KR101677231B1 - 무혈청배지（serum free medium）를 이용한 메갈로사이티바이러스의 효율적 제조방법 - Google Patents

무혈청배지（serum free medium）를 이용한 메갈로사이티바이러스의 효율적 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 무혈청배지 (Serum Free Media, SFM)를 이용한 바이러스의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 (a) 바이러스에 저감염성을 보이는 어류 주화세포에 우태아혈청(FBS) 0~0.5% 을 함유하는 SFM (Serum Free Medium)을 사용한 바이러스 식균을 통한 감염성의 증대 방법 ; 및 (b) 상기 어류 주화세포에서의 바이러스 분리 단계를 포함하여 어류 주화세포를 이용한 고농도 바이러스의 생산을 특징으로 하는 바이러스 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 주화세포의 바이러스에 대한 감염력과 민감도가 우수하면서, 계대배양에 의한 카피 수 감소도 일어나지 않아, 보다 효율적으로 백신제조에 필요한 바이러스를 생산할 수 있다.

Description

무혈청배지（serum free medium）를 이용한 메갈로사이티바이러스의 효율적 제조방법{Enhanced Production of Megalocytivirus Using Serum Free Medium}
본 발명은 무혈청 또는 저혈청배지 (Serum Free Media, SFM)를 이용한 바이러스의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 (a) 바이러스에 저감염성을 보이는 어류 주화세포에 우태아혈청(FBS) 0~0.5% 을 함유하는 SFM을 사용하는 바이러스 식균 방법을 통한 숙주세포에 대한 감염성의 증대 방법 ; 및 (b) 상기 어류 주화세포에서의 바이러스 배양 증식 단계를 포함하여 어류 주화세포를 이용한 고농도 바이러스의 생산을 특징으로 하는 바이러스 제조방법에 관한 것이다.
이리도비리데 과(Iridoviridae family)는 5개의 속(genus)으로 구분되며 이중 어류에 병원성을 나타내는 이리도바이러스는 라나바이러스 속(genus Ranavirus)과 메갈로사이티바이러스 속(genus Megalocytivirus)에 포함된다. 라나바이러스 속에 속하는 바이러스는 여러 주화세포에서 비교적 쉽게 배양된다고 알려져 있으나, 메갈로사이티바이러스 속(megalocytivirus genus)의 경우 세계적으로 담수, 해산어 양식 산업에 큰 타격을 주고 있지만, 아직까지 다양한 세포주를 이용한 in vitro 배양에서 많은 어려움이 보고되고 있다. 따라서 현재 메갈로사이티바이러스의 생산과 연구는 in vitro 배양의 어려움에 의하여 매우 제한적으로 진행되고 있어 다양한 주화세포에 대한 메갈로사이티바이러스의 감수성 증대 방법 개발이 어류 백신 개발 등의 산업적 측면에서 중요한 문제로 대두되고 있다.
메갈로사이티바이러스에 감염된 어류의 조직을 사용하여 주화세포에서 virus 의 배양을 실시하면, 첫 세대의 계대배양에는 감수성을 보이지만 다시 그 배양된 바이러스를 주화세포에 식균하는 viral passage를 실시하면 감염력이 급격하게 감소하고 동시에 배양 액 내의 바이러스 카피수가 점진적으로 감소하는 결과를 보인다. 특히 BF-2 세포주 등의 경우, 메갈로사이티바이러스에 대하여 감염이 된다고 알려져 있으나, 감염율이 현저히 낮다. 예를 들면, 메갈로사이티바이러스를 BF-2 세포와 KRE-3 세포에 감염시켰을 때, 첫 감염에서는 CPE가 보였으나 바이러스를 계대(passage)함에 따라 점점 그 감염력과 바이러스 카피 수가 감소하는 것으로 알려져 있다(Nakajima, K. and Sorimachi, M., Fish Pathol., 29:29, 1994; Chou, H.Y. et al., Fish Pathol., 33:201, 1998)
그 원인과 해결 방법은 현재까지 알려져 있지 않다. 그러나 숙주 주화세포의 바이러스 감염에 대한 민감도를 증대 시킬 수 있는 방법이 개발된다면 이러한 문제는 해결될 수 있을 것으로 생각된다.
숙주 주화세포는 여러 생리적 조건에서 각기 다른 수준의 자체 방어 물질을 생산하며 이는 바이러스 침입에 대한 민감도를 결정하는 중요한 요소로서 작용한다. 만약 숙주의 방어 생산물질을 감소시킨 상태에서 바이러스의 식균을 실시하면 바이러스에 대한 숙주세포의 방어력 감소에 의하여 식균된 바이러스는 높은 감염력을 보여줄 수 있을 것이다. 그러므로 숙주세포의 생리적 기능에 최소한의 영향을 주면서 자체방어 능력을 감소시킬 수 있는 방법을 개발한다면, 바이러스의 감염력 증대로 이어질 수 있을 것이다. 이러한 관점에서 볼 때, 세포배양배지가 세포주에 대한 바이러스 감염성에 영향을 미칠 수 있을 것이라 판단하였다.
세포를 배양하는 배지 중, 혈청이 첨가되지 않고 인공적으로 제작된 배지인 Serum Free Media (SFM)은 VERO cell에서 rabies virus의 복제를 증가시키며 (Frazzati-Gallina, N.M. et al., J. Ocean Univ. China, 2012:65, 2001), C3H와 GR tumor cell에서 SFM에서 배양 시 serum이 첨가된 배지와 비교했을 때 더 높은 titer의 mouse mammary tumor virus를 획득할 수 있게 한다고 보고된 바 있다(Richard, F.B. et al., In vitro., 12:558, 1976).
