりもする。この点、逆説的にＢｓｔ２遺伝子の機能がウィルスの産生抑制に強力に寄与することを示している。
今までワクチン製造のためのウィルスを産生するためには、有精卵にウィルス種菌を接種して増殖させる方法（ＫＲ２０１２−０１０３７３７Ａ）を使用しているが、これは卵アレルギーがある人には使用が困難であったり、ウィルス増殖用有精卵の供給安定性及びウィルス伝播などの問題点で非常に効率が落ちる短所がある。このような問題点を克服するための方法として、動物細胞培養を介してウィルスを産生してワクチンを製造する方法（ＫＲ２０１２−００３３３３４Ａ）が使用されている。無菌状態で動物細胞を大量に培養した後、ウィルスを動物細胞に感染させてワクチンを産生したり、あるいは遺伝子工学的な方法を利用して病原体で抗体生成を誘導する抗原だけを産生する方法などがこれに属する。動物細胞の培養によるワクチン製造の最も大きい長所は、産生規模の拡張性にある。ワクチン産生の原材料となる動物細胞は、培養規模に応じて希望するだけの拡張が可能である。
しかし、このような多くの長所があるにもかかわらず動物細胞培養によるワクチンの産生が容易でないのは、多少低い単位体積当たり収率のためである。動物細胞を利用してワクチンを産生する際に、低い単位体積当たり収率を克服するために、遺伝子工学的な手法を利用して優秀な宿主動物細胞株を開発しようとする試みが一部あるが（Ｊａｎｇ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ８５：１５０９−１５２０，２０１０）、まだ不十分な状態である。従って、ウィルス産生を最適化するための産生細胞株の探索、培養条件の改善及び感染条件の改善などが求められている。
以前の研究で本発明者等は、ウィルス産生能のある細胞株でＢｓｔ２遺伝子機能を喪失させて、ウィルス放出が促進されてウィルス産生能が増加して、宿主細胞の死滅が抑制されてウィルス産生細胞株の安定性が増加することを確認した（ＷＯ２０１４１４２４３３）。
そこで、本発明者等は、動物細胞株を利用したワクチン製造用目的ウィルス産生収率の向上によりウィルス産生及びウィルス抗原タンパク質製造の最適化方法を探そうと鋭意努力した結果、動物細胞株のＢｓｔ２タンパク質を除去すると、ウィルスの放出促進及び宿主細胞の死滅抑制効果以外に宿主細胞にウィルス感染が顕著に促進されて、目的ウィルスの産生が増加することを確認して本発明の完成に至った。
本発明の目的は、Ｂｓｔ２遺伝子の機能が喪失されているウィルス産生能のある細胞株に目的ウィルスを感染させることを特徴とする目的ウィルスの感染を促進させる方法を提供するところにある。
本発明の他の目的は、Ｂｓｔ２遺伝子の機能が喪失されているウィルス産生能のある細胞株に目的ウィルスを感染させた後、培養することを特徴とする目的ウィルスの産生を増進させる方法を提供するところにある。
本発明のさらに他の目的は、Ｂｓｔ２遺伝子の機能が喪失されているウィルス産生能のある細胞株に目的ウィルスを感染させた後、培養することを特徴とする抗原タンパク質の製造方法を提供するところにある。
本発明のさらに他の目的は、前記方法によって製造されたウィルス抗原タンパク質を利用することを特徴とするウィルス性疾病に対するワクチン製造方法を提供するところにある。
前記目的を達成するために、本発明は、Ｂｓｔ２遺伝子の機能が喪失されているウィルス産生能のある細胞株に目的ウィルスを感染させる工程を含む、目的ウィルスの感染を促進させる方法を提供する。
本発明はまた、Ｂｓｔ２遺伝子の機能が喪失されているウィルス産生能のある細胞株に目的ウィルスを感染させた後、培養する工程を含む、目的ウィルスの産生を増進させる方法を提供する。(
本発明はまた、Ｂｓｔ２遺伝子の機能が喪失されているウィルス産生能のある細胞株に目的ウィルスを感染させた後、培養する工程を含む、抗原タンパク質の製造方法を提供する。
本発明はまた、前記方法によって製造されたウィルス抗原タンパク質を利用することを特徴とするウィルス性疾病に対するワクチン製造方法を提供する。
重合酵素連鎖反応後、電気泳動してＢｓｔ２遺伝子機能を喪失させた細胞株（Ａ：ＭＤＣＫ細胞株、Ｂ：Ｖｅｒｏ細胞株)の突然変異を確認した結果を示した結果である。 野生型細胞株とＢｓｔ２遺伝子機能が喪失された細胞株でＭＯＩによる感染能を比較した結果である。 野生型細胞株とＢｓｔ２遺伝子機能が喪失された細胞株で感染時間による感染能を比較した結果である。 Ｖｅｒｏ細胞の野生型細胞株とＢｓｔ２遺伝子機能が喪失された細胞株Ｇ−Ｄ５で全細胞抽出物の細胞内ウィルス抗原タンパク質の増加を比較した結果である。 Ｖｅｒｏ細胞の野生型細胞株とＢｓｔ２遺伝子機能が喪失された細胞株Ｇ−Ｄ５で培養ウェル（ｗｅｌｌ）及び単位細胞当たり細胞内ウィルス抗原タンパク質の増加を比較した結果である（Ａ：培養ウェル当たりウィルス抗原タンパク質、Ｂ：単位細胞当たり細胞内ウィルス抗原タンパク質）。 ＭＤＣＫ細胞の野生型細胞株とＢｓｔ２遺伝子機能が喪失された細胞株Ｊ−Ｄ１０で全細胞抽出物及び単位細胞当たり細胞内ウィルス抗原タンパク質の増加を比較した結果である（Ａ：全細胞抽出物、Ｂ：単位細胞当たり細胞内ウィルス抗原タンパク質）。 Ｂｓｔ２遺伝子機能が喪失されたヒト２９３Ｔ細胞株でウィルス抗原タンパク質の増加を比較した結果である。
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法及び以下で詳述する實驗方法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
本発明では、動物細胞株のＢｓｔ２タンパク質を除去すると、ウィルスの放出促進及び宿主細胞死滅抑制効果以外に宿主細胞にウィルス感染が顕著に促進されて、目的ウィルス及び抗原タンパク質の産生が増加することを確認した。
本発明の方法で製造された細胞株は、野生型宿主細胞に比べてより少ない量のウィルスとより短い感染許容時間であっても簡単にウィルスに感染されて、感染されたウィルスのタンパク質が野生型宿主細胞に比べてより多く産生される特徴がある。また、感染後産生されたウィルスが、野生型宿主細胞に比べてより容易に細胞外部に放出されて、ウィルス感染された細胞が、細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）に抵抗性を有する安定した細胞でより長期間においてウィルスを産生できる特徴を有する。従って、本発明の目的ウィルスの感染促進及び産生増進方法は、ウィルス及び抗原タンパク質の産生収率向上により、ウィルス性疾病治療及び予防用ワクチン製造に有用である。
一観点において、本発明は、Ｂｓｔ２遺伝子の機能が喪失されているウィルス産生能のある細胞株に目的ウィルスを感染させる工程を含む、目的ウィルスの感染を促進させる方法に関する。
本発明において、感染を促進させる方法は、目的ウィルスの感染速度を速くするため、適切な培養細胞株がないウィルス疾患に対する新規ワクチン開発に適用が可能である。
他の観点において、本発明は、Ｂｓｔ２遺伝子の機能が喪失されているウィルス産生能のある細胞株に目的ウィルスを感染させた後、培養する工程を含む、目的ウィルスの産生を増進させる方法に関する。
本発明において、目的ウィルスの産生増進とは、ウィルスタンパク質、即ち抗原タンパク質の絶対産生量が増加することをいう。
さらに他の観点において、本発明は、Ｂｓｔ２遺伝子の機能が喪失されているウィルス産生能のある細胞株に目的ウィルスを感染させた後、培養工程を含む、抗原タンパク質の製造方法に関する。
本発明において、目的ウィルスの感染促進及び感染したウィルスの産生増進方法は、抗原タンパク質の産生量増加及び精製効率を最大化できる長所がある。また、本発明においてウィルス感染により細胞死滅が抑制されると、抗原タンパク質製造時に細胞投入周期を最小化することができて、同時にウィルス粒子が培養液に放出されることが促進されると、抗原タンパク質の絶対産生量もさらに増加させることができる。
