WO2018143649A1

WO2018143649A1 - 자가 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 그 제조방법

Info

Publication number: WO2018143649A1
Application number: PCT/KR2018/001294
Authority: WO
Inventors: 신성재; 최완수; 김우식; 김혁순; 김홍민
Original assignee: 주식회사 큐라티스
Priority date: 2017-01-31
Filing date: 2018-01-30
Publication date: 2018-08-09
Also published as: CA3052130A1; KR20180089223A; KR101893886B1; EP3578186A1; BR112019015783A2; JP2020506186A; EP3578186A4; AU2018215650A1; US20200246380A1; CN110337298A

Abstract

본 발명은 알레르기 질환 등을 포함하는 자가 면역 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 조성물의 제조방법과 상기 방법에 의해 제조된 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 간단하고 용이한 공정을 통하여 미성숙 수지상 세포로부터 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 높은 수율로 유도할 수 있고, 이를 이용하여 자가 면역 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.

Description

자가 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 그 제조방법

본 발명은 자가 면역 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 조성물의 제조방법과 상기 방법에 의해 제조된 조성물에 관한 것이다.

면역 체계에 있어서 면역 반응과 면역 관용 반응은 상호 조화와 균형을 이루어야 한다. 과다 면역 반응이 일어나는 경우 과민성 알레르기 질환이나 자가 면역 질환 등이 발생할 수 있으며, 이들은 사람의 생존과 삶의 질에 매우 큰 영향을 준다.

모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중의 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원 물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 많은 비자기(non-self) 항원에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있는 능력을 가지고 있다는 것이다. 이처럼 자기 항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라 한다.

이러한 자기 관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기 항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하면서 다발성 경화증(multiple sclerosis), 1형 당뇨병, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염 등의 자가 면역 질환이 발생하게 되며, 뿐만 아니라 이식과 같은 시술 이후 면역거부 반응이 발생하게 된다.

구체적으로 자가 면역 질환은 자기 세포에 대한 이상 반응으로 나타나는 질병으로서 현재 치료제로는 T 세포에서의 신호변환 경로를 차단하는 면역 억제제가 가장 많이 사용되고 있으나, 이러한 면역 억제제들은 독성, 감염, 임파종, 당뇨병, 진전(tremor), 두통, 설사, 고혈압, 오심, 신기능 장애 등의 부작용이 발생하는 문제점이 있다. 따라서, 부작용이 없고 저렴하면서도 치료 효과가 우수한 새로운 치료제의 개발이 필요한 실정이다.

또한, 상기 자가 면역 질환의 일종에 해당하는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)은 성인에서 가장 흔하게 발병하는 염증성 관절염으로, 그 원인이 아직 완전히 알려지지 않았으나, 자가 면역 기전으로 인한 염증 반응으로 이해되고 있다. 이러한 류마티스 관절염을 치료하는 데 사용되는 항류마티스 약제와 생물학적 제재가 증상 조절을 통해 삶의 질을 개선하는 효과를 보이지만, 궁극적인 치료 목표인 연골 및 골 파괴 감소를 통한 장애를 예방하기에는 아직 부족하다. 또한, 일부 환자에서는 치료 효과가 불완전하기도 하고 생물학적 제제를 장기간 사용할 때 항체가 생성되어 치료 효과가 떨어지기도 하며, 다수의 약물 부작용이 치료에 걸림돌이 되고 있다.

한편, 수지상 세포는 선천성 면역뿐만 아니라 후천적인 인과에 의해 선택적으로 발생되는 획득 면역 조절에도 중추적인 역할을 담당하는 세포로서, 구체적으로는 주로 외부에서 침입한 항원의 정보를 T 세포에 제시하는 기능을 수행하는 대표적인 항원 제시 세포의 일종이다.

상기 수지상 세포는 근원(origin), 표현형(phenotype) 및 기능(function) 등에 따라 다양한 부분 모집단(subpopulations)으로 구성된다. 구체적으로 플라즈마사이토이드 수지상 세포(plasmacytoide dendritic cells, pDC)의 경우 다양한 병원균 유래 자극에 대응하여 I형 IFN을 높은 수준으로 생산할 수 있다. 이들은 표면 표현형에 의해 일반적인 수지상 세포(conventional dendritic cells, cDC)와 구별된다. 상기 pDC는 B220를 발현하고, CD11c는 낮은 수준으로 발현하는 반면, cDC는 CD11c 및 CD11b를 높은 수준으로 발현하지만, B220는 발현하지 않는다. 상기 pDC 및 cDC는 모두 조화로운 면역 반응의 효과적인 자극제로 작용할 수 있도록, 미성숙 수지상 세포가 성숙되는 과정에 의해 얻어진다.

상기한 바와 같이, pDC는 DNA 바이러스나 단일 가닥 RNA 바이러스에 의해 감염 시 대량의 I형 IFNs를 분비함으로써 면역 세포를 활성화시켜 바이러스 감염의 방어에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 특히 항원을 제시할 수 있는 성숙한 수지상 세포(maturated DCs, mDCs)를 강력하게 활성화시켜 T 세포에 의한 항바이러스 반응을 증폭시키는데 일조한다.

하지만, 체내에서 pDC의 분화나 역할에 대한 연구는 다른 수지상 세포에 비하여 미미한 실정이다. 수지상 세포의 면역을 주관하는 특정 유전자의 발현 조절이나 면역 관용 유발 물질 발굴을 통해 일관성 있게 면역 관용성을 유지 혹은 강화시킨 면역 관용성 수지상 세포의 제조 기술이 시급히 요구되고 있다. 특히, 상기 pDC가 다양한 자가 면역 질환에서 중요한 역할을 할 것이라는 연구가 많이 이루어지고 있지만, 면역 관용성 pDC를 제작하는 체계적이고 표준화된 분화 방법이 알려지지 않았다.

본 발명의 발명자들은 미성숙 수지상 세포(dendritic cells)에 톨 유사 수용체 작용제(toll-like receptor agonist, TLR agonist)를 처리한 후 분화를 유도하거나, 혹은 상기 미성숙 수지상 세포를 분화하는 과정 중에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하는 경우, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포가 유도되며, 이를 사용하는 경우 자가 면역 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있음을 발견하여 본 발명에 이르게 되었다.

본 발명의 일 목적은 자가 면역 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 조성물을 제조하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조되어, 자가 면역 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 미성숙 수지상 세포에 톨 유사 수용체 작용제(toll-like receptor agonist)를 처리하여 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포(plasmacytoid dendritic cells, pDC)를 제조하는 단계를 포함하는, 자가 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 미성숙 수지상 세포에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하여 유도된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 포함하는, 자가 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 미성숙 수지상 세포에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하여 유도된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 포함하는, 자가 면역 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 미성숙 수지상 세포에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하여 유도된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 포함하는, 자가 면역 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 간단하고 용이한 공정을 통하여 미성숙 수지상 세포로부터 면역 관용성을 갖는 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 높은 수율로 유도할 수 있어, 대량의 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 안정적인 공급을 가능하도록 한다.

또한, 본 발명에서 상기와 같이 얻어진 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포는 염증성 사이토카인 및 염증 유발 인자의 발현을 억제하여 다양한 자가 면역 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있고, 인체에 투여하는 경우 안전하다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 미성숙 수지상 세포에 대하여 분화 유도용 인자(Flt3L-containing media) 및 톨 유사 수용체 작용제(TLRs agonists) 처리 방법의 설계도를 나타낸 것이다.

도 2는 실시예 1에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)의 분리를 나타낸 것이다.

도 3의 (a)는 실시예 1에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포에 특이적으로 유도되는 표면 발현 분자들을 나타낸 것이다.

도 3의 (b)는 실시예 1에서 미성숙 수지상 세포의 수 대비 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 수의 비율을 그래프로 나타낸 것이다.

도 4는 실시예 2에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)와 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에서 사이토카인(IFN-α, IFN-β, IL-12p70, IL-10)의 발현 양상을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

도 5는 실시예 3에서 본 발명의 일 실시예에 따라 다양한 톨 유사 수용체 작용제의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포와 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(non)에서 사이토카인 IL-10의 발현 양상을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

도 6은 실시예 4에서 본 발명의 일 실시예에 따라 미성숙 수지상 세포에 대하여 처리되는 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 시점에 따라 사이토카인(IFN-α, IFN-β, TNF-α, IL-12p70, IL-10)의 발현 양상을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

도 7은 실시예 5에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)와 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에서 MHC complex 분자, CD80 및 CD86의 발현 양상을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

도 8은 실시예 6에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)와 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에서 IDO, CCR9 및 PD-L1의 발현 양상을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

도 9의 (a)는 실시예 7에서 T 세포에 대하여 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC) 또는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)를 처리한 후 조절 T 세포로의 증식 여부를 유세포 분석기 LSRFortessa x-20을 통하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 9의 (b)는 실시예 7에서 T 세포에 대하여 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC) 또는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)를 처리한 후 조절 T 세포의 증식률을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

도 10은 실시예 8에서 야생형 수지상 세포(WT) 및 TLR2 넉아웃 마우스에서 분리한 수지상 세포(TLR2-/-)의 Rv1411c 단백질과의 결합 정도를 나타낸 것이다.

도 11은 실시예 9에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질(0.1 ㎍/ml, 0.5 ㎍/ml))의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c(0.1㎍/ml)-pDC, Rv1411c(0.5㎍/ml)-pDC)와 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에서 사이토카인(IFN-α, IFN-β, TNF-α, IL-12p70, IL-10)의 발현 양상을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

도 12는 실시예 10에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC)와 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에서 MHC complex 분자, CD80, CD86 및 면역 관용 유도 분자(IDO, CCR9 및 PD-L1)의 발현 양상을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

도 13은 실시예 11에서 T 세포와, 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC) 또는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)를 혼합 배양한 후 T 세포의 증식 정도를 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

도 14는 실시예 11에서 T 세포와, 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC) 또는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)를 혼합 배양한 후 IFN-gamma의 분비 양상을 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

도 15의 (a)는 실시예 12에서 T 세포에 대하여 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC) 또는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)를 처리한 후 조절 T 세포로의 증식 여부를 유세포 분석기 LSRFortessa x-20을 통하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 15의 (b)는 실시예 12에서 T 세포에 대하여 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(RVc1411c-pDC) 또는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)를 처리한 후 조절 T 세포의 증식률을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

도 16은 실시예 13에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질)의처리 후 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(RVc1411c-pDC)에 의하여 분화된 T 세포를 CD4+, CD25- 작동 T 세포와 함께 배양한 후, CD25- 작동 T 세포 대비 프라이밍된 T 세포의 비율에 대하여 T 세포 증식능의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

도 17은 실시예 14에서 본 발명의 일 실시예에 따라톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질 및 Pam3)의처리 후 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLR agonist)와, 미처리 후 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Non)의 수를 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

도 18은 실시예 15에서 콜라겐 유도 관절염 동물 모델을 제작하기 위한 실험 설계도를 나타낸 것이다.

