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    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1164—NK cells

Definitions

  • the present invention relates to a technique for culturing natural killer cells (NK cells) applied to immunotherapy, and more particularly, to a method for culturing natural killer cells (NK cells) Efficiently amplifying and activating the NK cells and increasing the proportion of NK cells, and determining the use of the serum according to the use, and optionally culturing the serum-free or non-serum-containing culture medium Kit, an immunocyte culture method using the kit, a serum-free immune cell culture fluid obtained by the kit or the culture method, and a cosmetic composition comprising the culture medium.
  • NK cells natural killer cells
  • the mammalian immune system consists of a number of unique cells that act to defend the host from infected bacteria, viruses, toxins, and other non-host substances.
  • Cell types that play a major role in the specificity of the immune system are called lymphocytes, and lymphocytes include NK cells called B cells and T cells and natural killer cells.
  • T cells are termed thymocyte, B cells are named in the bone marrow, and NK cells are born with the ability to distinguish exactly from others when they are born, (NK) cells.
  • NK NK cells
  • the T-helper cell population determines two immunological pathways, Th1 and Th2.
  • Th1 cells are characterized by their ability to elevate cell-mediated immune responses. Th1 cells produce cytokines IL-2 and interferon-y. Th2 cells are also CD4 + cells, but they are distinct from Th1 cells. Th2 cells are responsible for antibody production and produce the cytokines IL-4, IL-5, IL-10 and IL-13. These cytokines play an important role in interfering with Th1 and Th2 responses.
  • NK cells are large granular lymphocytes (LGLs), a characteristic form of lymphocytes, that are excellent in killing infected viruses and tumor cells, and do not kill most normal cells
  • LGLs large granular lymphocytes
  • NK cells respond to cytokines such as IL-2, IL-12, and interferon, thereby enhancing cytotoxicity, secretory, and proliferative functions.
  • the phenotype of NK cells is CD16 (Fc ⁇ RIII) and CD56 in humans, and CD16 and CD56 are used as markers for NK cells because they do not have TRC (T-cell receptor complex) on the cell surface.
  • NK cells are known to play an important role in early organism defense mechanisms and tumor immunity of the human body.
  • NK cells can kill specific auto-cells, allogeneic cells, and even xenogeneic cancer cells without immunological acquisition by the expression of major histocompatibility complex (MHC), especially when expressing or expressing Class 1 MHC You can kill target cells that do not.
  • MHC major histocompatibility complex
  • NK cells can effectively kill most cancer cells that do not express MHC, as well as kill some virus-infected cells and bacteria such as salmonella typhi.
  • NK cells which excellently act on cancer cells, represent only 5 to 25% of peripheral blood lymphocytes even when they are normal people.
  • the proportion of NK cells decreases to less than 5%
  • NK cells In the activation and proliferation of immune cells, particularly NK cells, antibodies such as IL-2 and other cytokines and CD3 are used.
  • the current technology is the CD3 antibody, which plays a very important role in the proliferation of immune cells.
  • the problem is that it is very difficult to activate immune cells using this antibody. That is, the current common technique for immune cell culture is to immobilize CD3 antibody in a flask and to stimulate it for a certain time.
  • immune cells vary in susceptibility to each individual and vary greatly depending on cell culture conditions or the skill level of the operator. For example, when the stimulation of the CD3 antibody is low or almost not, the immune cells do not proliferate.
  • NK cells hardly proliferate and NKT cells or T cells proliferate. In this case, since T cells are particularly proliferated, it is not easy to obtain a large number of NK cells.
  • the current method generally used is to firstly stimulate CD3 antibody, It is difficult to obtain proliferated NK cells in large quantities which are highly influenced and activated.
  • cytokines ⁇ -interferon, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, etc.
  • IL-2, IL-8, IL-12, IL-18, etc. inhibit the overproduction of Th2 cytokines as well as skin immunity, It can be used very effectively for the treatment of inflammation.
  • IL-8 which is mass produced in NK cells, aggregates mononuclear cells in the blood and differentiates them into macrophages.
  • the macrophage first acts to remove the antigen, but there is no more antigen to be removed, or it is converted to M2a type by IL-4, and the M2a-type macrophage has several kinds of Related factors (TGF-beta, bFGF, PDGF, VEGF, MMPs, TIMPs).
  • TGF-beta bFGF
  • PDGF PDGF
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • MMPs TIMPs
  • IL-8 can effectively combat keratinocytes to the epidermis, effectively keeping the skin layer strong and healthy, and effectively preventing external infiltration, thereby improving or treating skin diseases.
  • IL-8 alone or IL-8 and IL-4 or interferon gamma obtained through easily obtainable recombinant technology are mixed, IL-4 is converted into M2a-type macrophages by IL-8-stimulated macrophages So that the wound treatment and skin care effect can be enhanced.
  • the rate of immune cell death is faster than the rate of immune cell proliferation after 2 weeks from the time of culture, and after 3 to 4 weeks, It becomes hard to find. Therefore, the immune cells are usually obtained by extracting lymphocytes from the blood, culturing the extracted lymphocytes for 2 weeks to obtain the proliferated immune cells, and using the obtained immune cells or the culture medium as it is or after freezing. As a result, a large amount of blood is required to obtain a large amount of immune cells or an immune cell culture solution.
  • serum is generally used in immunocyte culturing.
  • a culture solution obtained by using serum of another person or animal is used as a cosmetic composition or therapeutic agent, there is a risk of infection of an unknown disease due to serum use This is a difficult problem, and a culture solution containing no serum is urgent required.
  • the available lifespan of immune cells is within 24 hours after the blood collection. That is, the life span is short and after one day after the blood collection, the cells are weakened rapidly and cell culture becomes difficult. These problems make it difficult to obtain donor blood.
  • a method capable of culturing weakened immune cells by culturing and recovering immune cells in a leukocyte removal filter that is discarded in the preparation of a transfusion blood preparation or in an immune cell obtained from a person who has passed time after blood sampling or is weak in immunity Is required.
  • the inventor of the present invention has found that, after fixing the anti-CD3 antibody and reacting it for a certain period of time, the present invention does not perform the step of removing the antibody, and furthermore, the original weak immunocyte or the immune cell of the elderly
  • the present invention has been accomplished by developing a method for stably amplifying NK cells in a lymphocyte culture even in immune cells of cancer patients.
  • the present invention provides a stable immune cell culture method in which the specific gravity of T cells is low and the specific gravity of NK cells is remarkably high in the finally obtained lymphocyte culture solution even when the cells are cultured.
  • Still another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition which is effective as a therapeutic agent for wounds such as wound and burn, and treatment of skin diseases by including a serum-free immune cell culture fluid having a high concentration such as interleukin-8 and interferon gamma as an active ingredient will be.
  • the object of the present invention is not limited to the above-mentioned objects, and although not explicitly mentioned, the object of the invention which can be recognized by a person skilled in the art from the description of the detailed description of the invention .
  • the present invention relates to a B unit composed of a basic solution comprising IL-2, L-glutamine and a medium for cell culture; And a solution of the cytokine 1-1 formed by dissolving the IL-12 and IL-18 in the base solution such that the IL-12 contains a concentration of 0.5 to 5 ng / mL and the IL-18 contains the concentration of 2 to 50 ng / C1-1 unit; And a solution of the cytokine 1-2 formed by dissolving the IL-12 and IL-18 in the base solution such that the IL-12 contained at a concentration of 5.1 to 15 ng / mL and the IL-18 at a concentration of 30 to 120 ng / C1-2 unit; A C2 unit consisting of a cytokine 2 solution formed by dissolving said IL-15 in said basic solution such that IL-15 is contained at a concentration of 10-50 ng / mL; An A1 unit consisting of a solution of antibody
  • the A1 unit is first added to the lymphocyte culture medium rather than the D unit.
  • the anti-CD16, anti-CD56, and basic solution contained in the A1 unit are separated and packaged and mixed in the medium addition step to form the antibody 1 solution.
  • the anti-CD16, anti-CD56 and basic solution of the antibody 1 solution contained in the A2 unit and the basic solution are separately packaged and mixed in the medium addition step to form the antibody 2 solution .
  • the anti-CD3 and cytokine 1 solutions contained in the D unit are separately packaged and mixed in the medium addition step to form the antibody-cytokine mixed solution.
  • the units are selected from the group consisting of C1-1 unit, C2 unit, A1 unit, D unit, C1-1 unit, A2 unit, C2 unit, A2 unit, B unit and C1-2 unit, Or the order of C1 unit, C1 unit, A1 unit, D unit, C1-1 unit, A2 unit, C2 unit, A2 unit, B unit and C1-2 unit, , The C1-1 unit, the A2 unit, the C2 unit, the A2 unit, the B unit and the C1-2 unit, or the order of C2 unit, A1 unit, D unit, C1-1 unit, A2 unit, C2 unit, A2 unit, B Unit and the C1-2 unit in that order to the lymphocyte culture medium.
  • the present invention also relates to a method for the treatment of cancer, comprising the steps of: adding at least one of a cytokine 1-1 solution of a C1-1 unit and a cytokine 2 solution of a C2 unit to a separate lymphocyte; A second step of adding the antibody 1 solution of the A1 unit to the medium in which the first step is performed; A third step of adding a D-unit antibody-cytokine mixed solution to the medium in which the second step is performed; A fourth step of adding a cytokine 1-1 solution of C1-1 unit to the medium in which the third step is performed and then adding autologous plasma; A fifth step of adding the A2 solution of antibody 2 to the medium in which the fourth step is performed and then adding autologous plasma or FBS; A sixth step of adding C2 solution of cytokine 2 to the medium in which the fifth step is performed and then adding autologous plasma or FBS; And a seventh step of adding A2 solution of antibody A2 and autologous plasma or FBS to the medium in which the sixth system is
  • the seventh step is performed by adding the basic solution of B unit and the autologous plasma or FBS to the medium on which the seventh step is performed, and culturing; And a ninth step of adding autologous plasma or FBS to the medium in which the eighth step is performed, and then culturing the cells in a large-capacity cell culture container containing the cell culture medium.
  • the isolated lymphocytes are separated from blood one day or more after blood collection.
  • the seventh step or the ninth step is separated into a cell and a serum culture solution; An eleventh step of washing cells separated in step 10; A step 12 in which the cell washed in step 11 is placed in a new culture container, and a basic solution of the B unit is added and cultured; And a 13th step of culturing the medium in which the step 12 is performed in a large-capacity cell culture container containing the cell culture medium and adding a cytokine 1-2 solution of C1-2 unit.
  • the autologous plasma comprises more than 40 usp units of heparin per ml of plasma.
  • the added autologous plasma or FBS content is less than 10% by volume of the total medium.
  • the present invention also provides an immune cell culture solution cultured by any one of the above-mentioned culturing methods.
  • the present invention also provides a serum-free immune cell culture obtained from an immune cell culture solution cultured with any of the above-mentioned media addition kits or an immune cell culture solution cultured by the culture method.
  • the present invention also relates to the above-described serum-free immune cell culture fluid; And a cosmetic base.
  • the serum-free immune cell culture fluid acts as an active ingredient in at least one of inflammation improvement, skin whitening, pigmentation elimination, and skin regeneration.
  • the serum-free immune cell culture fluid is contained in an amount of 50% by weight or less based on the total composition.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for the treatment of wounds or skin diseases comprising burns and wounds comprising the serum-free immune cell culture fluid described above.
  • the present invention has the following excellent effects.
  • the kit for culturing an immune cell culture medium of the present invention removes the cumbersome process of culturing the lymphocytes (immune cells) for a predetermined time while immobilizing the anti-CD3 antibody in a culture container, And NK cells can be stably amplified and mass-proliferated in the lymphocyte culture solution finally obtained at the same time.
  • the immunocyte culturing method of the present invention can be carried out by sequentially using the additives constituting the unit contained in the medium addition kit, that is, by specifying the sequence of stimulating the lymphocytes, the original weakly immune cells or the immune cells of the elderly Even when the immune cells of cancer patients are cultured, the specific gravity of T cells is low and the specific gravity of NK cells can be remarkably increased in the finally obtained lymphocyte culture solution.
  • NK cells can be cultured very easily by standardizing a culture medium additive to be added in a culture step so that NK cells can be proliferated at a remarkably high rate in lymphocyte culture.
  • a serum-free immune cell culture medium having a high concentration such as interleukin-8 and interferon gamma is contained as an effective ingredient, and the effect of the skin whitening and the skin regenerating effect is improved.