本発明で「産生能」とは、ウィルスが宿主細胞を感染させた後、細胞内で増殖して細胞外培養液に放出されることを意味する。
本発明で「機能喪失」とは、Ｂｓｔ２遺伝子の塩基の一部を突然変異させることによって、宿主細胞へのウィルス感染促進、目的ウィルスの産生増進、細胞外培養液にウィルス放出促進及び宿主細胞の死滅を抑制させることを意味する。
本発明で「感染促進」とは、Ｂｓｔ２遺伝子の塩基の一部を突然変異させることによって、少ない数のウィルスで短い時間内に宿主細胞への浸透が行われることを意味する。
本発明で「産生増進」とは、Ｂｓｔ２遺伝子の塩基の一部を突然変異させることによって、宿主細胞当たり細胞内ウィルスタンパク質の量が増加することを意味する。
本発明で「抗原タンパク質」とは、ウィルス感染によって生じる抗原を総称であり、これらのタンパク質は、ウィルスの抗原性や病原性に関与して、宿主細胞は、これを認識してウィルスの感染に対する防御作用を現わす。インフルエンザウィルス粒子は、１６種類（Ｈ１〜Ｈ１６）の赤血球凝集素（ＨＡ）及び９種類（Ｎ１〜Ｎ９）のノイラミニダーゼ（ＮＡ）と規定される表面抗原とＳ抗原(主にリボ核タンパク質ＮＰと規定する抗原)を有してＳ抗原の血清学的特異性によってＡ、Ｂ、Ｃの３型に分けられる。
本発明で「細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）」とは、細胞が能動的に生体エネルギーであるＡＴＰを積極的に消耗しながら死に至る過程で、異常な細胞分裂、放射線、紫外線、細菌感染またはウィルス感染などの原因で細胞が正常な機能を維持できなくなる場合、誘導される細胞の縮小、ＤＮＡの規則的な切断及び細胞膜のフラグメンテーション過程を意味する。
本発明で「ウィルス」とは、ヒトや動物に疾病を誘発し得るウィルスを意味して、好ましくはインフルエンザ及びヘルペスウィルス（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）を意味して、より好ましくはＰ／Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｈ３Ｎ２及びＭＨＶ６８で構成された群から選択されるものであってもよいが、これに限定されない。
本発明において、ウィルスは、皮膜型または裸出型ウィルスであることを特徴とし、ウィルスが核酸、タンパク質のキャプシドだけで構成されたものを裸出型ウィルス（ｎａｋｅｄ ｖｉｒｕｓ）といい、キャプシドの外を皮膜が包んでいる型は皮膜型ウィルス（ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ｖｉｒｕｓ）という。
また、本発明において、ウィルスは、ＤＮＡまたはＲＮＡウィルスであることを特徴とする。ＤＮＡウィルスは、遺伝情報を担当する核酸がＤＮＡであるウィルスで、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ（ヘルペスウィルス）及び環状（ｃｉｒｃｕｌａｒ）ＤＮＡウィルスがあり、ＲＮＡウィルスは、遺伝情報を担当する核酸がＲＮＡであるウィルスで、（−）ｓｓＲＮＡ（インフルエンザウィルス）、（＋）ｓｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡウィルスがある。
本発明において、ウィルス産生能のある細胞株は、ウィルス性疾病治療及び予防のためのワクチン開発に使用される細胞株を種類に関係なく使用することができ、好ましくは動物由来細胞株を使用することができ、より好ましくは２９３Ｔヒト細胞株、ＭＤＣＫ、Ｖｅｒｏ及びマウスの線維芽細胞で構成された群から選択されてもよいが、これに限定されない。
本発明で使用されたＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ，ｃａｎｉｎｅ ｋｉｄｅｎｅｙ）細胞株は、犬の腎臓から樹立した上皮様細胞であり、Ｖｅｒｏ細胞株は猿の腎臓内膜から樹立した細胞である。これらの二つは、肝炎ウィルス、ワクチニアウィルス及びインフルエンザウィルスなどに感受性を示すので、ウィルス産生及び研究に最も一般的に使用される細胞株である。
本発明において、Ｂｓｔ２遺伝子の機能が喪失されているウィルス産生能のある細胞株は、Ｂｓｔ２の細胞質部位を暗号化しているＢｓｔ２遺伝子ｅｘｏｎ１部位の塩基を欠失させたり、ｅｘｏｎ１部位に塩基を挿入させることが好ましいが、これに限定されない。
本発明では、配列番号１または２で表されるＢｓｔ２遺伝子のｅｘｏｎ１部位に塩基を１個乃至１５個挿入または欠失させて突然変異細胞株を製造しようした。
本発明の一実施例では、配列番号１で表されるＭＤＣＫ細胞株のＢｓｔ２遺伝子のｅｘｏｎ１塩基を欠失または挿入させて突然変異された対立遺伝子を含むウィルス産生能が増加された突然変異細胞株を１０個製造した。
［配列番号１］
ATGGCACCTACGCTTTACCACTACTACTGGCCTGTGCCCATAACTGACGAGTCAGAGTCAATGTCATCAAGTCAGAAGCTGAGCTGGCTGGAGTGGCTGGGCATCTTGGGGATCCCAGTGGTGATGGGTCTGTCTGTGGCTCTGATCATCTTTGTTGTCAAGACCAACAGCAAAGCCTGCGGGGATGGCCTCCTAGTAGAGCAGGAGTGTCACAATGTCACCAGCCTCCTGGAGCGCCAACTAACCCAAACCCGGCAAGCGTTACAGGGGACCATGGACCAGGCTACCACCTGCAACAAGACTGTG
本発明では、前記配列番号１の４５番乃至５４番の塩基を１個乃至１０個欠失させるか、１個乃至６個挿入させてＢｓｔ２遺伝子の機能が喪失された突然変異細胞株を製造しようとし、下記配列番号３乃至８及び配列番号１７乃至２１の塩基配列を有する細胞株を含むことができ、好ましくはＫ−Ｅ４、Ｊ−Ｃ１０、Ｊ−Ｄ１０、Ｄ−Ｅ２、Ｋ−Ｇ３、Ｊ−Ｅ２、Ｈ−Ｇ５、８−Ｄ８、１４−Ｆ１１及び１２−Ｂ８であり得る。
［配列番号３］
ATGGCACCTACGCTTTACCACTACTACTGGCCTGTGCCCATAACTGA-AGTCAGAGTCAATGTCATCAAGTCAGAAGCTGAGCTGGCTGGAGTGGCTGGGCATCTTGGGGATCCCAGTGGTGATGGGTCTGTCTGTGGCTCTGATCATCTTTGTTGTCAAGACCAACAGCAAAGCCTGCGGGGATGGCCTCCTAGTAGAGCAGGAGTGTCACAATGTCACCAGCCTCCTGGAGCGCCAACTAACCCAAACCCGGCAAGCGTTACAGGGGACCATGGACCAGGCTACCACCTGCAACAAGACTGTG
［配列番号４］
ATGGCACCTACGCTTTACCACTACTACTGGCCTGTGCCCATAAC-ACGAGTCAGAGTCAATGTCATCAAGTCAGAAGCTGAGCTGGCTGGAGTGGCTGGGCATCTTGGGGATCCCAGTGGTGATGGGTCTGTCTGTGGCTCTGATCATCTTTGTTGTCAAGACCAACAGCAAAGCCTGCGGGGATGGCCTCCTAGTAGAGCAGGAGTGTCACAATGTCACCAGCCTCCTGGAGCGCCAACTAACCCAAACCCGGCAAGCGTTACAGGGGACCATGGACCAGGCTACCACCTGCAACAAGACTGTG
［配列番号５］
ATGGCACCTACGCTTTACCACTACTACTGGCCTGTGCCCATAACT----AGTCAGAGTCAATGTCATCAAGTCAGAAGCTGAGCTGGCTGGAGTGGCTGGGCATCTTGGGGATCCCAGTGGTGATGGGTCTGTCTGTGGCTCTGATCATCTTTGTTGTCAAGACCAACAGCAAAGCCTGCGGGGATGGCCTCCTAGTAGAGCAGGAGTGTCACAATGTCACCAGCCTCCTGGAGCGCCAACTAACCCAAACCCGGCAAGCGTTACAGGGGACCATGGACCAGGCTACCACCTGCAACAAGACTGTG