도 19는 실시예 15에서 콜라겐 유도 관절염 동물 모델 마우스에 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-tolpDC)와 음성 대조군으로 인산화 완충 수용액(PBS), 양성 대조군으로 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)와 메트로트렉세이트(MTX)를 처리한 후 관절염 스코어를 평가한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

도 20은 실시예 15에서 콜라겐 유도 관절염 동물 모델 마우스에 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-tolpDC)와 음성 대조군으로 인산화 완충 수용액(PBS), 양성 대조군으로 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)와 메트로트렉세이트(MTX)를 처리한 후 관절염의 유발율을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

도 21은 실시예 16에서 콜라겐 유도 관절염 동물 모델 마우스에 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)와 음성 대조군으로 인산화 완충 수용액(PBS), 양성 대조군으로 메트로트렉세이트(MTX)를 처리한 후 상기 마우스의 발 조직을 H&E로 염색한 사진을 나타낸 것이다.

도 22는 실시예 16에서 콜라겐 유도 관절염 동물 모델 마우스에 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)와 음성 대조군으로 인산화 완충 수용액(PBS), 양성 대조군으로 메트로트렉세이트(MTX)를 처리한 후 관절염의 조직학적 스코어를 평가한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

도 23은 실시예 17에서 콜라겐 유도 관절염 동물 모델 마우스에 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)와 음성 대조군으로 인산화 완충 수용액(PBS), 양성 대조군으로 메트로트렉세이트(MTX)를 처리한 후 염증성 사이토카인인 종양괴사인자-α(TNF-α), 인터루킨-6(IL-6) 및 인터루킨-17(IL-17)의 혈중 농도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.

도 24는 실시예 18에서 콜라겐 유도 관절염 동물 모델 마우스에 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)와 음성 대조군으로 인산화 완충 수용액(PBS), 양성 대조군으로 메트로트렉세이트(MTX)를 처리한 후 다양한 염증 유발 인자의 발현 수준을 측정한 결과를 나타낸 것이다.

단, 도 1 내지 24에서 *은 P<0.05, **은 P<0.01, ***은 P<0.005를 의미한다.

본 발명은, 하기의 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 자가 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 제조하는 단계는, 미성숙 수지상 세포에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하며 수행될 수 있다.

본 명세서에서 용어, "수지상 세포 (dendritic cell, DC)"는 항원을 세포 내부로 흡수하여 MHC(major histocompatibility complex) 클래스 I 복합체 또는 MHC 클래스 Ⅱ 복합체와 함께 다양한 항원 샘플을 T 세포에 제시하는 전문적 항원 제시 세포(professional antigen presenting cell)를 의미한다. 또한 수지상 세포는 면역원성(immunogenic) 및 면역 관용성(tolerogenic) 항원 제시 세포를 모두 포함하며, 성숙도에 따라 미성숙 수지상 세포(immature dendritic cells; "imDC"), 준성숙 수지상 세포(semimature dendritic cells; "smDC") 및 성숙 수지상 세포(mature dendritic cells; "mDC")로 분류할 수 있다.

본 명세서에서 용어, "미성숙 수지상 세포"는 수지상 세포의 초기 성숙 단계에 발견되는 것으로, 단핵구 세포의 표면 표현형인 CD14를 발현하지 않으며, 또한, 공동 자극 분자 CD40, CD54, CD80, CD86 및 CD274의 어느 하나가 성숙 수지상 세포에 비해 낮은 수준으로 발현된다.

본 명세서에서 용어, "준성숙 수지상 세포"는 미성숙 수지상 세포의 특성의 일부를 상실하고, 성숙 수지상 세포의 표현형의 일부 특성을 갖는 수지상 세포로서, 부분적으로 또는 불완전하게 성숙된 형태 및 표현형적 특성을 나타내는 수지상 세포를 의미한다.

본 명세서에서 용어, "성숙 수지상 세포"는 미성숙 수지상 세포가 성숙화되어 형성된 세포를 의미한다. 성숙 수지상 세포는 DC-LAMP 뿐만 아니라 MHC 클래스 Ⅱ, CD40, CD54, CD80, CD86 및 CD274의 발현이 높고, 항염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)을 방출하며, 혼합림프구 반응(mixed lymphocyte reaction)에서 원시 동종이계 T 세포(allogeneic T cells) 및 동종동계 T 세포(syngeneic T cells)의 증식의 증가 및/또는 수지상 세포 사이토카인의 증가된 생성을 발생시키는 능력을 갖는 것을 특징으로 한다. 성숙 수지상 세포는 전형적으로 CCR7 및 CXCR4를 높은 수준으로 발현한다.

다만, 본 발명에서 상기 톨 유사 수용체 작용제가 처리되는 수지상 세포는 분화가 되지 않은 미성숙 수지상 세포인 것이 바람직하다. 여기서 상기 미성숙 수지상 세포는 원시적인 수지상 세포(naive dendritic cells)를 포함할 수 있고, 포유류의 골수 등으로부터 분리 및 획득된 것일 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기와 같이 미성숙 수지상 세포에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하여 분화 유도된 면역 관용성 수지상 세포는 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포(plasmacytoid dendritic cells, pDC)일 수 있다.

본 명세서에서 용어, "플라즈마사이토이드 수지상 세포(plasmacytoid dendritic cells)"란 수지상 세포의 한 부류(subset)로, 1958년 Dr. Lennert와 Dr. Remmele에 의하여 사람의 림프절에서 형질 세포(plasma cell)의 형태를 조직학적으로 발견함으로써 처음 알려졌지만 B 세포 특이적 마커 (immunoglobulin)를 발현하지 않는다는 사실이 알려지면서 플라즈마사이토이드 T 세포(Plasmacytoid T cells)로 명명되다가, T 세포의 공통적 마커인 CD3를 발현하지 않으면서 골수계 항원(myeloid lineage antigen)과 MHC class Ⅱ를 발현한다는 사실이 알려지면서 플라즈마사이토이드 단핵구(plasmacytoid monocyte)로 명명되었다. 그 후, 수지상 세포의 고유 성질인 동종 이계 혼합 림프구 반응(allerogenic mixed lymphocyte reaction, MLR)을 유도할 수 있는 능력이 확인됨에 따라 다시 플라즈마사이토이드 수지상 세포로 명명되고 있으며, 간단히 'pDC'로 표기하기도 한다.

본 명세서에서 용어, "면역 관용성"이란 특정 항원에 대하여 면역 반응을 나타내지 않는 상태뿐만 아니라, 면역 반응을 억제하는 상태를 의미한다. 따라서, 본 발명에서, 상기 "면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포"는 IL-10 등과 같은 항염증성 사이토카인의 분비를 촉진하고, IL-12p70 및 TNF-α 등의 염증성 사이토카인의 분비는 억제하며, 최근 면역 관용 유도분자들로 알려진 인돌아민-2,3 디옥시제네이즈(indoleamine-2,3 dioxygenase, IDO) 분자 및 면역 관용 유도 세포의 표면 분자인 CCR9이 높은 수준으로 발현되어, 조절 T 세포(regulatory T cells)의 분화를 유도하고, 작동 T 세포(effector T cells)의 활성을 억제할 수 있다.

본 발명에서는 상기 미성숙 수지상 세포의 분화 개시 이전 또는 분화 중에 상기 톨 유사 수용체 작용제를 처리함으로써 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 안정적으로, 그리고 대량으로 제조할 수 있다. 여기서, 상기 "분화 개시 이전"이라 함은, 미성숙 수지상 세포에 분화 유도용 인자를 처리하기 이전의 시점을 포함할 수 있다. 또한, 상기 "분화 중"이라 함은 상기 미성숙 수지상 세포에 분화 유도용 인자를 처리하는 시점으로부터 상기 분화 유도용 인자에 의하여 분화가 완료되기 이전까지의 시점을 의미한다. 바람직하게는 분화 유도용 인자를 처리하는 시점으로부터 상기 처리 후 7일 이내의 시기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 톨 유사 수용체 작용제는, 상기한 바와 같이 미성숙 수지상 세포의 분화 개시 이전 또는 분화 중에만 처리되면 구체적인 시점을 특별히 제한하지 않는다. 다만, 본 발명에서 상기 톨 유사 수용체 작용제를 미성숙 수지상 세포의 분화 중에 처리하는 경우, 분화 개시 시점으로부터 7일(168시간), 5일(120시간) 또는 3일(72시간) 이내에 처리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에서 상기 톨 유사 수용체 작용제를 미성숙 수지상 세포의 분화 개시 이전에 처리하는 경우, 상기 작용제를 처리한 시점으로부터 36시간, 바람직하게는 24시간 내에 분화 유도용 인자를 사용하여 미성숙 수지상 세포의 분화를 개시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에서는 상기 톨 유사 수용체 작용제를 1회 이상 처리할 수 있으며, 구체적인 처리 횟수를 특별히 제한하지 않으나, 상기 톨 유사 수용체 작용제를 미성숙 수지상 세포의 분화 중에 처리하는 경우, 상기 미성숙 수지상 세포의 분화 개시 시점으로부터 7일, 5일 또는 3일 이내에 상기 톨 유사 수용체 작용제를 적어도 1회 처리할 수 있다. 또한, 상기 톨 유사 수용체 작용제를 미성숙 수지상 세포의 분화 개시 이전에 처리하는 경우, 상기 미성숙 수지상 세포에 대하여 톨 유사 수용체 작용제를 적어도 1회 처리한 뒤, 어느 일 처리 시점으로부터 36시간 또는 24시간 이내에 상기 미성숙 수지상 세포의 분화를 개시하고, 그 분화 중에 선택적으로 1회 이상 추가로 처리할 수 있다.

여기서, 상기 "분화 개시"라 함은 미성숙 수지상 세포의 배양 배지에 분화 유도용 인자를 첨가하거나, 또는 분화 유도용 인자를 포함하는 배지에 미성숙 수지상 세포를 접종하여 배양하는 공정을 의미할 수 있으나, 분화 유도용 인자를 사용하여 미성숙 수지상 세포의 분화를 유도할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않는다.

