WO2018147630A1 - 어류 바이러스의 생산 방법 - Google Patents

어류 바이러스의 생산 방법 Download PDF

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WO2018147630A1
WO2018147630A1 PCT/KR2018/001640 KR2018001640W WO2018147630A1 WO 2018147630 A1 WO2018147630 A1 WO 2018147630A1 KR 2018001640 W KR2018001640 W KR 2018001640W WO 2018147630 A1 WO2018147630 A1 WO 2018147630A1
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WO
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virus
culture
fish
cells
cell
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PCT/KR2018/001640
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English (en)
French (fr)
Inventor
정현도
권우주
민준규
윤민지
Original Assignee
부경대학교 산학협력단
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof

Definitions

  • the present invention relates to a method of preparing a virus using a semi-continuous culture method or a cell line attached to a microcarrier and a vaccine using the virus produced using the fish virus.
  • F-SCs free-cell suspension cultures
  • fish cell lines have been developed in close to 100 species, but there are only cell lines showing adhesion-dependency, it is difficult to mass-produce fish viruses because ocean culture is difficult to carry out by F-SC method as in the case of mammals.
  • roller bottles have been used for the mass production of fish virus, but these methods require a very large labor force and at the same time have a very uneconomical limitation.
  • a BCS Batch Culture System
  • a viral infection supernatant is obtained and then the infected cell line is disposed together with a culture vessel. Therefore, in order to obtain an additional amount of virus solution, newly obtained continuous infected cell lines are cultured by dispensing in a culture vessel (Subculturing, subculture), and the virus obtained with the hassle of having to inoculate the virus lines again to the inoculation process if not continuously infected cell lines.
  • the concentration of is not high.
  • the culture of host cells is performed only for 5-7 days, and the reprogramming by intracellular accumulated virus is not performed. There has been a problem that is not done.
  • Iridoviridae Megalocytivirus is the causative agent of Red Sea Bream Iridovirus Disease (RSIVD). However, sea bream is much more susceptible to red snapper than about 10% cumulative mortality at aquaculture sites, resulting in high mortality of 90-100%. Mass cultivation of the virus is essential for the development of a vaccine to prevent the infection of megalocytivirus, but megalocytivirus grows only in limited fish cell lines, and infectivity is increased as the number of virus passages is increased in subculture. Is rapidly reduced (Chou eta., 1998; Imajoh et al., 2007; Nakajima and Sorimachi, 1994), indicating a very specific infection with decreased virus production resulting in decreased virus concentration in culture. There have been many difficulties in the industrial production of viruses.
  • each new cell line is passaged each time in a virus production method (BCS) using a conventional continuous infected cell line
  • BCS virus production method
  • the present invention comprises the steps of infecting a fish coin cell virus; Culturing the infected cells; Semi-continuous cell culture step of obtaining culture supernatant and replacing with fresh medium; And it provides a method for producing a virus, comprising the step of separating the virus from the obtained culture supernatant.
  • the present invention comprises the steps of mixing the fish coin cell line and microcarrier beads to attach the cell line to the microcarrier beads; Culturing the fish coin cell line attached to the microcarrier beads; Infecting the virus with fish coin cells attached to the microcarrier beads; Culturing the fish coin cells infected with the virus; And obtaining a culture supernatant and isolating the virus, thereby providing a virus production method using the microcarrier beads.
  • the present invention provides a vaccine composition comprising the virus produced or produced by the method of the present invention.
  • the semi-continuous culture method (SCCCS) of the present invention even in a long-term semi-continuous culture, it is possible to produce a high concentration of virus without reducing or killing host cell lines, and the virus production method using microcarriers enables floating culture of attachment-dependent fish cell lines. It is possible to mass-produce cell lines and viruses in high concentrations, so that mass production is possible, large-scale cells can be produced in a narrow space, and there is little possibility of contamination from outside, and it is easy for efficient and stable virus production and vaccine production. Do.
  • FIG. 1 is a diagram confirming the virus concentration in the supernatant obtained daily after IMV infection in PMF, GF-1 and BF-2 cell lines.
  • Figure 2 is a diagram confirming the cell degeneration after 10 consecutive cultures under the microscope:
  • IMV infected PMF cell line zero culture
  • Figure 3 is a diagram confirming the productivity of the virus according to the medium exchange cycle (1 day, 3 days and 5 days) in producing IMV by SCCCS culture method in PMF cell line.
  • FIG. 5 is a diagram confirming the virus productivity according to the culture medium (L-15, MEM and RPMI1640) in the production of IMV by the SCCCS culture method in the PMF cell line.
  • FIG. 6 is a diagram confirming the virus productivity according to the FBS concentration (1%, 5% and 10%) in the culture medium in producing IMV by SCCCS culture method in PMF cell line.
  • FIG. 7 is a diagram confirming the virus productivity according to the culture temperature (20 °C, 23 °C, 25 °C, 28 °C and 30 °C) in the production of IMV by SCCCS culture method in PMF cell line.
  • FIG. 8 is a diagram showing the cell number and virus productivity when producing IMV in PMF cell line using the optimized SCCCS method according to the number of medium exchange.
  • Figure 9 shows the morphology and cell degeneration of cells in PMF cell lines continuously infected with IMV using optimized SCCCS method:
  • IMV infected PMF cell line before virus culture IMV infected PMF cell line before virus culture
  • FIG. 10 shows the cellular changes after media exchange 20 times with PMF infected with IMV isolate subgroups II, III or IV by optimized SCCCS method:
  • 11 is a diagram showing the continuous productivity of the virus according to the subgroups II, III or IV of the IMV isolates in PMF cell line using the optimized SCCCS method.
  • FIG. 13 is a micrograph of PMF cells attached to various MCBs and 12 days after attachment:
  • FIG. 14 is a graph showing the number of cells produced in accordance with MCB types (cytodex 1, cytodex 3, cultispher, and Rapidcell) when cultured by attaching PMF cell lines to MCBs based on the amount of culture medium (ml).
  • MCB types cytodex 1, cytodex 3, cultispher, and Rapidcell
  • 15 is a graph showing the number of cells produced according to the MCB type (cytodex 1, cytodex 3 and cultispher) based on the surface area of the beads (mm 2 ) when the PMF cell line is attached to the MCB and cultured.
  • FIG. 16 is a view of the microscope after attaching the fish cell line PMF, GF-1, EPC or E-11 to Cytodex 1 and incubating for 12 days.
  • 17 is a graph showing cell number growth by attaching and culturing fish coin cells PMF, GF-1, BF-2, E-11 or EPC cell lines to Cytodex 1.
  • FIG. 18 shows the cell numbers and virus concentrations after inoculation of Cytodex 1 with each susceptible IMV, VNNV and VHS virus after 15 days of attachment and PMF, GF-1, EPC or E-11 cell line.
  • FIG. 19 shows the cytopathic effect (CPE) after inoculation of Cytodex 1 with each susceptible IMV, VNNV and VHS virus after 15 days of attachment and PMF, GF-1, EPC or E-11 cell line.
  • CPE cytopathic effect
  • 20 is a diagram confirming the increased cell number while transferring the fish cell line attached to the MCB to 5-fold and 10-fold culture vessel.
  • 21 is a graph confirming the production cell number and virus concentration according to the medium exchange cycle (1 day, 3 days or 5 days) while inoculating IMV on a Cytodex 1 attached PMF cell line and semi-continuous culture.
  • Figure 22 is a graph confirming the production cell number and virus concentration according to subgroups (subgroups II, III and IV) of the inoculated IMV in the production of IMV by semi-continuous culture of PMF cell line attached to Cytodex 1.
  • the present invention comprises the steps of infecting a fish coin cell virus; Culturing the infected cells; Semi-continuous cell culture step of obtaining culture supernatant and replacing with fresh medium; And separating the virus from the obtained culture supernatant.
  • the virus of the present invention may be an Iridoviridae family virus, with megalocytivirus being the virus causing disease in fish.
  • the virus produced in the present invention may be megalocytivirus selected from the group consisting of megalocivirus subgroup II, subgroup III and subgroup IV.
  • the virus can be serially infected with the virus by inoculating the fish coin cells with the virus and at least 20 medium exchanges every three days.
  • the infected cells can be cultured at 25 ° C. in medium containing 5% fetal bovine serum (FBS).
  • FBS fetal bovine serum
  • the medium exchange cycle when semi-continuous culture of infected cells is 3 days, and the medium exchange rate of replacing with fresh medium may be 70% (v / v).
  • Semi-continuous culture of the present invention is to obtain a culture solution containing the virus produced from the cells infected with the virus, and to perform the operation of culturing by adding a new culture medium while leaving the cells intact.
  • 70% of cell culture supernatant was obtained every 3 days, and the optimal conditions for virus production were established to refill fresh medium.
  • the fish-derived coin cells may use coin cells of (susceptible) fish infected with the virus, for example, sea bream, red sea bream, river bream, spot bass, halibut, black sea bream, robber, rockfish , Tuna, and mandarin-derived chemotactic cells can be used, and the group consists of the redfish fin (PMG) cell line, the grouper fin (GF-1) cell line, and the bluegill fry (BF-2) cell line. It is preferable that it is any one selected from, and most preferably the PMF cell line (Accession No. KCLRF-BP-00324, Korea Cell Line Bank) which is most optimized for the semi-continuous culture method of the present invention.
  • PMF cell line Accession No. KCLRF-BP-00324, Korea Cell Line Bank
  • coin cell refers to a cell that has been isolated from a fish tissue and cell-cultured through continuous passage culture, and "cell line” and “cell” are used interchangeably.
  • the PMF cell line produced more than 100-fold higher concentrations of virus than GF-1 and BF-2 when cultured with the semi-continuous culture method of the present invention. Since the virus was produced at a high concentration while maintaining it, it was confirmed that the cell line was optimized for the semi-continuous culture method of the present invention. In general, when virus-infected cell lines are cultured semi-continuously or continuously, the cells are denatured or killed so that the virus cannot be produced.
  • the term "passage” means delivering cells from one culture vessel to another, with or without dilution. Each time a cell is transferred from one vessel to another, certain portions of the cell may be missing, so that dilution of the cell, whether intended or unintentional, may occur. This term is synonymous with the term “subclture”.
  • the number of subcultures is the number of times the cells are cultured, which are either secondary cultured or transferred into a new vessel to grow in suspension or adherence. This term is not synonymous with the time required for the population doubling or cell population to replicate, ie the time generally required for individual cells in the cell population to replicate.
  • the present invention comprises the steps of mixing the fish coin cell line with the microcarrier beads to attach the cell line to the microcarrier beads; Culturing the fish coin cell line attached to the microcarrier beads; Infecting the virus with fish coin cells attached to the microcarrier beads; Culturing the fish coin cells infected with the virus; And obtaining a culture supernatant and isolating the virus.
  • the fish coin cell lines of the present invention are Pargus major fin (PMF), Grouper fin cell (GF-1), Blue gill fry (BF-2), Epithelioma pap ⁇ losum cyprinid (EPC) and E-11 ( It may be any one selected from the group consisting of a clone of the cell line SSN-1) cell line.
  • PMF Pargus major fin
  • GF-1 Grouper fin cell
  • BF-2 Blue gill fry
  • EPC Epithelioma pap ⁇ losum cyprinid
  • E-11 It may be any one selected from the group consisting of a clone of the cell line SSN-1) cell line.
  • the microcarrier beads may consist of dextran, gelatin or polystyrene, the diameter of the beads may be between 100 and 300 ⁇ m, the density may be between 1.02 and 1.04, and the surface area may be between 2000 and 8000 cm 2 / g. Can be. Because the density of the beads is larger than water, they are allowed to settle in a state where the stirring environment is not maintained, which makes it easier to distinguish the cultured cells from the supernatant.
  • the microcarrier beads may be commercially available Cytodex1, Cytodex3, Cultispher or Rapidcell, more preferably Cytodex1.
  • attaching the cell line to the microcarrier beads may be performed by repeating the stirring and stopping at 30 to 60 rpm for 1 to 3 hours.
  • fish serum, fish muscle extract or fish yolk extract in culture of the cell line throughout the steps of attaching the cell line to the microcarrier beads, culturing it and inoculating the cell line with the virus and producing the virus. May be added to the culture medium to culture the cell lines, and may be added at concentrations of 0.5%, 1.0% and 0.1%, respectively.
  • the fish coin cell line attached to the microcarrier beads can be cultured in a manner that exchanges 70% of the total media capacity every 1-3 days, and can be cultured at a stirring speed of 30-80 rpm.
  • a new microcarrier bead may be subcultured to a fish coin cell attached to the microcarrier bead in a volume ratio of 1: 1 to 1: 4, and in one embodiment of the present invention, the microcarrier Bead-coated fish coin cells were divided in half and dispensed into flasks of the same volume while subcultured with new microcarrier beads added 1: 1 or 1: 4 to the volume of the existing MCB-attached cell line.
  • fish coin cells attached to the microcarrier beads can be cultured in a small volume flask and then cultured in a scale-up subculture manner, adding new microcarrier beads while transferring to a larger volume flask.
  • the volume of the flask was increased by 5 and 10 times to scale-up subculture.
  • the virus is selected from the group consisting of Iridoviridae Megalocytivirus (IMV), Viral nervous necrosis virus (VNNV) and Viral Hemorrhagic Septicemia (VHSV). It may be any one and may be selected according to the sensitivity of the fish coin cells to be infected. In one embodiment, the PMF cell line and the GF-1 cell line were infected with IMV, the E-11 cell line with VNNV, and the EPC cell line with VHSV.
  • IMV Iridoviridae Megalocytivirus
  • VNNV Viral nervous necrosis virus
  • VHSV Viral Hemorrhagic Septicemia
  • the virus produced in the present invention may be selected from the group consisting of megalocytivirus subgroup II, subgroup III and subgroup IV.
  • the process of culturing virus-infected fish coin cells and obtaining a culture supernatant repeating the medium exchange process of adding the culture medium in the amount obtained after obtaining the culture supernatant without passage or cell division of cells. It may be performed by a semi-continuous cell culture method.
  • the medium exchange cycle when semi-continuous culture of infected cells is 3 days, and the medium exchange rate of replacing with fresh medium may be 70% (v / v).
  • Semi-continuous cultivation of the present invention is to obtain a culture solution containing the virus produced, and to perform the operation of culturing a new culture solution with the cells attached to the microcarrier beads intact in a semi-continuous manner.
  • 70% of the cell culture supernatant (cell culture medium) was obtained every 3 days, and the optimal conditions for virus production for refilling the new medium were established, and IMV was infected with the PMF cell line attached to Cytodex1 beads. In the case of continuous culture, it was confirmed that the viral productivity was most remarkable.
  • the invention relates to a vaccine composition
  • a vaccine composition comprising a virus inactivated virus produced or produced by the method of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
  • the excipient may be any one selected from the group consisting of beta-glucan, squalene and aluminum hydroxide, imiquimod, and Montanide ISA 780 VG, with beta-glucan most desirable.
  • the vaccine composition prevents infection of fish Megaridytivirus (IMV), Viral nervous necrosis virus (VNNV) or Viral Hemorrhagic Septicemia (VHSV). Or as a therapeutic vaccine.
  • IMV fish Megaridytivirus
  • VNNV Viral nervous necrosis virus
  • VHSV Viral Hemorrhagic Septicemia
  • the fish may be selected from the group consisting of stone bream, red snapper, gangdam bream, spot bass, flounder, black sea bream, robber leg, jerkball rock, squid and mandarin fish, more preferably rock bream or red snapper.
  • the vaccine composition may contain inactivated megalocytivirus (IMV), viral neuronal necrosis virus (VNNV) or viral hemorrhagic sepsis virus (VHSV), wherein the megalocytivirus is sub It may be a subgroup II, subgroup III or subgroup IV isolate.
  • IMV inactivated megalocytivirus
  • VNNV viral neuronal necrosis virus
  • VHSV viral hemorrhagic sepsis virus
  • the virus associated with such treatment is provided to the immune system of an organism to influence a specific immune response, preferably to induce an immune response, thereby vaccinating the organism to protect it from infection by the virus. do.
  • megalocytivirus inactivated with formalin according to the present invention is either used as a vaccine as it is or converted into a physiologically acceptable form. This can be done on the basis of experience in the preparation of chickenpox virus vaccines used for vaccination against cramps (disclosed by Stickl, H. et al. [1974] Dtsch. Med. Wschr. 99, 2386-2392).
  • viral particles are lyophilized in ampoules, preferably in free ampoules.
  • vaccination may be produced by sequential freeze-drying of the virus in the formulation.
  • This formulation may contain additional additives such as mannitol, dextran, sugar, glycine, lactose or polyvinylpyrrolidone or other adjuvants such as antioxidants or inert gases, stabilizers or recombinant proteins suitable for in vivo administration.
  • additional additives such as mannitol, dextran, sugar, glycine, lactose or polyvinylpyrrolidone or other adjuvants such as antioxidants or inert gases, stabilizers or recombinant proteins suitable for in vivo administration.
  • the glass ampoule can then be sealed and stored for several months between 4 ° C. and room temperature. However, unless otherwise required, the ampoule may preferably be stored below ⁇ 20 ° C.
  • the therapeutically effective amount of the therapeutic composition of the present invention may vary depending on various factors, for example, the method of administration, the site of interest, the condition of the individual, and the like. Therefore, when used in fish, the dosage should be determined in an appropriate amount in consideration of both safety and efficiency. It is also possible to determine the effective amount through animal testing. Such considerations when determining the effective amount include, for example, Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed. (2001), Pergamon Press; And E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (1990), Mack Publishing Co.
  • compositions of the present invention may also include carriers, diluents, excipients or combinations of two or more commonly used in biological agents.
  • Pharmaceutically acceptable carriers are not particularly limited so long as they are suitable for in vivo delivery of the composition, for example, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.
  • Compounds, saline solution, sterile water, Ringer's solution, buffered saline solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and one or more of these components can be mixed and used as needed. Conventional additives can be added.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may be additionally added to formulate into main dosage forms, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • it may be preferably formulated according to each disease or component by a suitable method in the art or using a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990).
  • composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable additive, wherein the pharmaceutically acceptable additive may include starch, gelatinized starch, microcrystalline cellulose, lactose, povidone, colloidal silicon dioxide, calcium hydrogen phosphate, lactose , Mannitol, malt, gum arabic, pregelatinized starch, corn starch, powdered cellulose, hydroxypropyl cellulose, opiodry, sodium starch glycolate, lead carnauba, aluminum silicate, stearic acid, magnesium stearate, aluminum stearate, calcium stearate , Sucrose, dextrose, sorbitol, talc and the like can be used.
  • the pharmaceutically acceptable additive according to the present invention is preferably included 0.1 parts by weight to 90 parts by weight based on the composition, but is not limited thereto.
  • compositions of the present invention may be administered orally (eg, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) or orally, depending on the desired method, and the dosage may be weight, age, sex, health of the individual.
  • the range varies depending on the condition, diet, administration time, administration method, excretion rate and severity of the disease.
  • the present invention is directed to a fish, comprising the step of administering a composition of the present invention to fish, Iridoviridae Megalocytivirus (IMV), viral nervous necrosis virus (VNNV) or viral A method for preventing Hemorrhagic Septicemia (VHSV) infection.