  • a serum-free immune cell culture fluid having a high concentration such as interleukin-8 and interferon gamma is contained as an active ingredient, and the effect is excellent in wound healing of wounds and burns, and treatment of skin diseases.
  • FIGS. 1 and 2 are photographs showing progress of inflammation and removal of pigmentation obtained by applying the cosmetic composition according to an embodiment of the present invention to acne areas.
  • FIG. 3 is a progressive photograph showing the effect of improving the inflammation and removing the pigmentation obtained by applying the cosmetic composition according to the embodiment of the present invention to a red spot formed by binding to an acid insect.
  • FIG. 4 is a progressive photograph showing the effect of improving the inflammation and removing the pigmentation obtained after applying the cosmetic composition according to the embodiment of the present invention to the allergen-producing region.
  • FIG. 5 is a progressive photograph showing the effect of removing inflammation and removing pigmentation, which is obtained after applying the cosmetic composition according to the embodiment of the present invention to a wide area where allergies occur at different time intervals.
  • FIG. 6 is a progressive photograph showing the skin regeneration effect obtained after applying the pharmaceutical composition according to the embodiment of the present invention to an image region.
  • first, second, etc. may be used to describe various elements, but the elements should not be limited by the terms. The terms are used only for the purpose of distinguishing one component from another.
  • first component may be referred to as a second component, and similarly, the second component may also be referred to as a first component.
  • serum-free immunocyte culture solution means a residue obtained by isolating an immune cell from a serum-free immune cell culture solution. Therefore, the serum-free immune cell culture fluid can be obtained by separating the immune cells from the serum-free immune cell culture fluid, and includes secondary metabolites of immune cells such as cytokines.
  • NK cell was used to include both NK cell and NKT cell.
  • the technical feature of the present invention is that the anti-CD3 antibody is immobilized in a culture container in order to stimulate lymphocytes and it is possible to determine whether the serum is contained selectively in a large-scale culture process without the cumbersome process of culturing the lymphocytes (immune cells)
  • the present invention relates to a method for the production of immunoglobulin G, which is capable of stably amplifying and proliferating NK cells in a final lymphocyte culture even when cultured with immune cells of the elderly immune cells or severe cancer patients, A cell culture medium addition kit, a culture method using the medium addition kit, and a use method of the product obtained from the culture solution.
  • NK cell-based immune cells when NK cell-based immune cells are cultured, antibodies such as CD3, CD16, and CD56 are generally used. If the cells are weakly stimulated, the cells often die more quickly. This is thought to induce apoptosis when a large stimulus is applied directly to the weakened cells.
  • the present invention is focused on the fact that, when the NK cell-based immune cells are cultured, the weakened cells are actively activated first and then the cells are proliferated without dying when the antibody is stimulated.
  • NK cell-based immune cells when NK cell-based immune cells are cultured, a mixture of IL-12 and IL-18 or a mixture of IL-12 and IL-15 or IL-15 alone or a mixture of IL-
  • cytokines such as interferon gamma were secreted.
  • These cytokines found that immune cells were restored and activated much, and when weakened immune cells were stimulated with antibodies in the activated state (anti-CD16 and anti NK cells, T cells, etc.) were proliferated as expected when stimulated with CD56 and then stimulated with anti-CD3 or stimulated with only anti-CD3.
  • the immune cells can be stimulated simply by adding the antibody to the medium without using the immobilized antibody.
  • immature progenitor cells that have not yet matured are stimulated with anti-CD16 and anti-CD56 antibodies to induce differentiation into NK cells
  • NK cells were proliferated without stimulation until the anti-CD3 antibody was degraded and disappeared in the culture medium. From the results of the experiment, It can be seen that the lymphocyte can be cultured in a very high proportion of NK cells without the cumbersome process of culturing the lymphocytes (immune cells) for a predetermined time while immobilizing the anti-CD3 antibody in the culture container to stimulate the lymphocytes.
  • immune cells can be cultured well, even if they are originally weak immune cells, for example immune cells of elderly or severe cancer patients. Particularly, when blood for blood transfusion is manufactured, leukocyte is filtered and removed, and thus it is very useful for recovering and culturing lymphocytes in a leucocyte removal filter.
  • the serum-free immunocyte culture medium supplement kit of the present invention is packaged individually so that it can be added to the medium at each step of the lymphocyte culture, and the contents, that is, , C2 unit, A1 unit, A2 unit and D unit.
  • these components were determined in consideration of the influence on the lymphocyte culture medium so that most of the cultured cells could be NK cells even when the weakened lymphocytes were cultured in the lymphocyte culture.
  • the culture medium for serum-free immune cell culture of the present invention can stably proliferate NK cells at least 500 to 5000 times as compared with the conventional culture method when culturing the lymphocytes isolated with blood more than one day after blood collection ,
  • the order in which these units are added to the lymphocyte culture medium and used may be configured to follow any of the following four schemes.
  • the B unit is composed of a basic solution, which contains IL-2, L-glutamine and a cell culture medium.
  • the content of IL-2 may be 100 ng / mL to 300 ng / mL, preferably 200 to 250 ng / mL (3240 IU / mL to 4000 IU / mL).
  • IL-2 is a glycoprotein with a molecular weight of 14-17 kDa, which is produced when T cells are recognized and activated by an antigen.
  • the IL-2 is secreted outside the T cell, And promote the growth of the T cell.
  • IL-2 also acts on NK cells, promoting growth, enhancing the killing capacity of NK cells, and acting on B cells to promote its growth.
  • L-Glutamine is a component acting as a nutrient for immune cell culture, and the cell culture medium may be a known medium as a basic medium for floating cell culture.
  • unit B As a specific example of the unit B, 2 mg of IL-2 and 100 ml of a 500 mM L-glutamine solution are added to a basic culture medium for floating cell culture (commercially available cell culture medium, if IL-2 or L-glutamine is already present in the basic medium And the amount thereof is adjusted so as to adjust the final concentration) to obtain a final solution of 10 L to prepare a base solution (unit B).
  • a basic culture medium for floating cell culture commercially available cell culture medium, if IL-2 or L-glutamine is already present in the basic medium And the amount thereof is adjusted so as to adjust the final concentration
  • the C1-1 unit is composed of cytokine 1-1 solution, which contains IL-12, IL-18 and base solution.
  • IL-12 may be contained at a concentration of 0.5 ng / mL to 5 ug / mL, preferably 1-3 ng / mL, more preferably 1.5 ng / 2.5 ng / mL.
  • IL-18 may be included at a concentration of 2 ng / mL to 50 ng / mL, preferably at a concentration of 6 ng / mL to 20 ng / mL, more preferably at a concentration of 11 ng / mL to 15 ng / mL.
  • the C1-2 unit is composed of a cytokine 1-2 solution, which contains IL-12, IL-18 and base solution in the same manner as the cytokine 1-1 solution, This is different.
  • IL-12 in the cytokine 1-2 solution may be contained at a concentration of 5.1 ng / mL to 15 ug / mL, preferably at a concentration of 6-12 ng / mL, more preferably 8 ng / mL to 10.5 ug / mL.
  • IL-18 may be included at a concentration of 30 ng / mL to 120 ng / mL, preferably at a concentration of 40 ng / mL to 80 ng / mL, more preferably at a concentration of 50 ng / mL to 70 ng / mL.
  • IL-12 is produced in dendritic cells (DC), macrophages, and B cells.
  • DC dendritic cells
  • IL-12 induces the production of IFN- ⁇ and TNF- ⁇ in NK cells and T lymphocytes, and reduces the production of IL-4, which inhibits IFN- ⁇ . It also increases the cytotoxicity of NK cells and CD8 + cytotoxic T lymphocytes.
  • IL-12 is closely related to the IL-2 signaling pathway in NK cells.
  • IL-2 induces the expression of IL-12 receptor ⁇ 1 and IL-12 receptor ⁇ 2 in NK cells to activate and activate IL-12 signaling-related proteins. This mechanism was well demonstrated in IFN- ⁇ production ability and target cell killing ability of NK cells.
  • IL-12 receptor ⁇ 2 appears to play an important role in IL-12 function, which has been reported to inhibit the development of Th2 and promote the development of Th1.
  • IL-12 signaling in T cells and NK cells is involved in the JAK-STAT signaling pathway and the activity of IL-12 receptor beta2 plays an important role in inducing and activating the phosphorylation of the transcription factor STAT4.
  • IL-18 is also produced by macrophages and is a proinflammatory cytokine gene. IL-18 binds to the IL-18 receptor and, together with IL-12, causes an immune response to cells infected with bacteria or viruses and increases the production of IFN- ⁇ in NK cells and T cells.
  • C1-1 unit As a specific example of the C1-1 unit, 10 ug of IL-12 and 50 ug of IL-18 were dissolved in water to make 10 ml, and cytokine solution (concentration of IL-12: concentration of IL-18: 5 ug / ml) Then 1 mL of the cytokine solution was dissolved in 500 mL of the basic solution to prepare a cytokine 1-1 solution (C1-1 unit) such that IL-12 was contained at a concentration of 2 ng / mL and IL-18 was contained at a concentration of 10 ng / mL. Can be prepared.
  • the C2 unit is composed of a cytokine 2 solution, the cytokine 2 solution having a configuration comprising IL-15 and a base solution.
  • the amount of IL-15 in the cytokine 2 solution may be 10 to 50 ng / mL, preferably 15 ng / mL to 25 ng / mL.
  • IL-15 is a multifunctional cytokine belonging to four helix bundle cytokine family. It acts on many kinds of cells and plays an important role in proliferation, survival and differentiation.
  • IL-15 is expressed in a wider variety of cells, and thus can be more broadly and more variously regulated than IL-2. In particular, it affects each phase of the immune response and acts on many types of cells involved in each stage of the immune response.
  • a series of studies have shown that IL-15 is directly involved in the formation of memory T cells It is arguing.
  • the cytokine 2 solution (C2 unit) can be prepared by dissolving IL-15 in a basic solution to a concentration of 20 ng / mL.
  • the A1 unit consists of a solution of antibody 1, which contains anti-CD16, anti-CD56 and base solution.
  • the content of anti-CD16 and anti-CD56 in the antibody 1 solution constituting the A1 unit may be 0.1 ⁇ 2.0 ug / mL, preferably 0.5 ⁇ 0.7 ug / mL, respectively.
  • CD16 and CD56 are surface proteins of NK cells.
  • CD16 antigen is added to NK cells to cause signal transduction.
  • Transferrin receptors such as the alpha chain of the IL-2 receptor, or tumor necrosis factor (TNF) or IFN-y can be produced.
  • the anti-CD56 antibody also performs a function similar to that of the anti-CD16 antibody.
  • the unit A1 6 ul of the anti-CD16 and anti-CD56 solutions (1 mg / ml) are respectively dissolved in 10 ml of the base solution to prepare the antibody 1 solution (A1 unit).
  • the A2 unit is composed of a solution of antibody 2, which can contain the antibody 1 solution: base solution in a volume ratio of 1: 6 to 10, Antibody solution 2 can be prepared.
  • the base solutions may be separately packaged separately and mixed in the medium addition step to form antibody 1 solution and antibody 2 solution, respectively.
  • the D unit is composed of an antibody-cytokine mixed solution, wherein the antibody-cytokine mixed solution may contain anti-CD3 and cytokine 1 solution.
  • the content of the anti-CD3 may be 1 ug / mL to 12 ug / mL, preferably 3 ug / mL to 8 ug / mL, and more preferably 4 ug / mL to 5 ug / mL.
  • T cells are activated upon receipt of a signal through the TCR, but the TCR alpha or beta chain can not carry the activation signal by itself and deliver the signal through the CD3 chain around the TCR.
  • the CD3 antigen acts to transmit the signal into the cell.
  • the TRC binds to the MHC + antigen
  • the CD3 antigen gives a signal into the cell.
  • the TCR binds to the CD3 antigen ( ⁇ , ⁇ , ,? or?).
  • an antibody-cytokine mixed solution can be prepared by dissolving 5 uL of an anti-CD3 solution (1 mg / mL) in 1 mL of a cytokine 1 solution.
  • the anti-CD3 and cytokine 1 solutions constituting the D unit to extend the period of use may be separately packaged separately and mixed in the medium addition step to form an antibody-cytokine mixed solution. In this case, the period of use may be extended for more than six months.