본 명세서에서 용어, "톨 유사 수용체 작용제(toll-like receptor agonist)"는 병원체(pathogen) 유래 보존된 분자적 물질로, PAMPs(Pathogen associated molecular patterns)일 수 있다. 여기서, 상기 병원체로는 그람-양성 박테리움, 그람-음성 박테리움, 균류 또는 바이러스가 될 수 있다. 또한, 상기 톨 유사 수용체 작용제는 손상되거나 또는 죽은 세포로부터 방출되는 내인성(endogenous) 분자들로, DAMPs(Damage associated molecular patterns)일 수 있다. DAMPs 또는 PAMPs는 TLR 신호를 통해 면역 응답을 개시하고 신호를 전달하기 위해 세포의 세포질 내에서 어댑터 분자들을 모으게 된다. 상기 톨 유사 수용체 작용제는 프래그먼트, 변종, 아나로그, 호모로지(homology) 또는 톨 유사 수용체와 결합하고 NF-κB 활동의 활성화와 같은, TLR-중재에 의한 활성화를 유도하는 PAMPs 또는 DAMPs의 유도체가 될 수 있다. 상기 톨 유사 수용체 작용제인 프래그먼트, 변종, 아나로그, 호모로그 또는 유도체는 TLR 효능제의 아미노산의 최소한 30~99% 동일하며 톨 유사 수용체-중재에 의한 활성화를 유도하게 된다.

본 발명에서 상기 미성숙 수지상 세포에 처리되는 톨 유사 수용체 작용제의 종류는 특별히 제한하지 않으나, PAMPs 리간드인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 MyD88(Myeloid differentiation primary response gene 88) 시그널을 경유할 수 있는 것이 미성숙 수지상 세포로부터 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 분화를 유도할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 톨 유사 수용체 작용제로는 TLR2 작용제, TLR4 작용제, TLR5 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, TLR9 작용제, TLR11 작용제, TLR12 작용제 및 TLR13 작용제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있고, 보다 구체적으로는 하기 표 1에 나타낸 리간드 중 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니며, 수지상 세포의 톨 유사 수용체에 결합할 수 있는 것으로, MyD88 시그널을 경유할 수 있는 리간드라면 제한없이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 톨 유사 수용체 작용제로 TLR2 작용제를 사용하는 경우, 그 보조 수용체(co-receptor)로 작용하는 TLR1 작용제 및 TLR6 작용제 중 1종 이상을 추가로 더 포함할 수 있다. 여기서, 상기 TLR1 작용제 및 TLR6 작용제의 구체적인 예시로는 하기 표 1에 나타낸 리간드일 수 있으나, 상기 TLR2 작용제의 보조 수용체로서 작용할 수 있는 리간드라면 특별히 제한하지 않는다.

리간드	PAMPs(Pathogen Associated Ligands)	리간드 유래 호스트(Ligand natural host)	합성 리간드
TLR1	다양한 트리아실 리포펩티드(multiple triacyl lipopeptides)	박테리아	Pam3Cys-*
TLR2	다양한 글리코리피드(multiple glycolipids)	박테리아	CFA
	다양한 리포펩티드(multiple lipopeptides)	박테리아	Pam3, MALP2-**
	다양한 리포프로테인(multiple lipoproteins)	박테리아	Pam2Cys**
	리포테이코산(lipoteichoic acid)	그람 양성 박테리아	FSL-1
	HSP 70, 또는 다른 열 충격 단백질(other heat shock proteins)	숙주 세포(host cells)	Hib-OMPC
	지모산(zymosan) (Beta- glucan)	균류 (fungi)
	단백질	결핵균(Mycobacterium tuberculosis)	Rv1411c 단백질, ESAT-6, PE/PPE Protein, Rv0577
TLR3	이중 가닥 RNA(double stranded RNA)	바이러스	Poly (I: C); 저분자량 또는 고분자량Poly (A: U)
TLR4	리포다당류(lipopolysaccharides, LPS); or IPS 유사체(MPLA)	그람 음성 박테리아	AGP
	열 충격 단백질	박테리아 및 숙주 세포	MPLA
	피브리노겐(fibrinogen)	숙주 세포	RC-529
	헤파린 황산 프레그먼트(heparin sulfate fragments)	숙주 세포	MDF2B
	히알루론산 프레그먼트(hyaluronic acid fragments)	숙주 세포	CFA
	니켈(nickel)
	다양한 오피오이드 약제(Various opoid drugs)
	단백질	결핵균(Mycobacterium tuberculosis)	RpfE, RpfB, Rv2299c, HBHA
TLR5	플라젤린(Flagellin)	박테리아	플라젤린
TLR6	다양한 디아실 리포펩티드(multiple diacyl lipopeptides)	마이코플라즈마(mycoplasma)	FSL1-Pam2CysMALP2-**
TLR7	바이러스 ssRNA(인플루엔자, VSV, HIV, HCV)	RNA 바이러스	구아노신 아날로그(guanosine analogs);이미다조퀴놀린(imidazoquinolines)(e.g. 이미퀴모드(Imiquimod), Aldara 　 R848, 레시퀴모드(Resiquimod)　), 록소리빈(loxoribine)
TLR8	작은 합성 화합물(small synthetic compounds); 단일 가닥 RNA(single-stranded RNA)	RNA, 인간 및 바이러스	이미다조퀴놀린;록소리빈;ssPolyU, 3M-012
TLR9	비메틸화된 CpG 올리고뉴클레오티드 DNA(Unmethylated CpG Oligodeoxynucleotide DNA); DNA; dsDNA 바이러스(HSV, MCMV); 헤모조인(Hemozoin)(Plasmodium)	박테리아, DNA 바이러스	CpG-올리고뉴클레오티드, 합성된 다양한 서열들(e.g. CpG-ODN 2006, 1826, 2395)
TLR10
TLR11	프로필린(Profilin)	톡소플라즈마 곤디(Toxoplasma gondii)
TLR12	프로필린(Profilin)	톡소플라즈마 곤디(Toxoplasma gondii)
TLR13	박테리아 리보솜 RNA 서열(bacterial ribosomal RNA sequence)"CGGAAAGACC"	바이러스, 박테리아
* TLR1 및 TLR2에 의해 인식되는 리간드** TLR2 및 TLR6에 의해 인식되는 리간드

본 발명에서 상기 톨 유사 수용체 작용제는 미생물, 바이러스, 식물 또는 동물 유래일 수 있고, 합성된 것일 수 있으며, 근원을 특별히 제한하지 않는다.

또한, 본 발명에서 상기 미성숙 수지상 세포의 분화는 분화 유도용 인자를 사용하여 수행될 수 있다. 여기서, 상기 분화 유도용 인자로는 FMS-유사 티로신 키네이즈 3 리간드(FMS-like tyrosine kinase 3, Flt3L)를 사용하는 것이 바람직하지만, 상기 미성숙 수지상 세포를 플라즈마사이토이드 수지상 세포 및 일반적인 수지상 세포(conventional plasmacytoid cells, cDC)로의 분화를 유도할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않는다.

또한, 본 발명에서 상기 미성숙 수지상 세포의 분화는 분화 유도용 인자를 포함하는 배지에 상기 미성숙 수지상 세포를 배양하거나, 상기 미성숙 수지상 세포의 배양 배지에 상기 분화 유도용 인자를 첨가하며 수행될 수 있다.

또한, 본 발명에서는 선택적으로 상기 분화 유도용 인자는 상기 미성숙 수지상 세포를 분화하는 과정 중에 1회 이상 추가로 첨가될 수 있다.

본 명세서에서 용어, "FMS-유사 티로신 키네이즈 3 리간드(FMS-like tyrosine kinase 3, Flt3L)"는 조혈 전구 세포(hematopoietic progenitors)를 활성화시켜 사이토카인 및 성장 인자로서의 기능을 수행하는 내인성 저분자에 해당한다.

또한, 본 발명에서 상기 미성숙 수지상 세포의 분화 기간은 특별히 제한하지 않으며, 사용되는 배지의 종류 및 환경에 따라 달라질 수 있으나, 예를 들면 5일 내지 15일 동안 수행될 수 있고, 바람직하게는 7일 내지 10일 동안 수행될 수 있으며, 보다 바람직하게는 8일 내지 9일 동안 수행될 수 있다.

본 발명에서는 상기와 같이 톨 유사 수용체 작용제를 처리하여 미성숙 수지상 세포로부터 분화 유도된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포에 톨 유사 수용체 작용제를 추가로 처리함으로써 상기 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 면역 관용성을 활성화시킬 수 있다.

본 발명에서 상기와 같이 분화 완료된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 활성화시킴에 있어 사용되는 톨 유사 수용체의 종류는 특별히 제한하지 않으며, TLR1 작용제, TLR2 작용제, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR5 작용제, TLR6 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, TLR9 작용제, TLR11 작용제, TLR12 작용제 및 TLR13 작용제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으나, 바람직하게는 TLR9 작용제를 사용할 수 있다.

본 발명에서는 상기와 같은 공정을 통해 미성숙 수지상 세포로부터 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포로의 분화를 효과적으로 유도할 수 있다. 이에 따라, 미성숙 수지상 세포를 이용하여 간단하고 용이한 공정을 통해 대량의 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 안정적으로 공급할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기와 같이 얻어진 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포는 염증성 사이토카인의 발현은 억제하고, 항염증성 사이토카인의 발현은 촉진하며, 조절 T 세포(regulatory T cells)로의 분화를 유도하고 작동 T 세포(effector T cell)의 활성은 억제하여 면역 반응을 효과적으로 억제함에 따라 다양한 자가 면역 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있으며, 동일한 항원에 의한 재발을 억제할 수 있다.

본 발명에서 상기 "자가 면역 질환"이란 개체 자신의 조직에 대해 일어나고 지정된 비-악성 질환 또는 장애이다. 모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중의 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 비자기(non-self) 항원들에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있다. 자기 항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라고 한다. 그러나 자기 관용을 유도 또는 유지함에 있어서 이상이 생기면 자기 항원에 대하여 면역 반응이 일어나게 되고, 그 결과 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는데 상기 과정에 의해 발생되는 질환을 자가 면역 질환이라고 한다. 상기 자기 면역 질환은 자신의 장기조직이나 그 성분에 대해 항체가 생산되는 염증성 질환으로서, 다수의 조직과 장기에 만성적인 전신적 염증을 일으키는 질병을 총칭할 수 있다.

