JP2017518084A - Bst2遺伝子の機能が喪失された細胞株を利用したウィルス感染促進及び産生増進方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の他の目的は、Bst2遺伝子の機能が喪失されているウィルス産生能のある細胞株に目的ウィルスを感染させた後、培養することを特徴とする目的ウィルスの産生を増進させる方法を提供するところにある。
本発明のさらに他の目的は、Bst2遺伝子の機能が喪失されているウィルス産生能のある細胞株に目的ウィルスを感染させた後、培養することを特徴とする抗原タンパク質の製造方法を提供するところにある。
本発明のさらに他の目的は、前記方法によって製造されたウィルス抗原タンパク質を利用することを特徴とするウィルス性疾病に対するワクチン製造方法を提供するところにある。
本発明で「機能喪失」とは、Bst2遺伝子の塩基の一部を突然変異させることによって、宿主細胞へのウィルス感染促進、目的ウィルスの産生増進、細胞外培養液にウィルス放出促進及び宿主細胞の死滅を抑制させることを意味する。
本発明で「感染促進」とは、Bst2遺伝子の塩基の一部を突然変異させることによって、少ない数のウィルスで短い時間内に宿主細胞への浸透が行われることを意味する。
本発明で「産生増進」とは、Bst2遺伝子の塩基の一部を突然変異させることによって、宿主細胞当たり細胞内ウィルスタンパク質の量が増加することを意味する。
本発明で「抗原タンパク質」とは、ウィルス感染によって生じる抗原を総称であり、これらのタンパク質は、ウィルスの抗原性や病原性に関与して、宿主細胞は、これを認識してウィルスの感染に対する防御作用を現わす。インフルエンザウィルス粒子は、16種類(H1〜H16)の赤血球凝集素(HA)及び9種類(N1〜N9)のノイラミニダーゼ(NA)と規定される表面抗原とS抗原(主にリボ核タンパク質NPと規定する抗原)を有してS抗原の血清学的特異性によってA、B、Cの3型に分けられる。
本発明で「細胞死滅(apoptosis)」とは、細胞が能動的に生体エネルギーであるATPを積極的に消耗しながら死に至る過程で、異常な細胞分裂、放射線、紫外線、細菌感染またはウィルス感染などの原因で細胞が正常な機能を維持できなくなる場合、誘導される細胞の縮小、DNAの規則的な切断及び細胞膜のフラグメンテーション過程を意味する。
本発明で「ウィルス」とは、ヒトや動物に疾病を誘発し得るウィルスを意味して、好ましくはインフルエンザ及びヘルペスウィルス(herpesvirus)を意味して、より好ましくはP/H1N1、A/H1N1、A/H3N2及びMHV68で構成された群から選択されるものであってもよいが、これに限定されない。
本発明の一実施例では、配列番号1で表されるMDCK細胞株のBst2遺伝子のexon1塩基を欠失または挿入させて突然変異された対立遺伝子を含むウィルス産生能が増加された突然変異細胞株を10個製造した。
[配列番号1]
ATGGCACCTACGCTTTACCACTACTACTGGCCTGTGCCCATAACTGACGAGTCAGAGTCAATGTCATCAAGTCAGAAGCTGAGCTGGCTGGAGTGGCTGGGCATCTTGGGGATCCCAGTGGTGATGGGTCTGTCTGTGGCTCTGATCATCTTTGTTGTCAAGACCAACAGCAAAGCCTGCGGGGATGGCCTCCTAGTAGAGCAGGAGTGTCACAATGTCACCAGCCTCCTGGAGCGCCAACTAACCCAAACCCGGCAAGCGTTACAGGGGACCATGGACCAGGCTACCACCTGCAACAAGACTGTG
[配列番号3]
ATGGCACCTACGCTTTACCACTACTACTGGCCTGTGCCCATAACTGA-AGTCAGAGTCAATGTCATCAAGTCAGAAGCTGAGCTGGCTGGAGTGGCTGGGCATCTTGGGGATCCCAGTGGTGATGGGTCTGTCTGTGGCTCTGATCATCTTTGTTGTCAAGACCAACAGCAAAGCCTGCGGGGATGGCCTCCTAGTAGAGCAGGAGTGTCACAATGTCACCAGCCTCCTGGAGCGCCAACTAACCCAAACCCGGCAAGCGTTACAGGGGACCATGGACCAGGCTACCACCTGCAACAAGACTGTG
[配列番号4]