  • the immunocyte culture method using the culture medium for serum-free immunocyte cultivation of the present invention comprises adding cytokine 1-1 solution of C1-1 unit and cytokine 2 solution of C2 unit to a separate lymphocyte
  • a first step of adding plasma A second step of adding the antibody 1 solution of the A1 unit to the medium in which the first step is performed;
  • the method of culturing an immune cell of the present invention described above can be carried out by the following two methods so that the immune cell culture solution finally obtained according to the application may or may not contain serum.
  • step 8 is performed by adding the basic solution of B unit and the autologous plasma or FBS to the medium on which the seventh step is performed and culturing; And a ninth step of adding autologous plasma or FBS to the medium in which the eighth step is performed, and then culturing the cells in a large-capacity cell culture container containing the cell culture medium.
  • the 10th step of separating the culture medium in which the seventh or ninth step has been performed into a cell and a serum culture solution An eleventh step of washing cells separated in step 10; A step 12 in which the cell washed in step 11 is placed in a new culture container, and a basic solution of the B unit is added and cultured; And the step of culturing the medium in which the step 12 is performed is placed in a large-capacity cell culture container containing the cell culture medium and the cytokine 1-2 solution of C1-2 unit is added and cultured .
  • steps 14 and 15 may be repeated one or more times to obtain a serum-free secondary culture solution, serum-free tertiary culture solution, and the like.
  • Cell cultures can be obtained in a batch of 3 to 4 liters or more.
  • the lymphocytes isolated in the first step may be separated from blood one day or more after the blood collection, or may be weak immune cells such as immune cells of the elderly or severe cancer patients, The content is less than 10% by volume of the total medium.
  • the third step should be performed after allowing the lymphocytes to sufficiently stimulate with anti-CD16 and anti-CD56 in the presence of antibody 1 solution, that is, in the presence of IL-2, D solution was added to the medium without immobilization, and the anti-CD3 antibody was degraded in the culture medium until stimulation was given, but NK cells were proliferated without any particular problem.
  • the autologous plasma added in the incubation step of the present invention contains at least three times more heparin than the amount of heparin contained in the autologous plasma used in the known culture method.
  • the blood does not clot, but when cells are added to the cell culture at 158 usp unit per 5 ml of plasma, the cells are not well cultured due to the coagulation.
  • the present invention it was confirmed that when the heparin was used at least three times as much as the usual amount, the cells could be cultured well without solidification.
  • the autologous plasma used in the culture method of the present invention may contain 40 usp unit or more, preferably 50-60 usp unit or more of heparin per 1 ml of plasma.
  • Interleukin-8 various growth factors and interferon gamma.
  • the concentration of interleukin-8 may be 100-20000 pg / mL, and the concentration of interferon gamma may be 400-400000 pg / mL.
  • the serum-free immune cell culture fluid obtained by separating only the immune cells from the serum-free culture medium contains the wound treatment including burns and wounds, dermatitis caused by allergies A skin disease treatment, and a skin cosmetic.
  • the cosmetic composition of the present invention is effective for at least one of skin whitening, pigmentation removal and wrinkle improvement by the action of interleukin-8 and interferon gamma by including a serum-free immune cell culture fluid and a cosmetic ingredient.
  • the serum-free immune cell culture fluid may be used in an amount of 0.1 to 50% by weight based on the total weight of the cosmetic composition
  • the IL-8 is preferably 1 pg / mL to 1200 pg / mL
  • the interferon gamma is preferably 5 pg / mL to 15000 pg / .
  • the inflammation improving effect was excellent in allergic rhinitis, allergic dermatitis, atopic dermatitis, acne and insect-induced inflammation, and especially it was effective in eliminating itching rapidly. It was found that the effect of the skin regeneration effect and the removal of the deposited pigment by the treatment of burns and wounds was very good and also had an effect on skin whitening.
  • the cosmetic composition of the present invention may be prepared by using a known method for producing a cosmetic composition including an emulsion, a liposome, a salt or the like, An in-body lotion, a skin lotion, an essence, a cream, and the like, so that a detailed description thereof will be omitted.
  • the pharmaceutical composition of the present invention has an effect effective for the treatment of wounds or skin diseases including burns and wounds by the action of interleukin-8 and interferon gamma, including a serum-free immune cell culture fluid as an effective ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered in various forms of parenteral administration.
  • diluents or excipients such as known pharmaceutically acceptable fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, .
  • the pharmaceutical preparations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions and freeze-drying agents.
  • the skin-applicable agents include suspensions, solutions, Emulsions such as water / oil (W / O) and oil / water (O / W) emulsions) and gel preparations can be used.
  • the serum-free immunocyte culture fluid may be used in an amount of 10 to 80 wt% based on the total weight of the pharmaceutical composition, wherein IL-8 is 100 pg / mL to 8000 pg / mL, interferon gamma is 300 pg / mL to 50000 pg / mL .
  • a serum-free immunocyte culture medium addition kit was prepared as follows.
  • C solution 20 ug of IL-12 and 125 ug of IL-18 were dissolved in distilled water to make 10 mL, and cytokine solution (C solution) was prepared.
  • C solution was dissolved in 1000 mL of the base solution (B solution) to prepare a cytokine 1-1 solution (C1-1 solution).
  • B solution base solution
  • C1-1 solution cytokine 1-1 solution
  • Using the 490 mL of this C1-1 solution 4.5 mL of each solution was placed in a container, and a C1-1 unit was prepared by adding a label "C1-1 solution" prepared in advance and stored in the refrigerator. The remaining 110 mL was used to make the D unit.
  • C solution (5 mL) was dissolved in 1000 mL of the basic solution to prepare a cytokine 1-2 solution (C1-2 solution).
  • C1-2 solution cytokine 1-2 solution
  • Each bottle was placed in a 50 mL container, and a C1-2 unit was prepared with the label "C1-2 solution" prepared beforehand and refrigerated.
  • C2 solution cytokine 2 solution
  • Antibody 1 solution (A1 solution) was prepared by dissolving 0.5 mg of each of anti-CD16 and anti-CD56 antibodies in 300 mL of B solution.
  • the A1 unit was prepared by adding 1 mL each of antibody 1 solution to the container labeled "A1 solution” and stored in the refrigerator. The remaining 200 mL was used to make the A2 unit.
  • A2 solution 200 mL of the A1 solution and 3400 mL of the B solution were mixed to prepare an antibody 2 solution (A2 solution).
  • the A2 unit was prepared by placing 9 mL and 27 mL of each in the container and labeling it with the "A2 solution" prepared beforehand, and then refrigerated. At this time, since the A1 solution and the A2 solution have a short shelf life within one month, they can be used as follows.
  • the cells were incubated at 37 ° C for 2 h.
  • the cell lysate was incubated at 37 ° C for 1 min.
  • A1 solution prepared by dissolving 6 uL of the separately packaged anti-CD16 and anti-CD56 antibody in 3 mL of the B solution is first put into a container, and the A1 unit is prepared by labeling with the previously prepared "A1 solution” and stored in the refrigerator. Add 2 mL of the remaining solution and 34 mL of B solution to make A2 solution. After making the A2 solution, 9 mL and 27 mL of the prepared A2 solution can be separately prepared, labeled with "A2 solution” and made into A2 unit and stored in the refrigerator. In this case, their validity period may be extended to more than six months.
  • Antigen-cytokine mixed solution was prepared by adding 500 ug of the anti-CD3 antibody to the C1-1 solution to make 105 mL, and the D unit was prepared by adding 1 mL each to the container and labeled "D solution" Respectively. At this time, since the solution D has a short shelf life within one month, it can be used as follows.
  • 5 uL of the anti-CD3 antibody solution (1 mg / mL) and 1 mL of the C1-1 solution are packed separately in separate containers to prepare the D unit, and the D solution can be prepared by mixing them at the time of use.
  • 5 ⁇ L of anti-CD3 antibody should be dissolved in 1 mL of C1-1 solution, labeled with "D1 solution, day 1", made into D unit, and stored in the refrigerator. In this case, the validity period may be extended to six months or more.
  • the prepared B unit, C1-1 unit, C1-2 unit, C2 unit, A1 unit, A2 unit and D unit may be disposed to prepare a medium supplemented with medium for serum-immune cell culture. If necessary, they may be arranged in the order of C1-1 unit, C2 unit, A1 unit, D unit, C1-1 unit, A2 unit, C2 unit, A2 unit, B unit and C1-2 unit in the order of use .
  • Lymphocytes and autologous plasma were prepared from the blood of the patient. Then, immune cells were cultured as follows using the culture medium for serum-free immune cell culture obtained in Example 1 as follows.
  • Blood mononuclear cells such as human lymphocytes or mononuclear cells have a specific gravity lower than 1.077
  • the blood of the patient to be treated is superimposed on a Ficoll-Paque Plus solution having a specific gravity of 1.077 and centrifuged at a constant centrifugal force to determine the specific gravity
  • the red blood cells and granulocyte layers larger than 1.077 were down, and the mononuclear cell layer and the platelets having a size of 1.077 or less were separated to obtain a mononuclear cell layer containing the lymphocytes, and only the lymphocytes were extracted from the separated mononuclear cell layer.
  • peripheral blood from patient A was collected in a 50 mL conical tube for one day, and then the upper plasma of the autologous plasma was placed in a heparin tube and placed in a new 50 mL conical tube. After centrifugation, plasma components of the upper layer were prepared as autologous plasma.
  • Day 0 The first step of adding autologous plasma after adding at least one of cytokine 1-1 solution of C1-1 unit and cytokine 2 solution of C2 unit to isolated lymphocytes was performed as follows.
  • lymphocytes were treated with C1-1 solution 1 vial (4.5 mL) and serum (0.5 mL) and placed in T25 flask and cultured in a CO2 Incubator (incubator).
  • the A1 solution 1 vial (1 mL) was added to the incubated T25 flask and gently shaken, followed by incubation in an incubator.
  • Step 6 in which C2 solution of cytokine 2 solution was added to the medium on which step 5 was performed, followed by addition of autologous plasma or FBS, was performed as follows.
  • C2 solution 1 vial 9 mL
  • 1 mL of autologous plasma or FBS or the like
  • Step 7 in which the A2 solution of antibody 2 and the autologous plasma or FBS were added to the medium in which the sixth system was performed, was performed as follows.
  • Step 8 in which the basal solution of B unit and autologous plasma or FBS were added to the medium in step 7, was performed as follows.
  • Step 9 cell harvesting step after mass culture in which the autologous plasma or FBS was added to the medium in which the step 8 was performed, and then cultured in a large-capacity cell culture container containing the cell culture medium The following was conducted.
  • Cells may be harvested at this stage by scraping the bottom of the cultured T150 flask with a scraper.
  • 10 ml of either autologous plasma or FBS (or similar) The cell suspension was then added, and 1/3 of the 1 L CO 2 permeable culture bag containing the cell culture medium was collected with a forceps, and the cell suspension was added thereto.
  • the mixture was massaged with the cell culture medium, Incubate well in a CO2 incubator and incubate.
  • Cells were harvested by centrifuging several times by placing the final culture solution in a centrifuge tube.
  • the harvested cells can be packaged in physiological saline bags and stored in refrigeration or freezing.
  • Day 7 The 10th step of separating the medium in which the seventh step was performed into cells and a serum culture medium was performed as follows.
  • the culture of the cultured T150 flask was centrifuged to separate into immune cells and serum.
  • step 11 the washed cells were placed in a new culture container, and the 12th step of adding and culturing the basal solution of B unit was performed as follows.
  • the washed immune cells were placed in a T150 flask, 100 ml of B solution was added thereto, and then cultured in a CO2 Incubator.
  • Day 11 to Day 14 The cells isolated in the 14th and 14th steps of separating the medium in which the step 13 was performed into a cell and a serum-free primary culture were added to the basic solution of the unit B to prepare a cell culture medium And then culturing the cells in a large-capacity cell culture container containing the cytokine 1-2 solution of C1-2 unit by culturing.
  • Secondary cell culture Immerse the harvested immune cells in primary culture solution into 100 ml of B solution. Add 1 mL of the culture bag containing the cell culture medium to the bag, place the culture medium containing the cells in the bag, add 50 mL of the cytokine 1-2 solution of C1-2 unit, place in a 5% CO 2 incubator Lt; / RTI >
  • Step 15 Secondary culture containing cells subjected to step 15 is separated into immune cells and culture medium through centrifugation (400xg). The separated culture is stored as a serum-free immune cell culture solution in a refrigerator.