이에, 본 발명자들은 숙주세포의 방어력 감소에 의한 바이러스의 감염력을 증대시키는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 어류주화세포를 0~0.5% 우태아혈청(FBS)을 함유하는 무혈청 또는 저혈청배지 (SFM)로 배양하며 메갈로사이티바이러스를 감염시키는 경우, 바이러스에 대한 감염력이 증대되고, 여러 계대가 지나도 바이러스 카피 수가 감소되지 않는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 SFM을 이용하는 새로운 바이러스 접종 방법을 사용함으로서 어류주화세포의 바이러스에 대한 감염성과 생산성을 동시에 증대시키고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 SFM을 이용하여 in vitro 조건에서 여러 계대 배양된 바이러스의 감염성 감소 현상을 제거 하는 새로운 바이러스 접종 방법을 통해 고농도의 메갈로사이티바이러스 생산방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 바이러스에 감수성 있는 어류종의 주화세포를 일정기간 배양 후, 0-0.5% FBS를 함유하는 무혈청 또는 저혈청 배지 (Serum free medium, SFM)으로 교체와 동시에 바이러스를 접종하는 단계 및 (b) 상기 어류 주화세포에서 바이러스를 배양 증식 하는 단계를 포함하는 어류세포주를 이용한 새로운 고농도의 바이러스 제조방법을 제공한다.
본 발명은 SFM을 이용한 새로운 바이러스 제조법은 주화세포의 바이러스에 대한 감염력과 민감도를 증대시키고, 이를 통해 보다 효율적으로 고농도의 메갈로사이티바이러스를 생산할 수 있게 한다.
본 발명에 따른 무혈청 또는 저혈청배지를 이용한 바이러스 제조법은 주화세포의 바이러스에 대한 감염력과 민감도가 우수하면서, 계대배양에 따른 바이러스의 감염력 감소현상도 일어나지 않아, 보다 효율적으로 백신제조에 필요한 고농도의 바이러스를 생산할 수 있게 한다.
도 1은 메갈로사이티바이러스의 MCP (major capsid protein) 유전자를 비교하여, 분류학적 계통 관계를 나타낸 것이다.
도 2는 메갈로사이티바이러스에 감염된 주화세포들의 CPE ( cytopathic effect, 세포변성효과) 를 관찰한 현미경 사진이다(＊:메갈로사이티바이러스를 감염시키지 않은 세포; ＊＊: 메갈로사이티바이러스를 감염시켜 세포변성효과를 나타내는 세포).
도 3은 다양한 주화세포에서 메갈로사이티바이러스 RB-1 type V0 (감염 조직으로부터 직접 채취한 RB-1 바이러스)의 배양시간에 따른 바이러스 카피수 변화를 나타낸 것이다.
도 4는 메갈로사이티바이러스에 대해 감수성이 있는 PMF, GF 및 BF-2 주화세포에서 메갈로사이티바이러스 RB-1의 계대배양 시 (viral passage) 나타나는 바이러스 증식의 감소 현상을 확인한 것이다.
도 5는 감염 조직 마쇄액 (RB-1 type V0)과 이를 이용하여 첫 번째 계대배양하여 수득한 바이러스 상등액 (RB-1 type V1)에 대해 각각 기존 L-15 배양법과 본 발명의 SFM 처리법으로 배양하여 증식시킨 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에서 확립한 SFM 처리방법을 이용한 바이러스의 배양법을 도식화한 것이다.
도 7은 SFM 처리방법을 이용한 바이러스의 배양법의 최적화 : SFM에 첨가 된 다양한 농도의 FBS가 바이러스의 배양생산에 미치는 효과에 대한 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 SFM을 사용하여 각각의 주화세포에 대해 RB-1 type V0 (감염 조직 마쇄액)와 RB-1 type V1 (in vitro 배양을 통하여 1 번 계대 배양을 한 RB-1 바이러스)의 감염력을 비교하여 SFM 처리방법을 이용한 바이러스 배양법의 효과를 분석 한 것이다.
도 9는 RB-1 type V0 와 RB-1 type V5 (in vitro 배양을 통하여 5 번 계대 배양을 한 RB-1 바이러스) 의 돌돔에 대한 병원성 비교의 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 RB-1 type V0 와 RB-1 type V5 와의 MCP 유전자 염기 배열을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 SFM 처리 방법을 이용한 배양이 PMF 세포의 면역반응에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
메갈로사이티바이러스는 in vitro에서의 계대배양에서 감염력의 점진적 감소, 그리고 생산력 감소에 의한 배양액에서의 바이러스 농도 저감화 현상 등이 나타나는 매우 특이적인 감염을 나타내기 때문에, 바이러스의 산업적인 생산에 많은 어려움이 있었다. 본 발명에서는 다양한 주화세포를 이용해 다양한 유전형의 메갈로사이티바이러스 배양과 계대 배양 횟수에 따른 감염력의 저감화 현상을 해소 하는 동시에 바이러스 생산력을 증대 시키는 방법을 개발하고자 하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 바이러스에 감수성 있는 어류종의 주화세포를 일정기간 배양 후, 0-0.5% FBS를 함유하는 SFM으로 교체와 함께 바이러스를 접종하는 단계 및 (b) 상기 어류 주화세포에서의 바이러스 배양 증식 단계를 포함하여 어류 주화세포를 이용한 고농도 바이러스의 생산을 특징으로 하는 바이러스 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 바이러스는 대부분의 어류 질병 원인 바이러스인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 이리도비리데과(Iridoviridae family) 바이러스일 수 있으며, 가장 바람직하게는 메갈로사이티바이러스를 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 "주화세포"란 어류 조직에서 세포를 분리하여 연속적인 계대 배양을 통하여 세포주화한 세포를 의미한다.