ATGGCACCTACGCTTTACCACTACTACTGGCCTGTGCCCATAAC-ACGAGTCAGAGTCAATGTCATCAAGTCAGAAGCTGAGCTGGCTGGAGTGGCTGGGCATCTTGGGGATCCCAGTGGTGATGGGTCTGTCTGTGGCTCTGATCATCTTTGTTGTCAAGACCAACAGCAAAGCCTGCGGGGATGGCCTCCTAGTAGAGCAGGAGTGTCACAATGTCACCAGCCTCCTGGAGCGCCAACTAACCCAAACCCGGCAAGCGTTACAGGGGACCATGGACCAGGCTACCACCTGCAACAAGACTGTG
[配列番号5]
ATGGCACCTACGCTTTACCACTACTACTGGCCTGTGCCCATAACT----AGTCAGAGTCAATGTCATCAAGTCAGAAGCTGAGCTGGCTGGAGTGGCTGGGCATCTTGGGGATCCCAGTGGTGATGGGTCTGTCTGTGGCTCTGATCATCTTTGTTGTCAAGACCAACAGCAAAGCCTGCGGGGATGGCCTCCTAGTAGAGCAGGAGTGTCACAATGTCACCAGCCTCCTGGAGCGCCAACTAACCCAAACCCGGCAAGCGTTACAGGGGACCATGGACCAGGCTACCACCTGCAACAAGACTGTG
[配列番号6]
ATGGCACCTACGCTTTACCACTACTACTGGCCTGTGCCCATAACT---GAGTCAGAGTCAATGTCATCAAGTCAGAAGCTGAGCTGGCTGGAGTGGCTGGGCATCTTGGGGATCCCAGTGGTGATGGGTCTGTCTGTGGCTCTGATCATCTTTGTTGTCAAGACCAACAGCAAAGCCTGCGGGGATGGCCTCCTAGTAGAGCAGGAGTGTCACAATGTCACCAGCCTCCTGGAGCGCCAACTAACCCAAACCCGGCAAGCGTTACAGGGGACCATGGACCAGGCTACCACCTGCAACAAGACTGTG-3'
[配列番号7]
ATGGCACCTACGCTTTACCACTACTACTGGCCTGTGCCCATAAC----GAGTCAGAGTCAATGTCATCAAGTCAGAAGCTGAGCTGGCTGGAGTGGCTGGGCATCTTGGGGATCCCAGTGGTGATGGGTCTGTCTGTGGCTCTGATCATCTTTGTTGTCAAGACCAACAGCAAAGCCTGCGGGGATGGCCTCCTAGTAGAGCAGGAGTGTCACAATGTCACCAGCCTCCTGGAGCGCCAACTAACCCAAACCCGGCAAGCGTTACAGGGGACCATGGACCAGGCTACCACCTGCAACAAGACTGTG
[配列番号8]
ATGGCACCTACGCTTTACCACTACTACTGGCCTGTGCCCATAACTGACGACGAGTCAGAGTCAATGTCATCAAGTCAGAAGCTGAGCTGGCTGGAGTGGCTGGGCATCTTGGGGATCCCAGTGGTGATGGGTCTGTCTGTGGCTCTGATCATCTTTGTTGTCAAGACCAACAGCAAAGCCTGCGGGGATGGCCTCCTAGTAGAGCAGGAGTGTCACAATGTCACCAGCCTCCTGGAGCGCCAACTAACCCAAACCCGGCAAGCGTTACAGGGGACCATGGACCAGGCTACCACCTGCAACAAGACTGTG
[配列番号17]
Atggcacctacgctttaccactactactggcctgtgcccataactgacctatgagagtcagagtcaatgtcatcaagtcagaagctgagctggctggagtggctgggcatcttggggatcccagtggtgatgggtctgtctgtggctctgatcatctttgttgtcaagaccaacagcaaagcctgcggggatggcctcctagtagagcaggagtgtcacaatgtcaccagcctcctggagcgccaactaacccaaacccggcaagcgttacaggggaccatggaccaggctaccacctgcaacaagactgtggtgaccctgtcagcttccctggtgaaggagaaggcctggggtcaggagcagctcacccgaggagagaaacttcagggagagatcgagacattgaagcagcagctgcaggccgctttggaggaggtgaagcagctaagagaagggaaggaggcctcaagcaaggaaagggaaaccagctccgtcagctccttgaaggcaccccccggctccgtggtggtccccgtgtacctgctcctaggccttagggctctgctggcctga