구체적으로, 본 발명에서 상기 자가 면역 질환은 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 패혈증성 쇼크, 알러지성 천식, 알러지성 비염, 아토피성 피부염, 궤양성 대장염, 누선염, 알츠하이머 질환, 뇌졸중, 동맥경화증, 혈관 재협착, I형 당뇨병, II형 당뇨병, 담마진, 결막염, 건선, 전신성염증반증후군, 다발성근염, 피부근염, 결절성 다발관절염, 혼합결합 조직증, 쉐그렌증후군, 통풍, 파킨슨병, 근위축성측색경화증, 당뇨성망막증, 다발성경화증, 크론병, 만성 갑상선염, 세리아크병, 중증근무력증, 심상성천포창, 바이러스질환, 세균성질환, 방사선에 의한 장해, 동맥경화, 혈관종, 혈관섬유종, 재관류장해 및 심장비대증으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 자가 면역 질환을 억제하거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 "치료" 및 "개선"은 본 발명의 조성물의 투여로 자가 면역 질환의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 비강 내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.

본 발명에서, "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여 시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.

본 발명의 조성물은 단독으로, 혹은 종전의 자가 면역 질환 치료제로 예를 들어 류마티즘 관절염 치료제인 메토트렉세이트(methotrexate, MTX) 등과 혼합하여 사용할 수 있고, 혹은 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

또한 본 발명은, 약학적으로 유효한 양의 본 발명에 따른 상기 약학적 조성물을 자가 면역 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 자가 면역 질환의 치료 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은, 약학적으로 유효한 양의 본 발명에 따른 상기 약학적 조성물을 자가 면역 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 자가 면역 질환의 예방 방법에 관한 것이다.

본 발명의 치료 방법 또는 예방 방법에서 투여되는 약학적 조성물은 앞서 기재된 바와 중복되어, 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 이하의 기재를 생략한다.

본 발명에서 상기 약학적 조성물의 투여 방법은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 복강 내 주사, 직장 내 주사, 피하 주사, 정맥 주사, 근육 내 주사, 자궁 내 경막 주사, 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사 또는 흉부 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 임상 투여 시에 경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명에서 상기 약학적 조성물의 투여 횟수는 특별히 제한하지 않으며, 1회 이상 수행할 수 있고, 보다 상세하게는 예방과 치료 목적에 따라 1회 이상 또는 증상이 있을 때에는 반복 투여할 수 있으나, 바람직하게는 1회 내지 3회 투여할 수 있다.

이때, 상기 약학적으로 유효한 양이란 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg이며, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 투여량은 특정 환자의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여 기간, 투여 방법, 제거율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

본 명세서에서 용어, "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 용어, "개체"는 본 발명의 조성물을 투여하여 자가 면역 질환이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등의 모든 동물을 의미한다.

본 명세서에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 이는 개체의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

또한 본 발명은, 상기의 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 자가 면역 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서 미성숙 수지상 세포에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하여 면역 관용성 수지상 세포를 유도하는 방법에 관한 자세한 설명은 상기 약학적 조성물에 기재된 바와 중복되어, 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 이하의 기재를 생략한다.

본 발명에서 화장료 조성물은 화장수, 영양로션, 영양에센스, 마사지 크림, 미용목욕물첨가제, 바디로션, 바디밀크, 배스오일, 베이비오일, 베이비파우더, 샤워겔, 샤워크림, 선스크린로션, 선스크린크림, 선탠크림, 스킨로션, 스킨크림, 자외선차단용 화장품, 크렌징밀크, 탈모제{화장용}, 페이스 및 바디로션, 페이스 및 바디크림, 피부미백크림, 핸드로션, 헤어로션, 화장용크림, 쟈스민오일, 목욕비누, 물비누, 미용비누, 샴푸, 손세정제(핸드클리너), 약용비누{비의료용}, 크림비누, 페이셜 워시, 전신 세정제, 두피 세정제, 헤어린스, 화장비누, 치아미백용 겔, 치약 등의 형태로 제조될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 조성물은 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 용매나, 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물 내에 더 추가될 수 있는 용매의 종류는 특별히 한정하지 않으나, 예를 들어, 물, 식염수, DMSO 또는 이들의 조합을 사용할 수 있고, 담체, 부형제 또는 희석제로는 정제수, 오일, 왁스, 지방산, 지방산 알콜, 지방산 에스테르, 계면활성제, 흡습제(humectant), 증점제, 항산화제, 점도 안정화제, 킬레이팅제, 완충제, 저급 알콜 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 필요에 따라 미백제, 보습제, 비타민, 자외선 차단제, 향수, 염료, 항생제, 항박테리아제, 항진균제를 포함할 수 있다.

상기 오일로서는 수소화 식물성유, 피마자유, 면실유, 올리브유, 야자인유, 호호바유, 아보카도유가 이용될 수 있으며, 왁스로는 밀랍, 경랍, 카르나우바, 칸델릴라, 몬탄, 세레신, 액체 파라핀, 라놀린이 이용될 수 있다.

지방산으로는 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레산이 이용될 수 있고, 지방산 알콜로는 세틸 알콜, 옥틸 도데칸올, 올레일 알콜, 판텐올, 라놀린 알콜, 스테아릴 알콜, 헥사데칸올이 이용될 수 있으며 지방산 에스테르로는 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 부틸 스테아레이트가 이용될 수 있다. 계면 활성제로는 당업계에 알려진 양이온 계면활성제, 음이온 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용가능하며 가능한 한 천연물 유래의 계면활성제가 바람직하다.

그 외에도 화장품 분야에서 널리 알려진 흡습제, 증점제, 항산화제 등을 포함할 수 있으며, 이들의 종류와 양은 당업계에 공지된 바에 따른다.

또한 본 발명은, 상기의 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 자가 면역 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 식품 조성물은 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 과자, 떡, 빵 등의 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 독성 및 부작용이 거의 없는 식물추출물로 구성된 것이므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 미세소포체가 식품 조성물에 포함될 때 그 양은 전체 중량의 0.1 내지 50%의 비율로 첨가할 수 있다.

여기서, 상기 식품 조성물이 음료 형태로 제조되는 경우 지시된 비율로 상기 식품 조성물을 함유하는 것 외에 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 즉, 천연 탄수화물로서 포도당 등의 모노사카라이드, 과당 등의 디사카라이드, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜 등을 포함할 수 있다. 상기 향미제로서는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등) 등을 들 수 있다.

그 외 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 50 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

[실시예 1] 톨 유사 수용체 작용제의 플라즈마사이토이드 수지상 세포로의 분화 조절 효과

미성숙 수지상 세포의 분화 중에 톨 유사 수용체 작용제를 처리한 경우, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포로 분화가 유도되는지 확인하기 위하여, 도 1에 나타낸 설계도를 따라 하기와 같이 실험을 수행하였다.

구체적으로, C57BL/6 마우스로부터 골수 채취용 주사를 이용해 대퇴부 골수를 채취하였다. 채취한 골수를 인산화 완충 수용액(Phosphate buffer saline, PBS)으로 세척한 후 염화암모늄을 이용하여 적혈구를 제거하였다. 분리한 세포(3×10⁶cell/웰)를 6-웰 플레이트에서 접종한 뒤, 10% FBS(Fetal bovine serum, 송아지 혈청), 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신, 50μM 머캅토에탄올, 0.1 mM 비필수 아미노산, 1 mM 피루브산 나트륨 및 250 ng/ml FLT3L을 포함하는 RPMI 1640 1ml를 첨가하여 배양 및 분화를 개시하였다. 분화 개시 후 3일째에 Pam3를 100 내지 500ng/ml의 농도로 처리하였다. 분화 개시 후 5일이 경과하였을 때 상기의 RPMI 1640 1ml를 추가적으로 보충해준 후 8일까지 배양하였다. 배양 후 얻어진 세포들을 플라즈마사이토이드 수지상 세포 분리 키트 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)와 자기 세포 분류 시스템(Vario MACS: Miltenyi Biotec, Auburn, CA)을 이용하여 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 85% 이상의 순도로 분리였다(도 2). 상기 톨 유사 수용체 작용제의 처리가 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 분화에 영향을 끼칠 수 있기 때문에 플라즈마사이토이드 수지상 세포에서 특이적으로 유도되는 표면 발현 분자들을 8일째에 확인하여 그 결과를 도 3의 (a)에 나타내었다. 또한, 톨 유사 수용체 작용제를 처리한 경우(TLRs-pDC)에 있어서, 초기 미성숙 수지상 세포의 수 대비 8일 경과 후 얻어진 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 수의 비율을 측정하여 그 결과를 도 3의 (b)에 나타내었다. 단, 상기 톨 유사 수용체 작용제의 분화 조절 효과를 확인하기 위하여 톨 유사 수용체 작용제를 처리하지 않은 경우를 비교예(pDC)로 나타내었다.

도 2에서 보는 바와 같이, 톨 유사 수용체 작용제를 처리하여도 플라즈마사이토이드 수지상 세포로 분화가 유도된 것을 확인할 수 있었고, 분화 효율에 있어서도 미처리한 경우와 차이가 발생하지 않는 것을 확인할 수 있었다.

[실시예 2] 분리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 자극 및 사이토카인의 분비 양상 확인

상기 실시예 1에서 분리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 사이토카인 분비 양상을 확인하기 위하여, 분리한 세포(5×10⁵cell/ml)를 48웰 플레이트에 접종한 뒤 ODN1826 (1 μg/ml)을 처리하여 자극하였다. 24시간이 경과한 후 얻어진 상층액을 분리하고, 효소면역정량법(ELISA, Enzyme Linked Immunosorbent assay)을 통해 사이토카인 분비 양상을 확인하여 그 결과를 도 4에 나타내었다. 단, 톨 유사 수용체 작용제의 처리 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 미성숙 수지상 세포의 분화 중에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하지 않은 경우를 비교예(pDC)로 나타내었다.

도 4에서 보는 바와 같이, 일반적으로 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에서는 I형 인터페론 (IFN-α 및 IFN-β)과 대표적인 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-12p70가 강력하게 유도되었다. 하지만, 톨 유사 수용체 작용제(0.5 μg/ml)를 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)의 경우 ODN1826으로 자극하자 그 발현 수준이 급격하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 면역 억제성 사이토카인인 IL-10의 발현 수준은 톨 유사 수용체 작용제의 처리 후 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)에서 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다.

이를 통하여, 본 발명에 따라 미성숙 수지상 세포에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포와는 달리 면역 관용성을 갖는 것을 알 수 있었다.