본 발명에서 "SFM"은 0~0.5% 우태아혈청(FBS)을 함유하는 무혈청 또는 저혈청 배지를 의미하고, 바람직하게는 0~0.1% 우태아혈청(FBS) 함유 배지를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 어류 유래 주화세포는 해당 바이러스에 감염되는 어류의 주화세포라면 제한없이 사용할 수 있으며, 일예로 돌돔, 강담돔, 점농어, 넙치, 감성돔, 강도다리, 조피볼락, 능성어, 쏘가리 유래의 주화세포를 사용할 수 있으며, 바람직하기는 참돔유래 지느러미세포 (PMF 세포) GF세포, 또는 BF-2 세포를 사용 할 수 있으나 이에 한정 하는 것은 아니다.
우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)은 다양한 주화세포에서 세포성장과 효율적인 바이러스 수득을 위해 많이 사용되고 있으나, 가격이 비싸며, 프리온(prion) 및 다른 바이러스의 오염에 대한 위험이 존재한다. 따라서, FBS를 사용하지않는 바이러스 배양방법은 감염도 및 민감도 향상 이외에도 보다 경제적이라는 이점이 존재한다.
일반적으로 SFM을 사용하여 포유류 유래의 동물세포주를 배양하기 위해서는 세포 주가 몇 세대에 걸쳐서 SFM에 대한 적응과정이 필요하다. 세포주를 SFM에서 배양하는 것은 방어력 증대물질의 생산 감소를 포함한 세포주의 생리적 변화를 일으키게 할 수 있으며, 이는 세포주의 바이러스 등에 대한 방어능력 변화 또는 바이러스의 침투력 또는 감염력에도 변화를 유도할 수 있다는 것과 동일한 의미로 해석할 수 있다. 결론적으로 이러한 SFM 처리는 세포주의 바이러스에 대한 민감성에도 변화를 유도할 수 있다는 것일 것이다.
본 발명에 있어서, 메갈로사이티바이러스는 모든 종류의 메갈로사이티바이러스를 포함하며, 서브그룹 1, 서브그룹 2, 서브그룹 3 및 서브그룹 4로 구성된 군에서 선택되는 메갈로사이티바이러스인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서는 in vitro 계대배양시 메갈로사이티바이러스의 증식 저감화현상에 대해 SFM처리법을 이용한 바이러스 배양방법을 통하여 고농도 바이러스를 수득할 수 있음을 보여 주고 있다. L-15배지를 이용하여 배양한 어류 주화세포에 메갈로사이티바이러스 RB-1 type V0 (감염어의 조직 마쇄액으로 108 copies/ml 에 상응하며 각 flask에의 식균량은 106 copies/flask 로 함)를 접종하여 배양할 때와 달리 in vitro 계대배양을 한 바이러스 RB-1 type Vn (n은 계대 횟수)은 계대횟수의 증가와 함께 감염성 감소를 보여 점진적으로 배양된 최종 바이러스의 농도가 감소하는 양상을 보였다 (도 4).
이러한 현상을 극복하기 위하여 개발한 본 발명의 SFM 처리법을 적용하여 in vitro 배양 시 주화세포의 감염성 증대로 인한 메갈로사이티바이러스 RB-1의 바이러스 배양 농도 증가 여부를 조사하였다. 먼저 10% FBS가 함유된 L-15 배지에서 3일간 배양 된 여러 주화세포를 SFM 배지로 교환하고, RB-1 type V0 (106 copies/flask )을 접종하였다. RB-1 type V0 접종 7일 후에 수득된 바이러스 RB-1 type V1을 미리 준비한 감염되지 않은 주화세포에 106 copies/flask의 농도가 되게 접종하는 방법을 연속적으로 실시함으로써 바이러스의 계대(passage) 실험을 실시하였다.
그 결과 PMF와 GF 세포에서 L-15 배지를 이용하여 RB-1 type V1 바이러스를 in vitro 계대배양 시 감염되지 않았으나 본 발명의 SFM을 사용하는 방법으로 한 배양 시에는 감염력증대 효과에 의하여 고농도의 바이러스 수득이 가능함을 보여 주었다 (도 5). 이러한 바이러스의 증식을 정량적으로 비교 분석한 결과 SFM 처리 방법을 이용하여 배양한 메갈로사이티바이러스 V1의 증식은 PMF 세포에서 L-15 배지를 사용 한 경우에 대비하여 평균 약 1340배, 그리고 GF 세포에서는 평균 약 200배의 증가를 보여 주었다. 더구나 감염이 거의 되지 않아 바이러스의 수득을 거의 할 수 없었던 BF-2에 대해서도 SFM 처리법을 적용 시 비교적 높은 농도의 바이러스 수득이 가능함을 확인할 수 있었다. 이를 통해 SFM 처리방법을 이용한 바이러스 배양의 효과는 다양한 어류세포에서 매우 뚜렷하게 나타남을 확인하였다 (도 8).
본 발명의 다른 양태에서는, SFM 배지에 각기 다른 농도의 FBS를 첨가 한 효과를 보기 위하여 L-15 배지에서 3일간 배양 한 PMF 세포주에 FBS 함유 비율을 0~10%로 달리한 SFM 배지로 각각 교체한 후 RB-1 type V0 (106 copies/ flask)을 접종하였다. 접종 후 0, 1, 3, 5 및 7일 후 각각의 배양 상등액내에 있는 바이러스를 정량하였다. 그 결과, SFM 배양법의 최적 조건은 0.1% FBS가 첨가된 SFM을 사용 하였을 때의 배양 상등액에서 최대의 바이러스 카피수(6.14x109 copies/ml)를 얻었다 (도 7). 위에서 확립한 방법을 적용하여 다른 서브그룹의 메갈로사이티바이러스를 PMF, GF 및 BF-2 세포주에 대한 in vitro 배양실험에서는 3가지 바이러스 타입 모두 모든 세포주에서 높은 배수로 배양됨을 확인하였다.