  • Tertiary cell culture Immerse the harvested immune cells in the secondary culture solution into 100 mL of B solution. Add 1 mL of the culture bag containing the cell culture medium to the bag, place the culture medium containing the cells in the bag, add 50 mL of the cytokine 1-2 solution of C1-2 unit, place in a 5% CO 2 incubator Lt; / RTI >
  • step 1 to 2 or more times according to the cell condition to obtain a total of 4 liters or more on a batch of serum-free culture medium.
  • Step 9 cell harvesting step after mass culture in which the autologous plasma or FBS was added to the medium in which the step 8 was performed, and the cells were then placed in a large-capacity cell culture container containing the cell culture medium The following was conducted.
  • Day 8 Add 10 ml of all the remaining plasma or FBS (or similar) to the culture medium.
  • One liter of CO 2 permeation culture bag containing cell culture medium is collected by using a forceps, and then cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C in a bag.
  • Example 2 The same method as in Example 2 was carried out except that the first step was not carried out in Example 2 to obtain a comparative culture.
  • immunocytes such as lymphocytes isolated from the blood after one day of blood sampling from patients were activated by cytokine-stimulated lymphocytes and stimulated with anti-CD16 and anti-CD56 It is possible to increase not only the number of cells to be proliferated but also the proportion of NK cells.
  • Serum culture medium First, Secondary serum culture medium Three-phase serum culture medium 4, secondary serum culture medium Culture days (days) day7 day11 day15 day19 day23 Culture fluid yield (L) 0.06 1.1 1.1 1.1 1.1 Cell number (x 10 ⁇ 7) 11.5 120 150 140 125 IL-8 (ng / mL) 36.1 7.8 8.4 6.2 5.1 INF-g (ng / mL) 1250 121.1 113.2 57.95 32.1 NK cells (%) (CD16 +, CD56 +) 21.2 34.6 46.72 56.17 55.2 Serum (oil, without) U radish radish radish radish radish radish radish radish radish
  • Serum culture medium The first serum-free culture medium Secondary serum culture medium Three-phase serum culture medium 4, secondary serum culture medium Culture days (days) day11 day15 day19 day23 day27 Culture fluid yield (L) 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 Cell number (x 10 ⁇ 7) 210 410 390 350 245 IL-8 (ng / mL) 3.8 4.4 4.2 3.8 2.5 INF-g (ng / mL) 49.7 126.3 55.6 30.6 15.2 NK cells (%) (CD16 +, CD56 +) 34.6 46.72 56.1 55.7 56.2 Serum (oil, without) U radish radish radish radish radish radish radish radish radish
  • an immune cell culture solution rich in cytokine content can be obtained by changing the culture medium at intervals of 3 to 4 days from the secondary culture solution. Since the immune cell culture liquid of the present invention contains a large amount of cytokines, skin whitening, elimination of pigmentation, and skin regeneration effect are excellent, it can become a competitive material as a therapeutic agent or cosmetic material.
  • a cosmetic composition having the composition shown in Table 4 below containing 5% by weight of the serum-free immune cell culture obtained in Example 3 was prepared.
  • the cosmetic composition was applied to the two acne areas after cleansing twice in the morning and evening, and photographs showing the progress of 7 days and 16 days 1 and Fig.
  • FIG. 3 is a photograph showing the progress of the cosmetic composition obtained by applying the cosmetic composition twice / morning and evening to the red spot area formed by the acid worms in order to confirm the effect of the cosmetic composition obtained in Example 5 on improving inflammation and removing pigmentation.
  • FIG. 4 shows a photograph showing the progress of application of the cosmetic composition to the allergy-causing site twice or morning and evening in order to confirm the effect of the cosmetic composition obtained in Example 5 on the improvement of inflammation and the removal of pigmentation.
  • FIG. 5 shows a photograph showing the progress of application of the cosmetic composition to the wide area where various allergies occurred with a time difference twice in the morning and evening in order to confirm the effect of improving the inflammation and removing the pigmentation of the cosmetic composition obtained in Example 5 .
  • a pharmaceutical composition containing 20% by weight of the serum-free immune cell culture obtained in Example 3 was prepared.
  • the composition was prepared in the same manner as in Example 3 except that 20% by weight of the serum-free immune cell culture was used.
  • FIG. 6 shows a photograph showing the progress of application of the pharmaceutical composition to the burned area twice or three times in the morning and evening in order to confirm the skin regeneration effect of the pharmaceutical composition obtained in Example 6.
  • the oblique cut shown in FIG. 6 is firstly laid in the baker's oven at the end of June, 2016, and the vertical wound is on the 31st of August.
  • the pharmaceutical composition was applied to the burned area twice in the morning and evening, and the appearance of the upper epidermis was recovered and the deposited pigment disappeared when the 16th day elapsed.
  • the pharmaceutical composition was applied , It was confirmed that the treatment effect was better.

Abstract

본 발명은 면역요법에 적용되는 자연살해세포(Natural Killer cell; NK 세포) 배양기술에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 종래의 면역세포배양방법과 비교하여 채혈한지 하루 이상 지나거나 많이 약해져 있는 면역세포 일지라도 효율적으로 증폭 및 활성화시키는 동시에 NK세포가 차지하는 비율을 현저하게 증가시켜 배양할 수 있는 무혈청면역세포배양용 배지첨가키트, 상기 키트를 이용한 면역세포배양방법, 상기 키트 또는 배양방법에 의해 얻어진 무혈청면역세포배양액 및 상기 배양액을 포함하는 화장료조성물에 대한 것이다.

Description

무혈청면역세포배양용 배지첨가키트, 상기 키트를 이용한 면역세포배양방법, 상기 키트 또는 배양방법에 의해 얻어진 무혈청면역세포배양액 및 상기 배양액을 포함하는 화장료조성물
본 발명은 면역요법에 적용되는 자연살해세포(Natural Killer cell; NK 세포) 배양기술에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 종래의 면역세포배양방법과 비교하여 채혈한지 하루 이상 지나거나 많이 약해져 있는 면역세포 일지라도 효율적으로 증폭 및 활성화시키는 동시에 NK세포가 차지하는 비율을 현저하게 증가시킨 후 혈청사용여부를 용도에 따라 결정하여 선택적으로 혈청을 포함하거나 포함하지 않은 상태로 배양할 수 있는 무혈청면역세포배양용 배지첨가키트, 상기 키트를 이용한 면역세포배양방법, 상기 키트 또는 배양방법에 의해 얻어진 무혈청면역세포배양액 및 상기 배양액을 포함하는 화장료조성물에 대한 것이다.
포유동물의 면역계는 다수의 독특한 세포로 구성되어 있는데, 이들 세포는 침입한 세균, 바이러스, 독소 및 다른 비-숙주 물질로부터 숙주를 방어하는 작용을 한다. 면역계의 특이성에 주된 역할을 하는 세포 유형을 림프구라고 부르며, 림프구에는 B세포 및 T세포와 자연살해세포라고 하는 NK세포가 있다. T세포는 흉선에서 발생한다는 데서 명명된 것이며, B세포는 골수에서 발생하는 데서 명명된 것이고 NK세포는 태어나면서부터 나와 남을 정확히 구별할 수 있는 능력을 타고났고 자신이 아닌 것을 즉시 찾아 제거한다고 해서 자연살해(NK)세포라고 한다. T-세포군에는 억제 T 세포 (suppressor T cell), 세포독성 T 세포 및 T 헬퍼 세포와 같은 수종의 아형군이 있다. T-헬퍼 세포 아군은 Th1 및 Th2의 두 가지 면역 경로를 결정한다. Th1 세포 (CD4+ 세포의 기능적 아형군)는 세포 매개성 면역 반응을 상승시키는 능력이 특징이다. Th1 세포는 사이토카인 IL-2 및 인터페론-γ를 생산한다. Th2 세포 역시 CD4+ 세포이지만, Th1 세포와는 구별된다. Th2 세포는 항체 생산을 담당하며, 사이토카인 IL-4, IL-5, IL-10 및 IL-13을 생산한다. 이들 사이토카인은 Th1 및 Th2 반응을 상호 저해하도록 하는 데 중요한 역할을 한다.
면역요법에서 활성화시키는 면역세포 중에서 특히 NK 세포는 림프구의 일종인 특징적인 형태인 거대과립형 림프구(LGL, Large granular lymphocytes)로서, 감염된 바이러스, 종양세포를 죽이는 능력이 뛰어나고 대부분의 정상 세포는 죽이지 않는 특성을 가지고 있는데, 그 항종양 작용은 괴사(necrosis)나 세포예정사(apoptosis), 또는 이들 두 가지 작용기전이 동시에 발생하여 이루어진다. NK 세포는 IL-2, IL-12, 인터페론(Interferon) 등의 사이토카인(cytokine)에 반응하며 이에 의해 역가(cytotoxicity), 분비성(secretory), 증식성(proliferative) 기능이 상승한다. NK 세포의 표현형(phenotype)은 사람에 있어서 CD16(FcγRIII), CD56이며, CD16과 CD56은 세포표면에 TRC(T-cell receptor complex)가 없어 NK세포에 대한 마커(marker)로 활용된다.
이와 같은 NK 세포는 초기 생체방어 기구와 인체의 종양면역에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 즉, NK 세포는 주요조직적합유전자 복합체(Major Histocompatibility Complex : MHC)의 발현에 따른 면역 획득 과정 없이도 특정자기세포, 동종세포, 심지어 이종 암세포도 살상할 수 있으며, 특히 Class1 MHC를 적게 발현하거나 발현하지 않는 표적 세포들을 더 잘 죽일 수 있다. 따라서, NK 세포는 MHC가 발현되지 않는 대부분의 암세포를 효과적으로 죽일 수 있으며, 그 외에도 몇몇 바이러스에 감염된 세포와 장티프스균(salmonella typhi)과 같은 세균들을 죽일 수 있다.
그러나, 이와 같이 암세포 살상에 탁월한 작용을 하는 NK 세포는 정상적인 사람인 경우에도 말초혈액 림프구의 5 ~ 25 % 만을 차지하고 있으며, 특히 암환자의 경우에는 그 비율이 5 % 미만으로 저하되기 때문에, 면역요법을 통한 별도의 증폭 과정 없이는 암세포를 효과적으로 공격하는 데에 한계가 있다.
면역세포 특히 NK세포를 활성화하고 증식시키는데 있어서 IL-2 등의 Cytokine 과 CD3 등의 항체가 사용된다. 현행 기술은 면역세포의 증식에 있어서 매우 중요한 역할을 하는 것이 CD3 항체인데, 문제는 이 항체를 이용해서 면역세포를 활성화 시키는 것이 매우 까다롭다는 것이다. 즉, 면역세포 배양 시 현재의 일반적 인 기술은 CD3항체를 플라스크에 고정화 시켜서 일정시간 자극하는 방법을 주로 사용한다. 그러나 면역세포의 경우 각 개인마다 감수성이 다르고 또한 세포배양 조건 또는 작업자의 숙련 정도에 따라서 매우 많은 차이가 난다. 예를 들면 CD3 항체의 자극이 적게 되거나 거의 안 되면 면역세포는 증식이 잘 안 된다. 또한 너무 많이 자극이 되면 NK세포는 거의 증식이 안 되고 NKT세포 또는 T세포가 많이 증식이 된다. 이 경우 특히 T세포가 많이 증식되기 때문에 NK세포를 많이 증식시켜 얻기란 쉽지 않다.
특히, 처음부터 CD3 항체의 강한 자극이 가해지면 미성숙 전구세포들은 T세포로 성숙하게 되므로 일반적으로 행해지고 있는 현행 방법은 처음에 CD3 항체를 살짝 자극하는 방법을 사용하는데, 개인 차 등 주변 환경 요건에 의해 많이 좌우되어 활성화된 많은 양으로 증식된 NK세포를 얻는데 어려움이 있다.
한편, 말초혈액으로부터 림프구를 분리하여 고농도의 IL-2와 CD3, CD16, CD56 등의 항체를 사용하여 면역세포를 체외에서 배양하면 NK 세포와 Th1형의 세포들이 증식되며 면역세포가 분열하고 성장하는 과정에서 여러 가지 싸이토카인을 분비하는데 이러한 싸이토카인들(γ-인터페론, IL-2, IL-8, IL-12, IL-18 등)은 피부면역 강화뿐만 아니라 Th2 싸이토카인의 과생산을 억제할 수 있어 피부염증 치료 에 매우 효과적으로 사용될 수 있다.