[실시예 3] 다양한 톨 유사 수용체 작용제의 처리에 따른 플라즈마사이토이드 수지상 세포에서의 IL-10 분비 양상 확인

다양한 톨 유사 수용체 작용제의 면역 관용성 유도 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 분화를 유도하되, 톨 유사 수용체 작용제로는 하기 표 2에 나타낸 리간드를 사용하였다. 8일 배양 후 플라즈마사이토이드 수지상 세포 분리 키트 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)와 자기 세포 분류 시스템(Vario MACS: Miltenyi Biotec, Auburn, CA)을 이용하여 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 85% 이상의 순도로 분리하였다. 분리된 세포(5×10⁵cell/ml)를 48웰 플레이트에 접종하고, ODN1826 (1 μg/ml)을 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 이후 상층액만을 분리하여 면역 억제성 사이토카인 IL-10의 분비 양상을 효소면역정량법으로 확인하여 그 결과를 도 5에 나타내었다. 단, 톨 유사 수용체 작용제의 처리 효과를 확인하기 위하여, 미성숙 수지상 세포의 분화 중에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하지 않은 경우를 비교예(non)로 나타내었다.

Non	TLR2 작용제	TLR3 작용제	TLR4 작용제	TLR7 작용제	TLR9 작용제
미처리	Pam3	Poly I:C	LPS	이미퀴모드	CpG-ODN

도 5에서 보는 바와 같이, 다양한 톨 유사 수용체 작용제 중 MYD88 시그널을 경유하는 TLR2 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제 및 TLR8 작용제로 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포만이 ODN1826으로 자극하자 IL-10의 발현 수준이 유의하게 증가된 것을 확인할 수 있었다.

이를 통하여 미성숙 수지상 세포의 분화 중에 MYD88 시그널을 경유하는 톨 유사 수용체를 처리하는 경우 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포가 유도되는 것을 알 수 있었다.

[실시예 4] 톨 유사 수용체 작용제의 처리 시점에 따른 플라즈마사이토이드 수지상 세포에서의 사이토카인 분비 양상 확인

톨 유사 수용체 작용제의 처리 시점에 따른 면역 관용성 유도 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 분화를 유도하되, 톨 유사 수용체 작용제를 분화 개시 시점(0 day treatment), 분화 개시일로부터 3일이 경과하였을 때(3 day treatment) 처리하였다. 총 8일 배양 후 플라즈마사이토이드 수지상 세포 분리 키트 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)와 자기 세포 분류 시스템(Vario MACS: Miltenyi Biotec, Auburn, CA)을 이용하여 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 85% 이상의 순도로 분리하였다. 분리된 세포(5×10⁵cell/ml)를 48웰 플레이트에 접종하고, ODN1826 (1 μg/ml)을 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 이후 상층액만을 분리한 뒤 사이토카인의 분비 양상을 효소면역정량법으로 확인하여 그 결과를 그 결과를 도 6에 나타내었다. 단, 톨 유사 수용체 작용제의 처리 효과를 확인하기 위하여, 미성숙 수지상 세포의 분화 중에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하지 않은 경우를 비교예(no-treatment, non)로 나타내었다.

도 6에서 보는 바와 같이, 톨 유사 수용체 작용제를 분화 개시 시점(0 day treatment) 또는 분화 개시일로부터 3일째(3 day treatment)에 처리한 경우 모두, 미처리한 경우(no-treatment)에 비하여 I형 인터페론 (IFN-α 및 IFN-β)과 대표적인 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-12p70의 발현은 억제되고, 항염증성 사이토카인인 IL-10의 발현 수준은 현저히 증가한 것을 볼 수 있었다.

이를 통하여 톨 유사 수용체 작용제를 미성숙 수지상 세포의 분화 개시 시점, 즉 분화 유도용 인자인 FLT3L과 동시에 처리하여도, 분화 중에 처리한 경우와 마찬가지로 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 분화가 유도되는 것을 알 수 있었다.

[실시예 5] 톨 유사 수용체 작용제가 처리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 공동 자극 인자 및 MHC 분자의 발현 확인

플라즈마사이토이드 수지상 세포를 포함한 수지상 세포는 외부 항원 인지 시 T 세포를 활성화시키기 위하여 MHC 분자들을 통해 항원을 제시하고, CD80 및 CD86과 같은 공동 자극 인자를 발현하여 상호작용을 촉진시킨다.

이에 따라, 상기 실시예 1에서 분리한 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 ODN1826으로 자극한 후 24시간 동안 배양한 뒤 상기 세포 표면 분자들의 발현 수준을 확인하였다. 먼저 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 표면 인자 발현에 미치는 영향을 분석하기 위하여, 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 특이적인 마커들인 항-CD11c (PE-Cy7, BD Biosciences), 항-PDCA-1 (PerCP-eFluor　 710, ebioscience)와 세포 표면 분자들에 특이적인 항-CD80 (v450, BD Biosciences), 항-CD86 (APC, ebioscience), 항-MHC-I (PE, ebioscience) 및 항-MHC-II (APC-eFluor　780, ebioscience) 항체를 4℃에서 30분간 처리한 후 유세포 분석기 LSRFortessa x-20 (BD Biosciences)를 통하여 분석하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었다. 단, 톨 유사 수용체 작용제의 처리 효과를 확인하기 위하여, 미성숙 수지상 세포의 분화 중에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하지 않은 경우를 비교예(pDC)로 나타내었다.

도 7에서 보는 바와 같이, 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에서는 공동 자극 인자인 CD86과 외인성 항원 제시를 하는 MHC 클래스 Ⅱ 분자가 높은 수준으로 발현되었으나, 톨 유사 수용체 작용제를 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)의 경우 반응을 보이지 않거나 감소하는 특징을 보여 주었다. 한편, 또 다른 공동 자극 인자 중 하나인 CD80과 내인성 항원이나 교차 항원 제시를 하는 MHC 클래스 I 분자는 톨 유사 수용체 작용제로 처리되어 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)가 처리되지 않은 세포(pDC)보다 더 높은 수준으로 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

[실시예 6] 톨 유사 수용체 작용제가 처리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 면역 관용 유도 분자의 발현 확인

일반적인 수지상 세포는 항원 제시를 통하여 T 세포 반응을 일으켜 후천성 면역 반응을 활성화시키지만, 일부 면역 관용성 수지상 세포의 경우 T 세포의 반응을 억제한다고 보고되고 있다. 이러한 면역 반응의 억제는 최근 다양한 면역 관용 유도 분자들로 예를 들면, PD-L1 및 IDO의 유도를 통해 이루어진다고 보고되고 있다. 또한 CCR9+pDCs은 조절 T 세포의 강력한 유도를 통하여 다양한 면역관용 현상을 유도할 수 있다고 보고되고 있다.

따라서, 이하에서는 상기 실시예 1에서 분리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포에서 면역 관용 유도 분자들의 발현을 확인하기 위하여, 플라즈마사이토이드 수지상 세포에 특이적인 마커들인 항-CD11c (PE-Cy7, BD Biosciences) 및 항-PDCA-1 (PerCP-eFluor　710, ebioscience)과 면역 관용 유도 세포 표면 분자들인 항-PD-L1(PE, ebioscience) 및 항-CCR9 (FITC, ebioscience)과 같은 세포 표면 인자 항체를 4℃에서 30분간 처리하였다. 또한, 세포 내에서 유도되는 IDO의 발현을 측정하기 위해 고정(fixation)/침투(permeabilization) (BD Bioscience)를 4℃에서 30분간 처리한 후 항-IDO (eFluor　 660, ebioscience)를 염색하고 유세포 분석기 LSRFortessa x-20을 이용하여 발현 수준을 분석한 뒤 그 결과는 도 8에 나타내었다. 단, 톨 유사 수용체 작용제의 처리 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 미성숙 수지상 세포의 분화 중에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하지 않은 경우를 비교예(pDC)로 나타내었다.

도 8에서 보는 바와 같이, 톨 유사 수용체 작용제로 처리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 경우, ODN1826으로 자극하자 CCR9 및 IDO 분자 모두 미처리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포에 비하여 발현양이 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었고, CCR9의 경우는 비자극시에도 미처리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포에 비하여 높은 발현 양상을 보였다.

이를 통하여, 미성숙 수지상 세포의 분화 시 톨 유사 수용체 작용제를 처리한 경우, 면역 관용성을 갖는 플라즈마사이토이드 수지상 세포가 분화 유도된 것을 알 수 있었다.

[실시예 7] 톨 유사 수용체 작용제가 처리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 조절 T 세포 유도 능력 확인

면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Tolerogenic pDC)는 조절 T 세포(Regulatory T cell, Treg)로의 분화를 유도하고, 작동 T 세포(effector T 세포)의 활성이나 증식을 억제한다고 보고되고 있다.

따라서, 이하에서는 톨 유사 수용체 작용제를 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)에 의한 조절 T 세포(Foxp3+CD4+ T cells)의 증식 여부를 확인하였다. 구체적으로, 동종이형 마우스에서 분리 후 CellTrace (Invitrogen)로 염색한 T 세포를 상기 실시예 1에서 분리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)와 5:1의 비율로 5일 동안 혼합 배양하였다. 단, 상기 플라즈마사이토이드 수지상 세포로는, ODN1826로 자극(ODN +)된 플라즈마사이토이드 수지상 세포와 미자극(ODN -)된 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 사용하였다. 5일 배양 후, 항-CD4 (Percp-cy5.5, ebioscience)를 4℃에서 30분 동안 처리하고 Foxp3/전사 인자 염색 버퍼(Transcription Factor Staining Buffer)(ebioscience)를 37℃에서 30분 동안 처리하였다. 그 후, 항-Foxp3 (PE, ebioscience)로 처리한 뒤 조절 T 세포로의 증식 여부를 유세포 분석기 LSRFortessa x-20을 통하여 확인한 결과를 도 9의 (a)에 나타내었고, 조절 T 세포의 증식률을 계산하여 그 결과는 도 9의 (b)에 나타내었다. 단, 톨 유사 수용체 작용제의 처리 효과를 확인하기 위하여, ODN1826로 자극(ODN +) 또는 미자극된 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 비교예(pDC)로 나타내었다.

도 9에서 보는 바와 같이, 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)의 경우 조절 T 세포의 증식을 유도하지 못하였고, ODN1826로 자극(ODN +)하자 오히려 조절 T 세포의 증식이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 톨 유사 수용체 자극제로 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)의 경우 ODN1826로 자극한 경우(ODN +)가 미자극한 경우(ODN -)보다 조절 T 세포의 증식이 현저하게 유도된 것을 확인할 수 있었다.