  • IMV Iridoviridae Megalocytivirus
  • VNNV viral nervous necrosis virus
  • VHSV Hemorrhagic Septicemia
  • the lyophilisate is dissolved in 0.01-0.5 ml of aqueous solution, preferably physiological saline or Tris buffer and systemically or topically, i.e. peritoneal, parenteral, subcutaneous, intramuscular or known to those skilled in the art. It can be administered by any other route of administration. Dosage form, dosage and frequency of administration can be optimized by one skilled in the art in a known manner.
  • Example 1 Iridobibria megalocytivirus isolation
  • Iridoviridae Megalocytivirus (IMV) subgroup II, subgroup III, and subgroup IV for infecting fish coin cells were imported from Singapore in 2009 with a dead sea bream (185.4 g) showing signs of IMV infection in a farm in Tongyeong, Gyeongsangnam-do, 2013. It was isolated from perilla flounder (3.2 g) and flounder (323.4 g) showing infectious symptoms in a farm in Geoje, Gyeongsangnam-do, Korea. The virus was extracted from the spleen tissue of each infected fish and crushed in a 10-fold volume of PBS, centrifuged for 5 minutes at 10,000 g at 4 ° C., and filtered through a 0.2 ⁇ m syringe filter.
  • each virus was confirmed by PCR using a major capsid protein (MCP) gene, and confirmed by sequencing.
  • MCP major capsid protein
  • 10 ⁇ l of the filtered virus sample was inoculated into the GF-1 coin cell line cultured in a T-25 flask for 3 days, incubated for 7 days, and the supernatant was taken and stored at 70 ° C. until use.
  • QPCR quantitative PCR analysis was performed for quantitative analysis of the isolated virus. Specifically, separation of the viral DNA is GeneAll r ExgeneTM Tissue SB mini kit using (GeneAll) was isolated according to the manufacturer's method, elution until use separated in a final volume (elution) steps so that the 100 ⁇ l at -20 °C Stored.
  • 10 ⁇ l of 2 ⁇ PreMix SYBR Green with low ROX, Enzynomics
  • 0.5 pM of primer and 1 ⁇ l of template DNA were used, with a final volume of 20 ⁇ l.
  • the conditions of qPCR were reacted for 10 minutes at 95 ° C., followed by 40 cycles of reactions of 95 ° C.
  • 141bp product obtained using the primer as a primer in the TOPO-TA vector (Invitirogen, USA), transformed into Escherichia coli DH5 ⁇ and cultured in large quantities, and then the recombinant plasmid Separation was carried out in 10-fold dilutions (1 ⁇ 10 8 to 1 ⁇ 10 1 copies / ⁇ l) to create a standard curve.
  • the chemotactic cells include pagrus major fin (PMF) cell lines (Korea Cell Line Bank Accession No. KCLRF-BP-00324), grouper fin (GF-1) cell lines (ECACC, Australia) and Bluegill that are sensitive to IMV.
  • PMF pagrus major fin
  • GF-1 grouper fin
  • BF-2 bluegill fry
  • Example 1-1 1 ml of the IMV subgroup II virus supernatant 5x10 5 copies / ml concentration of Example 1-1 was injected and sufficiently adsorbed using Twister (Vision Scientific co., LTD, VS-96 TW) in the incubator for 2 hours, and then 4 ml It was added and incubated at 25 °C. The virus concentration of the supernatant taken was measured daily, taking the supernatant in the flask daily after IMV inoculation and replacing the cells with a 100% fresh medium, while continuously culturing the cell line (SCCCS, semi-continuous cell culture system). In addition, after 10 consecutive cultures, cell degeneration was confirmed under a microscope (Nikon, Eclipse TS100).
  • the highest concentration of IMV was produced in the PMF cell line, and the average virus concentration was 1.46x10 5 , 4.14x10 5 and 9.49x10 6 copies / ml in BF-2, GF-1 and PMF, respectively (FIG. 1). .
  • PMF produced IMV up to a concentration 100 times higher than GF-1 and BF-2, with a maximum of 7 ⁇ 10 7 copies / ml at 15 days of SCCCS culture.
  • cell degeneration after 10 consecutive cultures was the most frequent in PMF cell line, and the virus was maintained at high concentration without desorption as cells were maintained even after continuous medium exchange by PMF degeneration caused by IMV infection. Can be produced (FIG. 2). Therefore, the IMV production optimization experiment through the subsequent SCCCS culture method was performed using the PMF cell line as a representative coin cell line.
  • the total virus produced showed the amount of virus in all virus supernatants obtained for 30 days immediately after virus infection, where the amount of virus supernatant produced was 150 ml, 50 ml and 30 ml, respectively, at 1, 3 and 5 day cycles, respectively. It was.
  • medium exchange of the 5-day cycle initially showed somewhat higher concentrations, but then gradually decreased virus production due to cell detachment (FIG. 3). That is, the virus productivity when cultured with a medium exchange cycle of 3 days was found to be the highest, after which the medium exchange cycle was 3 days in the SCCCS culture method.
  • the productivity of IMV according to the medium exchange rate in the SCCCS culture method was confirmed. Specifically, when the medium is exchanged with the medium exchange cycle (3 days) established in the conditions of Example 3-1, the medium is exchanged by dividing the percentage of medium to be replaced with a new medium by 30%, 70% or 100%. Afterwards, the amount of virus obtained was quantified by the q-PCR method of Example 1-2.
  • the cells were maintained at all ratios, and the concentration of virus was observed.
  • the medium exchange rate of 30% the virus concentration rose rapidly at the beginning, but after 15 days, the cells gradually dropped and the virus concentration continued to decrease.
  • the virus concentration continued to increase at 100% medium exchange rate, compared to 70% exchange. It took longer than the 70% and 30% exchange rates to increase at low rates and reach the virus concentration peak.
  • the concentration of virus continued to increase for 15 days, after which the virus concentration remained without dropping of cells (FIG. 4). Therefore, the medium exchange rate during SCCCS culture during subsequent experiments was optimized to 70%.
  • the culture conditions were optimized by comparing the virus productivity according to the type of medium, FBS concentration and culture temperature. It was. Among them, L-15, MEM and RPMI 1640 were compared with each other.
  • the experiments were performed after exchanging with each medium for at least 10 times in order to adapt PMF cells to respective mediums.
  • Each PMF cell adapted in fresh medium was cultured by injecting into a T-25 flask at 1 ⁇ 10 5 cells / ml after the last passage and when the cells occupy more than 80% of the bottom of the flask, Virus supernatants were used to inoculate 1 ⁇ 10 5 copies / ml.
  • Example 1-2 After 3 days of inoculation, 70% of the virus supernatant produced was obtained and cultured by aliquoting the obtained amount of fresh medium (70% exchange of the medium every 3 days). In this way, the amount of virus obtained daily was quantified by the q-PCR method of Example 1-2.
  • the culture conditions were optimized by comparing the virus productivity according to the type of medium, FBS concentration and culture temperature. It was. Among them, in order to set an appropriate concentration of fetal bovine serum (FBS) used as an additive of the culture medium in SCCCS, the cells were cultured in the same manner as in Example 4-1, and the virus was inoculated every three days. The medium was exchanged 70%. At this time, 1%, 5% and 10% of FBS was added to the medium, and the concentration of the produced virus supernatant was analyzed by q-PCR.
  • FBS fetal bovine serum
  • the culture conditions were optimized by comparing the virus productivity according to the type of medium, FBS concentration and culture temperature. It was. Among them, in order to confirm the optimum cell culture temperature, the cells were cultured in the same manner as in Example 4-1 to inoculate the virus, and the culture temperature was changed to 20, 23, 25, 28 while replacing 70% of the medium every three days. And 30 ° C., respectively, to confirm the productivity of the virus. Other cell culture conditions were cultured under the optimized conditions in Example 4-2.
  • the IMV subgroup II virus supernatant 1ml of Examples 1-1 after the 5th of the inoculated inoculated the PMF cells 1x10 5 cells / ml concentration in T-flask, and the cells accounted for more than 80% of the bottom of the flask 5x10 5
  • the mixture was injected at a copy / ml concentration and sufficiently adsorbed using Twister (Vision Scientific co., LTD, VS-96 TW) in the incubator for 2 hours, and then 4 ml was further added and incubated at 25 ° C. For periodic cell number determination, one flask was removed each time from 10 T-flasks inoculated with the same amount of cells by the same method.
  • the number of cells was 15 cycles of medium exchange, and all cells in the flask were desorbed using 0.25% trypsin.Then, the cells were diluted and counted to 80-200 cells in 0.1 mm 3 with a hemocytometer to count the cells in 1 ml. Measured. Viral concentrations were also quantified by q-PCR analysis after DNA was isolated by sampling the supernatant at the same cycle.
  • IMV in PMF cultured with SCCCS had a concentration of at least 4.99x10 9 copies / ml and a maximum of 8.47x10 9 copies / ml, and the average amount of virus produced per day was 1.09x10 10 copies / day (FIG. 8). .
  • the average concentration of the cells was 3.86x10 6 cells / ml (Fig. 8), it was confirmed that even in the medium exchange 20 times, 50 times and 100 times without a decrease or drop of the cells (Fig. 9). Subsequently, the virus was produced without shedding cells even in the subsequent culture.
  • Example 1 In order to confirm the productivity according to SCCCS of the virus of each subgroup of IMV, isolates of subgroups II, III and IV obtained in Example 1 were inoculated into PMF cell lines, and then cultured by the methods optimized in Examples 3 and 4. The virus productivity was confirmed later. In addition, denaturation of cells inoculated with each virus subgroup was confirmed under a microscope.
  • Example 8 Comparison of Virus Productivity between Passage (BCS) and Semi-Continuous Cultures (SCCCS)
  • the productivity of IMV using a conventional cell line simple passage culture was compared with the productivity of IMV using the semi-continuous culture (SCCCS) method of the present invention.
  • IMV was inoculated to 10 5 copies / ml of the PMF cell line in the flask and medium exchange was carried out every three days so that the number of times was 20 or more (P20) to induce sufficient continuous infection.
  • P20 the number of times was 20 or more (P20) to induce sufficient continuous infection.
  • cells that were judged to be sufficiently serially infected were used for accurate comparison.
  • the experimental group using the BCS method was used as a cell line (BCS-P30 or P60 passaged 30 or 60 times representing PMF infected PMF).
  • Virus production method division 21 days of virus production (ml) Average concentration of virus (copies / ml) BCS BCS-P30 15.0 6.17E + 08 BCS-P60 15.0 5.93E + 08 SCCCS SCCCS-W50 24.5 5.55E + 09 SCCCS-W100 24.5 6.97E + 09
  • the amount of virus supernatant produced by BCS for 21 days was 15 ml, and the amount produced by SCCCS was 24.5 ml, which was 1.6 times higher than that of SCS.
  • the concentration is also more than 10 times higher than the total amount of virus produced is estimated to be 15 times higher (Table 3).
  • High Dose Iridovirus Inactivated Vaccine was prepared using IMV (Iridoviridae Megalocytivirus) subgroup II isolated from infected sea bream in Example 1. Specifically, IMV subgroup II was produced under the optimal conditions established in the above examples, diluted to adjust to 2 ⁇ 10 9 copies / ml (SCCCS-IMV-SII). As a control, the supernatant of 5 ⁇ 10 8 copies / ml was used as the virus supernatant produced by subculture under the same medium and conditions (BCS-IMV-SII).
  • Vaccines were prepared by centrifuging the prepared and produced virus in each method at 12,000 rpm for 10 minutes and then inactivating with formalin 0.1% (v / v) at 4 ° C. for 2 weeks (BCS-IMV-SII and HDIV). SCCCS-IMV-SII). 0.1 ml of inactivated vaccine was intraperitoneally injected into 20 healthy sea breams (6.98 ⁇ 1.54 g of body weight) for 4 weeks. Both vaccine groups showed no mortality and both vaccines were stable.
  • HDIV SCCCS-IMV-SII vaccine
  • BCS-IMV-SII vaccine 5x10 8 copies / ml
  • PBS pH 7.2
  • 20 sea bream 7.94 ⁇ 1.37 g
  • 20 red snapper 9.28 ⁇ 2.21 g
  • the anti-IMV infection prevention effect of the virus vaccine (HDIV) produced by the semi-continuous culture method (SCCCS) was 25% and 15% greater in sea bream and red snapper than the vaccine prepared with BCS-IMV-SII (Table 4).
  • HDIV (SCCCS-IMV-SII vaccine) diluted to 1/10 showed a similar survival rate as the BCS-IMV-SII vaccine using the stock solution, which is remarkable for use as a vaccine compared to the virus produced by the conventional subculture. I found it useful.
  • IMV Iridoviridae Megalocytivirus
  • VNNV Viral nervous necrosis virus
  • VHSV Viral Hemorrhagic Septicemia
  • spleen tissues known to have the highest IMV and VHSV and brain tissues known to have the highest VNNV were extracted and pulverized in PBS at a concentration of 10% w / v, followed by centrifugation at 10,000 g for 4 minutes. After passing through a 0.2 ⁇ m syringe filter, 10 ⁇ l were taken and each cell was injected with a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells / ml in a T-25 flask, followed by IMV and VNNV in fish coin cell lines PMF, E-11 and EPC, respectively. VHSV was inoculated, and the virus was propagated for 7 days and the supernatant was stored at 70 ° C. until use.
  • Parf major fin (PMF), Grouper fin cell (GF-1), Blue gill fry (BF-2), Epithelioma pap ⁇ losum cyprinid (EPC) and a clone of the cell line SSN- 1)
  • PMF Parf major fin
  • GF-1 Grouper fin cell
  • BF-2 Blue gill fry
  • EPC Epithelioma pap ⁇ losum cyprinid
  • SSN- 1 Cell lines were cultured in T-75 flasks at 25 ° C. in L-15 medium (Sigma Aldrich) to which antibiotics (penicillin 100 IU / ml, streptomycin 100 ⁇ g / ml) and 10% FBS (Gibco) were added. It was.
  • MCB micro carrier bead
  • Cytodex 1, Cytodex 3, Cultispher or Rapidcell according to the manufacturer's recommendations.
  • Each microcarrier was used at a concentration of 5 mg / ml and Cultispher 1 was used at a concentration of 1 mg / ml.
  • the microcarriers in powder form were quantified according to the spinner flask capacity and hydrated at room temperature for more than 3 hours using PBS. During this process, MCB was precipitated to remove PBS and filled with new PBS. Repeated. After sterilization with a sterilizer and before use to remove the PBS and used after washing 2-3 times with cell culture medium (L15).
  • the culture medium of the fish cell line cultured in the flask was removed, and 500 ⁇ l of trypsin 0.25% (v / v) was injected into each flask to react at 25 ° C. for 5 minutes, and then all the cells were removed. It was then diluted with 10 ml of culture medium to remove trypsin and mixed in 50 ml of tube. Cells were centrifuged at 500 g using a centrifuge (Hanil, Combi-514R). After centrifugation, all the supernatant was removed and the pellet was diluted with 20 ml of PBS.
  • the cells were counted with a hemocytometer (Supe rior, Hausser ultra plane) and injected into the spinner flask at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells / ml.
  • a hemocytometer Symmett, Hausser ultra plane
  • the whole of the beads washed with the culture medium was injected with the culture medium, and fetal bovine serum was added to a final concentration of 10% (v / v).
  • the culture medium of the appropriate volume was added according to the volume of the Spinner flask and incubated in a 25 ° C. incubator at 60 rpm with a slow stirrer (Misung, MSD24), which is a method recommended by the manufacturer.
  • Example 11 Each fish coin cells attached to MCB in Example 11 were incubated at a stirring speed of 60 RPM in a 100 ml Spinner flask at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells / ml, which is a manufacturer's recommended condition.
  • the culture conditions were optimized using the PMF cell line attached to Cytodex 1 (MCB) as follows, and whether the other fish cell lines (GF-1, BF-2, E-11 and EPC) can be cultured under the optimized conditions. It was confirmed.
  • the medium exchange cycle is divided into 1 day, 3 days and 5 days while replacing the medium with fresh medium each time 70% (v / v) Cell growth was confirmed through cell number measurement using the MTT assay.
  • PMF cells attached to Cytodex 1 were injected in 96-well plates by diluting stepwise at a concentration of 1/2 ⁇ from 1 ⁇ 10 6 cells / ml, and the number of cells was measured using a hemocytometer after 24 hours of incubation.
  • the absorbance at 450 nm was measured using CCK-8 by the MTT assay method to prepare a standard curve of the cell number according to each absorbance.
  • the cells in the beads were then measured for absorbance using CCK-8 by sampling some of the beads in the flask, and counting the cells according to the standard curve above to determine the total number of cells in the flask.
  • each of the fish coin cells attached to the MCB showed a number of cells around 1x10 6 cells / ml at 30, 60, 90 and 120 RPM, indicating that the culture was well performed, especially at 60 RPM. After 12 days, the cell number was 1.06 x 10 6 cells / ml, showing the highest cell productivity (Table 5).
  • Example 11 the respective fish coin cells attached to the MCB were cultured in 100 ml, 250 ml, and 500 ml Spinner flasks to determine the cell numbers.
  • Example 11 the growth rate of each kind and concentration of serum added to the culture medium of each fish chemotactic cells attached to MCB was confirmed. Specifically, after incubating with 0%, 1%, 5% and 10% of FBS (Fetal bovine serum), or 5% and 10% of NCS (New born carp serum), and in Example 12-1, As shown in the cell productivity.
  • FBS Fetal bovine serum
  • NCS New born carp serum
  • FBS Fetal bovine serum
  • NCS New born carp serum
  • Example 12-1 to 12-6 the optimum culture conditions of fish cell lines attached to MCB, medium exchange cycle 3 days, stirring speed 60RPM, 250ml Spinner flask, LBS medium containing FBS 5% serum, initial cells
  • concentration was set at 1 ⁇ 10 5 cells / ml and the cell culture temperature of 25 ° C.
  • This optimized condition showed remarkable cell culture efficiency of at least 1 ⁇ 10 6 cells / ml in both PMF cell lines as well as in all fish cell lines (GF-1, BF-2, E-11 and EPC) used in the present invention.
  • conditions for improving the adhesion and growth capacity of cell lines attached to MCB are conditions for stirring and stopping the initial agitation speed for a certain time. Repeatedly confirmed the adhesion and proliferation of the cells.
  • Control culture was carried out at 60 RPM, which is the optimized stirring speed in Example 12, Experimental group 1 was repeated 60RPM stirring and stopping (1 minute / 4 minutes) for 2 hours, Experimental group 2 was stirred and stopped 30RPM (1 minute / 4 minutes) was repeated for 2 hours.
  • the adherence rate to MVB of the cell lines of the experimental group 1 and the experimental group 2 was increased by 30% or more compared to the control group on day 1, and the cells adhered to the MCB very evenly (Table 6).
  • the increase in cell adhesion rate affects the proliferation of cells, and compared to Test Group 1 and Control Group, the number of cells after 7 days in culture was up to 1.46-fold in PMF cell line, up to 1.38-fold in GF-1 cell line, and EPC. Cell lines showed an effect of up to 1.25 fold increase (Table 6).