이러한 싸이토카인들 중 NK세포에서 대량 생산되는 IL-8은 혈액 중 단핵구를 모이게 하고 마크로파지로 분화하게 한다. 마크로파지는 먼저 항원을 제거하는 활동을 하게 되나 제거해야 할 항원이 더 이상 없거나 또는 IL-4에 의해 M2a형으로 바뀌게 되고 이 M2a 형 마크로파지가 창상이나 염증 등으로 파괴된 조직을 복구하기 위해 여러 종류의 관련 인자들(TGF-β, bFGF, PDGF, VEGF, MMPs, TIMPs)을 만들어 준다. 궁극적으로 NK세포에서 다량 만들어진 IL-8에 의해 마크로파지(M2a 형)를 증가 시켜 줌으로써 염증 또는 상처의 치료를 빠르게 치료할 수 있다. 더욱이 IL-8은 케라티노싸이트를 표피로 모이게 하여 표피층을 튼튼하고 건강하게 유지시켜주어 외부 침입을 효과적으로 막음으로써 피부질환 개선 또는 치료에 그 효과가 좋을 수 있다. 또한 쉽게 얻을 수 있는 유전자재조합 기술을 통하여 얻은 IL-8 단독 또는 IL-8과 IL-4 또는 인터페론 감마등를 혼합 사용할 경우 IL-8에 의해 많이 증식된 마크로파지를 IL-4가 M2a형의 마크로파지로 변환시켜 주기 때문에 창상 치료 및 피부 미용효과를 높여 줄 수 있다.
하지만, 지금까지 알려진 면역세포배양방법으로 면역세포를 배양하게 되면 배양시점에서 2주후부터는 면역세포가 증식되는 속도보다 면역세포가 사멸하는 속도가 빨라져서 3주 내지 4주가 지나면 배양배지에는 면역세포를 거의 발견하기 힘들어진다. 따라서 통상 면역세포는 혈액으로부터 림프구를 추출한 후 추출된 림프구를 2주 동안 배양시켜 증식된 면역세포를 얻고, 얻어진 면역세포 또는 배양액을 그대로 사용하거나 동결 보관하여 사용하였다. 그 결과 다량의 면역세포 또는 면역세포 배양액을 얻기 위해서는 다량의 혈액이 요구되는 문제점이 있었다.
또한 면역세포 배양시 일반적으로 혈청을 사용하는데 이 경우 다른 사람 또는 동물의 혈청을 사용하여 얻은 배양액을 화장료 조성물 또는 치료제로 사용하고자 할 때 혈청 사용에 의한 우리가 알 수 없는 질병의 감염 우려가 있어 사용이 곤란한 문제가 있어 혈청이 들어 있지 않은 배양액이 절실히 요구된다.
더욱이, 면역세포는 사용할 수 있는 유효기간이 채혈 후 24시간이내 이다. 즉, 수명이 짧고 채혈 후 하루가 지나면 급속도로 세포가 약해져 세포배양이 어려워진다. 이러한 문제들로 인해 공여 혈액을 구하는 것이 쉽지 않다. 채혈 후 시간이 많이 지났거나 면역력이 약한 사람으로부터 얻어진 면역세포일지라도 또는 수혈용 혈액제제 제조시 버려지는 백혈구제거 필터에 있는 면역세포까지 회수하여 배양하기 위해서는 약해져 있는 면역세포도 활성화시켜 배양할 수 있는 방법이 필요하다.
본 발명자는 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 연구 노력한 결과, 항CD3 항체를 고정한 후 일정시간 반응시킨 후 제거하는 공정을 수행하지 않고, 더 나아가 원래 약한 면역세포이거나 예를 들어 고연령층의 면역세포 또는 중증 암환자의 면역세포일지라도 림프구배양액에서 NK세포를 안정적으로 증폭시킬 수 있는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 림프구를 자극하기 위해 항CD3 항체를 배양용기에 고정화시킨 상태로 림프구(면역세포)를 일정시간 배양하는 번거로운 과정 없이 대용량배양과정에서 선택적으로 혈청 포함여부를 결정하여 배양할 수 있으면서도 동시에 최종적으로 얻어지는 림프구배양액에서 NK 세포를 안정적으로 증폭시켜 대량으로 증식시킬 수 있는 조성을 갖는 무혈청면역세포배양용 배지첨가키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 배지첨가키트에 포함된 유닛을 구성하는 첨가제를 순차적으로 사용함으로써 즉 림프구에 자극을 주는 순서를 특정함으로써 원래 약한 면역세포이거나 예를 들어 고연령층의 면역세포 또는 중증 암환자의 면역세포을 배양하는 경우에도 최종적으로 얻어지는 림프구배양액에서 T세포의 비중은 낮고 NK세포의 비중이 현저하게 높은 안정적인 면역세포배양방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 림프구배양시 NK세포가 현저하게 높은 비율의 증식될 수 있도록 배양단계에서 첨가되어야 하는 배지첨가제를 규격화함으로써 극히 용이하게 NK세포를 배양할 수 있는 무혈청면역세포배양용 배지첨가키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인터루킨-8 및 인터페론 감마 등의 농도가 높은 무혈청 면역세포배양액을 유효성분으로 포함하여 피부미백이나 피부재생효과로 인한 주름개선 등에 효과가 우수한 화장료조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인터루킨-8 및 인터페론 감마 등의 농도가 높은 무혈청 면역세포배양액을 유효성분으로 포함하여 창상이나 화상 등의 상처 치료 및 피부질환치료 등에 효과가 우수한 약학적조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않으며, 명시적으로 언급되지 않았더라도 후술되는 발명의 상세한 설명의 기재로부터 통상의 지식을 가진 자가 인식할 수 있는 발명의 목적 역시 당연히 포함될 수 있을 것이다.
상술된 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 IL-2, L-글루타민 및 세포배양용 배지를 포함하는 기본용액으로 구성된 B유닛; IL-12가 0.5∼5 ng/mL농도 및 IL-18가 2∼50 ng/mL 농도로 포함되도록 상기 IL-12 및 IL-18을 상기 기본용액에 용해시켜 형성된 사이토카인1-1용액으로 구성된 C1-1유닛; IL-12가 5.1∼15 ng/mL농도 및 IL-18이 30∼120 ng/mL 농도로 포함되도록 상기 IL-12 및 IL-18을 상기 기본용액에 용해시켜 형성된 사이토카인1-2용액으로 구성된 C1-2유닛; IL-15가 10~50ng/mL 농도로 포함되도록 상기 IL-15를 상기 기본용액에 용해시켜 형성된 사이토카인2용액으로 구성된 C2유닛; 항CD16 및 항CD56이 각각 0.1 ~ 15ug/mL농도로 포함되도록 상기 항CD16 및 항CD56을 상기 기본용액에 용해시켜 형성된 항체1용액으로 구성된 A1유닛; 상기 항체1용액: 상기 기본용액을 1:6~10의 부피비로 포함하는 항체2용액으로 구성된 A2유닛; 및 항CD3가 1~12 ug/mL농도로 포함되도록 상기 항CD3를 상기 사이토카인1용액에 용해시켜 형성된 항체-사이토카인혼합용액으로 구성된 D유닛;을 포함하는 무혈청면역세포배양용 배지첨가키트를 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 A1유닛이 상기 D유닛보다 림프구배양배지에 먼저 첨가된다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 A1유닛에 포함된 상기 항CD16, 항CD56 및 상기 기본용액이 분리 포장되고, 배지첨가단계에서 혼합되어 상기 항체1용액을 형성한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 A2유닛에 포함된 상기 항체1용액의 항CD16, 항CD56 및 상기 기본용액과, 상기 기본용액은 각각 분리 포장되고, 배지첨가단계에서 혼합되어 상기 항체2용액을 형성한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 D유닛에 포함된 항CD3 및 상기 사이토카인1용액은 각각 분리 포장되고, 배지첨가단계에서 혼합되어 상기 항체-사이토카인혼합용액을 형성한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 유닛들은 상기 유닛들은 C1-1유닛, C2유닛, A1유닛, D유닛, C1-1유닛, A2유닛, C2유닛, A2유닛, B유닛 및 C1-2유닛의 순서, 또는 C2유닛, C1-1유닛, A1유닛, D유닛, C1-1유닛, A2유닛, C2유닛, A2유닛, B유닛 및 C1-2유닛의 순서, 또는 C1-1유닛, A1유닛, D유닛, C1-1유닛, A2유닛, C2유닛, A2유닛, B유닛 및 C1-2유닛의 순서, 또는 C2유닛, A1유닛, D유닛, C1-1유닛, A2유닛, C2유닛, A2유닛, B유닛 및 C1-2유닛의 순서로 림프구배양배지에 순차적으로 첨가되어 사용되도록 구성된다.
또한, 본 발명은 분리된 림프구에 C1-1유닛의 사이토카인1-1용액 및 C2유닛의 사이토카인2용액 중 하나 이상을 첨가한 다음 자가혈장을 첨가하는 제1단계; 상기 제1단계가 수행된 배지에 A1유닛의 항체1용액을 첨가하는 제2단계; 상기 제2단계가 수행된 배지에 D유닛의 항체-사이토카인혼합용액을 첨가하는 제3단계; 상기 제3단계가 수행된 배지에 C1-1유닛의 사이토카인1-1용액을 첨가한 다음 자가혈장을 첨가하는 제4단계; 상기 제4단계가 수행된 배지에 A2유닛의 항체2용액을 첨가한 다음 자가혈장 또는 FBS를 첨가하는 제5단계; 상기 제5단계가 수행된 배지에 C2유닛의 사이토카인2용액을 첨가한 다음 자가혈장 또는 FBS를 첨가하는 제6단계; 및 상기 제6계가 수행된 배지에 A2유닛의 항체2용액 및 자가혈장 또는 FBS를 첨가하는 제7단계;를 포함하는 면역세포배양방법을 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 제7단계가 수행된 배지에 B유닛의 기본용액 및 자가혈장 또는 FBS를 첨가하여 배양하는 제8단계; 및 상기 제8단계가 수행된 배지에 자가혈장 또는 FBS를 첨가한 후 세포배양배지가 들어있는 대용량세포배양용기에 넣고 배양하는 제9단계;를 더 포함한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 분리된 림프구는 채혈 후 1일 이상 도과한 혈액으로부터 분리된 것이다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 제7단계 또는 제9단계가 수행된 배지를 세포와 혈청배양액으로 분리하는 제10단계; 상기 제10단계에서 분리된 세포를 세척하는 제11단계; 상기 제11단계에서 세척된 세포를 새로운 배양용기에 넣고 B유닛의 기본용액을 첨가하여 배양하는 제12단계; 및 상기 제12단계가 수행된 배지를 세포배양배지가 들어있는 대용량세포배양용기에 넣고 C1-2유닛의 사이토카인1-2용액을 첨가하여 배양하는 제13단계;를 더 포함한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 제13단계가 수행된 배지를 세포와 무혈청1차배양액으로 분리하는 제14단계; 및 상기 제14단계에서 분리된 세포를 B유닛의 기본용액을 첨가하여 세포배양배지가 들어있는 대용량세포배양용기에 넣고 C1-2유닛의 사이토카인1-2용액을 첨가하여 배양하는 제15단계;를 더 포함한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 자가혈장은 혈장 1ml당 헤파린이 40 usp unit이상 포함된 것이다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 첨가되는 자가혈장 또는 FBS의 함량은 전체배지의 10부피% 미만이다.
또한, 본 발명은 상술된 어느 하나의 배양방법으로 배양된 면역세포배양액을 제공한다.
또한, 본 발명은 상술된 어느 하나의 배지첨가키트로 배양된 면역세포배양액 또는 배양방법으로 배양된 면역세포배양액으로부터 얻어진 무혈청면역세포배양액을 제공한다.
또한, 본 발명은 상술된 무혈청면역세포배양액; 및 화장료베이스;를 포함하는 화장료조성물을 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 무혈청면역세포배양액은 염증개선, 피부 미백, 색소 침착 제거, 피부재생 중 하나 이상에 유효성분으로 작용한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 무혈청면역세포배양액은 전체 조성물 중량기준 50중량%이하로 포함된다.
또한 본 발명은 상술된 무혈청면역세포배양액을 포함하는 화상 및 창상을 포함하는 상처 또는 피부질환 치료용 약학적조성물을 제공한다.