이를 통하여, 본 발명에 따라 분화 유도된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 세포에 톨 유사 수용체 작용제를 추가로 처리한 경우 면역 관용성을 활성화되어 조절 T 세포로의 분화 또한 효과적으로 유도함을 알 수 있었다.

[실시예 8] Rv1411c 단백질의 톨 유사 수용체 작용제로서의 활성 확인

기존 보고에 따르면 결핵균 유래 단백질들은 다양한 톨 유사 수용체에 결합할 수 있다는 보고가 있다. 따라서, 이하에서는 TLR2 넉아웃 마우스와 야생형 마우스의 골수에서 분화시킨 수지상 세포와 Rv1411c 단백질의 결합을 확인하여 Rv1411c 단백질의 톨 유사 수용체 작용제로서의 활성을 확인하였다.

구체적으로, 마우스 골수를 분리하여 적혈구를 제거한 뒤, 수지상 세포의 분화를 위하여 10% FBS, 1% 항생제 및 100ng/ml의 GM-CSF (granulocyte-macrophage-colony stimulating factor)가 함유된 RPMI1640 배양액을 사용하여 8일간 배양하였다. 8일 배양 후 야생형 수지상 세포(WT)와 TLR2 넉아웃 마우스(TLR2-/-)에서 분리한 수지상 세포 각각에 5 μg/ml의 Rv1411c 단백질을 처리한 후 2시간 동안 간헐적으로 섞어주어 단백질의 결합을 용이하게 하였다. 이후 Rv1411c 단백질에 표지된 His분자에 항원-항체 특이성을 가지는 항체로 염색하여 유세포 분석기를 사용하여 결합 정도를 측정하고, 그 결과는 도 10에 나타내었다.

도 10에서 보는 바와 같이, 야생형 수지상 세포(WT)에서는 TLR2 넉아웃 수지상 세포(TLR2-/-)에 비하여 Rv1411c 단백질과의 결합이 증가한 것으로 확인되었으나, TLR2 넉아웃 수지상 세포(TLR2-/-)에서는 Rv1411c 단백질을 처리하였음에도 불구하고 처리하지 않은 실험군과 동일한 결합 정도를 확인하였다.

이를 통하여 Rv1411c 단백질은 TLR2 수용체에 결합하며 TL2 작용제로서 활성을 갖는 것을 확인하였다.

[실시예 9] Rv1411c 단백질의 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 분화 유도능 확인

상기 실시예 1과 동일한 공정으로 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 분화를 유도하되, 톨 유사 수용체 작용제로는 상기 실시예 8에서 톨 유사 수용체 작용제로서의 활성이 확인된 Rv1411c 단백질(O.1 ㎍/ml, 0.5 ㎍/ml)을 사용하였다. 8일 배양 후 플라즈마사이토이드 수지상 세포 분리 키트 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)와 자기 세포 분류 시스템(Vario MACS: Miltenyi Biotec, Auburn, CA)을 이용하여 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 85% 이상의 순도로 분리하였다. 분리된 세포(5×10⁵cell/ml)를 48웰 플레이트에 접종하고, ODN1826 (1 μg/ml)으로 처리한 뒤 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 얻어진 상층액을 분리하여 효소면역정량법(ELISA, Enzyme Linked Immunosorbent assay)을 통해 사이토카인 분비 양상을 확인한 결과를 도 11에 그래프로 나타내었다. 단, Rv1411c 단백질의 처리 효과를 확인하기 위하여, Rv1411c 단백질이 미처리된 것으로, ODN1826로 자극(ODN +) 또는 미자극된(ODN -) 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 비교예(pDC)로 나타내었다.

도 11에서 보는 바와 같이, Rv1411c 단백질로 처리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c(0.1㎍/ml)-pDC, Rv1411c(0.5㎍/ml)-pDC)를 ODN1826으로 자극하자 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포에서 강력하게 유도되는 I형 인터페론(IFN-α 및 IFN-β)과 대표적인 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-12p70의 발현이 농도 의존적으로 급격하게 감소하는 것을 볼 수 있었고, 면역 억제성 사이토카인인 IL-10은 농도 의존적으로 그 발현 수준이 현저히 증가하는 것을 확인하였다.

이를 통하여, Rv1411c 단백질로 처리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포와는 다르게 면역 관용성을 갖는 것을 알 수 있었으며, 상기 Rv1411c 단백질의 처리 농도와 비례하여 면역 관용성의 정도 또한 증가하는 것을 확인하였다.

[실시예 10] Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 공동 자극 인자, MHC 분자 및 면역 관용 유도 분자의 발현 확인

상기 실시예 9에서 Rv1411c 단백질로 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포에서 표면 분자 및 효소의 발현 양상을 확인하였다.

먼저 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 표면 인자 발현 영향을 분석하기 위하여, 플라즈마사이토이드 수지상 세포에 특이적인 마커들인 항-CD11c (PE-Cy7, BD Biosciences) 및 항-PDCA-1 (PerCP-eFluor　 710, ebioscience)와, 항-CD80 (v450, BD Biosciences), 항-CD86 (APC, ebioscience), 항-MHC-I (PE, ebioscience) 및 항-MHC-II (APC-eFluor　780, ebioscience), 항-PD-L1(PE, ebioscience) 및 항-CCR9 (FITC, ebioscience)과 같은 세포 표면 인자 항체를 4℃에서 30분간 처리하였다. 또한 세포 내에서 유도되는 IDO의 발현을 측정하기 위하여 고정(fixation)/침투(permeabilization) (BD Bioscience)를 4℃에서 30분 동안 처리한 뒤, 항-IDO (eFluor　 660, ebioscience)를 처리한 후 유세포 분석기 LSRFortessa x-20을 통하여 분석하여 그 결과를 도 12에 나타내었다. 단, Rv1411c 단백질의 처리 효과를 확인하기 위하여, Rv1411c 단백질이 미처리된 것으로, ODN1826로 자극(ODN +) 또는 미자극된(ODN -) 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 비교예(pDC)로 나타내었다.

도 12에서 보는 바와 같이, ODN1826 자극 시 Rv1411c 단백질로 미처리된 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에서는 공동 자극 인자인 CD86과 외인성 항원 제시를 하는 MHC 클래스 Ⅱ 분자가 높은 수준으로 발현되는 반면, Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC)는 반응을 보이지 않거나 감소하는 특징을 볼 수 있었다.

반면, 또 다른 공동 자극 인자 중 하나인 CD80과 내인성 항원이나 교차 항원제시를 하는 MHC 클래스 I 분자의 경우는, Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC)가 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)보다 더욱 높은 수준으로 발현되는 것을 확인하였다.

또한, Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC)의 경우, ODN1826으로 자극(ODN +) 시 PD-L1, CCR9 및 IDO 분자 모두, 미자극한 경우(ODN -)에 비하여 발현 수준이 증가하는 것을 확인할 수 있었고, CCR9과 PD-L1의 경우는 미자극 시(ODN -)에도 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에 비하여 높은 발현 양상을 나타내는 것을 확인하였다.

[실시예 11] Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 T 세포의 활성 억제

면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 생체 내에서의 가장 중요한 특징은 T 림프구의 활성을 억제하는 것이다. 이에, 상기 실시예 9에서 Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포가 T 세포의 증식과 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.

구체적으로, 동종이형 마우스에서 분리하여 CellTrace (Invitrogen)로 염색한 T 세포(1.5×10⁵cell/well)를 1X의 PMA/Ionomycin (ebioscience)을 통하여 자극을 주었다. 이러한 PMA/Ionomycin의 처리는 T 림프구의 증식 속도를 증가시키며, 인터페론 감마(IFN-gamma)의 분비를 촉진시키게 된다. 이러한 반응들이 이루어질 때 T 세포와 Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC) 또는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)의 비율이 1:5가 되도록 혼합하여 3일간 배양하였다. 3일 후, 항-CD4 (Percp-cy5.5, ebioscience), 항-CD8 (Percp-cy5.5, ebioscience)를 처리하고, 4℃에서 30분간 염색하였다. 유세포 분석기 LSRFortessa x-20을 통하여 T 세포의 증식 정도를 분석하여 그 결과를 도 13에 나타내었다. 또한, 상기 3일 배양 후 얻어진 상층액을 분리한 뒤 효소면역정량법(ELISA, Enzyme Linked Immunosorbent assay)을 통해 IFN-gamma의 분비 양상을 확인하여 그 결과를 도 14에 나타내었다. 단, Rv1411c 단백질의 처리 효과를 확인하기 위하여, Rv1411c 단백질이 미처리된 것으로, ODN1826로 자극(ODN +) 또는 미자극된(ODN -) 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 비교예(pDC)로 나타내었다.

도 13에서 보는 바와 같이, Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC)와 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC) 모두 T 세포의 증식을 유도하였지만, Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC)가 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)보다 CD4+ T 세포에 대한 증식 유도 능력이 훨씬 낮게 관찰되었다.

또한, 도 14에서 보는 바와 같이, Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC)가 미처리된 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에 비하여 낮은 수준으로 IFN-gamma의 분비를 유도하는 것을 확인하였다.

[실시예 12] Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 조절 T 세포 분화 조절

동종이형 마우스에서 분리 후 CellTrace (Invitrogen)로 염색한 T 세포를 상기 실시예 9에서 Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC) 또는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)와 그 비율이 10:1, 5:1 또는 1:1이 되도록 하여 5일 동안 배양하였다. 단, 상기 플라즈마사이토이드 수지상 세포로는 ODN1826로 자극된 것(ODN +)과 미자극 된 것(ODN -)을 사용하였다. 배양 후 5일 째에, 세포들에 항-CD4 (Percp-cy5.5, ebioscience)로 4℃에서 30분간 처리하고 Foxp3/전사 인자 염색 버퍼 (ebioscience)를 37℃에서 30분 동안 처리하였다. 그 후 항-Foxp3 (PE, ebioscience)를 염색하여 유세포 분석기 LSRFortessa x-20을 통해 조절 T 세포로의 증식 여부를 확인하였고, 그 결과는 도 15의 (a)에 나타내었다. 또한, 조절 T 세포의 증식률을 계산하여 그 결과는 도 15의 (b)에 나타내었다.

도 15에서 보는 바와 같이, 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)의 경우 조절 T 세포의 증식을 유도하지 못하였고, ODN1826로 자극하는 경우 오히려 조절 T 세포의 증식이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 반면, Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC)의 경우 ODN1826로 자극하자(ODN +) 미자극한 경우(ODN -)보다 조절 T 세포의 증식을 현저하게 유도함을 확인할 수 있었으며, T 세포 대비 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC)의 비율이 증가할수록 조절 T 세포의 증식률 또한 증가하는 것을 확인하였다.