［配列番号６］
ATGGCACCTACGCTTTACCACTACTACTGGCCTGTGCCCATAACT---GAGTCAGAGTCAATGTCATCAAGTCAGAAGCTGAGCTGGCTGGAGTGGCTGGGCATCTTGGGGATCCCAGTGGTGATGGGTCTGTCTGTGGCTCTGATCATCTTTGTTGTCAAGACCAACAGCAAAGCCTGCGGGGATGGCCTCCTAGTAGAGCAGGAGTGTCACAATGTCACCAGCCTCCTGGAGCGCCAACTAACCCAAACCCGGCAAGCGTTACAGGGGACCATGGACCAGGCTACCACCTGCAACAAGACTGTG-3'
［配列番号７］
ATGGCACCTACGCTTTACCACTACTACTGGCCTGTGCCCATAAC----GAGTCAGAGTCAATGTCATCAAGTCAGAAGCTGAGCTGGCTGGAGTGGCTGGGCATCTTGGGGATCCCAGTGGTGATGGGTCTGTCTGTGGCTCTGATCATCTTTGTTGTCAAGACCAACAGCAAAGCCTGCGGGGATGGCCTCCTAGTAGAGCAGGAGTGTCACAATGTCACCAGCCTCCTGGAGCGCCAACTAACCCAAACCCGGCAAGCGTTACAGGGGACCATGGACCAGGCTACCACCTGCAACAAGACTGTG
［配列番号８］
ATGGCACCTACGCTTTACCACTACTACTGGCCTGTGCCCATAACTGACGACGAGTCAGAGTCAATGTCATCAAGTCAGAAGCTGAGCTGGCTGGAGTGGCTGGGCATCTTGGGGATCCCAGTGGTGATGGGTCTGTCTGTGGCTCTGATCATCTTTGTTGTCAAGACCAACAGCAAAGCCTGCGGGGATGGCCTCCTAGTAGAGCAGGAGTGTCACAATGTCACCAGCCTCCTGGAGCGCCAACTAACCCAAACCCGGCAAGCGTTACAGGGGACCATGGACCAGGCTACCACCTGCAACAAGACTGTG
［配列番号１７］
Atggcacctacgctttaccactactactggcctgtgcccataactgacctatgagagtcagagtcaatgtcatcaagtcagaagctgagctggctggagtggctgggcatcttggggatcccagtggtgatgggtctgtctgtggctctgatcatctttgttgtcaagaccaacagcaaagcctgcggggatggcctcctagtagagcaggagtgtcacaatgtcaccagcctcctggagcgccaactaacccaaacccggcaagcgttacaggggaccatggaccaggctaccacctgcaacaagactgtggtgaccctgtcagcttccctggtgaaggagaaggcctggggtcaggagcagctcacccgaggagagaaacttcagggagagatcgagacattgaagcagcagctgcaggccgctttggaggaggtgaagcagctaagagaagggaaggaggcctcaagcaaggaaagggaaaccagctccgtcagctccttgaaggcaccccccggctccgtggtggtccccgtgtacctgctcctaggccttagggctctgctggcctga
［配列番号１８］
Atggcacctacgctttaccactactactggcctgtgcccataactga---gtcagagtcaatgtcatcaagtcagaagctgagctggctggagtggctgggcatcttggggatcccagtggtgatgggtctgtctgtggctctgatcatctttgttgtcaagaccaacagcaaagcctgcggggatggcctcctagtagagcaggagtgtcacaatgtcaccagcctcctggagcgccaactaacccaaacccggcaagcgttacaggggaccatggaccaggctaccacctgcaacaagactgtggtgaccctgtcagcttccctggtgaaggagaaggcctggggtcaggagcagctcacccgaggagagaaacttcagggagagatcgagacattgaagcagcagctgcaggccgctttggaggaggtgaagcagctaagagaagggaaggaggcctcaagcaaggaaagggaaaccagctccgtcagctccttgaaggcaccccccggctccgtggtggtccccgtgtacctgctcctaggccttagggctctgctggcctga
［配列番号１９］
Atggcacctacgctttaccactactactggcctgtgcccataactga-gagtcagagtcaatgtcatcaagtcagaagctgagctggctggagtggctgggcatcttggggatcccagtggtgatgggtctgtctgtggctctgatcatctttgttgtcaagaccaacagcaaagcctgcggggatggcctcctagtagagcaggagtgtcacaatgtcaccagcctcctggagcgccaactaacccaaacccggcaagcgttacaggggaccatggaccaggctaccacctgcaacaagactgtggtgaccctgtcagcttccctggtgaaggagaaggcctggggtcaggagcagctcacccgaggagagaaacttcagggagagatcgagacattgaagcagcagctgcaggccgctttggaggaggtgaagcagctaagagaagggaaggaggcctcaagcaaggaaagggaaaccagctccgtcagctccttgaaggcaccccccggctccgtggtggtccccgtgtacctgctcctaggccttagggctctgctggcctga
［配列番号２０］
Atggcacctacgctttaccactactactggcctgtgcccataa----------agagtcaatgtcatcaagtcagaagctgagctggctggagtggctgggcatcttggggatcccagtggtgatgggtctgtctgtggctctgatcatctttgttgtcaagaccaacagcaaagcctgcggggatggcctcctagtagagcaggagtgtcacaatgtcaccagcctcctggagcgccaactaacccaaacccggcaagcgttacaggggaccatggaccaggctaccacctgcaacaagactgtggtgaccctgtcagcttccctggtgaaggagaaggcctggggtcaggagcagctcacccgaggagagaaacttcagggagagatcgagacattgaagcagcagctgcaggccgctttggaggaggtgaagcagctaagagaagggaaggaggcctcaagcaaggaaagggaaaccagctccgtcagctccttgaaggcaccccccggctccgtggtggtccccgtgtacctgctcctaggccttagggctctgctggcctga
［配列番号２１］