본 발명은 다음과 같은 우수한 효과를 갖는다.
먼저, 본 발명의 면역세포배양용 배지첨가키트는 림프구를 자극하기 위해 항CD3 항체를 배양용기에 고정화시킨 상태로 림프구(면역세포)를 일정시간 배양하는 번거로운 과정을 제거하고 대용량배양시 선택적으로 혈청을 포함여부를 결정하여 배양할 수 있으면서도 동시에 최종적으로 얻어지는 림프구배양액에서 NK 세포를 안정적으로 증폭시켜 대량으로 증식시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 면역세포배양방법은 배지첨가키트에 포함된 유닛을 구성하는 첨가제를 순차적으로 사용함으로써 즉 림프구에 자극을 주는 순서를 특정함으로써 원래 약한 면역세포이거나 예를 들어 고연령층의 면역세포 또는 중증 암환자의 면역세포을 배양하는 경우에도 최종적으로 얻어지는 림프구배양액에서 T세포의 비중은 낮고 NK세포의 비중을 현저하게 높일 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면 림프구배양시 NK세포가 현저하게 높은 비율의 증식될 수 있도록 배양단계에서 첨가되어야 하는 배지첨가제를 규격화함으로써 극히 용이하게 NK세포를 배양할 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료조성물에 의하면 인터루킨-8 및 인터페론 감마 등의 농도가 높은 무혈청 면역세포배양액을 유효성분으로 포함하여 피부미백이나 피부재생효과로 인한 주름개선 등에 효과가 우수하다.
또한, 본 발명의 약학적조성물에 의하면 인터루킨-8 및 인터페론 감마 등의 농도가 높은 무혈청 면역세포배양액을 유효성분으로 포함하여 창상이나 화상 등의 상처 치료 및 피부질환치료 등에 효과가 우수하다.
본 발명의 이러한 기술적 효과들은 이상에서 언급한 범위만으로 제한되지 않으며, 명시적으로 언급되지 않았더라도 후술되는 발명의 실시를 위한 구체적 내용의 기재로부터 통상의 지식을 가진 자가 인식할 수 있는 발명의 효과 역시 당연히 포함된다.
도 1 및 도 2는 본 발명의 실시예에 따른 화장료조성물을 여드름부위에 도포 한 후 얻어지는 염증개선 및 색소침착제거효과를 보여주는 경과사진들이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 화장료조성물을 산 벌레에 물려 생긴 붉은 반점에 도포 한 후 얻어지는 염증개선 및 색소침착제거 효과를 보여주는 경과사진이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 화장료조성물을 알러지발생부위에 도포 한 후 얻어지는 염증개선 및 색소침착제거 효과를 보여주는 경과사진이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 화장료조성물을 여러 개의 알러지가 시간차를 두고 발생한 넓은 부위에 도포 한 후 얻어지는 염증개선 및 색소침착제거 효과를 보여주는 경과사진이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 약학적조성물을 화상 부위에 도포 한 후 얻어지는 피부재생효과를 보여주는 경과사진이다.
본 발명에서 사용하는 용어는 단지 특정한 실시예들을 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성 요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성 요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안된다. 상기 용어들은 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성 요소는 제2 구성 요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성 요소도 제1 구성 요소로 명명될 수 있다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본 발명에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 "무혈청면역세포배양액"은 혈청이 포함되지 않은 면역세포배양액에서 면역세포를 분리한 나머지를 의미한다. 따라서, 무혈청면역세포배양액은 혈청 없이 증식된 면역세포배양액에서 면역세포를 분리함으로써 얻을 수 있으며, 싸이토카인과 같은 면역세포의 2차 대사산물이 포함되어 있다. 또한, "NK세포"는 NK cell과 NKT cell을 모두 포함하는 의미로 사용되었다.
이하, 첨부한 도면 및 바람직한 실시예들을 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다.
그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐 본 발명을 설명하기 위해 사용되는 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.
본 발명의 기술적 특징은 림프구를 자극하기 위해 항CD3 항체를 배양용기에 고정화시킨 상태로 림프구(면역세포)를 일정시간 배양하는 번거로운 과정 없이 대용량배양과정에서 선택적으로 혈청 포함여부를 결정하여 배양할 수 있는 것은 물론 원래 약한 면역세포이거나 예를 들어 고연령층의 면역세포 또는 중증 암환자의 면역세포을 배양하는 경우에도 최종적으로 얻어지는 림프구배양액에서 NK 세포를 안정적으로 증폭시켜 대량으로 증식시킬 수 있는 조성을 갖는 무혈청면역세포배양용 배지첨가키트, 그 배지첨가키트를 이용한 배양방법 및 그 배양액으로부터 얻어진 산물의 이용방법에 있다.
일반적으로 NK세포 기반 면역세포를 배양할 때 CD3, CD16, CD56 등의 항체를 일반적으로 많이 사용하는데 약해져 있는 세포에 이들을 직접 자극하면 오히려 세포가 더 빨리 죽는 경우가 자주 발생한다. 이는 약해져 있는 세포에 큰 자극이 바로 가해 졌을 때 세포자멸사를 유도하는 것으로 여겨진다.
본 발명은 이러한 문제점을 해결하기 위한 것으로 NK세포 기반 면역세포를 배양할 때 약해져 있는 세포를 먼저 튼튼하게 활성화 시키고 이어서 항체를 자극하였을 때 세포가 죽지 않고 많이 증식된다는 점에 착안된 것이다.
즉, NK세포 기반 면역세포를 배양할 때 항체 자극 전에 IL-2의 일정 농도 하에 IL-12와 IL-18 혼합 또는 IL-12와 IL-15 혼합 또는 IL-15 단독 등 Cytokine으로 먼저 12 ~ 24시간 이상 자극을 줄 경우 인터페론감마 등 많은 Cytokine을 분비되는 것을 확인하였고 이들 Cytokine에 의해서 면역세포가 많이 회복되고 활성화 되는 것을 발견하였으며 약해진 면역세포가 활성화된 상태에서 항체로 자극하였을 때(항CD16과 항CD56을 자극하고 그 후 항CD3를 자극하였을 때 또는 항CD3만으로 자극하였을 때) 의도한 바대로 NK세포, NKT세포, T세포 등이 잘 증식되는 것을 확인하였기 때문이다. 이 때, 항체는 고정화시켜 사용할 필요 없이 단순히 배지 내에 추가 해 주는 것만으로 면역세포를 자극할 수 있다.
이와 같이 본 발명에서 개발한 원리에 따라 아직 성숙되지 않은 미성숙 전구세포를 항CD16 및 항CD56 항체로 자극하여 NK 세포로 분화를 유도하고 이미 성숙된 NK세포를 활성화 한 후 T세포에 항CD3 항체를 자극하여 활성화 된 T세포가 NK세포를 활성화 하게 하면 항CD3항체가 배양배지 내에서 분해되어 없어질 때까지 자극을 줘도 아무 문제없이 NK 세포가 많이 증식됨을 확인한 실험결과로부터, 본 발명의 배양방법에서는 림프구를 자극하기 위해 항CD3 항체를 배양용기에 고정화시킨 상태로 림프구(면역세포)를 일정시간 배양하는 번거로운 과정 없이도 NK세포의 비율이 매우 높게 림프구를 배양할 수 있는 것을 알 수 있다.
이러한 방법을 사용하면 원래 약한 면역세포이거나 예를 들어 고연령층의 면역세포 또는 중증 암환자의 면역세포일지라도 면역세포를 잘 배양할 수 있다. 특히 수혈용 혈액제조시 백혈구를 필터하여 제거하는데 이렇게 버려지는 백혈구 제거 필터 중의 림프구를 회수하여 배양할 때도 매우 유용하게 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 무혈청면역세포배양용 배지첨가키트는 림프구배양의 각 단계에서 배지에 첨가될 수 있도록 각각 개별적으로 포장되고 내용물 즉 구성성분이 다른 B유닛, C1-1유닛, C1-2유닛, C2유닛, A1유닛, A2유닛 및 D유닛을 포함한다. 여기서, 상기 유닛들은 림프구배양시 약해진 림프구를 배양하더라도 배양된 세포의 대부분이 NK세포일 수 있도록 림프구배양배지에 미치는 영향을 고려하여 포함될 구성성분이 결정되었다. 특히, 본 발명의 무혈청면역세포배양용 배지첨가키트는 채혈후 1일 이상 지난 혈액으로 분리된 림프구를 배양하는 경우 기존배양방식과 비교하여 NK세포를 최소 500배 내지 5000배까지 안정적으로 증식시킬 수 있게 하기 위해, 상기 유닛들을 림프구배양배지에 첨가하여 사용하는 순서가 다음의 네 가지 방식 중 어느 하나를 따르도록 구성될 수 있다.
① C1-1유닛, C2유닛, A1유닛, D유닛, C1-1유닛, A2유닛, C2유닛, A2유닛, B유닛 및 C1-2유닛의 순서, ② C2유닛, C1-1유닛, A1유닛, D유닛, C1-1유닛, A2유닛, C2유닛, A2유닛, B유닛 및 C1-2유닛의 순서, ③ C1-1유닛, A1유닛, D유닛, C1-1유닛, A2유닛, C2유닛, A2유닛, B유닛 및 C1-2유닛의 순서, ④ C2유닛, A1유닛, D유닛, C1-1유닛, A2유닛, C2유닛, A2유닛, B유닛 및 C1-2유닛의 순서.
먼저, B유닛은 기본용액으로 구성되는데, 기본 용액은 IL-2, L-글루타민 및 세포배양용 배지를 포함한다. 이때 IL-2의 함량은 100ng/mL ~ 300ng/mL일 수 있는데, 바람직하게는 200 ~ 250 ng/mL(3240IU/mL ~ 4000IU/mL)의 농도로 포함될 수 있다.
주지된 바와 같이 IL-2는 T 세포가 항원을 인식하여 활성화될 때 만들어지는 분자량 14 ~ 17 kDa의 당단백질(glycoprotein)로서, T 세포 밖으로 분비된 다음, IL-2를 생산한 T 세포 자신과 반응하여 해당 T 세포의 성장을 촉진하게 된다. IL-2는 또한 NK 세포에 작용하여 성장을 촉진하고 NK 세포의 살해능력을 강화하며, B 세포에 작용하여 그 성장을 촉진하기도 한다. L-글루타민은 면역세포 배양을 위한 영양분으로 작용하는 성분이고, 세포배양용배지는 부유세포배양용 기본배지로서 공지된 상태의 것을 사용할 수 있다.
B유닛의 구체적인 구현예로서 IL-2 2mg과 500mM L-glutamine 용액100mL를 부유세포 배양용 기본 배지(시중에서 판매되고 있는 세포 배양배지, 만약 기본 배지에 IL-2 또는 L-glutamine 이 이미 존재할 경우 최종농도를 맞추기 위해 첨가량을 조정한다)에 넣어 녹이고 최종 10L를 만들어 기본용액(B유닛)을 제조할 수 있다.
C1-1유닛은 사이토카인1-1용액으로 구성되는데, 사이토카인1-1용액은 IL-12, IL-18 및 기본용액을 포함한다. 여기서, 사이토카인1-1용액 중 IL-12는 0.5 ng/mL~ 5 ug/mL의 농도로 포함될 수 있는데, 바람직하게는 1-3 ng/mL의 농도, 보다 바람직하게는 1.5ng/mL ~ 2.5ng/mL의 농도일 수 있다. IL-18은 2ng/mL ~ 50ng/mL의 농도로 포함될 수 있는데, 바람직하게는 6ng/mL ~ 20ng/mL의 농도, 보다 바람직하게는 11ng/mL ~ 15ng/mL의 농도로 포함될 수 있다.
C1-2유닛은 사이토카인1-2용액으로 구성되는데, 사이토카인1-2용액은 사이토카인1-1용액과 동일하게 IL-12, IL-18 및 기본용액을 포함하고, 단지 각 성분의 함량이 상이하다. 사이토카인1-2용액 중 IL-12는 5.1 ng/mL~ 15 ug/mL의 농도로 포함될 수 있는데, 바람직하게는 6-12 ng/mL의 농도, 보다 바람직하게는 8ng/mL ~ 10.5ug/mL의 농도일 수 있다. IL-18은 30ng/mL ~ 120ng/mL의 농도로 포함될 수 있는데, 바람직하게는 40ng/mL ~ 80ng/mL의 농도, 보다 바람직하게는 50ng/mL ~ 70ng/mL의 농도로 포함될 수 있다.