다른 관점에서, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 바이러스를 다양한 방법으로 활용하거나 불활화시켜 백신을 제조하는 것을 특징으로 하는 바이러스 항원의 제조방법에 관한 것이라고 할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 메갈로사이티바이러스의 확보
본 실시예에서는 참돔지느러미 세포주에 감염시키기 위한 메갈로사이티바이러스를 감염어류에서 분리하였다.
메갈로사이티바이러스는 경상남도 남해안의 가두리 양식장에서 전형적인 메갈로사이티바이러스의 감염증상을 보이는 돌돔으로부터 2012년 메갈로사이티바이러스 RB-1 을 분리하였다. 그리고 2011년 거제도 양식장의 넙치로부터 메갈로사이티바이러스 OF-1 type을, 2009년 싱가포르에서 수입된 펄구라미로부터 메갈로사이티바이러스 PG-1 type을 각각 분리하였다. 바이러스는 각 감염어의 비장과 신장 조직을 적출 분리하여 10 배 volume의 PBS에서 마쇄한 뒤 4℃ 10,000g에서 10분간 원심분리하고, 그 상등액을 건강한 돌돔에 접종 하였다. 돌돔이 폐사하거나 빈사상태가 되면 신장과 비장을 적출하는 방법을 통해 바이러스를 증폭 및 재분리하였고 -70℃에서 사용 전까지 보관하였다.
상기 각 감염어의 비장 조직으로부터 total DNA를 분리 후 PCR을 실시하여 메갈로사이티바이러스 감염을 확인하였다. PCR에 사용된 프라이머는 메갈로사이티바이러스의 MCP(major capsid protein) 유전자 부위로부터 고안된 M2F (5'-GGC GGCGACAATGCCGTG-3':서열번호 1)와 M2R (5'-ATAACGACCAGTTCAAAC-3':서열번호 2) 프라이머를 이용하였다.
증폭시킨 PCR 생성물은 Prep-A-Gene DNA purification kit (Bio-Rad Laboratories, USA)를 사용하여 정제하였고, 정제된 DNA는 TOPO-TA Cloning Kit (Invitrogen Co., USA)를 사용하여 클로닝한 후, Big Dye Terminator Cycle DNA Sequencing Kit (ABI PRISM PE Applied Biosystems, USA)를 사용하여 염기서열을 확인하였다. 염기서열은 Clustal W program과 MEGA4 program (Version 2.1. Department of Biology, Arizona State University, Tempe, AZ, USA)으로 계통적 분석을 실시하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 RB-1, PG-1 그리고 OF-1은 각각 메갈로사이티바이러스의 서브그룹 2, 3 및 4에 속하는 것으로 나타났으며 이하의 실험에서 메갈로사이티바이러스의 세 가지 서브그룹을 대표하는 strains로 사용하였다.
실시예 2 : 참돔지느러미 세포주의 확립
건강한 참돔 치어 (4.0±0.5 cm)를 부산의 한 양식장에서 구입하였다. 구입한 참돔은 70% 에탄올로 체표면을 소독한 뒤 지느러미를 적출하였다. 지느러미는 1 mm2이하의 크기로 잘게 자른 뒤 항생제 (penicillin, 200 IU/ml; streptomycin, 200 ㎍/ml)가 첨가된 Hank's balanced salt solution (HBSS, Sigma-Aldrich, USA)로 3번 세척하였다.
세척된 지느러미는 0.25% trypsin-EDTA 용액(Gibco, USA)으로 4℃에서 60분간 세포를 떼어내었다. Trypsin-EDTA를 처리한 지느러미 조직 및 세포는 20% FBS (Gibco, USA)와 항생제 (penicillin, 200 IU/ml; streptomycin, 200 ㎍/ml)가 첨가된 L-15 (Sigma-Aldrich)배지 10 ml을 첨가하고 4℃ 500 g에서 10분간 원심 분리를 3회 실시하여 trypsin을 제거하였다. 세포는 다시 20% FBS와 항생제 (penicillin, 200 IU/ml; streptomycin, 200 ㎍/ml)가 첨가된 L-15 배지 5 ml에 현탁한 뒤 25 cm2 tissue culture flask (Corning, USA)에 접종하였다. 참돔 지느러미 세포는 25℃에서 배양되었으며, 배지는 2일에 한 번씩 교환하였다. 초대(primary)배양된 참돔지느러미 세포는 fibroblast-like cell과 epithelial-like cell이 함께 자라는 것이 관찰되었다.
초대배양한 참돔지느러미세포가 단층 (monolayer)을 형성하면 0.5% trypsin-EDTA solution (Gibco, USA)으로 세포를 떼어내었다. 떼어낸 세포는 L-15배지 10 ml을 첨가하고 4℃ 500g에서 10분간 원심 분리하여 trypsin을 제거한 뒤 1:4 의 비율로 나누어 계대배양하였다. 10세대 계대배양 하였을때 FBS의 농도를 10%로 감소시켰으며, 항생제의 농도는 100 IU/ml의 penicillin과 100 ㎍/ml의 streptomycin으로 감소시켜 배양하였다.
분리한 참돔 지느러미 세포는 Pagrus major fin (PMF) 세포로 명명하고, 2014년 9월 3일자로 한국세포주은행에 기탁번호 KCLRF-BP-00324로 기탁하였다.
실시예 3: 메갈로사이티바이러스의 정량적 분석
바이러스의 정량적 분석을 위해서 quantitative PCR (qPCR)을 이용하였다. 먼저 viral DNA의 분리는 AccuPrep Genomic DNA Extraction kit (Bioneer, Korea)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 분리 한 후 LightCycler 480 II (Roche, USA)를 이용한 absolute qPCR법으로 바이러스의 카피수를 정량하였다.
Absolute qPCR은 2ㅧLightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche, USA) 10 μl, 0.5 pM of 각각의 primer 그리고 1 μl의 template DNA를 첨가한 후, 최종 volume이 20 μl가 되도록 하였다. qPCR의 조건은 95℃에서 10분간 반응한 후, 95℃ 10초, 60℃ 15초, 72℃ 20초의 반응을 1 cycle로 하여 40 cycles를 반응시켰으며, 마지막 cycle 후에는 모든 반응물에 대하여 72℃부터 95℃까지의 영역에서 melting curve분석 하는 것으로 실시하였다.