Atggcacctacgctttaccactactactggcctgtgcccata---gacga---agagtcaatgtcatcaagtcagaagctgagctggctggagtggctgggcatcttggggatcccagtggtgatgggtctgtctgtggctctgatcatctttgttgtcaagaccaacagcaaagcctgcggggatggcctcctagtagagcaggagtgtcacaatgtcaccagcctcctggagcgccaactaacccaaacccggcaagcgttacaggggaccatggaccaggctaccacctgcaacaagactgtggtgaccctgtcagcttccctggtgaaggagaaggcctggggtcaggagcagctcacccgaggagagaaacttcagggagagatcgagacattgaagcagcagctgcaggccgctttggaggaggtgaagcagctaagagaagggaaggaggcctcaagcaaggaaagggaaaccagctccgtcagctccttgaaggcaccccccggctccgtggtggtccccgtgtacctgctcctaggccttagggctctgctggcctga
本発明では、製造された突然変異細胞株の塩基配列を分析した結果、ＭＤＣＫ細胞のＫ−Ｅ４、Ｊ−Ｃ１０、Ｊ−Ｄ１０及び１４−Ｆ１１細胞においていずれの対立遺伝子に解読枠移動突然変異が発生したことを確認することができた。
本発明で「解読枠移動突然変異」とは、遺伝暗号は遺伝子の塩基３個を一つの枠として読むことができるが、塩基が１個、２個または３の倍数でない数で欠失または挿入されて遺伝暗号を読むことができる解読枠が変わる突然変異を意味する。
前記突然変異細胞中Ｊ−Ｄ１０は、寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２８５で寄託された。
本発明の他の実施例では、配列番号２で表されるＶｅｒｏ細胞株のＢｓｔ２遺伝子のｅｘｏｎ１塩基を欠失させて突然変異された対立遺伝子を含むウィルス産生能が増加された突然変異細胞株を２個製造した。
［配列番号２］
ATGGCACCTATTTTGTATGACTATTGCAAAATGCCCATGGATGACATTTGCAAGGAAGACAGGGACAAGTGCTGTAAACTGGCCGTAGGAATTCTGGGGCTCCTGGTCATAGTGCTTCTGGGGGTGCCCCTGATTTTCTTCATCATCAAGGCCAACAGCGAGGCCTGCCAGGATGGCCTCCGGGCAGTGATGGAGTGTCACAATGTCACCTATCTCCTGCAACAAGAGCTGGCCGAGGCCCAGCGGGGCTTTCGGGACGCAGAGGCCCAGGCTGTCACCTGCAACCAGACTGTG
本発明では、前記配列番号２の１１６番乃至１３０番の塩基を１個乃至１２個欠失させてＢｓｔ２遺伝子の機能が喪失された突然変異細胞株を製造しようとし、下記配列番号９及び１０の塩基配列を有する細胞株を含むことができ、好ましくはＤ−Ｄ８及びＧ−Ｄ５であり得る。
［配列番号９］
ATGGCACCTATTTTGTATGACTATTGCAAAATGCCCATGGATGACATTTGCAAGGAAGACAGGGACAAGTGCTGTAAACTGGCCGTAGGAATTCTGGGGCTCCTGGTCATAGTGC------------CCCTGATTTTCTTCATCATCAAGGCCAACAGCGAGGCCTGCCAGGATGGCCTCCGGGCAGTGATGGAGTGTCACAATGTCACCTATCTCCTGCAACAAGAGCTGGCCGAGGCCCAGCGGGGCTTTCGGGACGCAGAGGCCCAGGCTGTCACCTGCAACCAGACTGTG
［配列番号１０］
ATGGCACCTATTTTGTATGACTATTGCAAAATGCCCATGGATGACATTTGCAAGGAAGACAGGGACAAGTGCTGTAAACTGGCCGTAGGAATTCTGGGGCTCCTGGTCATAGTGCTTCTGGGGGTGCCCTGATTTTCTTCATCATCAAGGCCAACAGCGAGGCCTGCCAGGATGGCCTCCGGGCAGTGATGGAGTGTCACAATGTCACCTATCTCCTGCAACAAGAGCTGGCCGAGGCCCAGCGGGGCTTTCGGGACGCAGAGGCCCAGGCTGTCACCTGCAACCAGACTGTG
本発明のさらに他の実施例では、配列番号２４で表されるヒト２９３Ｔ細胞株のＢｓｔ２遺伝子のｅｘｏｎ１塩基を欠失または挿入させて突然変異された対立遺伝子を含むウィルス産生能が増加された突然変異細胞株を３個製造した。
［配列番号２４］
ATGGCATCTACTTCGTATGACTATTGCAGAGTGCCCATGGAAGACGGGGATAAGCGCTGTAAGCTTCTGCTGGGGATAGGAATTCTGGTGCTCCTGATCATCGTGATTCTGGGGGTGCCCTTGATTATCTTCACCATCAAGGCCAACAGCGAGGCCTGCCGGGACGGCCTTCGGGCAGTGATGGAGTGTCGCAATGTCACCCATCTCCTGCAACAAGAGCTGACCGAGGCCCAGAAGGGCTTTCAGGATGTGGAGGCCCAGGCCGCCACCTGCAACCACACTGTGGTAAGCTCCTCAACTCCTTTGGATGGCCTAGTACTAGGCGGTGGGAGGGACAAGAATCTCTCCCCAGAAATCTGACCCAGGGTGGGTCTCCAGGGAGATGCAGGGGAGGTCCTGAAACTGCTCCTGGGCCCCCACATCAAGGGACCTAGGTTCCCCTACCAGGGTTTGTGGGCCCCTAACCCAGTCCAGGGCACTGGTGTAGGGGCAGGGTGTTAAAACTCTCCAGATCCCCCAAATCGGGGACCTCAGTATCCCCCTGGGACTTAGGTGAATTTATAAATTCTTTCCAGGGCACTGGTGTCGGGGGCCTTGAAACTCCTCGTGGGCACCAGTCCTGGGGGAGTAGAAATCCCTATTCAGGGTTGAAGGGGGACCTCACCAGACCCTGAAAAAGGGGGCTTTTGAAATTTTCACTTCATCCCTAAGAAACTGAAATATTCACCTGGGTCCTGATATGGGGGATCTTGAAACTCTCGCTGGGCATGTCACTTGGGCGGGGAAATCCCACTGCATTCTGGATTTGGTAGGGCCCTCTAACTTTTCTTGGGCCATTGCTCAGGCAATCTGGAAATGTCCACTAAACTTTGGTTATCGATAGCCTCCAAGTTTCCACGTGGGGTGGCCTCAAAACTCCCATTTTGAGGACCCACATGCTTATGGGTGGCCCTGGGAGAGTGTGTGGTTGTGGCTGTTCTTTAAGGTTGGAGACCATGGTGCAGAGAGGGTTGGAAGAAAACCTGAAAGGGGTTTGCATTTAAGCCCCTCTGTCCCCAGGACCTAGGGAGGAGGCCCAGGTCCCAGGGGCAGCAGCCAAACTCCCCAGGCCAAAACCCCAGATTCTAACTCTTCTTAGATGGCCCTAATGGCTTCCCTGGATGCAGAGAAGGCCCAAGGACAAAAGAAAGTGGAGGAGCTTGAGGGTGAGAAAGGGAGAAGGGAGAGGGCCGGGGAGGGGTGAGTCAGGTATGGAAGAGGGGGTGGGGGCAGGGAGACCAGGGCTGGAGGTTGGGGTAAGGGGGAGGTTCTGTCCCAGAGTGGAGCAGGGCCCCAGCATGGCCACATGCTGACCCGCCCCCTGTTTCTGTCCTCCCACCCTACCAGGAGAGATCACTACATTAAACCATAAGCTTCAGGACGCGTCTGCAGAGGTGGAGCGACTGAGGTCAGAGATAGCCTTCCCCCGCTACCCTCCACCTGCCACATTCCTCTCACCCCCACATCCCTAGCCCAAGACCCAGGATCTCCTTTGCTCCCAAAATCCCCATTGCCCCAAGGGATAAAGTTTGAGTCCCACAAAAGGATAACTTAGCCCCTAGGGTCACAGAGCCATGGGTGGCCGCTGTCCATTCCCTCCCCGGTGACTTGGATTGGGGCGGTGCGGGGGGAACTCCCGGGGGCGGTGGGCTTACAGGGAGGGCGGCAGGAGCCAGGACGAGCAGATGCCTGATTTGCCATCTGTACCGCAGAAGAGAAAACCAGGTCTTAAGCGTGAGAATCGCGGACAAGAAGTACTACCCCAGCTCCCAGGACTCCAGCTCCGCTGCGGCGCCCCAGCTGCTGATTGTGCTGCTGGGCCTCAGCGCTCTGCTGCAGTGA