이를 통하여, 본 발명에 따라 분화 유도된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 세포에 톨 유사 수용체 작용제를 추가로 처리한 경우 면역 관용성을 활성화시켜 조절 T 세포의 증식 또한 효과적으로 유도함을 확인하였다.

[실시예 13] Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포에 의한 작동 T 세포의 활성 억제

조절 T 세포는 면역 관용 수지상 세포를 유도하고 다른 T 세포의 증식을 억제한다고 보고되고 있다. 따라서 이하에서는 상기 실시예 12에 따라 Rv1411c 단백질에 의해 분화 유도된 T 세포의 조절 T 세포로서의 활성을 확인하였다.

먼저 마우스의 비장을 분리한 후 적혈구를 제거한 뒤 자기세포분류시스템(MACS)을 사용하여 CD4+, CD25- 작동 T 세포를 분리해 낸 후 증식 정도를 알아보기 위하여 보라색 증식 염색제(violet proliferation dye)로 염색하였다. 이후 분화된 T 세포를 CD4+, CD25- 작동 T 세포와 함께 항 CD3e와 항CD28 항체로 코팅된 웰에서 2일 동안 배양하였다. 그 결과, CD25- 작동 T 세포 대비 프라이밍된 T 세포의 비율에 대하여 T 세포 증식능의 변화를 측정하여 도 16에 그래프로 나타내었다.

도 16에서 보는 바와 같이, Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포 중 ODN1826으로 자극된 세포(Rv1411c-pDC(ODN))에 의하여 유도된 T 세포만이 작동 T 세포의 분화 정도를 감소시키는 것을 확인하였다.

이를 통하여, 본 발명에 따라 분화 유도된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 세포에 톨 유사 수용체 작용제를 추가로 처리한 경우 면역 관용성을 활성화시켜 작동 T 세포의 활성을 효과적으로 억제함을 확인하였다.

[실시예 14] 톨 유사 수용체 작용제의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 획득 수율

C57BL/6 마우스로부터 골수 채취용 주사를 이용해 대퇴부 골수를 채취하였다. 채취한 골수를 인산화 완충 수용액(Phosphate buffer saline, PBS)으로 세척한 후 염화암모늄을 이용하여 적혈구를 제거하였다. 분리한 세포(5×10⁵cell/웰)를 6-웰 플레이트에서 접종한 뒤, 10% FBS(Fetal bovine serum, 송아지 혈청), 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신, 50μM 머캅토에탄올, 0.1 mM 비필수 아미노산, 1 mM 피루브산 나트륨 및 250 ng/ml FLT3L을 포함하는 RPMI 1640 1ml를 첨가하여 배양 및 분화를 개시하였다. 분화 개시 후 3일째에 톨 유사 수용체 작용제로 Rv1411c 단백질과 Pam3를 100 내지 500ng/ml의 농도로 처리하였다. 분화 개시 후 5일이 경과하였을 때 상기의 RPMI 1640 1ml를 추가적으로 보충해준 후 8일까지 배양하였다. 배양 후 얻어진 세포들을 플라즈마사이토이드 수지상 세포 분리 키트 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)와 자기 세포 분류 시스템(Vario MACS: Miltenyi Biotec, Auburn, CA)을 이용하여 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 85% 이상의 순도로 분리였다. 분리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 수(TLR agonist)를 측정한 결과를 도 17에 그래프로 나타내었다. 단, 톨 유사 수용체 작용제의 처리 효과를 확인하기 위하여, 미성숙 수지상 세포의 분화 중에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하지 않은 경우를 비교예(non)로 나타내었다.

도 17에서 보는 바와 같이, 미성숙 수지상 세포의 분화 중에 톨 유사 수용체 작용제를 처리한 경우(TLR agonist), 미처리한 경우(Non)와 비교하여 분화 유도되는 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 수가 현저히 증가함을 확인하였다.

이를 통하여, 미성숙 수지상 세포의 분화 시 톨 유사 수용체 작용제를 처리한 경우, 대량의 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 제조할 수 있음을 확인하였다.

[실시예 15] 톨 유사 수용체 작용제의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 관절염 치료 효과

1. 콜라겐-유도 관절염 동물 모델의 제작

콜라겐-유도 동물 모델을 제작하기 위하여, 도 18에 나타낸 설계도를 따라 하기와 같이 실험을 수행하였다.

구체적으로, 일반적으로 콜라겐 유도 관절염 질환 동물 모델로 알려진 5주령 DBA1/J 수컷 마우스를 구입하여 SPF 조건하에 1주간 순화시킨 후, 6주령 때에 실험을 실시하였다. 100㎍ 소 유래 타입 콜라겐 (in 0.05M acetic acid)에 동량의 프로인트 완전 면역 보강제(Freund's complete adjuvant) (Chondrex Inc., Redmod, Washington)를 섞어 유화액화한 뒤 100㎕를 상기 마우스의 꼬리 피하 기저부에 주입하였다 (1st Immunization). 21일 후, 부스팅 (Boosting)을 위하여 동일한 유화액을 재주입하였다.

2. 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 준비

상기 실시예 9에서 Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포 및 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 준비한 뒤, 5 μg/ml의 타입 Ⅱ 콜라겐 항원과 1 μg/ml의 ODN1826 (TLR9 작용제)을 이용하여 3시간 동안 자극한 후 수집(harvest)하였다. 상기와 같이 활성화된 면역 관용성 수지상 세포의 주입으로 인한 관절염 치료 효과를 확인하기 위하여, 상기와 같이 2차로 유화액을 제조하는 시점에, 상기 제조한 콜라겐-유도 관절염 질환 동물 모델 마우스의 양쪽 대퇴부에 플라즈마사이토이드 수지상 세포1x10⁶ cell/mice를 나누어 근육 주사(i.m.)로 주입하였다. 7일 후(28일차) 동종 및 동량의 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 한차례 더 재주입하였다. 다만, 상기 Rv1411c 단백질의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 치료 효과를 확인하기 위하여, 음성 대조군으로 인산화 완충 수용액(Phosphate buffer saline, PBA)과, 양성 대조군으로는 0.2 mg/kg의 메토트렉세이트(methotrexate, MTX)를 5% 아라비아 검 (in water)에 현탁시킨 현탁액을 매일 경구 투여하였다.

3. 관절염 증상 평가

각 군별 관절염의 심각도 (Severity)는 3일 마다 육안으로 관찰하여 하기 표 3의 관절염 스코어 (Arthritis score)를 통해 평가하였고, 각각 평가자 (3인)는 암맹 평가로 진행하여 부스팅 후 15일까지 측정하여 그 결과는 도 19에 그래프로 나타내었다. 또한, 각 군별 관절염의 유발율을 측정하여 그 결과는 도 20에 나타내었다.

질환 점수	관절염 증상
0	부종이나 종장이 없다.
1	발 또는 발목관절에 국한된 경한 부종과 발적
2	발목관절에서 족근골(metatarsal)에 걸친 경한 부종과 발적
3	발목관절에서 족근골에 걸친 중등도의 부종과 발적
4	발목에서 다리전체에 걸쳐 부종과 발적이 있는 경우

도 19에서 보는 바와 같이, 콜라겐-유도 관절염 동물 모델 마우스에 음성 대조군으로 인산화 완충 수용액만을 투여한 경우(PBS)와, 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 주입한 경우(pDC)는 관절염의 억제 효과가 없었으나, Rv1411c 단백질 처리를 통해 분화 유도된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-tolpDC)를 주입한 경우는 관절염의 증상이 음성 대조군 대비 대략 86% 정도 억제되는 것을 확인할 수 있었으며, 기존에 관절염 치료제로 알려진 메토트렉세이트를 투여한 경우(MTX)보다도 관절염 억제 효과가 뛰어난 것을 확인하였다.

또한, 도 20에서 보는 바와 같이, 콜라겐-유도 관절염 동물 모델 마우스에 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 주입한 경우(pDC)는 음성 대조군 대비 유병율의 차이를 보이지 않았으나, Rv1411c 단백질 처리를 통해 분화 유도된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)를 주입한 경우는 질환의 발달 시기도 늦어졌고, 유병율이 75% 정도 감소한 것을 확인하였다.

이를 통하여, 본 발명에 따라 분화 유도된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 세포는 관절염의 유발을 억제하고, 그 증상을 완화하는 효과가 있음을 확인하였다.

[실시예 16] 콜라겐 유도 관절염 동물 모델의 관절 조직에서 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 영향

상기 실시예 15와 동일한 방법으로 콜라겐 유도 관절염 동물 모델을 제작한 뒤 음성 대조군으로 인산화 완충 수용액(PBS), 양성 대조군으로 메토트렉세이트(MTX), 또는 상기 실시예 9에서 Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(tolpDC)를 주입하였다.

상기 각 처리된 콜라겐 유도 관절염 동물 모델 마우스의 뒷발을 6일간 4에서 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정시킨 후, 6일간 4에서 암모니아 수용액 (2.52% NH4OH, 14% EDTA-acid)에 탈회시켰다. 조직을 파라핀화시키고 박절기를 통해 조직을 절편화하여 헤마톡실린 (hematoxylin)과 에오신(eosin)을 통해 염색하여 염색된 조직의 사진은 도 21에 나타내었다. 또한, 염색된 조직의 슬라이드 결과에 있어서 관절염 증상의 심각도는 하기 표 4의 기준에 따라 정량적으로 점수화하여 그 결과를 도 22에 나타내었다.

질환 점수	증상
0	정상
1	염증 세포의 침윤(infiltration of inflammatory cells)
2	약한 염증 및 판누스(pannus) 형성
3	중증 염증 및 판누스(pannus) 형성
4	두드러진 침윤
5	심각한 침윤 및 심각한 확산 연골(diffuse cartilage)

도 21에서 보는 바와 같이, 콜라겐-유도 관절염 동물 모델 마우스에 음성 대조군으로 인산화 완충 수용액만을 투여한 경우(PBS)와 비교하여 Rv1411c 단백질 처리를 통해 분화 유도된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 처리한 경우(TLRs-pDC)는 마우스의 관절 조직에서 관절 내 면역 세포의 침투, 연골 조직의 파괴, 뼈의 부식이 상대적으로 크게 감소한 것을 통하여 질환으로 인한 외형적 억제 효과뿐만 아니라 염증 유발로 인한 관절 조직 내 병리학적 완화 효과를 확인하였다.