Standard를 제작하기 위해 RB-1 viral DNA를 주형으로 MCP 유전자의 염기배열을 타겟으로 제작한 qM1F (5'-GGCGACTACCTCATTAATGT-3':서열번호 3)와 qM1R (5'-CCACCAGGTCGTTAAATGA-3':서열번호 4)을 사용하여 얻은 141 bp의 산물을 TOPO-TA 벡터 (Invitirogen, USA)에 삽입하여 Escherichia coli DH5α에 형질전환시킨 뒤 대량배양한 다음 재조합된 플라스미드를 분리하여 10 배씩 (1.0x108~1.0x101 copies/μl) 단계 희석하여 표준곡선(standard curve)를 작성하는데 사용하였다
실시예 4: 주화세포를 이용한 메갈로사이티바이러스의 배양
실시예 2에서 제조한 PMF 세포의 메갈로사이티바이러스 RB-1 에 대한 감수성을 알아보기 위하여, 바이러스 접종실험을 실시하였다. 25 cm2 tissue culture flask에 L-15배지를 이용하여 배양한 PMF, GF (ECACC, Australia) 및 BF-2 (ATCC, USA) 주화세포에 감염어의 비장 조직 마쇄액 (108 copies/ml 에 상응하며 각 flask (또는 vessel) 에의 식균량은 106 copies/flask 로 함)을 접종하였다. 접종 7일 후 바이러스가 접종된 PMF와 GF 주화세포에서 현미경 상에서 반짝이며 비대해진 세포변성효과 (cytopathic effect, CPE)가 관찰 되었다 (도 2). PMF와 GF 세포주에서 생산 된 바이러스 카피수(copy number)는 접종 후 지속적으로 증가해 7일째에는 각각 평균 1.28x109와 2.20x108 copies/ml의 농도를 나타내었다. 하지만 BF-2 세포의 경우 CPE는 관찰되나, 최종 바이러스 카피수는 3.83x106 copies/ml의 농도로 PMF와 GF보다 현저히 낮음을 확인할 수 있었다 (도 3).
바이러스의 계속적인 수득을 위하여 어류 세포주에 연속적으로 계대배양(passage)을 실시하였다. 감염된 돌돔의 비장 조직 마쇄액(106 copies/flask)을 위와 같은 방법으로 PMF, GF 및 BF-2 세포주에 0.1 ml씩을 접종하였고, 접종 7일 후 계대배양하여 수득된 바이러스 상등액을 10배씩 희석하여 미리 준비된 비감염 세포주에 같은 방법으로 각각 0.1 ml씩을 접종하였으며 이러한 계대배양을 4회 연속으로 실시하였다. 이러한 방법으로 수득된 바이러스 상등액인 RB-1 type Vn (n은 계대 배양 횟수, 단 감염 조직 마쇄액은 RB-1 type V0라 명명함)에 대해 각각 정량적으로 분석하였다. PMF 및 GF 주화세포에 RB-1 type V0을 접종하여 수득한 RB-1 type V1 (1번의 계대배양을 통해 수득한 바이러스 상등액)의 바이러스 농도는 각각 평균 6.30x107 copies/ml, 5.18x106 copies/ml 까지 증가하였으나 RB-1 type V2 (2번의 계대배양을 통해 수득한 바이러스 상등액)의 바이러스 농도는 각각 평균 1.01x106 copies/ml, 8.10x104의 농도로 나타나 계대배양 시 바이러스 카피 수가 두 세포주 모두에서 점차적으로 약 60~80배씩 감소함을 확인하였다 (도 4). BF-2 세포주에 대한 바이러스 계대배양의 결과는 앞의 실험에서 RB-1에 거의 감수성을 보이지 않았던 결과와 동일하게 첫 계대배양부터 바이러스가 성장하지 못하고 농도가 급격하게 감소함을 확인하였다. 연속적으로 PMF와 GF 세포주에 바이러스 계대배양을 한 결과 RB-1 type V0를 접종한 첫 계대배양을 제외하고는 바이러스의 성장이 거의 일어나지 않았고 접종액의 희석으로 인해 바이러스 농도가 점차적으로 감소되는 것을 확인할 수 있었으며, 이러한 결과를 통해 조직 마쇄액의 바이러스와 세포주에서 배양한 상등액 내 바이러스의 감염성에 차이가 있음을 확인하였다.
실시예 5 : SFM을 이용한 참돔 지느러미 세포에서의 메갈로사이티바이러스 배양 생산
실시예 4에서 주화세포에 배양을 거친 메갈로사이티바이러스는 다시 주화세포에 감염시킬 시 감염력이 급격히 저하됨을 확인하였다. 본 발명은 SFM (EX-CELLㄾ HeLa Serum-Free Medium for HeLa Cells ,Sigma-Aldrich, USA)을 이용하여 세포주에서 성장 시 나타나는 바이러스 감염성의 저감화를 해결하고자 하였으며 이를 통해 계대배양 시 고농도 메갈로사이티바이러스를 지속적으로 수득하고자 하였다.