本発明では、前記配列番号２４の５１番乃至１００番の塩基を３個乃至２７個欠失させたり、塩基を１個挿入させてＢｓｔ２遺伝子の機能が喪失された突然変異細胞株を製造しようとし、下記配列番号２５及び３０の塩基配列を有する細胞株を含むことができ、好ましくはＤ１９、Ｂ４及びＢ２４であり得る。
［配列番号２５］
ATGGCATCTACTTCGTATGACTATTGCAGAGTGCCCATGGAAGACGGGGA---------------------------GATAGGAATTC
［配列番号２６］
ATGGCATCTACTTCGTATGACTATTGCAGAGTGCCCATGGAAGACGGGGATAAGCGCTGTAAGCTTCTGCTGGGGATAGGAATTC------
［配列番号２７］
ATGGCATCTACTTCGTATGACTATTGCAGAGTGCCCATGGAAGACGGGGATAAGCGCTGTAAGCTTCtTGCTGGGGATAGGAATTC
［配列番号２８］
ATGGCATCTACTTCGTATGACTATTGCAGAGTGCCCATGGAAGACGGGGATAAGCGCTGTAAGC---------------------
［配列番号２９］
ATGGCATCTACTTCGTATGACTATTGCAGAGTGCCCATGGAAGACGGGGATAAGCGCTGTAAGCTTCTGCTGATAGGAATTC---
［配列番号３０］
ATGGCATCTACTTCGTATGACTATTGCAGAGTGCCCATGGAAGACGGGGATAAGCGCTGTAA--------TGGGGATAGGAATTC
本発明のＢｓｔ２遺伝子の機能が喪失された細胞株を利用したウィルス感染促進及び産生増進方法において、細胞の数は１×１０４乃至１×１０７であり、好ましくは５×１０４乃至５×１０６であってもよく、より好ましくは１×１０５乃至１×１０６であってもよい。
前記細胞に接種されたウィルスは、０．０００１乃至０．１ＭＯＩで３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで感染させることが好ましいか、これに限定されない。感染させたウィルスは新しい培養液を入れて３６〜７２時間培養した後、培養液を回収して適切な条件で遠心分離して上澄み液を収得できて、好ましくは４℃乃至１５℃で１５００ｒｐｍ乃至５０００ｒｐｍで５分乃至１５分間遠心分離して上澄み液を収得することができる。
本発明では、Ｂｓｔ２遺伝子の機能が喪失されているウィルス産生能のある細胞株に目的ウィルスを感染させた後、培養して目的ウィルスの産生増進によりウィルス抗原タンパク質を製造しようとした。前記ウィルス抗原タンパク質は、ウィルス性疾病に対する予防及び治療用ワクチンの製造に使用することができる。
したがって、本発明は、さらに他の観点において、前記方法によって製造されたウィルス抗原タンパク質を利用することを特徴とするウィルス性疾病に対するワクチン製造方法に関する。
前記ワクチン組成物には薬学的に許容可能な免疫補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）または賦形剤が追加的に含まれてもよい。免疫補助剤としては、体内に注入時抗体形成を増進させる役割をして本発明での目的達成が可能になるものであればいずれも使用可能で、特にアルミニウム塩（Ａｌ（ＯＨ）３，ＡｌＰＯ４）、スクアレン（ｓｑｕａｌｅｎｅ）、ソルビタン（ｓｏｒｂｉｔａｎｅ）、ポリソルベート８０（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０）、ＣｐＧ、リポソーム、コレステロール、ＭＰＬ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｌｉｐｉｄ Ａ）及びＧＬＡ（ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ ｌｉｐｉｄ Ａ）から選択された一つ以上が好ましいが、これに限定されない。
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
実施例１：Ｂｓｔ２遺伝子機能が喪失された細胞株
１−１：ＭＤＣＫ細胞株
野生型ＭＤＣＫ細胞株（高麗大学、ソン・ムンジョン教授)５×１０５個を１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、５Ｍβ−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、１０μｇ／ｍｌ ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎｅ、５０Ｕ／ｍｌ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、５０μｇ／ｍｌ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎが添加されたＤＭＥＭ ｃｏｍｐｌｅｔｅ（ＧＩＢＣＯ）培地で２４時間培養後、Ｂｓｔ２遺伝子のｅｘｏｎ１部位と結合可能なＴＡＬＥＮベクター（ＴｏｏｌＧｅｎ、韓国）１対、レポーターベクター（ＴｏｏｌＧｅｎ、韓国）１個及びＴｕｒｂｏｆｅｃｔ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ、米国)を混ぜた計１５μｇを培養中の細胞に入れて、４８時間、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。前記培養された反応物をＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を利用してＧＦＰとＲＦＰに共に陽性である細胞を選択的に選んだ５００個の細胞を９６−ｗｅｌｌに分注して単一クローン細胞を収得した。
収得された単一クローン細胞の突然変異の可否を確認するために、Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを抽出して配列番号１１で表されるｄＢｓｔ２−Ｆ ｐｒｉｍｅｒ及び配列番号１２で表されるｄＢｓｔ２−Ｒ ｐｒｉｍｅｒを利用して、９５℃５分、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分、７２℃１０分の条件で２５サイクルを繰り返して重合酵素連鎖反応を実施した。前記反応物を１０−３に希釈して配列番号１３で表されるＮｄＢｓｔ２−Ｆ ｐｒｉｍｅｒ及び配列番号１４で表されるＮｄＢｓｔ２−Ｒ ｐｒｉｍｅｒを利用して９５℃５分、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分、７２℃１０分の条件で２５サイクルを繰り返して再度重合酵素連鎖反応を実施した。
［配列番号１１］5'-GGTCAGGATGGCTCCTATGC-3'
［配列番号１２］5'-AACCTGACAGGGTCACCTGG-3'
［配列番号１３］5'-GTAGCCCCAGCCAAAGGTTTC-3'