[配列番号18]
Atggcacctacgctttaccactactactggcctgtgcccataactga---gtcagagtcaatgtcatcaagtcagaagctgagctggctggagtggctgggcatcttggggatcccagtggtgatgggtctgtctgtggctctgatcatctttgttgtcaagaccaacagcaaagcctgcggggatggcctcctagtagagcaggagtgtcacaatgtcaccagcctcctggagcgccaactaacccaaacccggcaagcgttacaggggaccatggaccaggctaccacctgcaacaagactgtggtgaccctgtcagcttccctggtgaaggagaaggcctggggtcaggagcagctcacccgaggagagaaacttcagggagagatcgagacattgaagcagcagctgcaggccgctttggaggaggtgaagcagctaagagaagggaaggaggcctcaagcaaggaaagggaaaccagctccgtcagctccttgaaggcaccccccggctccgtggtggtccccgtgtacctgctcctaggccttagggctctgctggcctga
[配列番号19]
Atggcacctacgctttaccactactactggcctgtgcccataactga-gagtcagagtcaatgtcatcaagtcagaagctgagctggctggagtggctgggcatcttggggatcccagtggtgatgggtctgtctgtggctctgatcatctttgttgtcaagaccaacagcaaagcctgcggggatggcctcctagtagagcaggagtgtcacaatgtcaccagcctcctggagcgccaactaacccaaacccggcaagcgttacaggggaccatggaccaggctaccacctgcaacaagactgtggtgaccctgtcagcttccctggtgaaggagaaggcctggggtcaggagcagctcacccgaggagagaaacttcagggagagatcgagacattgaagcagcagctgcaggccgctttggaggaggtgaagcagctaagagaagggaaggaggcctcaagcaaggaaagggaaaccagctccgtcagctccttgaaggcaccccccggctccgtggtggtccccgtgtacctgctcctaggccttagggctctgctggcctga
[配列番号20]
Atggcacctacgctttaccactactactggcctgtgcccataa----------agagtcaatgtcatcaagtcagaagctgagctggctggagtggctgggcatcttggggatcccagtggtgatgggtctgtctgtggctctgatcatctttgttgtcaagaccaacagcaaagcctgcggggatggcctcctagtagagcaggagtgtcacaatgtcaccagcctcctggagcgccaactaacccaaacccggcaagcgttacaggggaccatggaccaggctaccacctgcaacaagactgtggtgaccctgtcagcttccctggtgaaggagaaggcctggggtcaggagcagctcacccgaggagagaaacttcagggagagatcgagacattgaagcagcagctgcaggccgctttggaggaggtgaagcagctaagagaagggaaggaggcctcaagcaaggaaagggaaaccagctccgtcagctccttgaaggcaccccccggctccgtggtggtccccgtgtacctgctcctaggccttagggctctgctggcctga
[配列番号21]