  • serum, muscle extract and yolk extract (from sea bream or red sea bream) derived from fish (rock bream, red sea bream or halibut) were added to the MCB with 5% FBS.
  • the preparation method of each additive is as follows. Ten sea bream (210.4 ⁇ 56.2g), red snapper (354.1 ⁇ 83.3g), and flounder (282 ⁇ 78g) were prepared to obtain fish-derived serum, and blood collected by nonarrhythmic blood collection using a 10ml syringe was used. Serum was isolated after centrifugation (Gyrogen, Gyro 1524M) at 10,000 RPM.
  • TBS Tris-buffered saline, 50mM Tris, 0.9% NaCl, pH 7.6
  • homogenizer PolytronPT 1200E
  • the yolk extract was hatched from the sea bream and red sea bream fish, washed thoroughly with PBS, mixed with PBS 1: 1 (w / v), ground with a homogenizer, and extracted only with the supernatant at 3,500 rpm and 10,000 rpm. The supernatant was collected once more and stored at ⁇ 20 ° C. until it passed through a 0.45 ⁇ m filter.
  • the concentration range of 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.5% and 1% was set through the preceding experiment.
  • the PMF and EPC cell lines were mixed with MCB, microcarrier beads and respective cell lines were attached, and the cell culture was carried out using a cell culture medium containing additives for each concentration by the culture method optimized in Examples 12 and 13-1.
  • the medium containing the additive of the same conditions was used also when performing medium exchange every 3 days.
  • the fish-derived test group of 0.5 and 1.0% concentration showed 9.19x10 5 cell / ml and 12.97x10 5 cell / ml after 7 days of cell culture, which showed up to 2 times more cell growth than the control group during the same period.
  • the experimental group treated with muscle extract at 1.0 and 1.5% showed cell growth of 8.07x10 5 cells / ml and 9.15x10 5 cell / ml after 7 days of cell culture, which showed an increase of up to 1.5 times. .
  • Example 13-2-1 when cultured by adding 0.5% fish serum, 1.0% fish muscle extract and 0.1% yolk extract, the cell culture phenomenon was improved. It was determined as 0.5%, 1.0% and 0.1% (v / v).
  • IMV Iridoviridae Megalocytivirus
  • VHSV Viral Hemorrhagic Septicemia
  • the DNA of the virus GeneAll r ExgeneTM was isolated according to the manufacturer's method using a Tissue SB mini kit (GeneAll), and stored at 20 °C then eluted (elution) the final volume to be 100 ⁇ l.
  • the RNA of the virus was isolated according to the manufacturer's method using the RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen), and then suspended using 50 ⁇ l of Rnase free water.
  • cDNA synthesis For cDNA synthesis, add 0.5 ⁇ l of M-MLV reverse transcriptase (5 ⁇ l of Promega), 2 ⁇ l of dxP, 0.5 ⁇ l of dNTP, 1 ⁇ l of specific primer and 3 ⁇ l of extracted RNA, and add Nuclease-free water so that the total volume is 10 ⁇ l. After addition, it was made to react at 45 degreeC for 60 minutes and 99 degreeC for 10 minutes. The prepared cDNA was then used as a qPCR template and stored at -80 degrees until use.
  • the PMF cell line attached to the MCB inoculated with IMV by treatment of fish-derived additives showed a virus productivity of 4.8 times higher than that of the control group (Table 7), and the EPC cell line attached to the MCB inoculated with VHSV Virus productivity was 3.2 to 4.2 times higher than the control group (Table 8).
  • Example 3 the culture medium optimized in Example 3, and the medium to which the initial stirring speed and 0.5% of red sea bream serum were added as the basic culture conditions.
  • PMF cell lines were cultured in various types of MCBs, and adhesion ability was confirmed as the number of adherent cells.
  • MCBs are Cytodex1, Cytodex3, Cultispher and Rapidcell (Table 9).
  • the increase in the concentration of beads may increase the number of cultured cells, but it was confirmed that the beads collide with each other during the stirring due to the increase in the concentration of beads, and thus the efficiency is lowered.
  • Cytodex 1, Cytodex 3 and Rapidcell were identified as 5 mg / ml and Cultispher was 1 mg / ml.
  • PMF cell lines were attached to the appropriate concentration of beads and cultured at 3 days intervals while culturing, and cell attachment beads 12 days after culturing were attached under the microscope (Figs. 12 and 13).
  • Example 14 PMF, GF-1, BF-2, E-11 and EPC cell lines were attached and cultured using Cytodex 1 (5 mg / ml), which showed the best cell adhesion and proliferation ability. Each cell was cultured to be 1 ⁇ 10 5 cells / ml, and cultured under optimal conditions established in the above examples. In addition, after attaching the fish cell line and incubated for 12 days, the appearance of each cell line was confirmed under a microscope (Fig. 16).
  • each cell line showed the cell growth as shown in Figure 17 it was confirmed that the highest concentration from about 12 days after.
  • Cytodex 1 after attaching the PMF, GF-1, EPC and E-11 cells 1x10 5 cells / ml, respectively were cultured in 250ml Spinner flask. After 15 days of cell culture, each cell line was inoculated with a susceptible virus. Specifically, PMF and GF-1 cell lines were inoculated with IMV and EPC and E-11 cells at a concentration of 1 ⁇ 10 5 copies / ml of VNNV and VHSV, respectively. After virus inoculation, the cells were cultured for 15 days without changing medium, and the cells were observed under a microscope to confirm cell degeneration.
  • the cell number was measured at intervals of 3 to 4 days during the culture, and the culture supernatant was sampled to determine the virus concentration. Since VHSV had a culture optimum of 20 ° C., EPC cell lines were cultured at 20 ° C. after virus inoculation.
  • subculture There are two methods of subculture and scale-up method for dividing cells cultured in MCB to increase the cell number of MCB-attached fish cell lines.
  • the cells of existing MCB are divided into flasks of the same capacity.
  • the process, called subculture was defined as the scale-up of the entire cell-attached MCB from the lower volume flask to the higher volume flask.
  • the MCB-attached cell line was transferred from a small flask to a large flask (10 ml ⁇ 50 ml ⁇ 500 ml). Specifically, 10 ml of PMF cell line attached to MCB was cultured in an optimized manner in the above examples, and 50 ml (5-fold scale-up) after 15 days of culture. 10-fold scale-up (500 ml) was performed after 21 days after 5-fold scale-up. The increase in cell number was then expressed as the total cell number in the flask (FIG. 20).
  • IMV a virus showing susceptibility to PMF
  • IMV a virus showing susceptibility to PMF
  • the rate at which 90% or more cells were attached to the new MCB after subculture was confirmed as 9 and 15 days at the ratio of MCB-attached cell lines and adding new beads 1: 1 and 1: 4 (Table 11).
  • the number of cells reached more than 2x10 6 cells / ml after 15 days and 21 days in both groups.
  • cell adhesion rate and cell concentration continued to increase after scale-up, and after 10-fold scale-up, final 1 ⁇ 10 9 cells / flask or more cells were produced (FIG. 20).
  • the virus was inoculated into MCB-PMF produced in subculture or scale-up, and confirmed after 12 days, and all of the virus produced 5 ⁇ 10 9 copies / ml or more.
  • the scale-up method allowed 350 ml of virus to be produced every three days.
  • the culture of the microcarrier bead-attached cells using this scale-up method is suitable for mass production of cells and viruses, and the vaccine produced with the virus produced in this way is large enough to be directly used in aquaculture. .
  • the virus concentration also showed the characteristics of a typical continuous infection that continues to increase, and after the virus infection for a certain period of time the cells were maintained without degeneration. Therefore, a titration experiment was performed to continuously perform cell growth and virus production for a long time after viral infection.
  • PMF cells were attached to cytodex 1 (5mg / ml) in a 250ml spinner flask and cultured for 15 days. Thereafter, the cells were infected with 1 ⁇ 10 5 copies / ml of IMV to obtain an MCV-PMF cell line infected with IMV.
  • Example 18-1 It was confirmed whether the continuous culture of the MCB-attached PMF cell line of Example 18-1 can be attached to other types of MCBs (Cytodex1, Cytodex3, Cultispher, and Rapidcell). It was. The cell number was measured after 12 days and the virus concentration after 15 days of cell culture showed virus concentration after 12 days (Table 12).
  • Example 19 Confirmation of effect enhancement according to mass-produced vaccines and excipients using MCB
  • Vaccines using squalene + aluminum hydroxide as excipients include squalene (Sigma, 2.5%, v / v), glycerol (Amresco, 10%, v / v), Tween 80 (Sigma aldrich, 0.5%, v / v) in PBS. And mixed with aluminum hydroxide (Sigma aldrich 1% w / v) and reacted on ice for 15 minutes and homogenized with a PolytronPT 1200E homogenizer. The squalene excipient thus prepared and the inactivated SCMCS-IMV were mixed at a ratio of 1: 1 (v / v) and homogenized with a PolytronPT 1200E homogenizer.
  • Vaccine using Imiquimod as an excipient was dissolved in distilled water at a concentration of 1 mg / ml with diminished water of 98% or more, and diluted 100-fold to 1:20 (v / v) with SCMCS-IMV inactivated with formalin. It was prepared by mixing. Vaccines using Montanide ISA 780 VG based on vegetable oil as excipients were prepared by mixing Montanide ISA 780 VG with formalin-inactivated SCMCS-IMV at 1: 1 (v / v) and then homogenizing with PolytronPT 1200E homogenizer. It was. Vaccine mixed with each excipient was tested with 20 sea bream individuals in each group, PBS was used as a control.
  • the neutralizing antibody titers of the vaccine subjects were measured to confirm the effect of the vaccine. Specifically, three dolmen fishes of each vaccination group 4 weeks after vaccination were collected by microarrhythmic blood collection and centrifuged at 10,000 rpm, and the supernatant was separated and stored at -80 ° C until use. The serum dissolved at room temperature for neutralizing antibody experiment was diluted 10-fold with L-15 medium, and treated for 30 minutes at 55 °C for inactivation of complement. After dilution, the dilution period was set from 1/10 to 1/640 through the two-fold dilution, and mixed 1: 1 with 2 ⁇ 10 4 copies / ml of the virus supernatant and neutralized at 25 ° C. for 2 hours.
  • the final concentration for the antibody titer was set from 1/20 to 1/1280 to measure the neutralizing antibody titer.
  • Viruses neutralized at each concentration were infected by incubating 1 ⁇ 10 5 cells / ml of inoculated PMF cells for 5 days in 24 well plates, and neutralizing antibody titers were determined by observing CPE 7 days after infection.
  • the SCMCS-IMV-sII vaccine without the excipients showed an average survival rate of 58.33%, and survival rates over 10% were higher in the groups receiving beta-glucan, Squalene + Aluminum, and Montanide ISA 780 VG, respectively. (Table 13). In particular, the highest survival rate was 83.33% when Beta-glucan was used as an excipient.
  • the neutralization test showed the highest value of 266.67 in the vaccine groups using Beta-glucan or Montanide ISA 780 VG as an excipient, and over 200 neutralizing antibody values in all other vaccine groups (Table 13). . It is inferred that the immunization due to vaccination resulted in high average survival rate by producing sufficient antibodies against subsequent invasion of the antigen.

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Abstract

본 발명은 반연속 배양 방법으로 바이러스를 제조하는 방법 및 어류 바이러스를 마이크로캐리어에 부착된 세포주를 이용하여 고농도로 대량 생산하는 방법에 관한 것으로, 메갈로사이티바이러스에 연속 감염된 어류 세포주를 이용한 반연속 배양 방법 (SCCCS 법)을 이용하고, 마이크로캐리어 비드에 어류 세포주들을 부착 및 scale-up하는 최적 배양 조건을 도출함으로써, 종래의 연속 감염 세포주를 활용한 바이러스 제조 방법 (Batch culturing system, BCS)의 복잡성과 비효율성을 극복하고, 장기간 반연속 배양에도 숙주 세포주의 수적 감소 또는 사멸 없이 고농도의 바이러스 생산이 가능하게 하였으며, 부착 배양 특성을 가진 어류 세포주들을 협소한 공간에서도 대량으로 배양가능하게 하였으므로, 이를 이용해 어병 유발 바이러스를 고농도로 대량 생산하여 효율적이고 안정적으로 바이러스를 생산하고 백신을 제조할 수 있다.

Description

어류 바이러스의 생산 방법
본 발명은 어류 바이러스를 반연속 배양 방법 또는 마이크로캐리어에 부착된 세포주를 이용하여 바이러스를 제조하는 방법 및 이를 이용하여 제조된 바이러스를 이용한 백신에 관한 것이다.
최근 양식 산업의 발달과 함께 어류의 질병 문제는 점점 그 중요성이 커지고 있으며 질병의 관리문제의 정립 또한 그 중요성이 함께 증가하고 있다. 이러한 이유로 어류 질병에서 가장 많은 부분을 차지하는 바이러스성 질병에 대한 관리방법에 대한 수요 및 필요성이 증가하고 있다. 이러한 어류 바이러스 질병의 관리 방법 중에서 가장 중요한 것은 백신의 개발이다. 이에, 바이러스 백신의 개발을 위해서는 새로운 세포주의 대량 배양방법이 먼저 이루어져야 하며 이를 바탕으로 대량의 바이러스 생산이 경제적이고 효율적으로 이루어져야 한다.
세계의 Bio 산업계에서는 바이러스의 대량 생산을 위해 발효기(fermentor) 또는 생물반응기(Bioreactor)를 이용하는 것이 일반적이다. 바이러스의 대량 생산을 위해 필수적인 숙주 세포의 대량 배양을 위해서는 수십 내지 수백 리터 용량으로 scale-up할 수 있는 F-SC(Free-cell Suspension cultures) 방법이 이용되고 있다. 어류 세포주는 100여 종에 가깝게 개발되어 있으나 부착의존성을 나타내는 세포주들밖에 없으므로, 포유류의 경우와 같이 F-SC 방법으로 대양 배양을 실시하기 어려워 어류 바이러스의 대량 생산이 어려운 실정이다. 최근에 어류 바이러스의 대량 생산을 위하여 roller bottles를 이용한 방법이 활용되고 있으나 이러한 방법은 매우 많은 노동력을 요구하며 동시에 매우 비경제적인 방법인 한계가 있어왔다.
종래에 바이러스를 세포주에 감염시킨 뒤 바이러스를 생산하기 위해서는 바이러스 감염 상등액을 수득 후 감염 세포주는 배양 용기와 함께 폐기하는 BCS(Batch Culture system)이 이용되어 왔다. 그러므로 추가적인 양의 바이러스 액을 얻기 위해서는 새롭게 연속 감염된 세포주를 배양용기에 분주하여 배양하고 (Subculturing, 계대배양), 연속 감염 세포주가 아니라면 다시 세포주에 바이러스를 접종과정까지 실시해야 하는 번거로움과 함께 수득 바이러스의 농도가 높지 않다는 어려움이 있다. 더구나 이러한 방법은 closed system인 BCS법의 특성 때문에 숙주세포에 대한 배양이 5-7일 동안만 이루어지고 숙주 내 감염 바이러스(intracellular accumulated virus)에 의한 재식균이 이루어지지 않아 계속적인 고농도의 바이러스 생산이 이루어지지 않는다는 문제점이 있어왔다.
IMV(Iridoviridae Megalocytivirus)는 참돔 이리도바이러스 질병(Red Sea Bream Iridovirus Disease, RSIVD)의 원인체이다. 그러나 양식 현장에서 약 10% 내외의 누적 폐사율을 보이는 참돔보다는 돌돔이 훨씬 높은 감수성을 나타내어 고수온기에 감염이 발생하면 90-100%의 대량 폐사가 나타난다. 이러한 메갈로사이티바이러스의 감염을 예방하기 위한 백신 개발을 위해서는 바이러스의 대량 배양이 필수적이지만, 메갈로사이티바이러스는 제한적인 어류 세포주에서만 증식하고, 계대배양에서 배양 횟수 (virus passage)가 증가함에 따라 감염력이 급격히 감소되며 (Chou eta., 1998; Imajoh et al., 2007; Nakajima and Sorimachi, 1994), 바이러스 생산이 감소하여 배양액에서의 바이러스 농도가 감소하는 현상 등이 나타나는 매우 특이적인 감염을 나타내기 때문에, 바이러스의 산업적인 생산에 많은 어려움이 있었다.
현재 Iridoviridae Megalocytivirus(IMV) 의한 질병의 치료제는 알려진 바 없으며 예방할 수 있는 유일한 방법은 백신 개발이라 할 수 있다. 특히 돌돔이 메갈로사이티바이러스에 가장 감수성이 높으며, 매년 높은 발병률과 많은 폐사를 유발하하여 발병이 되면 매우 큰 피해를 입고 있으나, 는 사용할 수 있는 배양 바이러스의 농도가 낮아서 고농도 백신의 제조가 어렵기 때문에 백신 개발이 어려운 실정이다.
상업적으로 구입 가능한 세포주들 중에서 메갈로사이티바이러스의 감수성을 보인다고 알려진 것은 RTG-2(rainbow trout gonad), CHSE-214(chinook salmon embryo), FHM(fathead minnow), BF-2(blue gill fry), KRE-3(belp and re spotted grouper embryo) 등이 있으며, 이들은 세포변성 효과(cytophatic effects, CPE)가 발생하면서 증식된다고 알려져 있다 (Nakajima and Sorimachi, 1994a; Chou et al., 1998). 그러나 이들 모든 주화 세포는 메갈로사이티바이러스의 계대를 거치면 바이러스 역가(viral titer)가 점점 감소한다고 알려져 있어, 백신 제조에 필요한 고농도의 메갈로사이티바이러스를 경제적으로 대량 공급하는데 어려움이 있어 왔다.
현재 상업화된 모든 어류 주화세포에서는 이러한 고농도 바이러스의 지속적인 배양에 어려움이 있으며, 생산된 바이러스의 농도가 낮기 때문에 (바이러스의 산업적 농축과정은 고가의 비용이 요구되므로 경제적으로 의미가 없음) 고농도 백신으로서의 개발을 할 수 없는 실정이다 (Imajoh et a., 2007; Dong et al., 2013). 그러므로 현재 메갈로사이티바이러스의 산업적인 백신 개발을 위하여서는 이러한 문제점들을 해결하는 보다 효율적이고 연속적인 고농도 바이러스의 생산법이 필요하다.