［配列番号１４］5'-AGGCCTCCCCATGCCCAAAC-3'
電気泳動して反応物のサイズを確認した結果、配列番号２で表されるｅｘｏｎ１部位に突然変異が起きたと推定される細胞株は正常なＰＣＲ反応物サイズと核酸内加水分解酵素（ｅｎｄｏｎｕｃｌａｓｅ）により内部が切断された２個のバンドが追加で生じて突然変異が起きたことを確認した（図１Ａ）。
前記突然変異が確認された細胞株の塩基配列を分析するために、Ｔ７Ｅ１酵素（ＴｏｏｌＧｅｎ、韓国）を処理して反応させた反応物をＢｇｌ−Ｘｂａを利用して切って、ｐＵＣ１８ベクターとライゲーションした後、ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎとＸ−ｇａｌ−ＩＰＴＧが入っている培地で培養して白色コロニーを収得した。収得された白色コロニーを各クローン別に６個ずつ選択して塩基配列を分析した。
その結果、Ｂｓｔ２のｅｘｏｎ１部位の塩基が欠失または挿入された突然変異細胞株７個（Ｋ−Ｅ４、Ｊ−Ｃ１０、Ｊ−Ｄ１０、Ｄ−Ｅ２、Ｋ−Ｇ３、Ｊ−Ｅ２及びＨ−Ｇ５）を確認して、３個（Ｋ−Ｅ４、Ｊ−Ｃ１０及びＪ−Ｄ１０）は、一対の対立遺伝子全てにおいて解読枠移動突然変異が発生したことを確認した。
１−２：Ｖｅｒｏ細胞株
野生型Ｖｅｒｏ細胞株（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｃｈｅｎｇｙｕ Ｌｉａｎｇ）５×１０５個を１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、５Ｍβ−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、１０μｇ／ｍｌ ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎｅ、５０Ｕ／ｍｌ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、５０μｇ／ｍｌ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎが添加されたＤＭＥＭ ｃｏｍｐｌｅｔｅ（ＧＩＢＣＯ）培地で２４時間培養後、Ｂｓｔ２遺伝子のｅｘｏｎ１部位と結合可能なＴＡＬＥＮベクター（ＴｏｏｌＧｅｎ、韓国）１対、レポーターベクター（ＴｏｏｌＧｅｎ、韓国）１個及びＴｕｒｂｏｆｅｃｔ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ、米国)を混ぜた計１５μｇを培養中の細胞に入れて、４８時間、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。前記培養された反応物をＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を利用してＧＦＰとＲＦＰに共に陽性である細胞を選択的に選んだ５００個の細胞を９６−ｗｅｌｌに分注して単一クローン細胞を収得した。
収得された単一クローン細胞の突然変異の可否を確認するために、Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを抽出して配列番号１１で表されるｄＢｓｔ２−Ｆ ｐｒｉｍｅｒ及び配列番号１６で表されるＡＧＭ−Ｒ ｐｒｉｍｅｒを利用して９５℃５分、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分、７２℃１０分の条件で２５サイクルを繰り返して重合酵素連鎖反応を実施した。前記反応物を１０−３に希釈して配列番号１５で表されるＡＧＭ−Ｆ ｐｒｉｍｅｒ及び配列番号１６で表されるＡＧＭ−Ｒ ｐｒｉｍｅｒを利用して９５℃５分、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分、７２℃１０分の条件で２５サイクルを繰り返して再度重合酵素連鎖反応を実施した。
［配列番号１５］5'-GAGGGGGAGATCTGGATGG-3'
［配列番号１６］5'-CTTCTCTGCATCCAGGGAAG-3'
電気泳動して反応物のサイズを確認した結果、配列番号２のｅｘｏｎ１部位に突然変異が起きたと推定される細胞株２個は正常なＰＣＲ反応物サイズと核酸内加水分解酵素（ｅｎｄｏｎｕｃｌａｓｅ）により内部が切断された２個のバンドが追加でできて突然変異が起きたことを確認した（図１Ｂ）。
突然変異が確認された細胞株の塩基配列を分析して、その結果、Ｂｓｔ２のｅｘｏｎ１部位の塩基が欠失または挿入された突然変異細胞株２個（Ｄ−Ｄ８：ヘテロ及びＧ−Ｄ５：ノックアウト）を確認した。
１−３：線維芽細胞株Ｂ２Ｋ
Ｂｓｔ２が欠如したマウス線維芽細胞株（Ｂ２Ｋ）を産生するために、２４週齢のＢｓｔ２ノックアウトマウス（イスアブジス（ＩＳＵ ＡＢＸＩＳ、韓国）の太ももにＭＣＡ（３−ｍｅｔｈｙｌ ｃｈｏｌａｎｔｈｒｅｎｅ）１００μｇを注射した。約４ヶ月後太ももにできた癌を剥ぎ取った後、７０％エタノールで洗浄してバクテリアを除去して、１０％ＦＢＳとＲＰＭＩ培地が入れられたｄｉｓｈに移して手術用はさみで細かく切った。５０ｍｌ ｃｏｎｉｃａｌ ｔｕｂｅにｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（５００Ｕｎｉｔ／ｍｌ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ＩＶ，１５０Ｕｎｉｔ／ｍｌ ＤＮａｓｅ Ｉ）１３ｍｌと癌の断片を入れてｓｈａｋｅｒで、２５０ｒｐｍ、３７℃で１時間３０分振とうした。１０ｍｌピペットで３〜５回ピペッティングして断片をさらに分散した後、新しい５０ｍｌ ｃｏｎｉｃａｌ ｔｕｂｅにｎｙｌｏｎ ｍｅｓｈでフィルタリングして入れた。１２５０ｒｐｍで５分間遠心分離して上澄み液は除去した後、ペレットは新しい培地に分散してｎｙｌｏｎ ｍｅｓｈでフィルタリングして前記のような条件で遠心分離した。上澄み液を除去した後、ペレットを分散して１０ｃｍ ｄｉｓｈ当たり２．４×１０７ｃｅｌｌｓを接種して培養してＢｓｔ２ノックアウト癌細胞株（Ｂ２Ｋ）で維持した。
一方、野生型癌細胞株（ＭＢ１９）を産生するために、２４週齢のＢ６野生型マウス（オリエントバイオ、韓国）の太ももにＭＣＡ（３−ｍｅｔｈｙｌ ｃｈｏｌａｎｔｈｒｅｎｅ）１００μｇを注射した。約４ヶ月後太ももにできた癌を剥ぎ取った後、７０％エタノールで洗浄してバクテリアを除去して、１０％ＦＢＳとＲＰＭＩ培地が入れられたｄｉｓｈに移して手術用はさみで細かく切った。５０ｍｌ ｃｏｎｉｃａｌ ｔｕｂｅにｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（５００Ｕｎｉｔ／ｍｌ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ＩＶ，１５０Ｕｎｉｔ／ｍｌ ＤＮａｓｅ Ｉ）１３ｍｌと癌の断片を入れてｓｈａｋｅｒで、２５０ｒｐｍ、３７℃で１時間３０分振とうした。１０ｍｌピペットで３〜５回ピペッティングして断片をさらに分散した後、新しい５０ｍｌ ｃｏｎｉｃａｌ ｔｕｂｅにｎｙｌｏｎ ｍｅｓｈでフィルタリングして入れた。１２５０ｒｐｍで５分間遠心分離して上澄み液は除去した後、ペレットは新しい培地に分散してｎｙｌｏｎ ｍｅｓｈでフィルタリングして前記のような条件で遠心分離した。上澄み液を除去した後、ペレットを分散した１０ｃｍ ｄｉｓｈ当たり２．４×１０７ｃｅｌｌｓを接種して培養して野生型癌細胞株（ＭＢ１９）で維持した。
Ｂｓｔ２ノックアウト癌細胞株（Ｂ２Ｋ）とＢｓｔ２野生型癌細胞株（ＭＢ１９）のＭＨＣ ｃｌａｓｓ（ＫｂＤｂ（Ｒ１．２１．２）−ＡＰＣ，ＣＤ１ｄ（１Ｂ１）−ＰＥ）、ＬＦＡ−１（２０７）−Ｃｙｃ、及びＢｓｔ２（ｅ．Ｂｉｏ９２７）ｂｉｏｔｉｎ ＋ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＰＥを蛍光染色してＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用して発現程度を比較分析した。