Atggcacctacgctttaccactactactggcctgtgcccata---gacga---agagtcaatgtcatcaagtcagaagctgagctggctggagtggctgggcatcttggggatcccagtggtgatgggtctgtctgtggctctgatcatctttgttgtcaagaccaacagcaaagcctgcggggatggcctcctagtagagcaggagtgtcacaatgtcaccagcctcctggagcgccaactaacccaaacccggcaagcgttacaggggaccatggaccaggctaccacctgcaacaagactgtggtgaccctgtcagcttccctggtgaaggagaaggcctggggtcaggagcagctcacccgaggagagaaacttcagggagagatcgagacattgaagcagcagctgcaggccgctttggaggaggtgaagcagctaagagaagggaaggaggcctcaagcaaggaaagggaaaccagctccgtcagctccttgaaggcaccccccggctccgtggtggtccccgtgtacctgctcctaggccttagggctctgctggcctga
[配列番号2]
ATGGCACCTATTTTGTATGACTATTGCAAAATGCCCATGGATGACATTTGCAAGGAAGACAGGGACAAGTGCTGTAAACTGGCCGTAGGAATTCTGGGGCTCCTGGTCATAGTGCTTCTGGGGGTGCCCCTGATTTTCTTCATCATCAAGGCCAACAGCGAGGCCTGCCAGGATGGCCTCCGGGCAGTGATGGAGTGTCACAATGTCACCTATCTCCTGCAACAAGAGCTGGCCGAGGCCCAGCGGGGCTTTCGGGACGCAGAGGCCCAGGCTGTCACCTGCAACCAGACTGTG
[配列番号9]
ATGGCACCTATTTTGTATGACTATTGCAAAATGCCCATGGATGACATTTGCAAGGAAGACAGGGACAAGTGCTGTAAACTGGCCGTAGGAATTCTGGGGCTCCTGGTCATAGTGC------------CCCTGATTTTCTTCATCATCAAGGCCAACAGCGAGGCCTGCCAGGATGGCCTCCGGGCAGTGATGGAGTGTCACAATGTCACCTATCTCCTGCAACAAGAGCTGGCCGAGGCCCAGCGGGGCTTTCGGGACGCAGAGGCCCAGGCTGTCACCTGCAACCAGACTGTG
[配列番号10]
ATGGCACCTATTTTGTATGACTATTGCAAAATGCCCATGGATGACATTTGCAAGGAAGACAGGGACAAGTGCTGTAAACTGGCCGTAGGAATTCTGGGGCTCCTGGTCATAGTGCTTCTGGGGGTGCCCTGATTTTCTTCATCATCAAGGCCAACAGCGAGGCCTGCCAGGATGGCCTCCGGGCAGTGATGGAGTGTCACAATGTCACCTATCTCCTGCAACAAGAGCTGGCCGAGGCCCAGCGGGGCTTTCGGGACGCAGAGGCCCAGGCTGTCACCTGCAACCAGACTGTG
[配列番号24]
ATGGCATCTACTTCGTATGACTATTGCAGAGTGCCCATGGAAGACGGGGATAAGCGCTGTAAGCTTCTGCTGGGGATAGGAATTCTGGTGCTCCTGATCATCGTGATTCTGGGGGTGCCCTTGATTATCTTCACCATCAAGGCCAACAGCGAGGCCTGCCGGGACGGCCTTCGGGCAGTGATGGAGTGTCGCAATGTCACCCATCTCCTGCAACAAGAGCTGACCGAGGCCCAGAAGGGCTTTCAGGATGTGGAGGCCCAGGCCGCCACCTGCAACCACACTGTGGTAAGCTCCTCAACTCCTTTGGATGGCCTAGTACTAGGCGGTGGGAGGGACAAGAATCTCTCCCCAGAAATCTGACCCAGGGTGGGTCTCCAGGGAGATGCAGGGGAGGTCCTGAAACTGCTCCTGGGCCCCCACATCAAGGGACCTAGGTTCCCCTACCAGGGTTTGTGGGCCCCTAACCCAGTCCAGGGCACTGGTGTAGGGGCAGGGTGTTAAAACTCTCCAGATCCCCCAAATCGGGGACCTCAGTATCCCCCTGGGACTTAGGTGAATTTATAAATTCTTTCCAGGGCACTGGTGTCGGGGGCCTTGAAACTCCTCGTGGGCACCAGTCCTGGGGGAGTAGAAATCCCTATTCAGGGTTGAAGGGGGACCTCACCAGACCCTGAAAAAGGGGGCTTTTGAAATTTTCACTTCATCCCTAAGAAACTGAAATATTCACCTGGGTCCTGATATGGGGGATCTTGAAACTCTCGCTGGGCATGTCACTTGGGCGGGGAAATCCCACTGCATTCTGGATTTGGTAGGGCCCTCTAACTTTTCTTGGGCCATTGCTCAGGCAATCTGGAAATGTCCACTAAACTTTGGTTATCGATAGCCTCCAAGTTTCCACGTGGGGTGGCCTCAAAACTCCCATTTTGAGGACCCACATGCTTATGGGTGGCCCTGGGAGAGTGTGTGGTTGTGGCTGTTCTTTAAGGTTGGAGACCATGGTGCAGAGAGGGTTGGAAGAAAACCTGAAAGGGGTTTGCATTTAAGCCCCTCTGTCCCCAGGACCTAGGGAGGAGGCCCAGGTCCCAGGGGCAGCAGCCAAACTCCCCAGGCCAAAACCCCAGATTCTAACTCTTCTTAGATGGCCCTAATGGCTTCCCTGGATGCAGAGAAGGCCCAAGGACAAAAGAAAGTGGAGGAGCTTGAGGGTGAGAAAGGGAGAAGGGAGAGGGCCGGGGAGGGGTGAGTCAGGTATGGAAGAGGGGGTGGGGGCAGGGAGACCAGGGCTGGAGGTTGGGGTAAGGGGGAGGTTCTGTCCCAGAGTGGAGCAGGGCCCCAGCATGGCCACATGCTGACCCGCCCCCTGTTTCTGTCCTCCCACCCTACCAGGAGAGATCACTACATTAAACCATAAGCTTCAGGACGCGTCTGCAGAGGTGGAGCGACTGAGGTCAGAGATAGCCTTCCCCCGCTACCCTCCACCTGCCACATTCCTCTCACCCCCACATCCCTAGCCCAAGACCCAGGATCTCCTTTGCTCCCAAAATCCCCATTGCCCCAAGGGATAAAGTTTGAGTCCCACAAAAGGATAACTTAGCCCCTAGGGTCACAGAGCCATGGGTGGCCGCTGTCCATTCCCTCCCCGGTGACTTGGATTGGGGCGGTGCGGGGGGAACTCCCGGGGGCGGTGGGCTTACAGGGAGGGCGGCAGGAGCCAGGACGAGCAGATGCCTGATTTGCCATCTGTACCGCAGAAGAGAAAACCAGGTCTTAAGCGTGAGAATCGCGGACAAGAAGTACTACCCCAGCTCCCAGGACTCCAGCTCCGCTGCGGCGCCCCAGCTGCTGATTGTGCTGCTGGGCCTCAGCGCTCTGCTGCAGTGA
[配列番号25]
ATGGCATCTACTTCGTATGACTATTGCAGAGTGCCCATGGAAGACGGGGA---------------------------GATAGGAATTC
[配列番号26]
ATGGCATCTACTTCGTATGACTATTGCAGAGTGCCCATGGAAGACGGGGATAAGCGCTGTAAGCTTCTGCTGGGGATAGGAATTC------
[配列番号27]
ATGGCATCTACTTCGTATGACTATTGCAGAGTGCCCATGGAAGACGGGGATAAGCGCTGTAAGCTTCtTGCTGGGGATAGGAATTC
[配列番号28]
ATGGCATCTACTTCGTATGACTATTGCAGAGTGCCCATGGAAGACGGGGATAAGCGCTGTAAGC---------------------
[配列番号29]
ATGGCATCTACTTCGTATGACTATTGCAGAGTGCCCATGGAAGACGGGGATAAGCGCTGTAAGCTTCTGCTGATAGGAATTC---
[配列番号30]
ATGGCATCTACTTCGTATGACTATTGCAGAGTGCCCATGGAAGACGGGGATAAGCGCTGTAA--------TGGGGATAGGAATTC
1−1:MDCK細胞株
野生型MDCK細胞株(高麗大学、ソン・ムンジョン教授)5×105個を10%FBS、2mM L−glutamine、5Mβ−mercaptoethanol、10μg/ml gentamicine、50U/ml penicillin、50μg/ml streptomycinが添加されたDMEM complete(GIBCO)培地で24時間培養後、Bst2遺伝子のexon1部位と結合可能なTALENベクター(ToolGen、韓国)1対、レポーターベクター(ToolGen、韓国)1個及びTurbofect reagent(Thermo、米国)を混ぜた計15μgを培養中の細胞に入れて、48時間、37℃、5%CO2の条件で培養した。前記培養された反応物をFACS Aria(BD Bioscience)を利用してGFPとRFPに共に陽性である細胞を選択的に選んだ500個の細胞を96−wellに分注して単一クローン細胞を収得した。