본 발명에서는 메갈로사이티바이러스에 연속 감염된 어류 세포주를 이용한 반연속 배양 방법 (SCCCS 법)을 이용함으로써 종래의 연속 감염 세포주를 활용한 바이러스 제조 방법 (Batch culturing system, BCS)에서 매번 새로운 세포주를 계대배양하고 바이러스 접종배양해야 하는 복잡성과 비효율성을 극복하면서 고농도로 바이러스를 연속 생산하고, 마이크로캐리어 비드에 어류 세포주들을 부착 및 scale-up하고 최적 연속배양 조건을 도출하여 대량 배양함으로써 부착 배양 특성을 가진 어류 세포주들을 이용한 어류 바이러스의 고농도 생산이 어려운 점을 극복하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적의 달성을 위해, 본 발명은 어류 주화세포에 바이러스를 감염시키는 단계; 감염된 세포를 배양하는 단계; 배양 상등액을 수득하고 새로운 배지로 대체하는 반연속 배양(semi-continuous cell culture) 단계; 및 수득한 배양 상등액에서 바이러스를 분리하는 단계를 포함하는, 바이러스의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 어류 주화 세포주와 마이크로캐리어 비드를 혼합하여 세포주를 마이크로캐리어 비드에 부착하는 단계; 마이크로캐리어 비드에 부착된 어류 주화 세포주를 배양하는 단계; 마이크로캐리어 비드에 부착된 어류 주화세포에 바이러스를 감염시키는 단계; 상기 바이러스에 감염된 어류 주화세포를 배양하는 단계; 및 배양 상등액을 수득하고 바이러스를 분리하는 단계를 포함하는, 마이크로캐리어 비드를 이용한 바이러스 생산 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조 또는 생산한 바이러스를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 반연속 배양 방법 (SCCCS)은 장기간 반연속 배양에도 숙주 세포주의 수적 감소 또는 사멸 없이 고농도의 바이러스 생산이 가능하고, 마이크로캐리어를 이용한 바이러스 생산 방법은 부착의존적 어류 세포주의 부유 배양이 가능하므로, 세포주 및 바이러스를 고농도로 대량 생산할 수 있어 대량 생산이 가능하고, 협소한 공간에서도 대량의 세포를 생산할 수 있으며, 외부로부터 발생할 수 있는 오염 가능성이 낮아, 효율적이고 안정적인 바이러스의 생산 및 백신 제조에 용이하다.
도 1은 PMF, GF-1 및 BF-2 세포주에 IMV 감염 후 매일 수득한 상등액에서 바이러스 농도를 확인한 도이다.
도 2는 연속배양 10회 후의 세포 변성을 현미경으로 확인한 도이다:
A: IMV 감염된 PMF 세포주 (0회 배양);
B: IMV 감염된 GF-1 세포주 (0회 배양);
C: IMV 감염된 BF-2 세포주 (0회 배양);
D: SCCCS 배양 방식으로 10회 배양 (상등액 수득 후 배지 첨가 10회)한 IMV 감염된 PMF 세포주;
E: SCCCS 배양 방식으로 10회 배양 (상등액 수득 후 배지 첨가 10회)한 IMV 감염된 GF-1 세포주; 및
F: SCCCS 배양 방식으로 10회 배양 (상등액 수득 후 배지 첨가 10회)한 IMV 감염된 BF-2 세포주.
도 3은 PMF 세포주에서 IMV를 SCCCS 배양 방법으로 생산함에 있어서, 배지 교환주기 (1일, 3일 및 5일)에 따른 바이러스의 생산성을 확인한 도이다.
도 4는 PMF 세포주에서 IMV를 SCCCS 배양 방법으로 생산함에 있어서, 3일마다 배지를 교환할 때, 새 배지로 교환하는 배지의 비율 (30%, 70% 및 100%)에 따른 바이러스의 생산성을 확인한 도이다.
도 5는 PMF 세포주에서 IMV를 SCCCS 배양 방법으로 생산함에 있어서, 배양 배지 (L-15, MEM 및 RPMI1640)에 따른 바이러스 생산성을 확인한 도이다.
도 6은 PMF 세포주에서 IMV를 SCCCS 배양 방법으로 생산함에 있어서, 배양 배지 내의 FBS 농도 (1%, 5% 및 10%)에 따른 바이러스 생산성을 확인한 도이다.
도 7은 PMF 세포주에서 IMV를 SCCCS 배양 방법으로 생산함에 있어서, 배양 온도 (20℃, 23℃, 25℃, 28℃ 및 30℃)에 따른 바이러스 생산성을 확인한 도이다.
도 8은 최적화된 SCCCS 방법을 이용하여 PMF 세포주에서 IMV를 생산할 때의 세포수 및 바이러스 생산성을 배지 교환 횟수에 따라 확인한 도이다.
도 9는 최적화된 SCCCS 방법을 이용하여 IMV가 연속 감염된 PMF 세포주에서 세포의 형태와 세포변성을 확인한 도이다:
A: 바이러스 배양 전 IMV 감염 PMF 세포주;
B: 배지 교환 20회 후의 IMV 감염 PMF 세포주;
C: 배지 교환 50회 후의 IMV 감염 PMF 세포주; 및
D: 배지 교환 100회 후의 IMV 감염 PMF 세포주.
도 10은 IMV 분리주 subgroup Ⅱ, Ⅲ 또는 Ⅳ로 감염된 PMF를 최적화된 SCCCS 방법으로 20회 배지 교환한 이후의 세포변화를 확인한 도이다:
A: 바이러스 감염 전 PMF;
B: subgroup Ⅱ 분리주에 감염된 PMF;
C: subgroup Ⅲ 분리주에 감염된 PMF; 및
D: subgroup Ⅳ 분리주에 감염된 PMF.
도 11은 최적화된 SCCCS 방법을 이용한 PMF 세포주에서의 IMV 분리주 subgroup Ⅱ, Ⅲ 또는 Ⅳ에 따른 바이러스의 연속 생산성을 확인한 도이다.
도 12는 다양한 MCB에 부착된 PMF 세포 및 부착 12일 후의 현미경 사진이다:
A: Cytodex 1에 PMF 부착 직후;
B: Cytodex 1에 PMF 부착 후 배양 12일 뒤;
C: Cytodex 3에 PMF 부착 직후; 및
D: Cytodex 3에 PMF 부착 후 배양 12일 뒤.
도 13은 다양한 MCB에 부착된 PMF 세포 및 부착 12일 후의 현미경 사진이다:
A: Cultispher에 PMF 부착 직후;
B: Cultispher에 PMF 부착 후 배양 12일 뒤;
C: Rapidcell에 PMF 부착 직후; 및
D: Rapidcell에 PMF 부착 후 배양 12일 뒤.
도 14는 MCB에 PMF 세포주를 부착하여 배양시 MCB 종류 (cytodex 1, cytodex 3, cultispher 및 Rapidcell)에 따른 생산 세포수를 배양액 양 (ml)을 기준으로 나타낸 그래프이다.
도 15는 MCB에 PMF 세포주를 부착하여 배양시 MCB 종류 (cytodex 1, cytodex 3 및 cultispher)에 따른 생산 세포수를비드의 표면적(mm2)을 기준으로 나타낸 그래프이다.
도 16은 Cytodex 1에 어류 세포주 PMF, GF-1, EPC 또는 E-11을 부착한 뒤 12일 동안 배양한 후의 모습을 현미경으로 관찰한 도이다:
A: PMF;
B: GF-1;
C: EPC; 및
D: E-11.
도 17은 Cytodex 1에 어류 주화세포인 PMF, GF-1, BF-2, E-11 또는 EPC 세포주를 부착 및 배양하여 나타낸 세포수 성장 그래프이다.
도 18은 Cytodex 1에 PMF, GF-1, EPC 또는 E-11 세포 주를 부착 및 배양 15일 후에 각각의 감수성을 보이는 IMV, VNNV 및 VHS 바이러스를 접종한 뒤의 세포 수와 바이러스 농도를 나타낸다.
도 19는 Cytodex 1에 PMF, GF-1, EPC 또는 E-11 세포 주를 부착 및 배양 15일 후에 각각의 감수성을 보이는 IMV, VNNV 및 VHS 바이러스를 접종한 뒤 세포변성효과(CPE)를 관찰한 사진이다:
A: Cytodex 1에 PMF 부착 배양 15일 후;
B: Cytodex 1에 부착된 PMF에 IMV를 접종하고 12일 이후
C: Cytodex 1에 GF-1 부착 배양 15일 후;
D: Cytodex 1에 부착된 GF-1에 IMV를 접종하고 12일 이후
E: Cytodex 1에 E-11 부착 배양 15일 후;
F: Cytodex 1에 부착된 E-11에 VNNV를 접종하고 6일 이후;
G: Cytodex 1에 EPC 부착 배양 15일 후; 및
H: Cytodex 1에 부착된 EPC에 VHSV를 접종하고 6일 이후.
도 20은 MCB에 부착된 어류 세포주를 5배 용량 및 10배 용량의 배양 용기로 옮기면서 증가한 세포수를 확인한 도이다.
도 21은 Cytodex 1에 부착된 PMF 세포주에 IMV를 접종하고 반연속 배양하면서 배지 교환 주기 (1일, 3일 또는 5일)에 따른 생산 세포수 및 바이러스 농도를 확인한 그래프이다.
도 22는 Cytodex 1에 부착된 PMF 세포주를 반연속 배양하여 IMV 생산함에 있어서, 접종한 IMV의 서브그룹 (subgroup Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ)에 따른 생산 세포수 및 바이러스 농도를 확인한 그래프이다.
이하 본 발명을 설명한다.
일 측면에서, 본 발명은 어류 주화세포에 바이러스를 감염시키는 단계; 감염된 세포를 배양하는 단계; 배양 상등액을 수득하고 새로운 배지로 대체하는 반연속 배양(semi-continuous cell culture) 단계; 및 수득한 배양 상등액에서 바이러스를 분리하는 단계를 포함하는, 바이러스의 제조방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 바이러스는 이리도비리데 과 (Iridoviridae family) 바이러스일 수 있으며, 어류에서 질병을 일으키는 원인 바이러스인 메갈로사이티바이러스가 바람직하다.
일 구현예에서, 본 발명에서 제조하는 바이러스는 메갈로사이티바이러스 서브그룹(subgroup) Ⅱ, 서브그룹 Ⅲ 및 서브그룹 IV로 구성된 군에서 선택되는 메갈로사이티바이러스일 수 있다.
일 구현예에서, 어류 주화세포에 바이러스를 접종하고 3일 마다 배지 교환을 20회 이상 하여 세포를 바이러스로 연속 감염시킬 수 있다.
일 구현예에서, 감염된 세포는 우태아혈청(FBS) 5%가 포함된 배지에서 25℃로 배양될 수 있다.
일 구현예에서, 감염된 세포를 반연속 배양할 때의 배지 교환 주기는 3일이고, 새로운 배지로 대체하는 배지 교환 비율은 70% (v/v)일 수 있다.
본 발명의 반연속 배양은 바이러스에 감염된 세포들로부터 생산된 바이러스가 포함된 배양액을 수득하고, 세포들은 그대로 둔 상태로 새 배양액을 넣어 배양하는 조작을 반연속적으로 하는 것을 말한다. 본 발명의 일 실시예에서는 3일마다 세포 배양 상등액 (세포 배양 배지)를 70% 수득하고 새 배지를 다시 채워넣는 바이러스 생산 최적 조건을 수립하였다.
일 구현예에서, 상기 어류 유래 주화세포는 해당 바이러스에 감염되는 (감수성이 있는) 어류의 주화세포를 사용할 수 있으며, 일 예로 돌돔, 참돔, 강담돔, 점농어, 넙치, 감성돔, 강도다리, 조피볼락, 능성어, 쏘가리 유래의 주화세포를 사용할 수 있고, 참돔지느러미(pagrus major fin, PMF) 세포주, 그루퍼지느러미(Grouper fin, GF-1) 세포주 및 블루길자어(bluegill fry, BF-2) 세포주로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하며, 본 발명의 반연속 배양 방법에 가장 최적화되어 있는 PMF 세포주 (기탁번호 KCLRF-BP-00324, 한국세포주은행)가 가장 바람직하다.
본 발명의 용어 "주화세포"는 어류 조직에서 세포를 분리하여 연속적인 계대 배양을 통하여 세포주화한 세포를 의미하며, "세포주"와 "세포"는 혼용하여 사용한다.
본 발명의 일 실시예에서 PMF 세포주는 본 발명의 반연속 배양 방법으로 배양시 GF-1 및 BF-2보다 100배 이상 더 높은 농도의 바이러스를 생산하였으며, 배지 교환 105회 이후에도 세포의 감소나 탈락 없이 유지하면서 고농도로 바이러스를 생산하였으므로, 본 발명의 반연속 배양 방법에 최적화된 세포주임을 확인하였다. 일반적으로 바이러스로 감염시킨 세포주들을 반연속 또는 연속 배양할 경우, 세포에 변성이 오거나 사멸하기 때문에 바이러스 생산이 불가능하여 계대배양할 수 밖에 없었다.
본 발명의 일 실시예에서 반연속 배양 방법과 종래의 in vitro 계대배양 방법으로 메갈로사이티바이러스의 생산량을 비교한 결과, 본 발명의 반연속 배양 방법을 이용한 경우 종래의 계대배양에 비해 주어진 기간에서의 총 바이러스 생산량 및 하루 동안 생산되는 평균 바이러스 양 모두 최대 10배 이상 고농도의 바이러스를 수득할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 용어 "계대(passage)"는 희석하거나 하지 않고, 또는 희석함 없이, 하나의 배양 용기로부터 다른 용기로 세포를 전달하는 것을 의미한다. 세포가 한 용기에서 다른 용기로 이송될 때마다, 세포의 특정 부분이 결손될 수 있으므로, 의도 되었건 또는 의도되지 않았건 간에 세포의 희석이 일어날 수 있다. 이 용어는 용어 "2차 배양(subclture)"과 같은 의미이다. 계대 배양의 수는 세포가 배양되는 횟수로서, 새로운 용기 내로 2차 배양되거나 이송되어 현탁액 또는 부착 상태로 성장한다. 이 용어는 개체군 배가 또는 세포 개체군이 복제하는데 필요한 시간, 즉 세포 집락 중 개개의 세포가 복제하는데 대체로 걸리는 시간과 동의어가 아니다.
일 측면에서, 본 발명은 어류 주화 세포주와 마이크로캐리어 비드를 혼합하여 세포주를 마이크로캐리어 비드에 부착하는 단계; 마이크로캐리어 비드에 부착된 어류 주화 세포주를 배양하는 단계; 마이크로캐리어 비드에 부착된 어류 주화세포에 바이러스를 감염시키는 단계; 상기 바이러스에 감염된 어류 주화세포를 배양하는 단계; 및 배양 상등액을 수득하고 바이러스를 분리하는 단계를 포함하는, 마이크로캐리어 비드를 이용한 바이러스 생산 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 어류 주화 세포주는 PMF(Pargus major fin), GF-1(Grouper fin cell), BF-2(Blue gill fry), EPC(Epithelioma pap㎕osum cyprinid) 및 E-11(a clone of the cell line SSN-1) 세포주로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
일 구현예에서, 마이크로캐리어 비드는 덱스트란, 젤라틴 또는 폴리스티렌으로 이루어질 수 있으며, 비드의 직경은 100 내지 300㎛일 수 있고, 밀도는 1.02 내지 1.04일 수 있으며, 표면적은 2000 내지 8000cm2/g일 수 있다. 비드의 밀도가 물보다 크기 때문에 교반 환경이 유지되지 않는 상태에서는 가라앉게 되어 배양된 세포와 상등액을 보다 쉽게 구분할 수 있다.
일 구현예에서, 마이크로캐리어 비드는 상용되는 Cytodex1, Cytodex3, Cultispher 또는 Rapidcell일 수 있고, Cytodex1인 것이 더욱 바람직하다.
일 구현예에서, 세포주를 마이크로캐리어 비드에 부착하는 단계는 30 내지 60rpm으로 교반하고 정지하는 과정을 1 내지 3시간 동안 반복하여 수행할 수 있다.
일 구현예에서, 마이크로캐리어 비드에 세포주를 부착하는 단계, 이를 배양하는 단계 및 상기 세포주에 바이러스를 접종하고 바이러스를 생산하는 단계 전반에 걸쳐, 세포주의 배양시 어류 혈청, 어류 근육 추출물 또는 어류 난황 추출물을 배양 배지에 추가로 첨가하여 세포주를 배양할 수 있으며, 각각 0.5%, 1.0% 및 0.1%의 농도로 첨가될 수 있다.
일 구현예에서, 마이크로캐리어 비드에 부착된 어류 주화 세포주는 1 내지 3일 마다 배지를 전체 배지 용량의 70%를 교환하는 방식으로 배양될 수 있으며, 30 내지 80rpm의 교반 속도로 배양될 수 있다.
일 구현예에서, 마이크로캐리어 비드에 부착된 어류 주화세포에 새 마이크로캐리어 비드를 1:1 내지 1:4의 부피비로 추가하여 서브컬쳐(subculture)할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 마이크로캐리어 비드 부착된 어류 주화세포를 반으로 나눠 동일 용량의 플라스크에 분주하면서 새 마이크로캐리어 비드를 기존 MCB-부착 세포주의 부피에 대해 1:1 또는 1:4로 첨가하여 서브컬쳐하였다.
일 구현예에서, 마이크로캐리어 비드에 부착된 어류 주화세포를 작은 용량의 플라스크에서 배양한 뒤 더 큰 용량의 플라스크로 옮기면서 새 마이크로캐리어 비드를 추가하는 scale-up 서브 컬쳐 방식으로 배양될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 플라스크의 용량을 5배 및 10배로 증가시켜 scale-up 서브 컬쳐 하였다.
일 구현예에서, 바이러스는 메갈로사이티바이러스(Iridoviridae Megalocytivirus, IMV), 바이러스성 신경성 괴사 바이러스(Viral nervous necrosis virus, VNNV) 및 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia, VHSV)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 감염 대상인 어류 주화세포의 감수성에 따라 선택될 수 있다. 일 실시예에서, PMF 세포주 및 GF-1 세포주는 IMV로, E-11 세포주는 VNNV로, 및 EPC 세포주는 VHSV로 감염되었다.
일 구현예에서, 본 발명에서 생산되는 바이러스는 메갈로사이티바이러스 서브그룹(subgroup) Ⅱ, 서브그룹 Ⅲ 및 서브그룹 IV로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 바이러스에 감염된 어류 주화세포를 배양하고 배양 상등액을 수득하는 과정을, 배양 상등액을 수득한 뒤 수득한 양만큼 새로운 배지를 첨가하는 배지 교환 과정을 세포의 계대배양 또는 분주 과정 없이 반복적으로 실시하는 반연속 배양(semi-continuous cell culture) 방법으로 수행할 수 있다.
일 구현예에서, 감염된 세포를 반연속 배양할 때의 배지 교환 주기는 3일이고, 새로운 배지로 대체하는 배지 교환 비율은 70% (v/v)일 수 있다.
본 발명의 반연속 배양은 생산된 바이러스가 포함된 배양액을 수득하고, 마이크로캐리어 비드에 부착된 세포들은 그대로 둔 상태로 새 배양액을 넣어 배양하는 조작을 반연속적으로 하는 것을 말한다. 본 발명의 일 실시예에서는 3일마다 세포 배양 상등액 (세포 배양 배지)를 70% 수득하고 새 배지를 다시 채워넣는 바이러스 생산 최적 조건을 수립하였으며, Cytodex1 비드에 부착된 PMF 세포주에 IMV를 감염시켜 반연속 배양하는 경우에 가장 바이러스 생산성이 현저함을 확인하였다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조 또는 생산된 바이러스를 불활화한 바이러스와 약제학적으로 수용가능한 담체 (carrier) 또는 부형제를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 부형제는 베타-글루칸(Beta-glucan), 스쿠알렌 및 수산화알루미늄, 이미퀴모드(Imiquimod), 및 Montanide ISA 780 VG로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 베타-글루칸이 가장 바람직하다.