이를 위해 SFM을 세포주에 처리 시 바이러스 감염성에 대한 영향을 분석하고자 SFM 처리법과 기존의 접종방법인 10% 우태아혈청 함유 L-15 배양법의 비교 분석과 동시에 실시예 4에서 감염성이 다른 것으로 확인된 RB-1 type V0, RB-1 type V1을 각각 접종하여 최종 바이러스 카피수를 정량 분석하기 위한 실험을 진행하였다. 먼저, 메갈로사이티바이러스에 대해 가장 높은 감수성이 확인되었던 PMF 세포주를 이용하여 10% FBS가 첨가된 L-15 배지에 현탁한 뒤 25 cm2 tissue culture flask에 1x106 cells/ml을 접종하고 3일간 배양하여 세포를 부착 및 증식시킨 뒤, 80% 이상의 confluency를 나타내는 시점에 혈청이 첨가되지 않은 SFM으로 배지를 전부 교체해주었고 동시에 감염 조직 마쇄액(RB-1 type V0, 106copies/flask 농도로 희석하여 접종)와 마쇄액을 이용하여 in vitro 계대배양된 상등액(RB-1 type V1, 106copies/flask 농도로 희석하여 접종)을 각각 접종하여 접종일로부터 7일 후 바이러스 카피수를 비교 분석하였다.
L-15배지와 SFM를 이용하여 RB-1 type V0를 접종한 실험에서의 각 바이러스 최종 카피수는 1.28x109 copies/ml, 1.41x109 copies/ml로 서로 거의 동일하였으나 RB-1 type V1을 접종한 실험에서의 각 바이러스 최종 카피수는 2.64x106 copies/ml, 1.59x109 copies/ml로 약 600배의 큰 차이를 보였다 (도 5). 이러한 결과를 통해 SFM 처리법을 이용하여 바이러스 배양을 시행할 시 메갈로사이티바이러스 계대배양의 난점을 해결하여 연속적으로 고농도 바이러스를 수득할수 있음을 확인하였다.
실시예 6 : 고농도 메갈로사이티바이러스 in vitro 배양을 위해 무혈청배지에 첨가하는 우태아혈청의 최적 농도 확립
실시예 5에서 PMF 주화세포에 혈청을 첨가하지 않은 순수한 SFM을 처리하여 고농도의 메갈로사이티바이러스를 수득하였다. 이렇게 확립한 연속적인 고농도 바이러스 수득법을 좀 더 발전시켜 SFM을 세포주에 처리할 시 우태아혈청을 첨가하여 세포주의 더 높은 바이러스 민감성 증대 효과를 나타나게 하고자 PMF 세포주에 SFM을 처리할 때 우태아혈청을 첨가하여 RB-1 type V1을 배양하는 실험을 진행하였다. 이 때 바이러스 카피수를 가장 높게 수득할 수 있는 SFM의 우태아혈청의 최적 함유 농도를 구하기 위해 0%, 0.1%, 0.5%, 5% 및 10%의 각각 다른 농도의 FBS를 첨가하여 접종 실험을 실시하였으며 시간에 따른 바이러스의 증가를 확인하기 위하여 접종 후 0, 1, 3, 5 및 7일마다 배양 상등액을 샘플링하여 바이러스 DNA를 분리한 후 qPCR을 통한 정량분석을 하였다. SFM 처리법을 이용한 바이러스 배양방법은 도 6에 도식화하여 나타내었다.
그 결과 SFM을 이용한 RB-1 바이러스의 배양 시 최적의 FBS 첨가 농도는 0.1% FBS의 저혈청이 첨가된 SFM으로 배양하였을 때였으며, 이 때 최대의 바이러스 생산량 (2.34x109 copies/ml)을 확보할 수 있었다 (도 7). 이러한 방법을 본 발명의 접종방법으로 확립하고 다음으로 시행하는 SFM 처리법에 대해서는 0.1% FBS가 첨가된 SFM으로 배양하는 방식으로 하였다.
실시예 7: SFM을 이용하여 다양한 어류주화세포에서의 고농도 메갈로사이티바이러스 배양 생산 (또는 다양한 어류주화세포에서의 본 발명의 응용)
주화세포에 대한 바이러스 감염성 증대를 위하여 저혈청 함유의 SFM을 사용하는 본 발명의 특성이 PMF 뿐만 아니라 다양한 어류유래의 주화세포에서도 나타나는지를 분석하였다.
이를 확인하기 위해 PMF, GF 및 BF-2 주화세포에 대해 상기 실시예 6에서 확립한 방법으로 각각 기존의 L-15 배양법과 본 발명의 SFM 처리방법을 적용하여 감염 조직 마쇄액(RB-1 type V0, 106copies/flask 농도로 희석하여 접종)과 각 주화세포에 10% FBS가 함유된 L-15배양법으로 한 번의 계대배양 이후 수득된 상등액(RB-1 type V1, 106copies/flask 농도로 희석하여 접종)을 접종하여 7일 후의 바이러스 카피수를 비교 분석하였다.
본 발명의 SFM 처리방법을 적용하여 각 주화세포에서 증식된 바이러스를 기존의 L-15 배양을 통해 증식된 바이러스와 정량적으로 비교 분석한 결과, 각각 PMF에서 RB-1 type V0는 2,190배와 1,510배로 거의 동일하게 나타났고, RB-1 type V1은 2,030배와 1.9배로 나타나 RB-1 type V1은 RB-1 type V0와는 달리 기존 L-15 배양법으로 배양했을 시 감염력이 현저하게 떨어지나 SFM 처리를 통해 동일한 수준까지 감염력을 회복시킬 수 있는 것으로 확인되었다(도 8). GF에서도 RB-1 type V0는 328배와 215배, RB-1 type V1은 301배, 1.5배로 나타나 다른 세포주에서도 본 발명의 방법을 적용할 수 있음을 확인하였다. 또한, BF-2에서는 RB-1 type V0가 SFM 처리법을 적용할 시 약 40배 가량의 더 높은 수득률을 나타내, 메갈로사이티바이러스에 대해 비교적 저감염성의 세포주에 대해서도 본 발명의 방법을 적용하면 감염률을 더 높일 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해 본 발명의 SFM 처리법은 다양한 어류 주화세포에서의 메갈로사이티바이러스 RB-1 type의 바이러스 접종 시 연속적인 계대배양이 가능하게 하고 또한 각 세포주에서 생산할 수 있는 가장 높은 바이러스 농도를 수득할 수 있게 함을 확인하였다.