[配列番号11]5'-GGTCAGGATGGCTCCTATGC-3'
[配列番号12]5'-AACCTGACAGGGTCACCTGG-3'
[配列番号13]5'-GTAGCCCCAGCCAAAGGTTTC-3'
[配列番号14]5'-AGGCCTCCCCATGCCCAAAC-3'
野生型Vero細胞株(University of Southern California,Chengyu Liang)5×105個を10%FBS、2mM L−glutamine、5Mβ−mercaptoethanol、10μg/ml gentamicine、50U/ml penicillin、50μg/ml streptomycinが添加されたDMEM complete(GIBCO)培地で24時間培養後、Bst2遺伝子のexon1部位と結合可能なTALENベクター(ToolGen、韓国)1対、レポーターベクター(ToolGen、韓国)1個及びTurbofect reagent(Thermo、米国)を混ぜた計15μgを培養中の細胞に入れて、48時間、37℃、5%CO2の条件で培養した。前記培養された反応物をFACS Aria(BD Bioscience)を利用してGFPとRFPに共に陽性である細胞を選択的に選んだ500個の細胞を96−wellに分注して単一クローン細胞を収得した。
[配列番号15]5'-GAGGGGGAGATCTGGATGG-3'
[配列番号16]5'-CTTCTCTGCATCCAGGGAAG-3'
Bst2が欠如したマウス線維芽細胞株(B2K)を産生するために、24週齢のBst2ノックアウトマウス(イスアブジス(ISU ABXIS、韓国)の太ももにMCA(3−methyl cholanthrene)100μgを注射した。約4ヶ月後太ももにできた癌を剥ぎ取った後、70%エタノールで洗浄してバクテリアを除去して、10%FBSとRPMI培地が入れられたdishに移して手術用はさみで細かく切った。50ml conical tubeにdigestion solution(500Unit/ml collagenase IV,150Unit/ml DNase I)13mlと癌の断片を入れてshakerで、250rpm、37℃で1時間30分振とうした。10mlピペットで3〜5回ピペッティングして断片をさらに分散した後、新しい50ml conical tubeにnylon meshでフィルタリングして入れた。1250rpmで5分間遠心分離して上澄み液は除去した後、ペレットは新しい培地に分散してnylon meshでフィルタリングして前記のような条件で遠心分離した。上澄み液を除去した後、ペレットを分散して10cm dish当たり2.4×107cellsを接種して培養してBst2ノックアウト癌細胞株(B2K)で維持した。
ヒト293T細胞株5×105個を10%FBS、2mM L−glutamine、5Mβ−mercaptoethanol、10μg/ml gentamicine、50U/ml penicillin、50μg/ml streptomycinが添加されたDMEM complete(GIBCO)培地で24時間培養後、Bst2遺伝子のexon1部位と結合可能なCRISPRベクター(ToolGen、韓国)1個、レポーターベクター(ToolGen、韓国)1個、Cas9ベクター及びFugene(Promega、米国)を混ぜた計18μgを培養中の細胞に入れて、48時間、37℃、5%CO2の条件で培養した。前記培養された反応物をFACS Aria(BD Bioscience)を利用してGFPとRFPに共に陽性である細胞を選択的に選んだ500個の細胞を96−wellに分注して単一クローン細胞を収得した。
[配列番号22]5’-TGG CAC GGC CTA GGC ACT CA-3’
[配列番号23]5’-GGA TAC TGA GGT CCC CGA TT-3’
2−1:低いMOIのウィルス感染
Bst2遺伝子機能が喪失された細胞株の感染増進効果を確認するために、野生型MDCK細胞株とBst2機能喪失細胞株の感染能を比較した。本実施例では、実施例1で収得したJ−D10(寄託番号KCLRF−BP−00285)細胞株と同様にBst2遺伝子のexon1に解読枠突然変異を起こしてBst2遺伝子の発現を完全に除去した細胞株である、突然変異された対立遺伝子を含む8−D8、14−F11及び12−B8を使用した。8−D8、14−F11及び12−B8の突然変異配列は、前記配列番号17乃至21で表されて、8−D8は配列番号17、18、14−F11は配列番号19、20、及び12−B8は配列番号18、21の突然変異された対立遺伝子を含む。