일 구현예에서, 상기 백신 조성물은 어류 메갈로사이티바이러스(Iridoviridae Megalocytivirus, IMV), 바이러스성 신경성 괴사 바이러스(Viral nervous necrosis virus, VNNV) 또는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia, VHSV)의 감염증 예방 또는 치료용 백신으로 이용될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 어류는 돌돔, 참돔, 강담돔, 점농어, 넙치, 감성돔, 강도다리, 조피볼락, 능성어 및 쏘가리로 구성된 군에서 선택될 수 있으며, 돌돔 또는 참돔인 것이 더욱 바람직하다.
일 구현예에서, 상기 백신 조성물은 불활화된 메갈로사이티바이러스(IMV), 바이러스성 신경성 괴사 바이러스(VNNV) 또는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(VHSV)를 함유할 수 있다, 상기 메갈로사이티바이러스는 서브그룹(subgroup) Ⅱ, 서브그룹 Ⅲ 또는 서브그룹 IV 분리주일 수 있다. 따라서, 본 발명에서 이러한 치료에 관련된 바이러스는 특이적 면역반응에 영향을 주기 위해, 바람직하게는 면역반응을 유도하기 위해 생물의 면역계에 제공됨으로써 그 생물을 상기 바이러스에 의한 감염으로부터 보호하기 위해 백신 접종된다.
본 발명의 예방용 조성물 (즉, 백신)의 제조를 위해, 본 발명에 따라 포르말린으로 불활화된 메갈로사이티바이러스는 그대로 백신으로 이용되거나, 생리학적으로 허용가능한 형태로 변환된다. 이는 두창에 대한 백신접종에 사용된 수두 바이러스 백신의 제조에 있어서 경험을 토대로 하여 실시될 수 있다 (Stickl, H. 등에 의해 개시됨. [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392). 백신 주사의 제조를 위해 예를 들면, 바이러스 입자는 앰플 내, 바람직하게는 유리 앰플에서 동결건조된다. 다르게는, 백신 주사는 제제에서 바이러스의 순차적 동결-건조에 의해 생성될 수 있다. 이 제제는 만니톨, 덱스트란, 당, 글리신, 락토오스 또는 폴리비닐피롤리돈과 같은 추가 첨가제 또는 산화 방지제 또는 비활성 가스, 안정화제 또는 생체내 투여에 적합한 재조합 단백질과 같은 다른 보조제를 함유할 수 있다. 이어 유리 앰플을 밀봉하고 4℃ 및 실온 사이에서 몇 개월 동안 저장할 수 있다. 그러나, 다른 요구사항이 없는 한, 상기 앰플은 바람직하게는 -20℃ 미만에서 저장될 수 있다.
본 발명의 치료용 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 개체의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 어류에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 유효량을 결정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 치료용 조성물은 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 개체의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 조성물을 어류에 투여하는 단계를 포함하는, 어류의 메갈로사이티바이러스(Iridoviridae Megalocytivirus, IMV), 바이러스성 신경성 괴사 바이러스(Viral nervous necrosis virus, VNNV) 또는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia, VHSV) 감염을 예방하는 방법에 관한 것이다.
예방접종 또는 치료를 위해, 동결건조물은 0.01 내지 0.5ml의 수용액, 바람직하게는 생리 식염수 또는 트리스 완충액에 용해되며 전신적으로 또는 국소적으로, 즉 복강, 비경구, 피하, 근육내 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 투여경로에 의해 투여될 수 있다. 투여 형태, 복용량 및 투여횟수는 공지된 방식으로 당업자에 의해 최적화될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 이리도비브리대 메갈로사이티바이러스 분리
1-1. IMV subgroup Ⅱ, subgroup Ⅲ 및 subgroup Ⅳ 분리
어류 주화 세포에 감염시키기 위한 IMV(Iridoviridae Megalocytivirus) subgroup Ⅱ, subgroup Ⅲ 및 subgroup IV를 2013년 경상남도 통영의 한 양식장에서 IMV의 감염증상을 보이는 빈사상태의 돌돔(185.4g), 2009년 싱가포르에서 수입된 펄구라미(3.2g) 및 2011년 경상남도 거제의 한 양식장에서 감염증상을 보이는 넙치(323.4g)로부터 분리하였다. 바이러스는 각 감염어의 비장조직을 적출하여 10배 부피의 PBS에서 마쇄한 뒤, 4℃ 10,000g에서 5분간 원심분리하고, 0.2㎛ 시린지 필터(syringe filter)를 통과시켜 여과하였다. 각 바이러스는 MCP(Major capsid protein) 유전자를 이용한 PCR을 통해 확인하였고, 염기서열 분석을 통해 확정 진단하였다. 바이러스 증폭을 위하여 T-25 플라스크에서 3일 동안 배양한 GF-1 주화세포주에 상기에서 여과한 바이러스 시료 10㎕를 접종하여 7일간 배양한 뒤 상등액을 취해 사용 전까지 70℃에 보관하였다.
1-2. 분리한 바이러스의 정량 분석
분리한 바이러스의 정량 분석을 위해 qPCR(quantitative PCR) 분석을 수행하였다. 구체적으로, viral DNA의 분리는 GeneAllⓡ ExgeneTM Tissue SB mini kit (GeneAll)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 분리하였고, 용리(elution) 단계에서 최종 부피가 100㎕가 되도록 분리하여 사용 전까지 -20℃에서 보관하였다. Viral DNA의 absolute qPCR을 위해 2×PreMix (SYBR Green with low ROX, Enzynomics) 10㎕, 0.5pM의 프라이머 및 1㎕의 주형 DNA를 사용하였고, 최종 부피 20㎕가 되도록 하였다. qPCR의 조건은 95℃에서 10분간 반응한 후, 95℃ 10초, 60℃ 15초, 72℃ 20초의 반응을 1 사이클로 하여 40 사이클 반응시켰으며, 마지막 사이클 후에는 모든 반응물에 대하여 72℃부터 95℃까지의 영역에서 용융 곡선(melting curve) 분석을 수행하였다. 아울러, qPCR의 표준 곡선을 작성하기 위해 메갈로사이티바이러스 viral DNA를 주형으로 MCP 유전자의 염기배열을 타겟으로 제작한 qM1F (5'-GGC GAC TAC CTC ATT AAT GT-3') 및 qM1R (5'-CCA CCA GGT CGT TAA ATG A-3')을 프라이머로 이용하여 얻은 141bp의 산물을 TOPO-TA 벡터 (Invitirogen, USA)에 삽입하여 Escherichia coli DH5α에 형질전환시켜 대량 배양한 후, 재조합된 플라스미드를 분리하여 10배 단계 희석 (1x108 내지 1x101copies/㎕)하여 표준곡선(standard curve)을 작성하는데 사용하였다.
실시예 2. 반연속 배양법(SCCCS)을 이용한 주화세포에서의 IMV 생산
주화세포로는 IMV에 감수성을 보이는 참돔지느러미(pagrus major fin, PMF) 세포주 (한국세포주은행 기탁번호 KCLRF-BP-00324), 그루퍼지느러미(Grouper fin, GF-1) 세포주 (ECACC, Australia) 및 블루길자어(bluegill fry, BF-2) 세포주 (ATCC, USA)를 각각 1x105cells/ml가 되도록 T-25 플라스크에 식균한 뒤, 세포가 플라스크 바닥의 80% 이상을 차지하는 식균 5일 이후에 상기 실시예 1-1의 IMV subgroup II 바이러스 상등액 5x105 copies/ml 농도 1ml을 주입하여 2시간 동안 배양기 내에서 Twister (Vision Scientific co., LTD, VS-96 TW)를 사용하여 충분히 흡착 시켰고, 이후 4ml을 첨가하여 25℃에서 배양하였다. IMV 접종 이후 매일 플라스크 내의 상등액을 취하고 100% 새로운 배지로 교환하는 방식으로 세포주를 연속 배양 (SCCCS, semi-continuous cell culture system)하면서, 취한 상등액의 바이러스 농도를 매일 측정하였다. 또한, 10회 연속 배양 후에, 세포 변성을 현미경 (Nikon, Eclipse TS100)으로 확인하였다.
그 결과, PMF 세포주에서 가장 높은 농도의 IMV가 생산되었고, 평균 바이러스 농도는 BF-2, GF-1 및 PMF에서 각각 1.46x105, 4.14x105 및 9.49x106 copies/ml로 나타났다 (도 1). 특히, PMF는 GF-1 및 BF-2보다 100배 이상 더 높은 농도까지 IMV를 생산하였으며, SCCCS 배양 15일에 최대 7x107 copies/ml로 나타났다. 또한, 현미경으로 세포주의 변성을 확인한 결과, 연속배양 10회 후의 세포 변성이 PMF 세포주에서 가장 많이 나타났으며, 이러한 IMV 감염에 의한 PMF 변성에 의해 지속적인 배지 교환에도 세포가 유지되면서 탈착없이 고농도로 바이러스를 생산할 수 있다 (도 2). 이에, 이 후의 SCCCS 배양 방법을 통한 IMV 생산 최적화 실험은 PMF 세포주를 대표 주화 세포주로 사용하여 실시하였다.
실시예 3. 반연속 배양(SCCCS)에서의 배지 교환 최적화
3-1. 배지 교환 주기
PMF 세포주에서 IMV를 SCCCS 배양 방법으로 생산함에 있어서, 배지 교환주기에 따른 바이러스의 생산성을 확인하기 위해, 1일, 3일 및 5일을 주기로 100% 배지 교환 (전체 상등액 수득 후 새 배지 추가)을 실시하였고, 수득한 바이러스는 상기 실시예 1-2의 q-PCR 방법으로 정량분석하였다.
배지 교환 주기(일) 배지 교환 횟수(회) 생산된 총 바이러스 양(viral copies)
1 30 4.87E+09
3 10 6.04E+10
5 6 4.80E+09
그 결과, 1일, 3일 또는 5일 주기로 배지 교환한 경우 모두 정상적인 세포배양이 가능하였고 바이러스도 생산되었지만, 3일을 주기로 배지를 교환한 경우 다른 주기에 비하여 10배 이상 더 높은 바이러스 생산성을 보였다 (표 1). 생산된 총 바이러스는 양은 바이러스 감염 직후부터 30일 동안 수득한 모든 바이러스 상등액 내의 바이러스 양을 나타냈으며, 이 때 생산된 바이러스의 상등액의 양은 1일, 3일, 5일 주기에서 각각 150ml, 50ml 및 30ml였다. 또한, 5일 주기의 배지 교환은 초기에 다소 높은 농도를 보였지만 이후는 세포의 탈락으로 바이러스 생산이 점차 감소하였다 (도 3). 즉, 3일의 배지 교환 주기로 배양할 때의 바이러스 생산성이 가장 높은 것으로 나타나, 이 후 SCCCS 배양 방법에서 배지 교환 주기는 3일로 하였다.
3-2. 배지 교환 비율
SCCCS 배양 방법 중 배지 교환 비율에 따른 IMV의 생산성을 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 3-1에서 조건 수립한 배지 교환 주기 (3일)로 배지를 교환할 때, 새 배지로 교환하는 배지의 비율을 30%, 70% 또는 100%로 구분하여 배지를 교환한 뒤, 수득한 바이러스의 양을 상기 실시예 1-2의 q-PCR 방법으로 정량분석하였다.
그 결과, 모든 비율에서 세포가 유지되고 바이러스의 농도 증가가 관찰되었으나, 배지 교환 비율 30%에서 초반에는 바이러스 농도는 빠르게 올라갔지만 15일 이후에는 점차 세포가 탈락하여 바이러스 농도가 계속해서 감소하였다. 또한, 배지 교환 비율 100%에서는 계속해서 바이러스 농도가 증가하였지만 70% 교환에 비하여 낮은 속도로 증가하여 바이러스 농도 최고치에 도달하는데 70% 및 30% 교환 비율에 비하여 오랜 기간이 소요되었다. 배지 교환 비율 70%에서는 바이러스의 농도가 15일 동안 계속해서 증가하였고 이 후에도 세포의 탈락 없이 바이러스 농도가 유지되었다 (도 4). 이에, 이 후의 실험 중에 SCCCS 배양시 배지 교환 비율은 70%로 최적화하여 이용하였다.
실시예 4. 반연속 배양(SCCCS)에서의 배양 조건 최적화
4-1. 배양 배지 종류
상기 실시예 2 및 3에서 확립된 3일 주기로 배지를 70% 교환하는 SCCCS 배양 방법을 이용한 IMV 생산에 있어서, 배지의 종류, FBS 농도 및 배양 온도의 차이에 따른 바이러스 생산성을 비교하여 배양 조건을 최적화하였다. 그 중 배지의 종류는 L-15, MEM 및 RPMI1640를 비교하였다, 우선 PMF 세포에 각각의 배지로 적응을 시키기 위하여 각 배지로 교환한 이후 열 번 이상 계대배양한 뒤 실험을 진행하였다. 새로운 배지에서 적응된 각각의 PMF 세포는 마지막 계대배양 후 1x105cells/ml로 T-25 플라스크에 주입하여 배양하였고, 세포가 플라스크 바닥의 80% 이상을 차지하게 될 때에 상기 실시예 1-1의 바이러스 상등액을 이용하여 1x105 copies/ml이 되도록 접종하였다. 접종 3일 후, 생산된 바이러스 상등액 70%를 수득하고 수득한 양의 새로운 배지를 분주하여 배양하는 방식 (3일 주기로 배지를 70% 교환)으로 배양하였다. 이와 같은 방식으로 매일 수득한 바이러스의 양을 상기 실시예 1-2의 q-PCR 방법으로 정량분석하였다.
그 결과, 세 종류의 배지 모두에서 유사한 수준의 바이러스 생산성을 보였다 (도 5).
4-2. 우태아 혈청 농도
상기 실시예 2 및 3에서 확립된 3일 주기로 배지를 70% 교환하는 SCCCS 배양 방법을 이용한 IMV 생산에 있어서, 배지의 종류, FBS 농도 및 배양 온도의 차이에 따른 바이러스 생산성을 비교하여 배양 조건을 최적화하였다. 그 중, SCCCS에서 배양 배지의 첨가물로 사용되는 우태아혈청(Fetal bovine serum, FBS)의 적정 농도를 설정하기 위하여 상기 실시예 4-1에서와 동일한 방법으로 세포배양하여 바이러스를 접종하고 3일 주기로 배지를 70% 교환하였다. 이 때, 배지에 FBS를 1%, 5% 및 10%로 첨가하였으며, 생산된 바이러스 상등액의 농도는 q-PCR를 통해 분석하였다.
그 결과, 1%의 FBS를 사용한 군에서는 낮은 농도의 바이러스가 생산되었으며, 배양 15일 이후 세포의 confluency가 50% 이하로 저하되었다. 또한, FBS 농도 5% 및 10%의 그룹에서는 모두 정상적인 세포 배양 상태를 보였고, 유사한 농도의 바이러스가 생산됨을 확인할 수 있었다 (도 6). 따라서 본 발명에서는 경제적인 측면을 고려하려 5%의 FBS을 이용하는 것을 최적화된 배양 조건으로 선택하였다.
4-3. 배양 온도
상기 실시예 2 및 3에서 확립된 3일 주기로 배지를 70% 교환하는 SCCCS 배양 방법을 이용한 IMV 생산에 있어서, 배지의 종류, FBS 농도 및 배양 온도의 차이에 따른 바이러스 생산성을 비교하여 배양 조건을 최적화하였다. 그 중, 최적 세포 배양 온도를 확인하기 위하여, 상기 실시예 4-1에서와 동일한 방법으로 세포배양하여 바이러스를 접종하고 3일 주기로 배지를 70% 교환하면서, 배양 온도를 20, 23, 25, 28 및 30℃로 하여 바이러스의 생산성을 각각 확인하였다. 다른 세포배양 조건은 상기 실시예 4-2에서 최적화된 조건으로 배양하였다.
그 결과, 모든 온도 조건에서 IMV에 감염된 PMF 세포의 SCCCS 배양이 가능함을 확인하였고, 20℃의 조건에서는 바이러스 수율이 현저히 낮게 나타났으며, 30℃에서 배양할 경우 배양 15일 이후에 세포의 탈착이 나타나 바이러스의 농도가 감소되는 결과를 나타냈고, 25℃와 28℃에서 가장 높은 바이러스 생산성을 보였다 (도 7). 이에, 이후의 세포 배양은 25℃에서 실시하였다.
실시예 5. 반연속 배양(SCCCS)을 통한 바이러스의 장기 생산성 확인
PMF 세포주에서 SCCCS(Semi-batch cell culture system) 배양 방법을 이용한 IMV의 생산에 있어서, 상기 실시예들에서 확립한 최적 조건들 (배양 배지: L-15, 우태아혈청(FBS): 5%, 배양 온도: 25℃, 배지 교환 주기: 3일 및 배지 교환율: 70%)로 IMV를 생산성을 확인하였다. 구체적으로, T-flask에 PMF 세포 1x105cells/ml 농도를 식균하고, 세포가 플라스크 바닥의 80% 이상을 차지하는 식균 5일 이후에 상기 실시예 1-1의 IMV subgroup Ⅱ 바이러스 상등액 1ml을 5x105 copies/ml 농도로 주입하여 2시간 동안 배양기 내에서 Twister (Vision Scientific co., LTD, VS-96 TW)를 이용하여 충분히 흡착시켰으며, 이후 4ml을 더 첨가하여 25℃에서 배양하였다. 주기적인 세포수 측정을 위해 동일한 방법으로 동일한 양의 세포에 바이러스를 접종한 10개의 T-flask에서 매회 하나의 플라스크의 세포를 제거하여 측정하였다. 세포수는 배지 교환 15회를 주기로, 0.25% 트립신을 이용하여 플라스크 내의 세포를 모두 탈착한 뒤, 헤모사이토미터로 0.1mm3 내의 세포수가 80-200 세포가 되도록 희석하고 계수하여 1ml내의 세포수를 측정하였다. 바이러스 농도 또한 같은 주기로 상등액을 샘플링하여 DNA 분리한 뒤 q-PCR 분석 방법으로 정량하였다.
그 결과, SCCCS로 배양된 PMF에서 IMV는 최소 4.99x109 copies/ml 및 최대 8.47x109 copies/ml의 농도를 보였고, 하루 생산할 수 있는 평균 바이러스 양은 1.09x1010 copies/day로 나타났다 (도 8). 이 때, 세포의 농도는 평균 3.86x106 cells/ml였고 (도 8), 배지 교환 2O회, 50회 및 100회에도 세포의 감소나 탈락 없이 유지되는 것을 확인할 수 있었다 (도 9). 이 후, 계속되는 배양에서도 세포의 탈락 없이 바이러스를 생산하였다.