주지된 바와 같이 IL-12는 수지상세포(DC)와 매크로파지, B세포에서 생산된다. IL-12는 NK세포와 T 림프구에서 IFN-γ와 TNF-α의 생산을 유도하며, IFN-γ를 저해하는 IL-4의 생산을 감소시키는 역할을 한다. 또한 NK 세포와 CD8+ cytotoxic T림프구의 세포독성을 증가시킨다. IL-12는 NK세포 내에 IL-2 신호전달체계와 밀접한 관계를 갖고 있다. 또한, IL-2는 NK세포 내에 IL-12 수용체 β1과 IL-12 수용체 β2의 발현을 유도하여 IL-12 신호전달체계에 관련된 단백질들을 발현시키고 활성시킨다. 이러한 기전은 NK세포의 IFN-γ 생산 능력과 타겟세포 살해능력에서 잘 증명되었다. IL-12 수용체 β2는 IL-12 기능에 중요한 역할을 하는 것으로 보이는데, 이것은 Th2의 발생을 저해하는 동시에 Th1의 발생을 진행시키는 것으로 보고되었다. T세포와 NK세포에서 IL-12의 신호전달은 JAK-STAT 신호전달체계에 포함되며 IL-12 수용체 β2의 활성은 전사인자인 STAT4의 인산화를 유도하여 활성화시키는데 중요한 역할을 한다.
또한 IL-18은 매크로파지에서 생산되며 proinflamatory 사이토카인 유전자이다. IL-18은 IL-18 수용체에 결합하여 IL-12와 함께 박테리아나 바이러스에 감염된 세포에 면역반응을 일으키며 NK세포와 T세포에서 IFN-γ의 생산을 증가시킨다.
C1-1유닛의 구체적인 구현예로서 IL-12 10ug 및 IL-18 50ug을 물에 녹여 10mL로 만들어 사이토카인용액(IL-12 : 1ug/mL의 농도 IL-18 : 5ug/mL의 농도)을 제조한 다음, 사이토카인용액 1mL를 기본 용액 500mL에 녹여 IL-12가 2ng/mL의 농도로 포함되고, IL-18가 10ng/mL의 농도로 포함되도록 사이토카인1-1용액(C1-1유닛)을 제조할 수 있다.
C2유닛은 사이토카인2용액으로 구성되는데, 사이토카인2용액은 IL-15 및 기본용액을 포함하는 구성을 갖는다. 사이토카인2용액 중 IL-15의 함량은 10 ~ 50ng/mL의 농도일 수 있는데, 바람직하게는 15ng/mL ~ 25ng/mL일 수 있다.
주지된 바와 같이, IL-15는 4개의 helix bundle cytokine family에 속하는 다면발현성 사이토카인으로 많은 종류의 세포에 작용하여 증식, 생존, 분화에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 IL-15는 좀더 다양한 세포에서 발현되므로 IL-2와 비교하여 좀더 넓고 다양한 조절 작용을 할 수 있다. 특히, 면역반응의 각각의 phase에 영향을 주고 있으며, 또 각 단계의 면역반응에 관여하는 많은 종류의 세포에 작용하는데, 일련의 연구결과는 IL-15가 직접적으로 memory T cell의 형성에 관여한다고 논증하고 있다.
C2유닛의 구체적인 구현예로서 IL-15를 기본 용액에 녹여 농도 20ng/mL의 농도로 만들어 사이토카인2용액(C2유닛)을 제조할 수 있다.
A1유닛은 항체1용액으로 구성되는데, 항체1용액은 항CD16, 항CD56 및 기본용액을 포함한다. 이때 A1유닛을 구성하는 항체1용액 중 항CD16 및 항CD56의 함량은 각각 0.1 ~ 2.0 ug/mL일 수 있으며, 바람직하게는 각각 0.5 ~ 0.7ug/mL의 농도일 수 있다.
주지된 바와 같이 CD16 및 CD56은 NK세포의 표면단백질로서, 항CD16 항체 또는 항원항체복합체의 존재하에 림프구를 배양하게 되면 NK 세포에 CD16 항원이 첨가되어 신호전달이 일어나는데, 이들의 자극에 의해서 NK 세포에 IL-2 수용체의 α 사슬 등 트랜스페린(transferrin) 수용체가 발현하거나, 또는 종양괴사인자(tumor necrosis factor; TNF)나 IFN-γ가 생산될 수 있게 된다. 항CD56항체 또한 항 CD16항체와 비슷한 기능을 수행하게 된다.
A1유닛의 구체적인 구현예로서 항CD16 및 항CD56 용액(1mg/mL)을 각각 6uL씩을 기본용액 10mL에 녹여서 항체1용액(A1유닛)을 제조할 수 있다.
A2유닛은 항체2용액으로 구성되는데, 항체2용액은 항체1용액: 기본용액을 1:6~10의 부피비로 포함할 수 있으므로, A2유닛의 구체적인 구현예로는 항체1용액 6.5mL에 기본용액 30mL를 섞어서 항체2용액을 제조할 수 있다.
이와 같이 항체가 이미 기본용액에 첨가된 상태로 제조된 A1유닛 및 A2유닛은 냉장 보관시 1~2 개월 정도 사용가능하므로 사용기한을 연장시키기 위해 A1유닛 및 A2 유닛을 구성하는 항CD16, 항CD56, 기본용액은 개별적으로 분리 포장되고 배지첨가단계에서 혼합되어 각각 항체1용액 및 항체2용액을 형성하도록 구현할 수도 있다.
D유닛은 항체-사이토카인혼합용액으로 구성되는데, 항체-사이토카인혼합용액은 항CD3 및 사이토카인1용액을 포함할 수 있다. 이때 항CD3의 함량은 1ug/mL ~ 12ug/mL일 수 있으며, 바람직하게는 3ug/mL ~ 8ug/mL일 수 있고, 보다 바람직하게는 4ug/ml ~ 5ug/mL일 수 있다.
주지된 바와 같이, T cell은 TCR을 통해 신호를 받으면 activation 되지만, TCR 알파나 베타 체인은 그 스스로 activation signal을 전달하지 못하고 TCR 주변에 있는 CD3 chain을 통해 시그날을 전달하게 된다. 즉 CD3 항원은 TCR이 항원을 인식하면 그 신호를 세포내로 전달하는 역할 예를 들어 TRC가 MHC+항원과 결합할 때, 결합했다는 신호를 세포 내로 주는데, TCR은 CD3 항원 (γ, δ, ε, ζ, ζ또는η)과 복합체를 형성하고 있다.
D유닛의 구체적인 구현예로서 항CD3 용액(1mg/mL) 5uL를 사이토카인1용액 1mL에 녹여서 항체-사이토카인혼합용액(D유닛)을 제조할 수 있다.
D유닛의 경우에도 항체가 이미 사이토카인1용액에 첨가된 상태로 제조되면 냉장 보관시 1~2개월 정도 사용가능하다. 따라서 사용기한을 연장시키기 위해 D유닛을 구성하는 항CD3 및 사이토카인1용액은 개별적으로 분리 포장되고 배지첨가단계에서 혼합되어 항체-사이토카인혼합용액을 형성하도록 구현할 수도 있다. 이 경우 사용기한을 6개월 이상 연장할 수 있다.
다음으로, 본 발명의 무혈청면역세포배양용 배지첨가키트를 이용한 면역세포배양방법은 분리된 림프구에 C1-1유닛의 사이토카인1-1용액 및 C2유닛의 사이토카인2용액 중 하나 이상을 첨가한 다음 자가혈장을 첨가하는 제1단계; 상기 제1단계가 수행된 배지에 A1유닛의 항체1용액을 첨가하는 제2단계; 상기 제2단계가 수행된 배지에 D유닛의 항체-사이토카인혼합용액을 첨가하는 제3단계; 상기 제3단계가 수행된 배지에 C1-1유닛의 사이토카인1-1용액 을 첨가한 다음 자가혈장을 첨가하는 제4단계; 상기 제4단계가 수행된 배지에 A2유닛의 항체2용액을 첨가한 다음 자가혈장 또는 FBS를 첨가하는 제5단계; 상기 제5단계가 수행된 배지에 C2유닛의 사이토카인2용액을 첨가한 다음 자가혈장 또는 FBS를 첨가하는 제6단계; 및 상기 제6계가 수행된 배지에 A2유닛의 항체2용액 및 자가혈장 또는 FBS를 첨가하는 제7단계;를 포함한다.
상술된 본 발명의 면역세포배양방법은 용도에 따라 최종적으로 얻어지는 면역세포배양액에 혈청이 포함되거나 포함되지 않도록 다음의 두 가지 방법으로 수행될 수 있다.
먼저, 면역세포배양액에 혈청이 포함된 경우는 상기 제7단계가 수행된 배지에 B유닛의 기본용액 및 자가혈장 또는 FBS를 첨가하여 배양하는 제8단계; 및 상기 제8단계가 수행된 배지에 자가혈장 또는 FBS를 첨가한 후 세포배양배지가 들어있는 대용량세포배양용기에 넣고 배양하는 제9단계;를 더 포함하여 수행될 수 있다.
또한, 면역세포배양액에 혈청이 포함되지 않는 경우는 상기 제7단계 또는 제9단계가 수행된 배지를 세포와 혈청배양액으로 분리하는 제10단계; 상기 제10단계에서 분리된 세포를 세척하는 제11단계; 상기 제11단계에서 세척된 세포를 새로운 배양용기에 넣고 B유닛의 기본용액을 첨가하여 배양하는 제12단계; 및 상기 제12단계가 수행된 배지를 세포배양배지가 들어있는 대용량세포배양용기에 넣고 C1-2유닛의 사이토카인1-2용액을 첨가하여 배양하는 제13단계;를 더 포함하여 수행될 수 있다. 필요한 경우, 상기 제13단계가 수행된 배지를 세포와 무혈청1차배양액으로 분리하는 제14단계; 및 상기 제14단계에서 분리된 세포를 B유닛의 기본용액을 첨가하여 세포배양배지가 들어있는 대용량세포배양용기에 넣고 C1-2유닛의 사이토카인1-2용액을 첨가하여 배양하는 제15단계;를 더 포함하여 수행될 수 도 있다. 필요한 경우 제14단계 및 제15단계는 1회 이상 반복수행 되어 무혈청2차배양액, 무혈청3차배양액 등을 얻을 수 있는데, 배양된 세포 상태에 따라 1 ~ 2 번 이상 더 반복하여 무혈청면역세포배양액을 한 뱃치에서 3~4리터 이상을 얻을 수 있다.
이 때, 제1단계에서 분리된 림프구는 채혈 후 1일 이상 지난 혈액으로부터 분리된 것이거나 고연령층의 면역세포 또는 중증 암환자의 면역세포와 같이 약한 면역세포일 수 있으며, 첨가되는 자가혈장 또는 FBS의 함량은 전체배지의 10부피%미만이다.
제1단계가 수행된 후 제2단계가 수행될 때까지는 24시간 이상의 간격을 두면 약해진 면역세포를 충분히 활성화시킬 수 있다. 제2단계가 수행된 후 제3단계가 수행될 때까지도 24시간 이상의 간격을 두어 항체1용액으로 즉 IL-2 존재 하에 항CD16과 항CD56으로 충분히 림프구를 자극하도록 한 후 제3단계가 수행되어야 D용액에 포함된 항CD3 항체가 고정화되지 않고 배지에 첨가되어 항CD3항체가 배양배지 내에서 분해되어 없어질 때까지 자극을 주더라도 특별한 문제가 전혀 발생하지 않고 NK세포가 많이 증식되었다.