또한, 도 22에서 보는 바와 같이 콜라겐-유도 관절염 동물 모델 마우스에 Rv1411c 단백질 처리를 통해 분화 유도된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 처리한 경우(TLRs-pDC), 인산화 완충 수용액만을 투여한 경우(PBS) 보다 관절염 중증도가 현저히 감소하였고, 양성 대조군으로 메토트렉세이트를 처리한 경우(MTX)와 거의 동등한 수준의 치료 효과를 보였다.

이를 통하여, 본 발명에 따라 분화 유도된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 세포는 관절염의 증상을 완화하고 더 나아가 치료 효과가 있음을 확인하였다.

[실시예 17] 콜라겐 유도 관절염 동물 모델에서 염증성 사이토카인 생성에 대한 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 영향

상기 실시예 15와 동일한 방법으로 콜라겐 유도 관절염 동물 모델을 제작한 뒤 음성 대조군으로 인산화 완충 수용액(PBS), 양성 대조군으로 메토트렉세이트(MTX), 또는 상기 실시예 9에서 Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)를 주입한 후 마우스의 혈액을 추출하여 염증성 사이토카인인 종양괴사인자-α (TNF-α), 인터루킨-6 (IL-6) 및 인터루킨-17 (IL-17)의 혈중 농도를 측정해 그 결과를 도 23에 나타내었다.

도 23에서 보는 바와 같이, 정상군(Normal) 대비 인산화 완충 수용액만을 투여한 음성 대조군(PBS)에서는 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 IL-17의 농도가 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다. 하지만, Rv1411c 단백질 처리를 통해 분화 유도된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)를 투여한 경우, 음성 대조군(PBS) 대비 TNF-α는 약 48%, IL-6는 약 47%, IL-17는 약 37%의 정도 발현 수준이 유의적으로 감소한 것을 확인하였다.

이를 통하여 본 발명에 따라 분화 유도된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 세포는 염증성 사이토카인의 생산을 억제하여 관절염 질환을 완화시키는 효과가 있음을 확인하였다.

[실시예 18] 콜라겐 유도 관절염 질환 동물 모델에서 관절 조직 내 염증 유발 인자 발현에 대한 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 영향

상기 실시예 15와 동일한 방법으로 콜라겐 유도 관절염 동물 모델에서 Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 주입에 의한 관절 조직 내 염증 유발 인자의 발현 변화를 확인하고자 각각의 특이적인 프라이머(primer)를 이용하여 RT-PCR을 실시하였다.

구체적으로는 상기 실시예 15와 동일한 방법으로 콜라겐 유도 관절염 동물 모델을 제작한 뒤 음성 대조군으로 인산화 완충 수용액(PBS), 양성 대조군으로 메토트렉세이트(MTX), 또는 상기 실시예 9에서 Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(tolpDC)를 주입한 후 마우스의 관절 조직을 갈아 트리졸 시약(trizole reagent)에 용해시켰다. 총 RNA는 Easy-spin total RNA extraction kit (인트론 바이오테크놀로지)를 사용하여 PCR을 수행함으로써 획득하였다. 상기 PCR에서 사용된 프라이머들의 염기서열은 하기 표 5와 같다. 분석 결과는 도 24에 나타내었다.

구분	프라이머	유전자
1	Forward 5-ATGGCAACTGTTCCTGAACTCAAC-3	마우스 IL-1β
2	Reverse 5-CAGGACAGGTATAGATTCTTTCCTTT-3	마우스 IL-1β
3	Forward 5-ATGAAGTTCCTCTCTGCAAGAGACT-3	마우스 IL-6
4	Reverse 5-CACTAGGTTTGCCGAGTAGATCTC-3	마우스 IL-6
5	Forward 5-TCCACCACCATGCAGGTCCC-3	마우스 MCP-1
6	Reverse 5-CAGCAGGTGAGTGGGGCGTT-3	마우스 MCP-1
7	Forward 5-CCTCTTGCTCGTGGCTGCCT-3	마우스 MIP-1
8	Reverse 5-AGTGGCTCCTCCTGCCCTGC-3	마우스 MIP-1
9	Forward 5-CCTCACCATCATCCTCACTGCA-3	마우스 RANTES
10	Reverse 5-TCTTCTCTGGGTTGGCACACAC-3	마우스 RANTES
11	Forward 5-CCAGGTGTGGGGTGCCTGAT-3	마우스 MMP-1
12	Reverse 5-CAAACCTGGGCCTGGCTGGA-3	마우스 MMP-1
13	Forward 5-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3	마우스 GAPDH
14	Reverse 5-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3	마우스 GAPDH

주요 염증유발인자 파라미터는 대표적 염증성 사이토카인인 IL-1β와 IL-6, 염증성 케모카인인 MCP-1 (CCL2), MIP-1 (CCL3) 및 RANTES (CCL5)과, 골관절 파괴에 관여하는 염증성 기질 단백 분해효소(matrix metalloproteinase)인 MMP-1 (collagenase)에 해당한다.

도 24에서 보는 바와 같이, 정상군(Normal) 대비 인산화 완충 수용액만을 투여한 음성 대조군(PBS)의 경우 관절 조직 내 각 염증 유발 인자의 유전자 발현이 증가된 것을 확인할 수 있었다. 반면, Rv1411c 단백질 처리를 통해 분화 유도된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)를 투여한 경우, 순환적 염증성 사이토카인의 조절뿐만 아니라 질환의 타겟인 관절 부위의 염증 유발 인자의 발현 수준을 효과적으로 억제한 것을 확인하였다.

이를 통하여 본 발명에 따라 분화 유도된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 세포는염증 유발 인자의 발현을 억제하여 관절염 질환을 완화시키는 효과가 있음을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

미성숙 수지상 세포에 톨 유사 수용체 작용제(toll-like receptor agonist)를 처리하여 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포(plasmacytoid dendritic cells, pDC)를 제조하는 단계를 포함하는, 자가 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,

상기 톨 유사 수용체 작용제는 상기 미성숙 수지상 세포의 분화 개시 이전 또는 분화 중에 처리되어, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포로의 분화를 유도하는, 자가 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,

상기 톨 유사 수용체 작용제는 상기 미성숙 수지상 세포의 분화 개시 시점으로부터 분화 완료 이전에 처리되는, 자가 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.
제2항 또는 제3항에 있어서,

상기 미성숙 수지상 세포의 분화는 분화 유도용 인자를 사용하여 수행되는, 자가 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.
제4항에 있어서,

상기 분화 유도용 인자는 FMS-유사 티로신 키네이즈 3 리간드(FMS-like tyrosine kinase 3, Flt3L)인, 자가 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.
제4항에 있어서,

상기 분화 유도용 인자는 상기 미성숙 수지상 세포에 1회 이상 처리되는, 자가 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,

상기 톨 유사 수용체 작용제는 상기 분화 유도용 인자와 동시에 상기 미성숙 수지상 세포에 처리되는, 자가 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,

상기 톨 유사 수용체 작용제는 1회 이상 처리되는, 자가 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,

상기 톨 유사 수용체 작용제는 MyD88(Myeloid differentiation primary response gene 88) 시그널을 경유하는 것인, 자가 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,

상기 톨 유사 수용체 작용제는 TLR2 작용제, TLR4 작용제, TLR5 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, TLR9 작용제, TLR11 작용제, TLR12 작용제 및 TLR13 작용제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 자가 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.
제10항에 있어서,

상기 톨 유사 수용체 작용제는 TLR1 작용제 및 TLR6 작용제 중 적어도 하나를 추가로 더 포함하는, 자가 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.
제2항에 있어서,

상기 분화 유도된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포에 톨 유사 수용체 작용제를 추가로 처리하여 면역 관용성을 활성화시키는 단계를 더 포함하는, 자가 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.
제12항에 있어서,

상기 면역 관용성을 활성화시키기 위하여 사용되는 상기 톨 유사 수용체 작용제는 TLR9 작용제인, 자가 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,

상기 자가 면역 질환은 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 패혈증성 쇼크, 알러지성 천식, 알러지성 비염, 아토피성 피부염, 궤양성 대장염, 누선염, 알츠하이머 질환, 뇌졸중, 동맥경화증, 혈관 재협착, I형 당뇨병, II형 당뇨병, 담마진, 결막염, 건선, 전신성염증반증후군, 다발성근염, 피부근염, 결절성 다발관절염, 혼합결합 조직증, 쉐그렌증후군, 통풍, 파킨슨병, 근위축성측색경화증, 당뇨성망막증, 다발성경화증, 크론병, 만성 갑상선염, 세리아크병, 중증근무력증, 심상성천포창, 바이러스질환, 세균성질환, 방사선에 의한 장해, 동맥경화, 혈관종, 혈관섬유종, 재관류장해 및 심장비대증으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 자가 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.
미성숙 수지상 세포에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하여 유도된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 포함하는, 자가 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제15항에 있어서,

상기 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포는, 상기 미성숙 수지상 세포의 분화 개시 이전 또는 분화 중에 상기 톨 유사 수용체 작용제가 처리되어 분화 유도된 것인, 자가 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제15항에 있어서,

상기 톨 유사 수용체 작용제는 TLR2 작용제, TLR4 작용제, TLR5 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, TLR9 작용제, TLR11 작용제, TLR12 작용제 및 TLR13 작용제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 자가 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제17항에 있어서,

상기 톨 유사 수용체 작용제는 TLR1 작용제 및 TLR6 작용제 중 적어도 하나를 추가로 더 포함하는, 자가 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제15항에 있어서,

상기 자가 면역 질환은 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 패혈증성 쇼크, 알러지성 천식, 알러지성 비염, 아토피성 피부염, 궤양성 대장염, 누선염, 알츠하이머 질환, 뇌졸중, 동맥경화증, 혈관 재협착, I형 당뇨병, II형 당뇨병, 담마진, 결막염, 건선, 전신성염증반증후군, 다발성근염, 피부근염, 결절성 다발관절염, 혼합결합 조직증, 쉐그렌증후군, 통풍, 파킨슨병, 근위축성측색경화증, 당뇨성망막증, 다발성경화증, 크론병, 만성 갑상선염, 세리아크병, 중증근무력증, 심상성천포창, 바이러스질환, 세균성질환, 방사선에 의한 장해, 동맥경화, 혈관종, 혈관섬유종, 재관류장해 및 심장비대증으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 자가 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
미성숙 수지상 세포에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하여 유도된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 포함하는, 자가 면역 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
미성숙 수지상 세포에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하여 유도된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 포함하는, 자가 면역 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.