실시예 6. IMV 서브그룹별 반연속 배양 생산성 확인
IMV의 각 서브그룹의 바이러스의 SCCCS에 따른 생산성을 확인하기 위하여 실시예 1에서 확보한 subgroup Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ의 분리주를 각각 PMF 세포주에 접종한 뒤 실시예 3 및 4에서 최적화한 방법으로 배양한 뒤 바이러스 생산성을 확인하였다. 또한, 각각의 바이러스 서브 그룹을 접종한 세포의 변성을 현미경으로 확인하였다.
그 결과, 각각 서브그룹의 바이러스 모두 동일한 정도의 세포변성을 나타냈다 (도 10). 또한, 모든 그룹에서 세포가 탈락 없이 유지되었고, IMV subgroup에 상관없이 바이러스의 연속 생산성에서 Subgroup Ⅱ에 대비하여 뚜렷한 차이를 발견 할 수 없었다 (도 11). 이를 통해, 본 발명은 모든 IMV subgroup의 고효율적 생산에 적용할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 7. 용기에 따른 반연속 배양
PMF 세포주에서 SCCCS(Semi-batch cell culture system) 배양 방법을 이용한 IMV의 생산에 있어서, 세포 배양용기에 따른 바이러스 생산성을 확인하였다. 배양 용기는 T-25 플라스크, T-75 플라스크, 55mm 디쉬, Roller Bottles (corning, 850cm2)을 사용하였다. 또한, 배지를 T-75 플라스크에는 15ml, 55mm 디쉬에는 5ml, Roller bottles에는 200ml 첨가하여 상기 실시예들에서 수립한 최적 조건으로 세포 배양을 실시하였다. Roller bottles은 Low Profile Roller Mixer (2.3 inches in Height)를 사용하여 2RPM의 회전속도로 배양하였다. T-25 플라스크와 55m 디쉬에 배양하는 세포에는 바이러스 상등액 1ml을 첨가하여 2시간 동안 흡착이후 배지 4ml을 첨가하였고, T-75 플라스크에 배양하는 세포에는 3ml을 첨가하여 2시간 동안 흡착한 후 배지 12ml을 첨가하였다. 흡착은 Twister (Vision Scientific co., LTD, VS-96 TW)를 사용하였다. Roller bottles에 배양하는 세포에는 100ml의 바이러스 상등액을 첨가한 이후 2시간 동안 2RPM 속도로 흡착시킨 뒤 100ml을 첨가하였다. 모든 용기 내 바이러스 상등액은 3일에 한 번씩 70%의 배지를 교환하여 바이러스를 수득하였고, 각각의 용기에서 30일간 배양기간 동안의 평균 바이러스 농도를 측정하였다.
배지 용량(ml) 평균 바이러스 생산농도(x109copoies/ml)
T-25 Flask 5 6.52
T-75 Flask 15 7.01
55mm Dishes 5 0.95
850cm2 Roller Bottles 200 6.81
그 결과, 모든 용기에서 세포의 정상적인 유지를 확인할 수 있었으나 55mm 디쉬의 경우에는 바이러스 접종 이후 초기 단계에서부터 계속 하여 낮은 CPE를 나타냈다. 또한, 850cm2 Roller bottles을 사용할 경우에도 최대 바이러스농도와 평균바이러스 생산량이 모두 유사하게 나타나 숙주 세포 부착공간의 넓이와 무관하게 본 방법이 활용되는 것을 확인하였다 (표 2).
실시예 8. 계대배양(BCS) 및 반연속 배양(SCCCS)의 바이러스 생산성 비교
종래의 세포주 단순 계대 배양을 통한 바이러스 생산 방법 (Batch culturing system, BCS)을 통한 IMV의 생산성과 본 발명의 반연속 배양(SCCCS) 방법을 이용한 IMV의 생산성을 비교하였다. 구체적으로, 플라스크 내의 PMF 세포주에 105 copies/ml이 되도록 IMV를 접종하고 3일 마다 배지교환을 실시하여 그 횟수가 20회(P20) 이상 되도록 하여 충분한 연속 감염이 유도되도록 하였다. 그 후, 정확한 비교를 위하여 충분하게 연속감염된 것으로 판단되는 세포를 사용하였으며, 구체적으로 BCS 방법을 이용한 실험군으로는 IMV가 감염된 PMF를 대표하는 30회 또는 60회 계대배양한 세포주 (BCS-P30 또는 P60)를 사용하여 7일에 1회씩 계대배양하였고, SCCCS 실험군으로는 상기 실시예들에서 수립한 최적 조건으로 배지 교환을 50회 또는 100회 실시한 세포주 (SCCCS-W50 또는 W100)를 3일에 1회 배지 교환하는 반연속배양 방법으로 각각 21일 동안 배양한 뒤 바이러스의 생산성을 확인하였다.
바이러스생산방법 구분 21일간 바이러스의 생산량(ml) 바이러스의 평균농도(copies/ml)
BCS BCS-P30 15.0 6.17E+08
BCS-P60 15.0 5.93E+08
SCCCS SCCCS-W50 24.5 5.55E+09
SCCCS-W100 24.5 6.97E+09
그 결과, BCS에 의하여 21일간 생성된 바이러스 상등액의 양은 15ml 이었고, SCCCS에 의해 생성된 양은 24.5ml로 1.6배 많은 양의 생산량을 보였으며, 또한 SCCCS 방법이 BCS에 비하여 주어진 기간에서의 생성되는 바이러스 농도 또한 10배 이상 높아 총 생성되는 바이러스의 절대량은 15배 이상 높은 것으로 유추된다 (표 3). 이를 통해, SCCCS 방법을 이용한 바이러스의 생산이 효율적으로 고농도 (high dose)의 메갈로사이티바이러스를 생산할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 9. 반연속 배양 방법으로 생산된 바이러스를 이용한 불활화 백신 제조 및 효과 확인
상기 실시예 1에서 감염된 돌돔으로부터 분리한 IMV(Iridoviridae Megalocytivirus) subgroup Ⅱ을 이용하여 고농도 불활화 백신 (High Dose Iridovirus Inactivated Vaccine, HDIV)을 제작하였다. 구체적으로, 상기 실시예들에서 확립한 최적 조건으로 IMV subgroup Ⅱ를 생산하고, 이를 희석하여 2x109copies/ml로 조절하였다 (SCCCS-IMV-SⅡ). 대조군으로서 동일 배지 및 조건에서 계대배양 방법으로 생산한 바이러스 상등액은 5x108copies/ml 농도의 원액을 사용하였다 (BCS-IMV-SⅡ). 각각의 방법으로 조제 및 생산된 바이러스를 12,000rpm으로 10분 동안 원심분리한 후 4℃에서 2주간 포르말린 0.1% (v/v)로 불활화시켜 백신을 제조하였다 (BCS-IMV-SⅡ 및 HDIV인 SCCCS-IMV-SⅡ). 불활화된 백신 0.1ml를 건강한 돌돔 (어체중 6.98 ± 1.54 g) 20마리에 복강주사 하여 4주간 관찰한 결과 두 가지 백신 접종 그룹 모두 폐사한 개체가 없어, 두 백신 모두 안정성이 있는 것으로 확인되었다.
제작된 백신의 효과를 비교 및 확인하기 위하여, HDIV (SCCCS-IMV-SⅡ 백신) (2x109 copies/ml), BCS-IMV-SⅡ 백신 (5x108copies/ml) 및 PBS (pH 7.2)를 건강한 돌돔 (7.94 ± 1.37 g) 및 참돔 (9.28 ± 2.21 g) 20 마리에 각각 0.1ml 용량으로 복강주사하여 접종하였다. 백신 접종 2주 후에 SCCCS-IMV-SⅡ 바이러스 (1x104 copies/fish)를 복강 주사하여 백신 효과를 확인하였으며, 위 과정을 3번 반복 실시한 뒤 평균 생존율을 확인하였다.
그 결과, 반연속 배양 방법 (SCCCS)으로 생산한 바이러스 백신 (HDIV)의 IMV 감염 예방 효과가 BCS-IMV-SⅡ로 제작된 백신에 비하여 돌돔 및 참돔에서 25% 및 15% 더 큰 것으로 나타났다 (표 4). 또한 1/10로 희석된 HDIV (SCCCS-IMV-SⅡ 백신)에서는 원액을 사용한 BCS-IMV-SⅡ 백신과 유사한 생존률을 나타내, 종래의 계대배양 방식으로 생산된 바이러스에 비해 백신으로 이용하기에 현저하게 유용함을 알 수 있었다.
어종 백신종류 생존율(%) 평균 생존율 (%)
돌돔 SCCCS-HDIV 60 68.33 ± 7.64
75
70
1/10희석된SCCCS-HDIV 40 46.67 ± 7.64
55
45
BCS-IMV 50 43.33 ± 16.07
55
25
1/10 희석된 BCS-IMV 30 23.33 ± 5.77
20
20
Control 0 0.00 ± 0.00
0
0
참돔 SCCCS-HDIV 90 93.33 ± 2.89
95
95
1/10희석된SCCCS-HDIV 75 81.67 ± 5.77
85
85
BCS-IMV 70 78.33 ± 7.64
85
80
1/10 희석된 BCS-IMV 60 68.33 ± 7.64
70
75
Control 25 48.33 ± 2.89
30
30
실시예 10. MCB 부착용 어류 바이러스 준비
메갈로사이티바이러스(Iridoviridae Megalocytivirus, IMV), 바이러스성 신경성 괴사 바이러스(Viral nervous necrosis virus, VNNV) 및 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia, VHSV)는 각각 현장에서 감염된 어류로부터 분리하였다. 구체적으로, IMV는 2013년 경상남도 통영의 한 양식장에서 감염증상을 보이는 돌돔(185.4 g)으로부터, VNNV는 2014년 부산광역시 기장에서 감염증상을 보이는 넙치(231.2 g)로부터, VHSV는 2013년 경상북도 포항에서 감염증상을 보이는 넙치(183.3 g)로부터 얻어졌다. 각 감염어에서 조직 내 IMV와 VHSV가 가장 높은 것으로 알려진 비장조직과 VNNV가 가장 높은 것으로 알려진 뇌 조직을 적출하여 10% w/v 농도로 PBS에서 마쇄한 뒤, 4℃ 10,000g로 5분간 원심분리하고, 0.2㎛ syringe filter를 통과시킨 이후 10㎕를 취하여 T-25 플라스크에서 각 세포를1x105cells/ml 농도를 주입하여 5일간 배양한 어류 주화세포주 PMF, E-11 및 EPC에 각각 IMV, VNNV, VHSV를 접종하였고, 7일간 바이러스를 증식시킨 후 상등액을 사용 전까지 70℃에 보관하였다.
실시예 11. 어류 주화 세포의 MCB 부착
어류 주화 세포주인 PMF(Pargus major fin), GF-1(Grouper fin cell), BF-2(Blue gill fry), EPC(Epithelioma pap㎕osum cyprinid) 및 E-11(a clone of the cell line SSN-1) 세포주를 항생제 (penicillin 100 IU/ml, streptomycin 100 ㎍/ml) 및 10% FBS (Gibco)가 첨가된 L-15 배지 (Sigma Aldrich)에서 25℃ 조건으로 T-75 플라스크(flask)에서 배양하였다.
MCB(micro carrier bead)는 Cytodex 1, Cytodex 3, Cultispher 또는 Rapidcell를 제조사의 추천방법에 따라 준비하여 사용하였다. 각 마이크로캐리어의 농도는 5mg/ml의 농도로 사용하였고, Cultispher 1은 1mg/ml 농도로 사용하였다. 분말 상태의 마이크로캐리어는 spinner 플라스크 용량에 맞춰 적정량을 정량하고, PBS를 이용하여 상온에서 3시간 이상 수화시켰으며, 이 과정 중에 MCB를 침전시켜 PBS를 제거하고 새로운 PBS로 채우는 과정을 2~3회 반복하였다. 이후 멸균기로 멸균하고 사용하기 전에 PBS를 제거하고 세포 배양용 배지 (L15)로 2~3회 세척 후 사용하였다.
상기에서 플라스크에 배양된 어류 세포주의 배양액을 모두 제거하고 각 플라스크에 트립신 0.25%(v/v) 500㎕를 주입하여 25℃에서 5분간 반응시킨 이후 세포를 모두 떼어내었다. 이후 트립신을 제거하기 위하여 10ml의 배양 배지를 이용하여 희석하고 50ml의 튜브에서 혼합하였다. 세포를 모으기 위해 원심분리기 (Hanil, Combi-514R)를 이용하여 500g에서 원심분리 하였다. 원심분리 후 상등액을 모두 제거하고 펠릿을 PBS 20ml로 희석하여 hemocytometer (Supe rior, Hausser ultra plane)로 세포를 계수하고 spinner 플라스크 내에 1x105 cells/ml의 농도로 주입하였다. 이와 동시에 상기에서 배양 배지로 세척한 비드를 배양 배지와 함께 전량 주입하고, 우태아혈청을 최종농도 10% (v/v)가 되도록 첨가하였다. 이후 Spinner 플라스크의 용량에 맞춰 적정 용량의 배양 배지를 첨가해 주고 제조사에서 추천한 방법인 저속 교반기 (Misung, MSD24) 60rpm 으로 25℃ 인큐베이터 내에서 배양하였다.
실시예 12. MCB에 부착된 어류 주화세포 배양조건의 최적화
상기 실시예 11에서 MCB에 부착한 각각의 어류 주화세포들을 제조사에서 추천하는 조건인 1x105cells/ml의 농도로 100ml Spinner flask에서 60RPM의 교반 속도에서 배양하였다. 그러나, 상기 조건으로 세포 배양을 한 경우, 배지의 영양성분의 저하 및 pH 변화 등으로 인하여 지속적인 세포의 성장이 나타나지 못했고, 주기적인 배지의 교환이 필요하였다. 이에, Cytodex 1 (MCB)에 부착한 PMF 세포주를 이용하여 배양 조건을 하기와 같이 최적화하였으며, 최적화된 조건에서 다른 어류 세포주(GF-1, BF-2, E-11 및 EPC)의 배양 가능 여부를 확인하였다.
12-1. 배지 교환 주기
상기 실시예 11에서 MCB에 부착한 각각의 어류 주화세포들을 배양함에 있어서, 배지를 매회 70%(v/v)씩 새 배지로 교환하면서, 배지 교환 주기를 1일, 3일 및 5일로 구분하여 세포 성장성을 MTT 분석 방법을 이용한 세포수 측정을 통해 확인하였다. 구체적으로, Cytodex 1에 부착한 PMF 세포를 96 웰 플레이트에 1x106cells/ml농도에서부터 1/2배로 단계 희석하여 주입하였고, 24시간 배양 이후 헤모사이토미터를 이용하여 세포수를 계측하였다. 이와 동시에 MTT assay 방법으로 CCK-8을 이용하여 450nm에서의 흡광도를 측정하여 각 흡광도에 따른 세포수의 표준 곡선을 제작하였다. 이후 비드 내 세포는 플라스크 내의 일부 비드를 샘플링하여 CCK-8을 이용하여 흡광도 측정하였고, 위의 표준곡선에 따라 세포를 계수하여 플라스크 내의 전체 세포수를 측정하였다.
그 결과, 1일 및 3일 주기로 배지 교환하는 경우 1.11x106cells/ml 및 1.06x106cells/ml로 비슷한 세포성장을 보였고, 5일 주기로 배지를 교환하는 경우에는 세포 배양이 다소 낮은 농도로 나타났다 (표 5). 이는 다른 세포주들에서도 유사하게 나타났다.
12-2. 교반 속도
상기 실시예 11에서 MCB에 부착한 각각의 어류 주화세포들을 배양하면서, 교반 속도에 따른 세포수를 상기 실시예 12-1의 방법으로 확인하였다. 교반 속도는 30, 60, 90 또는 120 RPM 으로 구분하였다.
그 결과, MCB에 부착한 각각의 어류 주화세포들은 30, 60, 90 및 120 RPM 에서 모두 1x106cells/ml 전후의 세포수를 나타내 배양이 잘 이루어지고 있음을 알 수 있었고, 특히, 60 RPM에서 12일 이후 세포수 1.06 x 106cells/ml로 나타나 가장 높은 세포 생산성을 보였다 (표 5).
12-3. Spinner flask 용량
상기 실시예 11에서 MCB에 부착한 각각의 어류 주화세포들을 100mll, 250ml 및 500ml의 Spinner 플라스크에서 배양하면서 세포수를 확인하였다.
그 결과, MCB에 부착된 세포주는 다양한 규격의 Spinner flask에서 모두 잘 성장하는 것을 알 수 있었다 (표 5).
12-4. 혈청의 종류 및 농도
상기 실시예 11에서 MCB에 부착한 각각의 어류 주화세포들을 배양하는 배지에 첨가되는 혈청의 종류 및 농도별 세포 성장 정도를 확인하였다. 구체적으로, FBS(Fetal bovine serum)를 0%, 1%, 5% 및 10%, 또는 NCS(New born carp serum)를 5% 및 10% 첨가하여 배양한 뒤, 상기 실시예 12-1에서와 같이 세포 생산성을 확인하였다.
그 결과, FBS(Fetal bovine serum)를 첨가하는 것이 NCS (New born carp serum)를 첨가하는 것보다 높은 세포 생산성을 보였으며, FBS는 10% 및 5% 농도에서 잘 성장하였다 (표 5).
12-5.세포 농도
MCB에 세포 부착시 초기 접종하는 세포 농도에 따른 세포배양 효과는, 최대 세포수에 도달하는 시간은 세포 농도에 따라 다소 차이가 있었으나, 모두 최대 세포수로 도달하였다 (표 5).
12-6.배양온도
MCB에 부착된 PMF 세포주의 세포 배양 온도에 따른 세포 배양 효과를 확인한 결과, 배양 온도 22℃, 25℃ 및 28℃에서 모두 배양 가능하였고, 25℃에서 가장 좋은 세포 배양 효율을 보였다 (표 5).
배지 교환주기 12일 배양 이후 세포수(x106cells/ml)
1일 1.11
3일 1.06
5일 0.89
교반속도 (RPM)
30 0.84
60 1.06
90 0.97
120 0.67
Spinner flask 용량
100ml 0.87
250ml 1.06
500ml 1.17
혈청 종류및 농도
FBS 10% 1.12
FBS 5% 1.06
FBS 1% 0.54
FBS 0% 0.22
NCS 10% 0.72
NCS 5% 0.43
초기 세포 농도 (Cells/ml)
1x106 1.73
5x105 1.44
1x105 1.06
5x104 0.62
배양온도 (℃)
22 0.77
25 1.06
28 0.65
상기 실시예 12-1 내지 12-6을 통해, MCB에 부착된 어류 세포주의 최적 배양 조건을 배지 교환 주기 3일, 교반 속도 60RPM, 250ml Spinner flask, FBS 5% 혈청이 포함된 L15 배지, 초기세포 농도 1x105cells/ml, 세포배양 온도 25℃로 수립하였다. 이 최적화된 조건은 PMF 세포주 뿐만아니라 본 발명에서 사용한 모든 어류세포주 (GF-1, BF-2, E-11 및 EPC)에서 모두 1 x 106cells/ml 이상의 현저한 세포 배양 효율을 보였다.