실시예 8: SFM을 이용하여 참돔 지느러미 세포에서의 다양한 서브그룹의 메갈로사이티바이러스 배양 생산
실시예 4~7에서는 본 발명의 배양법을 적용하여 RB-1 type (Megalocytivirus subgroup 2)의 메갈로사이티바이러스에 대해서만 확인하였다. 메갈로사이티바이러스 in vitro 계대배양의 난점은 다른 서브그룹의 메갈로사이티바이러스에도 공통적으로 동일하게 나타나는 현상이므로 PMF, GF, BF-2를 이용하여 기존의 L-15 배양법과 상기 실시예 6에서 확립한 본 발명의 바이러스 배양법을 적용시켜 다른 서브그룹의 메갈로사이티바이러스에 대한 감염성을 비교 분석하였다.
각각의 주화세포에 한 번의 계대배양을 통해 수득한 각기 다른 서브그룹의 메갈로사이티바이러스 RB-1 type V1 (subgroup 2), PG-1 type V1 (subgroup 3) 및 OF-1 type V1 (subgroup 4)을 1.0x106 copies/ml 으로 희석하여 본 발명에서 확립한 접종법으로 각 세포주에 접종하고 접종 직후의 상등액과 7일 후의 상등액 내 바이러스 카피수를 정량하여 비교 분석하였다.
표 1에 나타난 바와 같이 기존의 L-15배양법을 이용한 바이러스 배양에서 증가배수가 모두 상당히 낮음을 확인할 수 있었으나, 실시예 7에서 확인한 RB-1의 결과와 동일하게 PMF와 GF 세포주에 본 발명에서 확립한 SFM 처리법을 적용한 바이러스 배양에서는 증가배수가 모든 서브그룹의 바이러스에서 상당히 높음을 확인할 수 있었다. 또한 BF-2 세포주에서 배양한 세가지 서브그룹 바이러스의 증식률은 PMF와 GF에서의 증식률보다는 현저히 낮았으나 기존의 L-15 배양법을 이용한 바이러스배양보다 증가배수를 높일 수 있었다.
결론적으로 SFM 처리법은 다양한 세포주 및 다양한 서브그룹의 메갈로사이티바이러스 배양에 광법위하게 적용할 수 있는 방법임을 확인하였다 (표 1).
PMF, GF 및 BF-2 세포주에 SFM처리법을 적용하여 배양한 3가지 서브그룹의 메갈로사이티바이러스 증가배수와 최종 바이러스 농도
세포 배지 바이러스 증가배수 최종 바이러스 농도
(copies/ml)
PMF L-15 RB-1 2.7 2.70E+06
PG-1 1.6 1.61E+06
OF-1 1.9 1.93E+06
SFM RB-1 2,060 2.06E+09
PG-1 1,620 1.62E+09
OF-1 1,010 1.01E+09
GF L-15 RB-1 1.5 1.54E+06
PG-1 1.8 1.81E+06
OF-1 0.8 8.42E+05
SFM RB-1 314 3.14E+08
PG-1 212 2.12E+08
OF-1 128 1.28E+08
BF-2 L-15 RB-1 1.2 1.21E+05
PG-1 0.8 8.31E+05
OF-1 1.2 1.24E+06
SFM RB-1 98 9.76E+07
PG-1 79 7.88E+07
OF-1 88 8.84E+07
(4) 배양된 바이러스의 특성 분석
이전 실험에서 SFM을 처리하여 바이러스를 접종 배양했을 때, 세포주 감수성 또는 바이러스의 감염력이 증가하여 바이러스가 상당히 높은 증가배수를 보이며 증식하는 것을 확인할 수 있었는데, 이러한 결과가 SFM에 의한 바이러스 감염력의 변화인지를 확인하기 위해 몇 가지 바이러스의 특성 분석을 위한 실험을 진행하였다.
먼저, 어류에 대한 병원성의 차이를 분석하기 위해 세포주에 in vitro 계대배양 시 RB-1 에 감염된 돌돔의 비장 조직 마쇄액인 RB-1 type V0 (1.0x105 copies/fish로 희석하여 접종)와 이를 in vitro에 식균하여 SFM 처리법을 이용하여 5번 계대된 RB-1 type V5를 (1.0x105 copies/fish로 희석하여 접종) 돌돔(어체중 8.0~12g)에 접종함으로써 RB-1 type V0와 V5 병원성의 차이를 비교하였다.
그 결과, 두 그룹 모두 접종 9~10일 후 폐사가 시작되어 14일 이내에 100% 폐사하였다. 반면 PBS를 접종한 대조구의 경우 폐사가 관찰되지 않았다(도 9).
또한, 감염력 증대 결과가 바이러스의 유전적 변이로 인한 것인지를 확인하기 위하여 감염된 돌돔의 비장에서 분리한 RB-1 type V0와 본 발명의 배양법을 적용하여 PMF 세포주에서 5번 계대배양한 RB-1 type V5의 RB-1의 MCP gene의 염기서열을 분석했으며, 서로의 유전적 차이를 비교해 보았다. 그 결과 RB-1 type V0와 V5 MCP gene의 상동성은 100%로 시퀀스 차이를 전혀 확인할 수 없었다(도 10).
결론적으로 V0와 V5을 비교한 결과에서 병원성과 염기서열 모두 차이를 확인할 수 없었으므로 SFM 처리에 의한 바이러스의 변이는 거의 없음을 확인하였다.