野生型MDCK細胞とBst2機能喪失細胞(5×104cell/well)に0.0001MOIのA/H3N2インフルエンザウィルスを各々1、5、10、20、30分及び1時間感染させた。以後、培養液を除去してagaroseで細胞層を覆って感染したウィルスを48時間増殖させた。
3−1:Vero及びMDCK細胞株
Bst2遺伝子機能が喪失された細胞株のウィルス抗原タンパク質産生増加効果を確認するために、野生型Vero及びMDCK細胞株とBst2機能喪失細胞株のウィルス抗原タンパク質産生を比較した。本実施例では、実施例1で収得されたG−D5及びJ−D10(寄託番号KCLRF−BP−00285)細胞株を使用した。
ヒト由来細胞でBst2遺伝子機能が喪失に伴うウィルス抗原タンパク質産生増加効果を確認するために、Bst2遺伝子をノックアウトさせた293T細胞株(B4、B24及びD19、2.5×105cell/well)を24−wellプレートに0.01MOIのH3N2(A/Brisbane/10/2007)インフルエンザウィルスで30分間感染させた後、新鮮な培養液をさらに添加して2日間追加培養した。
本実施例では、Bst2遺伝子機能が喪失された細胞株の単位細胞当たり細胞内ウィルス抗原タンパク質の量を分析した。Bst2遺伝子機能が喪失された細胞株は、ウィルスに感染しても細胞死滅を抑制する効果があって、実施例3の結果は、野生型細胞とBst2遺伝子機能が喪失された細胞の細胞数の差があり得るため、単位細胞当たり細胞内ウィルス抗原タンパク質量を分析した。
Claims (14)
- Bst2遺伝子の機能が喪失されておりそしてウィルス産生能のある細胞株に目的ウィルスを感染させる工程を含む、目的ウィルスの感染を促進させる方法。
- Bst2遺伝子の機能が喪失されておりそしてウィルス産生能のある細胞株に目的ウィルスを感染させる工程、及び
感染させた前記細胞株を培養する工程
を含む、目的ウィルスの産生を増進させる方法。 - Bst2遺伝子の機能が喪失されておりそしてウィルス産生能のある細胞株に目的ウィルスを感染させる工程、及び
感染させた前記細胞株を培養する工程
を含む、抗原タンパク質の製造方法。 - 前記細胞株は、動物細胞株であることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記動物細胞株は、MDCK、Vero、マウスの線維芽細胞及びヒト細胞から構成された群より選択されることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 前記ウィルスは、皮膜型または裸出型ウィルスであることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記皮膜型ウィルスは、インフルエンザまたはヘルペスウィルスであることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 前記ウィルスは、DNAまたはRNAウィルスであることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 0.0001乃至0.1MOIで目的ウィルスを感染させることを特徴とする請求項1から請求項3のいずれかに記載の方法。
- 細胞密度が1×104cells/ml乃至1×107cells/mlである細胞株に感染させることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 37℃、5%CO2の条件で行われることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記Bst2遺伝子の機能は、ウィルス産生能のある細胞株のBst2遺伝子exon1部位の特定塩基を欠失させることにより、又はexon1部位に特定塩基を挿入させることにより、喪失させることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記Bst2遺伝子exon1部位は、Bst2タンパク質の細胞質部位をコードしていることを特徴とする請求項12に記載の方法。
- 請求項3に記載の方法によって製造されたウィルス抗原タンパク質を利用することを含むウィルス性疾病に対するワクチン製造方法。
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