실시예 13. MCB에 부착된 어류세포의 부착 및 성장 향상 조건 수립
13-1. 초기 교반 속도에 따른 세포 부착 및 증식 확인
초기 배양에서 고속의 교반은 세포의 부착, 증식 및 성장에 좋지 않은 영향을 미치기 때문에, MCB에 부착된 세포주들의 부착력 및 성장능을 향상시키기 위한 조건으로 초기 교반 속도를 일정시간 동안 교반을 하고 멈추는 조건들로 반복하여 세포의 부착 및 증식을 확인하였다. 대조군 배양은 실시예 12에서 최적화된 교반 속도인 60 RPM으로 실시하였고, 실험군 1은 60RPM 교반 및 정지 (1분/ 4분)를 2시간 동안 반복하였으며, 실험군 2는 30RPM 교반 및 정지 (1분/ 4분)을 2시간 동안 반복하였다.
그 결과, 세 가지 세포주 모두 1일차에 실험군 1 및 실험군 2의 세포주의 MVB로의 부착률이 대조군에 비해 30% 이상 증가하였으며, 세포가 MCB에 매우 고르게 부착되었다 (표 6). 또한, 이러한 세포 부착률의 증가는 세포의 증식에 영향을 미쳐 시험군 1과 대조군과 비교해 볼 때, 배양 7일 후 세포수는 PMF 세포주에서 최대 1.46배, GF-1 세포주에서는 최대 1.38배 및 EPC 세포주에서는 최대 1.25배 증가하는 효과를 나타냈다 (표 6).
세포주 종류 1일 째 부착률(%) 3일 째 부착률(%) 6일 째 부착률(%) 배양 12일 후 세포수 (x 105 cells/ml)
PMF 대조군 60 80 90 9.7
실험군1 90 96 98 14.2
실험군2 90 94 94 13.6
GF-1 대조군 58 76 82 11.2
실험군1 90 94 96 15.4
실험군2 86 96 98 13.8
EPC 대조군 68 82 88 12.4
실험군1 94 96 98 15.5
실험군2 90 98 98 14.4
13-2. 어류 유래 추출물 첨가로 인한 세포 성장 및 바이러스 생산성 확인
13-2-1. 세포 성장 확인
보다 더 향상된 세포배양을 위하여 기존의 5% FBS와 함께 어류 (돌돔, 참돔 또는 넙치) 유래의 혈청(serum), 근육 추출물 및 난황추출물 (돌돔 또는 참돔 유래)을 각각 농도별로 첨가하여 세포의 MCB로의 부착 및 성장 향상 효과를 확인하고자 하였다. 구체적으로, 각 첨가물의 제조 방법은 다음과 같다. 어류 유래 혈청을 얻기 위해 각 10마리의 돌돔(210.4 ± 56.2g), 참돔 (354.1 ± 83.3g), 넙치(282 ± 78g)를 준비하였고, 10ml 주사기를 이용하여 미부정맥 채혈법으로 채혈한 혈액을 10,000 RPM에서 원심분리 (Gyrogen, Gyro 1524M) 이후 혈청을 분리하였다. 또한 근육추출물을 제작하기 위하여 비늘과 외피를 제거한 근육부를 homogenizer (PolytronPT 1200E)로 10%(w/v) 농도가 되도록 TBS(Tris-buffered saline, 50mM Tris, 0.9% NaCl, pH 7.6)를 첨가한 이후 3분간 마쇄하였다. 이후 50ml 튜브로 옮겨 3500rpm으로 10분간 원심 분리하였고, 상등액만 모아 다시 10,000 RPM으로 원심분리하여 상등액만 추출하였다. 혈청과 근육추출물 모두 0.45㎛ 시린지 필터를 이용하여 통과시킨 것을 사용전까지 -20℃에 보관하였다. 아울러, 난황추출물은 돌돔과 참돔 친어로부터 부화된 부화자어를 사용하여, PBS로 충분히 세척한 이후 PBS와 1:1(w/v)로 혼합하여 homogenizer로 마쇄하고 3,500rpm에서 상등액만 추출한 이후 10,000rpm에서 한 번 더 상등액을 모아 0.45㎛ 필터를 통과시킨 것을 사용하기 전까지 -20℃에 보관하였다.
상기와 같이 제조한 어류 유래 추출물이 유효한 농도구간 확인을 위하여 선행실험을 통해 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.5% 및 1%의 처리농도 구간을 설정하였다. PMF 및 EPC 세포주를 MCB와 혼합하여 마이크로캐리어 비드와 각각의 세포주를 부착한 뒤 실시예 12 및 13-1에서 최적화한 배양 방법으로 각각의 농도별 첨가물을 포함한 세포 배양 배지를 이용하여 세포배양을 7일간 실시하였고, 배지 교환을 3일 마다 할 때에도 같은 조건의 첨가물이 포함된 배지를 사용하였다.
그 결과, 0.5 및 1.0 % 농도의 어류 유래 혈청 실험군은 7일간 세포배양 결과 9.19x105cell/ml 및 12.97x105cell/ml로 나타나, 같은 기간 동안의 대조군에 비하여 최대 2배 이상의 세포 성장을 보였다 (표 7). 또한, 근육추출물를 1.0 및 1.5%(v/v)로 처리한 실험군은 7일간 세포 배양한 결과 세포수가 8.07x105 cell/ml 및 9.15x105 cell/ml로 나타나 최대 1.5배 가량 증가하는 효과를 나타냈다. 아울러, 0.5 및 1.0 % 농도의 난황추출물 첨가한 실험군은 7일간 배양한 세포 농도가 10.37x105cells/ml 및 10.80x105cells/ml로 나타나, 대조군에 비해 최대 1.8 배 정도의 세포 성장 향상 효과를 나타냈다 (표 7). 같은 방법으로 실험한 EPC 세포주에서도 FBS를 첨가한 대조군에 비하여 최대 1.8배 및 1.3배의 세포 성장 촉진 효과를 나타냈다.
세포주-바이러스 종류 유래 어종 농도(%) 배양 7일 후 세포수 바이러스 감염 7일후 농도
(1x105cells/ml) (1x107copies/ml)
PMF-Megalocytivirus FBS 0.05 5.91
0.1 5.85 1.58
0.5 6.07 1.28
1.0 6.10 1.87
1.5 6.11
혈청 돌돔 0.1 8.68
0.5 12.71 9.21
1.0 10.03
참돔 0.1 6.52
0.5 9.19 9.67
1.0 10.38
넙치 0.1 7.27
0.5 11.57 6.55
1.0 12.97
근육추출물 돌돔 0.5 7.12
1.0 9.10 3.21
1.5 9.12
참돔 0.5 6.58
1.0 9.15 4.51
1.5 9.10
넙치 0.5 6.19
1.0 8.14 3.10
1.5 8.07
난황추출물 돌돔 0.05 7.81
0.1 10.37 6.14
0.2 10.44
참돔 0.05 6.66
0.1 10.48 7.51
0.2 10.80 .
13-2-2. 바이러스 생산성 확인
상기 실시예 13-2-1을 통해, 0.5% 농도의 어류 혈청, 1.0% 농도의 어류 근육추출물 및 0.1% 농도의 난황추출물을 첨가하여 배양한 경우 향상된 세포 배양 현상을 나타내, 첨가물의 농도를 각각 0.5%, 1.0% 및 0.1%(v/v)로 결정하였다. 또한, 이와 같은 첨가물로 인해 MCB-부착 세포주에서의 바이러스 생산능의 변화를 확인하기 위하여, MCB에 각각 부착된 PMF 및 EPC 세포주에 각각 감수성을 나타내는 IMV(Iridoviridae Megalocytivirus) 및 VHSV(Viral Hemorrhagic Septicemia)를 각각 접종한 뒤, 7일 후에 바이러스 농도를 확인하였다. 바이러스의 농도는 qPCR(quantitative PCR) 방법으로 확인하였다. 구체적으로, 바이러스의 DNA를 GeneAllⓡ ExgeneTM Tissue SB mini kit (GeneAll)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 분리하였고, 최종 부피가 100㎕가 되도록 용리(elution)한 뒤 20℃에서 보관하였다. 또한, 바이러스의 RNA는 RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 분리한 뒤, 최종 50㎕의 Rnase free water를 사용하여 현탁하였다. 분리한 RNA는 cDNA 합성을 위하여 M-MLV reverse transcriptase 0.5㎕ (Promega) 5xbuffer 2㎕, dNTP 0.5㎕, specific primer 1㎕ 및 추출된 RNA 3㎕를 넣고 총 부피가 10㎕가 되도록 Nuclease-free water를 첨가한 후, 45℃에서 60분, 99℃에서 10분간 반응시켰다. 제작된 cDNA는 이후 qPCR 주형으로 사용하였고, 사용 전까지 -80도에 보관하였다. Viral DNA 또는 RNA의 absolute qPCR을 위해 2×PreMix (SYBR Green with low ROX, Enzynomics) 10㎕, 0.5pM의 각각의 바이러스 특이적 프라이머 1㎕ 및 1㎕의 주형을 사용하였고, 최종 부피가 20㎕가 되도록 하였다. qPCR의 조건은 95℃에서 10분간 반응한 후, 95℃ 10초, 60℃ 15초 및 72℃ 20초의 반응을 1 사이클로 하여 40 사이클을 반응시켰으며, 마지막 사이클 후에는 모든 반응물에 대하여 72℃부터 95℃까지의 영역에서 melting curve를 분석하였다.
그 결과, 어류 유래 첨가물의 처리에 의해, IMV를 접종한 MCB에 부착된 PMF 세포주는 대조군에 비하여 4.8 내 7.2배 이상 높은 바이러스 생산성을 (표 7), VHSV를 접종한 MCB에 부착된 EPC 세포주는 대조군에 비하여 3.2 내지 4.2배 높은 바이러스 생산성을 나타냈다 (표 8).
세포주-바이러스 종류 유래 어종 농도(%) 배양 7일 후 세포수 바이러스 감염 7일후 농도
( x 105cells/ml) ( x 107copies/ml)
EPC-VHS FBS 0.05 7.42
0.1 7.31 1.66
0.5 7.66 1.38
1.0 7.99 1.49
1.5 8.15
혈청 돌돔 0.1 8.03
0.5 10.76 5.82
1.0 9.53
참돔 0.1 7.65
0.5 11.66 5.56
1.0 12.42
넙치 0.1 7.20
0.5 12.24 4.85
1.0 9.10
근육추출물 돌돔 0.5 7.51
1.0 9.21 2.24
1.5 9.51
참돔 0.5 7.29
1.0 10.40 3.49
1.5 9.18
넙치 0.5 7.94
1.0 9.87 2.98
1.5 9.19
난황추출물 돌돔 0.05 7.85
0.1 9.17 4.46
0.2 8.06
참돔 0.05 7.24
0.1 8.08 3.22
0.2 9.25
이에, 이 후의 실험에서는 실시예 3에서 최적화된 배양 조건과 함께 실험구 1의 초기 교반속도와 참돔 혈청 0.5%를 첨가한 배지를 기본 배양 조건으로 하였다.
실시예 14. 비드 종류별 어류 세포주의 부착능 확인
상기 실시예들에서 수립한 최적 조건으로 다양한 종류의 MCB들에서 PMF 세포주를 배양하고 부착능을 부착 세포수로 확인하였다. 구체적으로, MCB는 Cytodex1, Cytodex3, Cultispher 및 Rapidcell (표 9)이다. 예비 실험에서 비드의 농도 증가가 배양세포의 수를 증가시킬 수 있으나 비드의 농도 증가에 의해 교반시 비드들끼리 충돌하여 오히려 효율이 떨어지는 것을 확인하였으며, 이를 통해 각각의 MCB에서의 적정 농도를 구한 결과, Cytodex 1, Cytodex 3 및 Rapidcell은 5 mg/ml로, Cultispher는 1 mg/ml로 확인되었다. 상기 적정 농도의 비드에 PMF 세포주를 부착하여 배양하면서 3일 간격으로 세포수를 확인하였으며, 세포 부착 후 배양 12일 후의 세포 부착 비드를 현미경으로 확인하였다 (도 12 및 13).
종류 제조사 크기(㎛) 물질 비드 밀도(g/cm3) 비드 표면적(cm2/g) 비드수(bead/g)
최소-최대 평균
Cytodex 1 GE Healthcare 131-220 190±58 Dextran 1.03 4400 4.30E+06
Cytodex 3 GE Healthcare 133-215 175±36 Collagen coated, 1.04 2700 3.00E+06
Cultispher PercellBiolytica 130-380 225±125 Cross linked gelatin, Macroporous 1.02-1.04 7500 1.00E+06
Rapidcell ICNPharmaceuticals 150-210 Polystyrene 1.02 - -
세포수를 확인한 결과, Cytodex 1, Cytodex 3, Cultispher 및 Rapidcell에서 생산된 세포를 배양액 (ml) 기준으로 나타낸 배양 12일 이후 세포수는 각각 27.1x106cells/ml, 21.4x106cells/ml, 17.37x106cells/ml 및 10.96x106cells/ml로 나타나 Cytodex 1 비드의 세포 부착 및 증식능이 가장 우수한 것으로 나타났다 (도 14). 또한, 생산된 세포를 비드의 표면적(mm2) 기준으로 나타낸 결과에서는 Cultispher가 가장 우수하였다 (도 15). 아울러, 각 비드 종류별 표면적(mm2)에 따른 세포수, 비드 하나에 부착되는 평균 세포수 및 비드 무게(mg) 당 세포수를 계산한 결과를 표 10에 나타냈다.
실험군 배양 12일 후 세포수 (106 cells/ml) 플라스크 내 전체 세포수 (cells/flask) 비드당 세포수(cells/bead) 비드 표면적당 세포수 (cells/mm2) 비드 mg 당 세포수 (cells/mg)
Cytodex 1 실험 1 2.71 6.78E+08 126.14 1.23E+05 5.42E+05
실험 2 2.59 6.48E+08 120.56 1.18E+05 5.18E+05
실험 3 2.48 6.20E+08 115.35 1.13E+05 4.96E+05
평균 2.59 6.48E+08 120.56 1.18E+05 5.18E+05
Cytodex 3 실험 1 2.15 5.38E+08 143.47 1.59E+05 4.30E+05
실험 2 2.24 5.60E+08 149.33 1.66E+05 4.48E+05
실험 3 1.97 4.93E+08 131.47 1.46E+05 3.94E+05
평균 2.12 5.30E+08 141.33 1.57E+05 4.24E+05
Cultispher 실험 1 1.73 4.34E+08 1736.00 2.31E+05 1.74E+06
실험 2 1.54 3.86E+08 1544.00 2.06E+05 1.54E+06
실험 3 1.88 4.72E+08 1888.00 2.52E+05 1.89E+06
평균 1.72 4.31E+08 1724.00 2.30E+05 1.72E+06
Rapidcell 실험 1 1.09 2.74E+08 - - 2.19E+05
실험 2 0.85 2.14E+08 - - 1.71E+05
실험 3 1.24 3.10E+08 - - 2.48E+05
평균 1.06 2.66E+08 - - 2.13E+05
실시예 15. MCB에 부착된 어류 세포주별 세포 성장 정도 확인
상기 실시예 14에서 세포 부착 및 증식능이 가장 우수한 것으로 나타난 Cytodex 1 (5mg/ml)를 이용하여 PMF, GF-1, BF-2, E-11 및 EPC 세포주를 각각 부착 및 배양하였다. 각각의 세포는 1x105cells/ml가 되도록 배양하였으며, 상기 실시예들에서 수립한 최적 조건으로 배양을 실시하였다. 또한, 어류 세포주를 부착하고 12일 동안 배양한 후 각각의 세포주의 모습을 현미경으로 확인하였다 (도 16).
그 결과, 각각의 세포 주는 도 17에서와 같은 세포성장을 보여 약 12일 이후부터 최고 농도를 나타냄을 확인할 수 있었다.
실시예 16. MCB를 이용하여 배양된 어류 주화세포에서의 어류 바이러스 생산
Cytodex 1에 PMF, GF-1, EPC 및 E-11 세포 1x105cells/ml를 각각 부착한 뒤 250ml Spinner 플라스크에서 배양하였다. 세포 배양 15일 이후 각 세포 주에 감수성을 보이는 바이러스를 접종하였다. 구체적으로, PMF 및 GF-1 세포주는 IMV를, EPC 및 E-11 세포는 각각 VNNV 및 VHSV를 1x105copies/ml 농도가 되도록 접종하였다. 바이러스 접종 후 배지 교환 없이 15일간 배양하였고, 이를 현미경으로 관찰하여 세포 변성을 확인하였다. 또한, 배양 중에 3일 내지 4일 간격으로 세포수를 측정하고, 배양 상등액을 샘플링하여 바이러스 농도를 측정하였다. VHSV는 배양 최적 조건이 20℃ 이므로, EPC 세포주는 바이러스 접종 이후 20℃에서 배양하였다.
그 결과, 도 18 및 19에 나타낸 바와 같이, VNNV 및 VHSV를 접종한 E-11 및 EPC의 경우 감염 7일 이후 세포의 탈락과 용해가 나타나 세포의 수가 빠르게 감소되었고, 이 시기에 바이러스 농도는 크게 증가하였다. 또한, IMV를 접종한 PMF와 GF-1의 경우 세포 변성효과는 보였지만 세포의 탈락은 나타나지 않았고, 많은 세포가 MCB에 부착되어 있었고 바이러스 농도는 점차 증가하였다. 특히, MCB-부착 PMF가 세포수도 감소하지 않으면서 높은 농도의 바이러스 생산을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 17. MCB 부착 어류 세포주의 subculture 및 scale-up
MCB 부착 어류 세포주의 세포수 증가를 위하여 MCB에 배양된 세포를 나누는 방법으로 subculture와 scale-up 방법의 두 가지 방식이 존재하며, 본 발명에서는 같은 용량의 플라스크로 기존의 MCB에 부착된 세포를 나누는 과정을 subculture라 하고 세포가 부착된 MCB 전체를 낮은 용량의 플라스크에서 높은 용량의 플라스크로 옮겨 가는 과정을 scale-up 이라고 정의하였다.
subculture의 경우 250ml의 플라스크에 상기의 실시예들에서 최적화된 방법으로 MCB에 부착된 PMF 세포주를 배양하고, 배양 15일 이후 기존에 배양된 세포 부착된 MCB 5mg/ml이 포함된 배지 125ml과 새로운 MCB 5mg/ml이 포함된 배지 125ml을 혼합하는 1;1(v/v) subculture 과정과 기존에 배양된 세포 부착된 MCB 5mg/ml이 포함된 50ml과 새로운 MCB 5mg/ml이 포함된 배지 200ml을 혼합하는 1:4(v/v) subculture 과정을 각각 실시하였다. 새로운 비드의 첨가 이후 동일한 세포 배양 방법으로 60rpm 교반 1분 후 4분 정지하는 과정을 2시간 동안 반복하였고, 이후 MCB에 세포가 부착된 비율을 3일 간격으로 측정하여 표 11에 나타내었다.