실시예 9: SFM이 PMF 세포주의 면역반응에 미치는 영향분석
SFM의 사용 시 바이러스 감염력의 증가원인을 분석하고자, 시간에 따른 세포주의 면역 유전자의 발현 변화를 분석해 보았다. 발현분석의 비교를 위해 1) SFM 배양법을 적용한 PMF, 2) SFM 배양법을 적용하여 RB-1을 접종한 PMF 3) L-15 배양법을 적용한 PMF 4) L-15 배양법을 적용하여 RB-1을 접종한 PMF로 총 4개의 그룹으로 구분하여 면역 유전자의 발현을 비교 분석하였다.
면역 유전자의 발현 분석은 각 배양법 적용 후 1, 2 그리고 4일째 그룹별로 각각 3개의 cell culture flask에서 실시하였다. RNA의 분리는 RNeasy plus mini kit (Qiagen, USA)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 분리하였으며, RNA는 Oligo-dT (Promega, USA)와 moloney murine leukemia virus (M-MLV, Promega, USA) 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 면역 유전자 발현 (IL-1β, IL-8 및 COX-2 gene)의 비교에 사용되었으며 표 2에 나타낸 프라이머를 이용하여, relative qPCR을 수행하여, -ΔΔCT method로 발현량을 계산하였으며 (Livak, K.J. and Schmittgen, T.D., Methods, 25:402, 2001) reference gene으로 β-actin 유전자를 사용하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, SFM 처리한 PMF 실험군에서 IL-1β, IL-8 그리고 COX-2 유전자 모두 2일째에 감소하는 것으로 나타나, SFM 처리를 이용한 세포주 배양은 PMF 및 다양한 세포의 방어 시스템을 저하시키고 그 결과, 세포 내의 미지의 원인으로 인하여 감염력이 억제된 계대배양을 거친 메갈로사이티바이러스와 메갈로사이티바이러스에 비교적 저감염성을 보인 세포주(BF-2)에서의 증식을 가능하게 한다는 이론적 배경을 확립하게 해주었다.
Name Sequence (5’ to 3’) Size (bp) 서열번호 타겟
rbB-actin F CAGGGAGAAGATGACCCAGA 154 5 β-actin
rbB-actin R CATAGATGGGCACTGTGTGG 6
rbIL1b F ATCTGGAGACGGTGGACAAC 142 7 IL-1β
rbIL1b R GCTGATGTACCAGTCGCTGA 8
rbIL8 F CCCTCCTGACCATCAGTGAA 152 9 IL-8
rbIL8 R TGATCTCAGTCTCCTCGCAG 10
rbCOX2 F ACCTTGTGGAGTCGTTCACC 154 11 Cox-2
rbCOX2 R CATGGAGAATCGCTTCCTGT 12
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
한국세포주연구재단 KCLRFBP00324 20140903
<110> Jeju National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Enhanced Production of Megalocytivirus Using Serum Free Medium <130> P14-B252 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M2F primer <400> 1 ggcggcgaca atgccgtg 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M2R primer <400> 2 ataacgacca gttcaaac 18 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> qM1F primer <400> 3 ggcgactacc tcattaatgt 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> qM1R primer <400> 4 ccaccaggtc gttaaatga 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rbB-actin F primer <400> 5 cagggagaag atgacccaga 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rbB-actin R primer <400> 6 catagatggg cactgtgtgg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rbIL1b F primer <400> 7 atctggagac ggtggacaac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rbIL1b R primer <400> 8 gctgatgtac cagtcgctga 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rbIL8 F primer <400> 9 ccctcctgac catcagtgaa 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rbIL8 R primer <400> 10 tgatctcagt ctcctcgcag 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rbCOX2 F <400> 11 accttgtgga gtcgttcacc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rbCOX2 R <400> 12 catggagaat cgcttcctgt 20

Claims (7)

  1. 다음 단계를 포함하는 어류 주화세포를 이용한 메갈로사이티바이러스의 제조방법:
    (a) 메갈로사이티바이러스에 감수성 있는 어류종의 주화세포를 일정기간 배양 후, 0-0.5% FBS를 함유하는 무혈청 또는 저혈청 배지 (Serum free medium, SFM)으로 교체와 동시에 바이러스를 접종하는 단계; 및
    (b) 상기 메갈로사이티바이러스가 접종된 어류 주화세포를 상기 무혈청 또는 저혈청 배지에서 배양하여 바이러스를 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 바이러스를 분리하는 단계.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 메갈로사이티바이러스는 서브그룹 1, 서브그룹 2, 서브그룹 3 및 서브그룹 4로 구성된 군에서 선택되는 메갈로사이티바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 어류 주화세포는 참돔지느러미주화세포(PMF(pagrus major fin)세포), GF 세포(grunt fin 세포, 벤자리지느러미주화세포) 또는 BF-2 (bluegill fry 세포, 블루길자어주화세포)인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항, 제4항 및 제6항 중 어느 한항의 방법으로 제조된 바이러스를 불활화시키는 것을 특징으로 하는 메갈로사이티바이러스 감염증 예방 또는 치료용 백신의 제조방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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EP3897703A2 (en) 2018-12-21 2021-10-27 Intervet International B.V. Serum free intracellular pathogen vaccine

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003219873A (ja) 2002-01-24 2003-08-05 Japan Science & Technology Corp サケ科キングサーモン由来の不死化細胞
KR100940111B1 (ko) * 2007-12-18 2010-02-02 부경대학교 산학협력단 이리도 바이러스 감염증에 대한 백신 조성물 및 이의제조방법
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Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003219873A (ja) 2002-01-24 2003-08-05 Japan Science & Technology Corp サケ科キングサーモン由来の不死化細胞
KR101044538B1 (ko) 2002-09-05 2011-06-27 버베리안 노딕 에이/에스 무혈청 조건하에서 일차세포의 배양 및 바이러스의 증식방법
KR100940111B1 (ko) * 2007-12-18 2010-02-02 부경대학교 산학협력단 이리도 바이러스 감염증에 대한 백신 조성물 및 이의제조방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Fish & Shellfish Immunology. 2010.05.08., vol. 29, pp. 399-406.*

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