その結果、ＭＢ１９が正常にＢｓｔ２を発現する一方、Ｂ２Ｋ癌細胞株はＢｓｔ２を発現しないことを確認して実施例に使用した。
１−４：ヒト２９３Ｔ細胞株
ヒト２９３Ｔ細胞株５×１０５個を１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、５Ｍβ−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、１０μｇ／ｍｌ ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎｅ、５０Ｕ／ｍｌ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、５０μｇ／ｍｌ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎが添加されたＤＭＥＭ ｃｏｍｐｌｅｔｅ（ＧＩＢＣＯ）培地で２４時間培養後、Ｂｓｔ２遺伝子のｅｘｏｎ１部位と結合可能なＣＲＩＳＰＲベクター（ＴｏｏｌＧｅｎ、韓国）１個、レポーターベクター（ＴｏｏｌＧｅｎ、韓国）１個、Ｃａｓ９ベクター及びＦｕｇｅｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国)を混ぜた計１８μｇを培養中の細胞に入れて、４８時間、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。前記培養された反応物をＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を利用してＧＦＰとＲＦＰに共に陽性である細胞を選択的に選んだ５００個の細胞を９６−ｗｅｌｌに分注して単一クローン細胞を収得した。
収得された単一クローン細胞の突然変異の可否を確認するために、Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを抽出して配列番号２２で表されるＨＢｓｔ２−Ｆ１ ｐｒｉｍｅｒ及び配列番号２３で表されるＨＢｓｔ２−Ｒ１ ｐｒｉｍｅｒを利用して９５℃３分、９４℃３０秒、７２℃３０秒、７２℃４５秒の条件で１０サイクル繰り返した後、９５℃３０秒、６２℃３０秒、７２℃４５秒の条件で２５サイクルを繰り返して重合酵素連鎖反応を実施した。
［配列番号２２］5’-TGG CAC GGC CTA GGC ACT CA-3’
［配列番号２３］5’-GGA TAC TGA GGT CCC CGA TT-3’
電気泳動して反応物のサイズを確認した後、突然変異が起きたと推定される細胞株の塩基配列を分析して、その結果、Ｂｓｔ２のｅｘｏｎ１部位の塩基が欠失または挿入された突然変異細胞株３個（D19 Allele 1: 27 nucleotide欠失，D19 Allele 2: 6 nucleotide 欠失，B4 Allele 1: 1 nucleotide挿入，B4 Allele 2: 21 nucleotide欠失，B24 Allele 1: 3 nucleotide欠失，B24 Allele 2: 8 nucleotide欠失）を確認した。
実施例２：Ｂｓｔ２遺伝子機能が喪失された細胞株の感染促進
２−１：低いＭＯＩのウィルス感染
Ｂｓｔ２遺伝子機能が喪失された細胞株の感染増進効果を確認するために、野生型ＭＤＣＫ細胞株とＢｓｔ２機能喪失細胞株の感染能を比較した。本実施例では、実施例１で収得したＪ−Ｄ１０（寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２８５）細胞株と同様にＢｓｔ２遺伝子のｅｘｏｎ１に解読枠突然変異を起こしてＢｓｔ２遺伝子の発現を完全に除去した細胞株である、突然変異された対立遺伝子を含む８−Ｄ８、１４−Ｆ１１及び１２−Ｂ８を使用した。８−Ｄ８、１４−Ｆ１１及び１２−Ｂ８の突然変異配列は、前記配列番号１７乃至２１で表されて、８−Ｄ８は配列番号１７、１８、１４−Ｆ１１は配列番号１９、２０、及び１２−Ｂ８は配列番号１８、２１の突然変異された対立遺伝子を含む。
野生型ＭＤＣＫ細胞とＢｓｔ２機能喪失細胞（５×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）にＡ／Ｈ３Ｎ２インフルエンザウィルスを０．００１ＭＯＩから２倍連続希釈して３０分間感染させた。以後、培養液を除去してａｇａｒｏｓｅで細胞層を覆って感染したウィルスを４８時間増殖させた。
その結果、Ｂｓｔ２機能喪失細胞株は、野生型細胞株に比べて約１／５程度少ない数のウィルスによって同様の感染効果を示すことを確認した（図２）。これにより、宿主細胞でＢｓｔ２タンパク質を除去してウィルス感染が促進されることを確認することができた。
２−２：ウィルス感染時間の短縮
野生型ＭＤＣＫ細胞とＢｓｔ２機能喪失細胞（５×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）に０．０００１ＭＯＩのＡ／Ｈ３Ｎ２インフルエンザウィルスを各々１、５、１０、２０、３０分及び１時間感染させた。以後、培養液を除去してａｇａｒｏｓｅで細胞層を覆って感染したウィルスを４８時間増殖させた。
その結果、Ｂｓｔ２機能喪失細胞株は、野生型細胞株に比べて感染時間１分では３ｐｆｕ／ｗｅｌｌから６ｐｆｕ／ｗｅｌｌに１．８倍、感染時間５分では６ｐｆｕ／ｗｅｌｌから１０ｐｆｕ／ｗｅｌｌに１．７倍、感染時間１０分では９ｐｆｕ／ｗｅｌｌから１４ｐｆｕ／ｗｅｌｌに１．５倍程度多い数のプラークが形成された（図３）。２０分以上十分な感染時間が許容された場合には、野生型ＭＤＣＫ細胞とＢｓｔ２機能喪失細胞のプラーク形成には差が出なかった。
これは、Ｂｓｔ２機能喪失細胞に短い感染時間の間、ウィルスがずっと浸透し易いことを示して、Ｂｓｔ２機能喪失細胞株は、野生型細胞株に比べてウィルスの感染能が顕著に優秀であることを示す。従って、Ｂｓｔ２タンパク質は、ウィルスが外部に放出されるのを抑制するという既存の効果の他にもウィルスが宿主細胞への侵入も抑制することを確認した。即ち、Ｂｓｔ２機能喪失細胞は、目的ウィルスの感染速度を増加させて感染を促進させることが分かる。
実施例３：Ｂｓｔ２遺伝子機能が喪失された細胞株の細胞内ウィルスタンパク質量の増加
３−１：Ｖｅｒｏ及びＭＤＣＫ細胞株
Ｂｓｔ２遺伝子機能が喪失された細胞株のウィルス抗原タンパク質産生増加効果を確認するために、野生型Ｖｅｒｏ及びＭＤＣＫ細胞株とＢｓｔ２機能喪失細胞株のウィルス抗原タンパク質産生を比較した。本実施例では、実施例１で収得されたＧ−Ｄ５及びＪ−Ｄ１０（寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２８５）細胞株を使用した。
野生型Ｖｅｒｏ及びＭＤＣＫ細胞とＢｓｔ２機能喪失細胞（５×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）に０．１ＭＯＩのＡ／Ｈ３Ｎ２インフルエンザウィルスを３０分間感染させた後、培養液を除去して新鮮な培養液に入れ替えて３６〜７２時間まで追加培養した。各時間帯別に培養液に抜け出たウィルスを除去して、培養容器の底に残った細胞をＰＢＳで洗浄後、回収して細胞抽出液を収得した。収得した細胞抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動した後、インフルエンザウィルスのＨＡタンパク質の大きい片を認識する抗ＨＡ単クローン抗体でｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析を行った。
その結果、Ｂｓｔ２遺伝子機能が喪失されたＧ−Ｄ５細胞は、細胞内インフルエンザウィルスタンパク質の量が野生型細胞に比べて、感染３６時間目に約５倍、感染７２時間目に約１５倍増加したことを確認した（図５Ａ）。また、Ｂｓｔ２遺伝子機能が喪失されたＪ−Ｄ１０細胞は、細胞内インフルエンザウィルスタンパク質の量が野生型細胞に比べて、感染３６時間目に約５７倍程度増加したことを確認した（図６Ｂ）。