Scale-up의 경우 MCB-부착 세포주를 작은 용량의 플라스크에서 큰 용량의 플라스크로 옮기면서 (10ml→ 50ml → 500ml) 배양을 실시하였다. 구체적으로, 상기의 실시예들에서 최적화된 방법으로 MCB에 부착된 PMF 세포주를 10ml 배양하고, 배양 15일 이후 50ml (5배 scale-up)하였다. 5배 scale-up 후 21일 이후 10배 scale-up (500ml)을 실시하였다. 이후 세포수의 증가를 플라스크 내의 전체 세포수로 나타내었다 (도 20).
아울러, subculture와 scale-up에서 최종 생산된 세포를 대상으로 PMF에 감수성을 보이는 바이러스인 IMV를 플라스크 내에 1x105 copies/ml 농도가 되도록 접종하였고, 15일 이후 바이러스 농도를 측정하였다.
마이크로캐리어에서 subculture 이후 세포 부착률 (%)
Pre culture 배양 기간 Subculture 이후 배양 기간
0 3 6 9 12 15 3 6 9 12 15 18 21
Pre culture 0 88.0 92.0 95.5 98.5 98.5
1:1 subculture 41.0 65.7 85.7 97.9 95.9 97.7 99.0 99.2
1:4 subculture 18.5 37.5 64.7 86.4 92.7 95.1 97.8 99.2
그 결과, subculture 이후 새 MCB로 세포가 90% 이상 부착되는 비율은, MCB-부착 세포주 및 추가하는 새 비드의 비율 1:1 및 1:4에서 9일 및 15일로 확인되었고 (표 11), 최종 세포 수는 두 그룹에서 15일 후, 21일 후에 모두 2x106 cells/ml이상 도달하였다. scale-up의 경우 scale-up 이후 세포 부착률 및 세포 농도가 계속해서 증가하였고, 10배의 scale-up의 이후에 최종 1x109cells/flask 이상의 세포가 생산되었다 (도 20). 또한, subculture 또는 scale-up으로 생산된 MCB-PMF에 바이러스를 각각 접종하고 12일 이후 확인한 결과, 모두 5x109 copies/ml 이상의 바이러스가 생산되었다. 특히 scale-up 방법을 통해서는 매 3일 마다 350ml의 바이러스가 생산 가능하였다.
따라서, 이와 같은 scale-up 방법을 이용한 마이크로캐리어 비드 부착된 세포의 배양은 세포 및 바이러스의 대량 생산에 적합하고 이렇게 생산된 바이러스로 제작된 백신은 양식현장에 직접 사용될 만큼의 많은 양인 것을 알 수 있다.
실시예 18. MCB에 부착된 PMF 세포주에서의 IMV 반연속배양
18-1. 배지 교환 주기에 따른 반연속 배양
상기 실시예 17의 MCB에 부착된 PMF 세포주의 경우 바이러스 농도 또한 계속해서 증가하는 전형적인 연속 감염의 특성을 보였으며, 바이러스 감염 이후에도 일정기간 이상 세포가 변성 없이 유지되는 특성을 나타냈다. 이에, 바이러스 감염 이후에도 장기간 동안 세포의 성장과 바이러스의 생산이 연속적으로 이루어지게 하는 적정화 실험을 수행하였다. 구체적으로, 250ml Spinner 플라스크에서 cytodex 1 (5mg/ml)에 PMF 세포를 부착하고 15일 동안 배양하였다. 그 후, 1x105copies/ml의 IMV로 감염시켜 IMV에 감염된 MCB-PMF 세포주를 얻었다. 이 후, 본원발명의 최적 세포 배양 조건으로 배양하면서 세포배양액 (바이러스)을 수득하고 새 배지를 첨가하는 배지 교환을 실시하는 반연속적 배양 방식(Semi-continuous Microcarrier culturing system, SCMCS)을 적용하여 연속 감염된 세포주로부터 바이러스의 지속적인 생산이 이루어지게 하였다. 이를 위해, 바이러스 감염 이후 배지 교환 주기를 1일, 3일 및 5일 (SCMCS-1day, SCMCS-3day 및 SCMCS-5day)로 조절하여 세포수의 변화와 생산 바이러스 농도의 변화를 확인하였다.
그 결과, 배지 교환과 바이러스 수득을 1일 주기로 실시할 경우 숙주세포는 지속적으로 유지되나 바이러스의 농도가 일정 수준 이상 증가하지 못하였다. 3일 주기로 배지 교환을 실시하는 경우에는 세포 배양이 지속적으로 가능하였으며, 세포의 증식에 어떤 뚜렷한 영향을 미치지 않았고, 배지 내 생산된 바이러스의 농도는 일정기간 동안 증가하여, 1x109~1x1010copies/ml의 고농도로 유지되었다. 이러한 바이러스의 생산은 30회 이상 실시된 반연속적 배양에서도 지속적으로 나타났으며, 장기간 실시 이후에는 약간의 세포변성과 일부세포의 탈락이 관찰되기도 했으나, 비드 내에서 새로운 세포의 성장에 의한 지속적 보상이 이루어지면서 숙주세포와 바이러스 생산은 계속해서 유지되었다. 5일 주기로 배지 교환을 실시한 경우 초기 바이러스 증가량은 높았으나, 배양 10일 이후부터 숙주세포의 수가 계속 감소하여 지속적인 배양이 어려웠고, 생산된 바이러스 농도 또한 감소하였다 (도 21).
18-2. MCB 종류에 따른 반연속 배양
상기 실시예 18-1의 MCB-부착 PMF 세포주의 연속 배양이 다른 종류의 MCB (Cytodex1, Cytodex3, Cultispher 및 Rapidcell)에 부착되어서도 가능한지 확인하였으며, GF-1 세포주와도 세포수 및 생산 바이러스 농도를 비교하였다. 세포수는 12일 이후 측정하여 나타내었고, 세포 배양 15일 이후 바이러스를 접종하여 12일 이후의 바이러스 농도를 나타내었다 (표 12).
12일 이후 세포수(x105cells/ml) 감염 12일 이후 바이러스 농도(x 108 copies/ml)
Cytodex 1 PMF 21.90 9.47
GF-1 24.50 0.25
Cytodex 3 PMF 18.00 6.08
Cultispher PMF 15.60 8.90
GF-1 17.5 0.16
Rapidcell PMF 8.54 5.39
그 결과, 다양한 MCB (Cytodex1, Cytodex3, Cultispher 및 Rapidcell)에 부착된 PMF 세포의 IMV 연속감염에도 뚜렷한 세포변성효과 없이 세포가 유지되는 것을 확인하였고, Cytodex1 및 3의 경우 오히려 세포수가 일부 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 모든 종류의 MCB 부착 세포주에서 반연속 배양 방법으로 생성되는 IMV의 농도는 모두 최대 2x109copies/ml 이상으로 나타났으며, 특히, MCB-부착 PMF 세포주를 반연속 배양하는 경우, 다른 어류 주화세포인 GF-1보다 바이러스 생산량이 현저히 높은 것을 알 수 있었다 (표 12).
18-3. 바이러스 서브그룹에 따른 반연속 배양
상기 실시예 18-1의 MCB-부착 PMF 세포주의 반연속 배양이 IMV의 subgroup Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ 바이러스에서도 적용 가능한지 확인하였다.
그 결과, subgroup Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ 바이러스에 각각 감염된 MCB-부착 PMF 세포주들 모두에서 1x109copies/ml 이상의 바이러스를 얻을 수 있었고, 세 서브그룹의 IMV로 감염된 PMF 세포주들은 탈락 없이 세포수가 유지되면서 바이러스를 계속해서 생산할 수 있었다 (도 22). 이에, MCB-부착 PMF 세포주가 모든 IMV subgroup에 대해 반연속 배양으로 세포 성장 유지 및 지속적 바이러스 생산이 가능함을 알 수 있었다.
실시예 19: MCB를 이용하여 대량 제작된 백신 및 부형제에 따른 효과 증진 확인
본 발명의 상기 실시예들에서는 MCB를 이용하여 어류 주화세포의 대량배양이 가능함을 확인하였으며, 상기 주화세포에서의 어류 바이러스의 대량 생산이 가능함을 확인하였다. 특히 PMF 세포는 반연속 배양시 IMV (subgroup Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ)를 연속 생산이 가능하였다. 이에, IMV 바이러스들 중 특히 국내 돌돔 양식에 큰 피해를 주고 있는 subgroup Ⅱ를 MCB-부착 PMF에 접종하여 반연속 배양 방법으로 생산한 뒤, 이를 포르말린(0.1%)으로 불활화한 백신 SCMCS-IMV-sII (이하 SCMCS-IMV로 표기)과 부형제로 Beta-glucan (Sigma, baker's yeast (S. cerevisiae)), squalene + aluminum hydroxide. Imiquimod (Enzo, U.S.A) 및 Montanide ISA 780 VG (Seppic, 36064A)를 각각 혼합하여 백신을 제조한 뒤, 각각의 효과를 확인하였다. 구체적으로, Beta-glucan을 부형제로 사용하는 백신은 한 어체에 glucan 0.15mg이 들어갈 수 있도록 불활화된 SCMCS-IMV-sII에 1.5mg/ml의 농도로 첨가한 뒤 PolytronPT 1200E homogenizer (Kinematica, Switzerland)를 이용하여 균질화하였다. squalene+aluminum hydroxide을 부형제로 사용하는 백신은 PBS에 squalene (Sigma, 2.5%, v/v), glycerol (Amresco, 10%, v/v), Tween 80 (Sigma aldrich, 0.5%, v/v) 및 aluminum hydroxide(Sigma aldrich 1% w/v)로 섞어 15분간 ice에서 반응시키고 PolytronPT 1200E homogenizer로 균질화하였다. 이렇게 제작된 squalene 부형제와 불활화된 SCMCS-IMV를 1:1 (v/v)로 혼합하여 PolytronPT 1200E homogenizer로 균질화하였다. Imiquimod를 부형제로 사용하는 백신은 98% 이상 정제된 Imiquimod를 증류수를 이용해 1 mg/ml 농도로 녹여준 후 이를 100배 희석하여 포르말린으로 불활화된 SCMCS-IMV과 1:20 (v/v)으로 혼합하여 제조하였다. 베지터블 오일을 기반으로 하는 Montanide ISA 780 VG를 부형제로 사용하는 백신은 Montanide ISA 780 VG과 포르말린으로 불활화된 SCMCS-IMV을 1:1 (v/v)로 혼합한 후 PolytronPT 1200E homogenizer로 균질화하여 제조하였다. 각각의 부형제를 혼합한 백신은 각 그룹당 20마리의 돌돔 개체로 실험을 실시하였으며, 대조군으로 PBS를 사용하였다. 각각의 백신 또는 PBS를 접종한 돌돔은 접종 4주 후, SCMCS-IMV를 희석하여 (1x105copies/fish) 공격 실험을 수행하였다. 수온은 25℃로 유지하였고, 환수는 매일 100% 환수하였다. 각 그룹별로 30 일간 누적 폐사율을 확인하면서, 폐사어와 빈사(moribund) 상태의 실험어의 경우 즉시 수조에서 꺼내 비장을 적출한 뒤 viral DNA를 분리하여 감염 여부를 M1F/R primer set를 이용한 PCR로 확인하였다.
또한, 백신의 효과를 확인하기 위하여 백신 개체에 대한 중화항체가를 측정하였다. 구체적으로, 백신 접종 4주 이후의 각 백신 접종 그룹의 돌돔 어체 3마리를 미부정맥 채혈법으로 채혈하여 10,000rpm으로 원심분리하고, 상등의 혈청을 분리하여 사용 전까지 -80℃에 보관하였다. 이후 중화항체 실험을 위해 상온에서 녹인 혈청은 L-15배지로 10배 희석하고, 보체 불활화를 위해 55℃에서 30분간 처리하였다. 이후 2 배의 단계희석을 통해 최대농도 1/10 부터 1/640까지 희석 구간을 설정하였고, 바이러스 상등액 2x104 copies/ml 과 1:1로 혼합하여 25℃에서 2시간 동안 중화시켰다. 따라서 항체가 측정을 위한 최종 농도는 1/20부터 1/1280까지 설정하여 중화항체가를 측정하였다. 각 농도별로 중화반응시킨 바이러스는 24 웰 플레이트에서 1x105cells/ml 의 농도 식균한 PMF 세포를 5일간 배양하여 감염시켰고, 감염 7일 이후에 CPE를 관찰하여 중화항체가를 결정하였다.
부형제 종류 생존율 (%) 평균 생존율 (%) 중화항체가 중화항체가 평균
non-adjuvant 65 68.33 ± 5.77 160 213.33
75 320
65 160
Adjuvant Beta-glucan 80 83.33 ± 2.89 320 266.67
85 160
85 320
Squalene+alum 80 80.00 ± 5.00 160 213.33
70 160
85 320
Imiquimod 60 63.33 ± 2.89 160 213.33
65 160
65 320
Montanide ISA780 VG 85 81.67 ± 5.77 320 266.67
70 160
85 320
Control 0 0.00 ± 0.00 0 0
0 0
0 0
그 결과, 부형제를 첨가하지 않은 SCMCS-IMV-sII 백신은 평균 58.33%의 생존율을 나타냈고, 부형제인 Beta-glucan, Squalene + Aluminum 및 Montanide ISA 780 VG를 각각 투여한 그룹들에서는 10% 이상 높은 생존율을 나타냈다 (표 13). 특히, Beta-glucan을 부형제로 사용한 경우 83.33%의 생존율로 가장 높게 나타났다.
또한, 중화항체가 시험(Neutralization test) 결과 Beta-glucan 또는 Montanide ISA 780 VG를 부형제로 이용한 백신 그룹들에서 266.67로 가장 높았고, 다른 모든 백신 그룹들 모두에서 200 이상의 중화항체가를 나타냈다 (표 13). 이를 통해, 백신접종으로 인한 면역화로 이후 항원의 침입에 대하여 충분한 항체를 생산함으로써 높은 평균 생존율을 보인 것으로 유추된다.

Claims (20)

1) 어류 주화세포에 바이러스를 감염시키는 단계;
2) 감염된 세포를 배양하는 단계;
3) 배양 상등액을 수득하고 새로운 배지로 대체하는 반연속 배양(semi-continuous cell culture) 단계; 및
4) 배양 상등액을 수득하는 단계를 포함하는, 바이러스의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 어류 주화세포는 참돔지느러미(pagrus major fin, PMF) 세포주, 그루퍼지느러미(Grouper fin, GF-1) 세포주 및 블루길자어(bluegill fry, BF-2) 세포주로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인, 바이러스의 제조방법.
제 1항에 있어서, 바이러스는 이리도비리데 과 (Iridoviridae family) 바이러스인, 바이러스의 제조방법.
제 3항에 있어서, 이리도비리데 과 바이러스는 메갈로사이티바이러스인, 바이러스의 제조방법.
제 4항에 있어서, 메갈로사이티바이러스는 서브그룹(subgroup) Ⅱ, 서브그룹 Ⅲ 및 서브그룹 IV로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인, 바이러스의 제조방법.
제 1항에 있어서, 감염은 바이러스를 접종하고 3일 마다 배지 교환을 20회 이상 하는 연속 감염인, 바이러스의 제조방법.
제 1항에 있어서, 배양 조건은 우태아혈청(FBS) 5%가 포함된 배지에서 25℃로 배양하는 것인, 바이러스의 제조방법.
제 1항에 있어서, 반연속 배양 단계의 배지 교환 주기는 3일이고, 새로운 배지로 대체하는 배지 교환 비율은 70% (v/v)인, 바이러스의 제조방법.
1) 어류 주화 세포주와 마이크로캐리어 비드를 혼합하여 세포주를 마이크로캐리어 비드에 부착하는 단계;
2) 마이크로캐리어 비드에 부착된 어류 주화 세포주를 배양하는 단계;
3) 마이크로캐리어 비드에 부착된 어류 주화세포에 바이러스를 감염시키는 단계;
4) 상기 단계 3)의 바이러스에 감염된 어류 주화세포를 배양하는 단계; 및
5) 배양 상등액을 수득하고 바이러스를 분리하는 단계를 포함하는, 마이크로캐리어 비드를 이용한 바이러스 생산 방법.
제 9항에 있어서, 어류 주화 세포주는 PMF(Pargus major fin), GF-1(Grouper fin cell), BF-2(Blue gill fry), EPC(Epithelioma pap㎕osum cyprinid) 및 E-11(a clone of the cell line SSN-1) 세포주로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인, 마이크로캐리어 비드를 이용한 바이러스 생산 방법.
제 9항에 있어서, 30 내지 60rpm으로 교반하고 정지하는 과정을 1 내지 3시간 동안 반복하여 세포주를 마이크로캐리어 비드에 부착하는, 마이크로캐리어 비드를 이용한 바이러스 생산 방법.
제 9항에 있어서, 어류 혈청, 어류 근육 추출물 또는 어류 난황 추출물을 배양 배지에 추가로 첨가하여 세포주를 배양하는, 마이크로캐리어 비드를 이용한 바이러스 생산 방법.
제 9항에 있어서, 마이크로캐리어 비드에 부착된 어류 주화 세포주는 1 내지 3일 마다 배지를 교환하여 배양하는, 마이크로캐리어 비드를 이용한 바이러스 생산 방법.
제 9항에 있어서, 마이크로캐리어 비드에 부착된 어류 주화 세포주는 30 내지 80rpm으로 교반하여 배양하는, 마이크로캐리어 비드를 이용한 바이러스 생산 방법.
제 9항에 있어서, 마이크로캐리어 비드에 부착된 어류 주화세포에 새 마이크로캐리어 비드를 1:1 내지 1:4의 부피비로 추가하여 서브컬쳐(subculture)하는, 마이크로캐리어 비드를 이용한 바이러스 생산 방법.
제 9항에 있어서, 마이크로캐리어 비드에 부착된 어류 주화세포를 작은 용량의 플라스크에서 배양한 뒤 더 큰 용량의 플라스크로 옮기면서 새 마이크로캐리어 비드를 추가하여 scale-up 서브 컬쳐하는, 마이크로캐리어 비드를 이용한 바이러스 생산 방법.
제 9항에 있어서, 바이러스는 메갈로사이티바이러스(Iridoviridae Megalocytivirus, IMV), 바이러스성 신경성 괴사 바이러스(Viral nervous necrosis virus, VNNV) 및 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia, VHSV)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인, 마이크로캐리어 비드를 이용한 바이러스 생산 방법.
제 9항에 있어서, 바이러스에 감염된 어류 주화세포를 배양하고 배양 상등액을 수득한 뒤 새로운 배지를 첨가하는 배지 교환 과정을 반복적으로 실시하는 반연속 배양(semi-continuous cell culture)인, 마이크로캐리어 비드를 이용한 바이러스 생산 방법.
제 1항 또는 제 9항의 방법으로 제조 또는 생산한 바이러스를 불활화한 바이러스와 약제학적으로 수용가능한 담체 (carrier) 또는 부형제를 포함하는 백신 조성물.
제 19항에 있어서, 부형제는 베타-글루칸(Beta-glucan), 스쿠알렌 및 수산화알루미늄, 이미퀴모드(Imiquimod), 및 베지터블 오일(vegetable oil) W/O로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인, 백신 조성물.
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