３−２：ヒト２９３Ｔ細胞株
ヒト由来細胞でＢｓｔ２遺伝子機能が喪失に伴うウィルス抗原タンパク質産生増加効果を確認するために、Ｂｓｔ２遺伝子をノックアウトさせた２９３Ｔ細胞株（Ｂ４、Ｂ２４及びＤ１９、２．５×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）を２４−ｗｅｌｌプレートに０．０１ＭＯＩのＨ３Ｎ２（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７）インフルエンザウィルスで３０分間感染させた後、新鮮な培養液をさらに添加して２日間追加培養した。
その結果、Ｖｅｒｏ及びＭＤＣＫ細胞株と同様に細胞内ウィルスタンパク質量が顕著に増加したことをウェスタンブロットで確認した（図７）。
Ｂｓｔ２遺伝子機能が喪失された細胞株は、ウィルス放出を促進する効果があるため、もし野生型細胞とＢｓｔ２遺伝子機能が喪失された細胞でウィルス増殖速度が同じでＢｓｔ２遺伝子機能が喪失された細胞からウィルスがすっと速い速度で放出されるのであれば、Ｂｓｔ２遺伝子機能が喪失された細胞には放出されなかった細胞内ウィルスの量がずっと少ないと予想される。しかし、Ｂｓｔ２遺伝子機能が喪失された細胞は、外部に放出されたウィルスの量及び細胞内に残っているウィルスの量も顕著に増加している。
従って、Ｂｓｔ２遺伝子機能が喪失された細胞株は、ウィルス放出及び増殖が促進されて、Ｂｓｔ２タンパク質は、宿主細胞でウィルスの増殖を抑制する可能性があることを確認した。即ち、Ｂｓｔ２機能喪失細胞は、目的ウィルスの増殖を促進させてウィルス産生及び抗原タンパク質の産生を増進させることが分かる。
実施例４：Ｂｓｔ２遺伝子機能が喪失された細胞株の単位細胞当たり細胞内ウィルスタンパク質の量の増加
本実施例では、Ｂｓｔ２遺伝子機能が喪失された細胞株の単位細胞当たり細胞内ウィルス抗原タンパク質の量を分析した。Ｂｓｔ２遺伝子機能が喪失された細胞株は、ウィルスに感染しても細胞死滅を抑制する効果があって、実施例３の結果は、野生型細胞とＢｓｔ２遺伝子機能が喪失された細胞の細胞数の差があり得るため、単位細胞当たり細胞内ウィルス抗原タンパク質量を分析した。
野生型Ｖｅｒｏ及びＭＤＣＫ細胞とＢｓｔ２機能喪失細胞（５×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）に０．１ＭＯＩのＡ／Ｈ３Ｎ２インフルエンザウィルスを３０分間感染させた後、培養液を除去して新鮮な培養液に入れ替えて３６〜７２時間まで追加培養した。各時間帯別に培養液に抜け出たウィルスを除去して、培養容器の底に残った細胞をＰＢＳで洗浄後、回収して細胞の数に比例的に細胞抽出液の量を決定（１×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌ）した。細胞１０４個に該当する細胞抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動した後、インフルエンザウィルスのＨＡタンパク質の大きい片を認識する抗ＨＡ単クローン抗体でｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析をした。
その結果、Ｂｓｔ２遺伝子機能が喪失されたＧ−Ｄ５細胞は、単位細胞当たり細胞内インフルエンザウィルスタンパク質の量が、野生型細胞に比べて、感染３６時間目には約２倍、感染７２時間目には約１７倍増加したことを確認した（図５Ｂ）。また、Ｂｓｔ２遺伝子機能が喪失されたＪ−Ｄ１０細胞は、単位細胞当たり細胞内インフルエンザウィルスタンパク質の量が野生型細胞に比べて、感染３６時間目に約７倍程度増加したことを確認した（図６Ｂ）。
これは、同数の細胞内に含まれたインフルエンザウィルスの量が、野生型細胞に比べてＢｓｔ２遺伝子機能が喪失された細胞で顕著に増加したことを示すものである。従って、Ｂｓｔ２遺伝子機能が喪失された細胞株は、ウィルス増殖が促進されて、Ｂｓｔ２タンパク質は、宿主細胞でウィルスの増殖を抑制する可能性があることを確認した。即ち、Ｂｓｔ２機能喪失細胞は、目的ウィルスの増殖を促進させてウィルス産生及び抗原タンパク質の産生を増進させることが分かる。
本発明によると、Ｂｓｔ２遺伝子の機能を喪失させた動物細胞株を利用した目的ウィルスの感染促進及び産生増進方法は、目的ウィルス及び抗原タンパク質の産生収率を向上することができるため、ウィルス性疾病及び予防のためのワクチン製造に有用である。
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。

Claims (12)

  1. Ｂｓｔ２遺伝子のｅｘｏｎ１部位の塩基を欠失させることにより、又はｅｘｏｎ１部位に塩基を挿入させることにより、Ｂｓｔ２遺伝子の機能が喪失されておりそしてウィルス産生能のある細胞株に目的ウィルスを感染させる工程を含む、目的ウィルスの感染を促進させる方法。
  2. Ｂｓｔ２遺伝子のｅｘｏｎ１部位の塩基を欠失させることにより、又はｅｘｏｎ１部位に塩基を挿入させることにより、Ｂｓｔ２遺伝子の機能が喪失されておりそしてウィルス産生能のある細胞株に目的ウィルスを感染させる工程、及び
    感染させた前記細胞株を培養する工程
    を含む、目的ウィルスの産生を増進させる方法。
  3. Ｂｓｔ２遺伝子のｅｘｏｎ１部位の塩基を欠失させることにより、又はｅｘｏｎ１部位に塩基を挿入させることにより、Ｂｓｔ２遺伝子の機能が喪失されておりそしてウィルス産生能のある細胞株に目的ウィルスを感染させる工程、及び
    感染させた前記細胞株を培養し、それによって抗原タンパク質を製造する工程
    を含む、抗原タンパク質の製造方法。
  4. 前記細胞株は、動物細胞株であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記動物細胞株は、ＭＤＣＫ、Ｖｅｒｏ、マウスの線維芽細胞及びヒト細胞から構成された群より選択されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
  6. 前記ウィルスは、皮膜型または裸出型ウィルスであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記皮膜型ウィルスは、インフルエンザまたはヘルペスウィルスであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
  8. 前記ウィルスは、ＤＮＡまたはＲＮＡウィルスであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  9. ０．０００１乃至０．１ＭＯＩで目的ウィルスを感染させることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  10. 細胞密度が１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ乃至１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌである細胞株に感染させることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  11. ３７℃、５％ＣＯ２の条件で感染が行われることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  12. 請求項３に記載の方法によって製造されたウィルス抗原タンパク質を利用することを含むウィルス性疾病に対するワクチン製造方法。
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