본 발명의 배양단계에서 첨가되는 자가 혈장은 헤파린이 공지된 배양방법에서 사용되는 자가혈장에 포함된 헤파린의 양보다 최소 3배 이상이 더 많이 포함된 것이다. 즉, 통상 채혈시 헤파린을 혈액 10mL당 158 usp unit을 사용할 지라도 혈액은 응고되지 않으나, 혈장 약 5ml당 158 usp unit으로 세포배양액에 넣었을 때 묵처럼 응고되는 현상으로 세포 배양이 잘 되지 않기 때문이다. 하지만 본 발명에서는 최소한 통상사용량의 3배 이상의 헤파린을 사용하였을 경우 응고 현상 없이 세포가 잘 배양될 수 있음을 확인하였는데, 알려진 것보다 해파린을 3~4배 이상 사용하여도 배양에 문제가 없음을 확인하였다. 또한 일반적으로 사용하는 혈장 불활성화 방법에서 섭씨 56도에서 30분간 가열하여 보체 등 단백질 등을 제거할 때 세포 배양에 필요한 유효성분들이 같이 제거 되지만, 본 발명과 같이 약 3배 이상의 헤파린을 사용하고 혈장불활성화 방법을 사용하지 않았을 때 배양에 필요한 유효성분들의 손실이 없기 때문에 소량의 혈장(plasma)를 사용할 수 있었다. 예를 들어 기존에는 배양액의 10부피%이상이 사용되지만, 본 발명에서 10부피%미만으로 3부피% 내지 7부피%만 사용하여도 배양이 잘 됨을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 배양방법에 사용되는 자가혈장은 혈장 1ml당 헤파린이 40 usp unit이상, 바람직하게는 50 ~ 60 usp unit이상 포함될 수 있다.
이와 같은 방식으로 면역세포를 배양하게 되면 세포배양단계에서 배양된 면역세포 수 중 30 내지 80%가 NK세포로 NK세포 비중을 높일 수 있고, 이와 같이 NK세포의 비중이 높아지면 혼합배양액에는 다량의 인터루킨-8, 각종 성장인자 및 인터페론 감마 등의 싸이토카인이 포함될 수 있는데, 일예로 인터루킨-8의 농도가 100 ~ 20000pg/mL이고, 인터페론 감마의 농도는 400 ~ 400000 pg/mL범위 일 수 있다. 이와 같이 무혈청 배양액에 인터루킨-8이나 인터페론 감마가 다량 포함되게 되면, 무혈청 배양액으로터 면역세포만을 분리하여 얻어진 무혈청 면역세포배양액은 화상 및 창상을 포함하는 상처치료, 알러지에 의한 피부염을 포함한 피부질환 치료, 및 피부 미용에 매우 효과가 우수한 유효성분으로 작용할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 무혈청 면역세포배양액 및 화장료성분을 포함함으로써 인터루킨-8 및 인터페론 감마의 작용에 의해 피부 미백, 색소 침착 제거, 주름 개선 중 하나 이상에 유효하다. 특히, 무혈청 면역세포배양액은 화장료조성물의 전체중량에 대해 0.1중량% 내지 50중량%까지 사용될 수 있는데, IL-8은 1pg/mL ~ 1200pg/mL, 인터페론 감마는 5pg/mL ~ 15000pg/mL 정도 포함될 수 있다. 후술하는 실험예를 통해 명백하듯이 알러지 비염, 알러지 피부염, 아토피 피부염, 여드름, 벌레 물려 생긴 염증 등에 염증 개선 효과가 좋았으며 특히 가려움을 신속히 없애 주는 효과가 있었다. 화상, 창상 등의 치료를 통한 피부재생효과와 침착 색소의 제거에 효과가 매우 좋았으며 또한 피부미백에도 효과가 있음을 확인하였다.
본 발명의 화장료 조성물은 본 발명의 면역세포배양방법으로 얻어진 면역세포배양액을 일정 중량으로 포함하는 것만 차이가 있을 뿐 공지된 에멀젼, 리포좀, 염분산 등을 포함한 화장료조성물 제조방법을 사용하여 공지된 제제인 바디로션, 스킨로션, 에센스, 크림 등으로 구현될 수 있으므로 이에 대해서 상세한 설명은 생략한다.
본 발명의 약학적 조성물은 무혈청 면역세포배양액을 유효성분으로 포함하여 인터루킨-8 및 인터페론 감마 등의 작용에 의해 화상 및 창상을 포함하는 상처 또는 피부질환 치료에 유효한 효과를 갖는다. 본 발명의 약학적 조성물은 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 약학적으로 허용되는 공지된 충전제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제 등를 사용하여 조제된다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함되는데, 피부에 적용할 수 있는 것으로는, 예를 들어 공지된 구성의 현탁제, 용액제, 거품제, 유제(예 : 유중수(water/ oil, W/O)와 수중유(oil/water,O/W)유제), 및 겔 제제 등이 사용될 수 있다.
특히, 무혈청 면역세포배양액은 약학적조성물의 전체중량에 대해 10중량% 내지 80중량%까지 사용될 수 있는데, IL-8은 100pg/mL ~ 8000pg/mL, 인터페론 감마는 300pg/mL ~ 50000pg/mL 정도 포함될 수 있다.
실시예 1
무혈청면역세포배양용 배지첨가키트를 다음과 같이 준비하였다.
1. B유닛 준비단계
IL-2 2.2mg과 500mM L-glutamine 용액 100mL를 부유세포 배양용 기본 배지(기본 배지에 IL-2 또는 L-glutamine 이 이미 존재할 경우 최종농도를 맞추기 위해 첨가량을 조정한다)에 넣어 녹이고 최종 10L를 만들어 기본 용액(B용액)을 제조하였다. 이 용액 3.8L를 이용하여 각각 용기에 36mL씩을 담아 마개를 하고 미리 준비한 "B solution" 라벨을 붙여서 B유닛을 준비하고 냉장 보관하였다. 나머지 6.2L는 다른 유닛을 만드는데 사용하였다.
2. C1-1유닛 준비단계
IL-12 20ug과 IL-18 125ug을 증류수에 녹여 10mL로 만들어 사이토카인용액(C용액)을 제조하였다. C용액 1mL를 기본용액(B용액) 1000mL에 녹여 사이토카인1-1용액(C1-1용액)을 제조하였다. 이 C1-1용액 중 490mL를 사용하여 용기에 각각 4.5mL씩 담아 마개를 하고 미리 준비한 "C1-1 solution"라벨을 붙여서 C1-1유닛을 준비하고 냉장 보관하였다. 나머지 110mL는 D유닛 제조에 사용하였다.
3. C1-2유닛 준비단계
C용액 5mL를 기본용액 1000mL에 녹여 사이토카인1-2용액(C1-2용액)을 제조하였다. 용기에 각각 50mL씩 담아 마개를 하고 미리 준비한 "C1-2 solution"라벨을 붙여서 C1-2유닛을 준비하고 냉장 보관하였다.
3. C2유닛 준비단계
IL-15 20ug을 B용액에 넣어 1000ml로 하여 사이토카인2용액(C2용액)을 제조하였다. C2용액을 용기에 9mL씩을 담아 마개를 하고 미리 준비한 "C2 solution" 라벨을 붙여서 C2유닛을 제조하고 냉장보관하였다.
4. A1유닛 준비단계
항CD16 및 항CD56 항체 각각 0.5mg을 B용액 300mL에 녹여 항체1용액(A1 용액)을 제조하였다. 용기에 항체1용액 100mL를 1mL씩을 담아 미리 준비한 "A1 solution"이 라벨을 붙여서 A1유닛을 준비한 다음 냉장 보관하였다. 남은 200mL는 A2유닛을 제조하는데 사용하였다.
5. A2유닛 준비단계
A1용액 200mL와 B용액 3400mL를 섞어서 항체2용액(A2용액)을 제조하였다. 용기에 9mL, 27mL씩을 각각 담아 미리 준비한 "A2 solution"라벨을 붙여서 A2유닛을 준비한 다음 냉장 보관하였다. 이 때, A1용액 및 A2용액은 1개월 이내의 짧은 유효기간을 가지므로, 다음과 같이 만들어 사용할 수도 있다.
항CD16(1mg/mL) 및 항CD56(1mg/mL) 항체 용액을 각 6uL씩과, B용액 3mL를 별도 포장해 두고 세포 배양시 서로 섞어 녹여 A1과 A2용액을 만들어 사용할 수 있다.
즉, 먼저 B용액 3mL에 별도 포장된 항CD16 및 항CD56 항체 각각 6uL를 용해시켜 만들어진 A1용액 중 1mL을 용기에 담아 미리 준비한 "A1 solution"의 라벨을 붙여서 A1유닛을 제조한 후 냉장 보관한다. 남은 용액 약 2mL에 B용액 34mL를 섞어서 A2용액을 만든 후 만들어진 A2용액을 9mL와 27mL를 따로 담아"A2 solution"의 라벨을 붙여서 A2유닛으로 제조한 후 냉장보관하여 사용할 수 있다. 이 경우 이들의 유효기간은 6개월 이상으로 연장될 수 있다.
6. D유닛 준비단계
항CD3항체 500ug을 C1-1 용액에 넣어 105mL로 하여 항체-사이토카인혼합용액(D 용액)을 제조한 후, 용기에 1mL씩을 담아 미리 준비한"D solution"의 라벨을 붙여서 D유닛을 준비한 후 냉장 보관하였다. 이 때, D용액은 1개월 이내의 짧은 유효기간을 가지므로, 다음과 같이 만들어 사용할 수도 있다.
항CD3항체 용액(1mg/mL) 5uL를 및 C1-1용액 1mL를 별도 용기에 각각 포장하여 D유닛을 준비한 다음, 사용시에 이들을 섞어서 D용액을 제조할 수 있다. 즉, 사용 전에 항CD3항체 5uL를 C1-1 용액1 mL에 넣어 녹이고 "D1 solution, day1"의 라벨을 붙여서 D유닛으로 제조한 후 냉장보관하여 사용할 수 있다. 이 경우 유효기간은 6개월 이상으로 연장될 수 있다.
7. 무혈청면역세포배양용 배지첨가키트 준비
준비된 B유닛, C1-1유닛, C1-2유닛, C2유닛, A1유닛, A2유닛 및 D유닛을 배치하여 무혈청면역세포배양용 배지첨가키드를 제조할 수 있다. 필요한 경우 사용 순서에 따라 C1-1유닛, C2유닛, A1유닛, D유닛, C1-1유닛, A2유닛, C2유닛, A2유닛, B유닛 및 C1-2유닛의 순서로 배치하여 준비될 수도 있다.
실시예 2
환자의 혈액으로부터 림프구 및 자가혈장을 준비한 다음, 실시예1에서 얻어진 무혈청면역세포배양용 배지첨가키트를 이용하여 다음과 같이 면역세포를 배양하였다.
1.림프구추출 및 자가혈장 준비단계
인간의 림프구 또는 단핵구 등의 단핵세포가 1.077보다 낮은 비중을 가지는 성질을 이용하여 치료 대상 환자의 혈액을 1.077 비중의 Ficoll-Paque Plus용액에 중첩시켜 일정한 원심력으로 원심 침전시킴으로써, 비중의 차이에 따라 비중이 1.077보다 큰 적혈구와 과립구층은 아래로, 1.077 이하인 단핵세포층과 혈소판 등은 위로 분리되게 하여 림프구가 포함된 단핵세포층을 얻고, 분리된 단핵세포층으로부터 림프구만을 추출하였다.
보다 구체적으로 살펴보면 환자A로부터 채혈한지 1일이 도과한 말초혈액 30㎖을 50㎖ conical tube에 넣은 후 원심분리한 후 상층의 자가혈장을 헤파린튜브에 넣어 처리한 다음 새로운 50㎖ conical tube에 넣고 다시 원심분리한 후 상층부의 혈장성분을 자가혈장으로 준비하였다.
그 후 혈장이 제거된 혈액튜브에 PBS를 넣어 부피를 30㎖로 맞춘 다음 잘 섞어서 준비해둔 Ficoll-Paque Plus가 들어있는 튜브에 옮기고, 800xg에서 15분간 원심분리한 후, 두 번째 층인 림프구가 들어 있는 연막층(buffy coat layer)을 분리하여 50㎖ conical tube에 모으고, PBS로 50㎖까지 부피를 맞춘 다음 섞어주었다. 그 후 2 내지 3번의 원심분리를 통해 상층액을 버리고 림프구를 분리하였다. 이 때 얻어진 림프구세포수는 1.0 x107 개였다.
2. Day 0: 분리된 림프구에 C1-1유닛의 사이토카인1-1용액 및 C2유닛의 사이토카인2용액 중 하나 이상을 첨가한 다음 자가혈장을 첨가하는 제1단계를 다음과 같이 수행하였다.
분리된 림프구 세포를 C1-1 solution 1바이알(4.5mL)과 혈청 0.5㎖을 처리하여 T25 Flask에 넣고 CO₂ Incubator(배양기)에서 배양하였다.
3. Day 1: 제1단계가 수행된 배지에 A1유닛의 항체1용액을 첨가하는 제2단계를 다음과 같이 수행하였다.
배양 중인 T25 플라스크에 A1 solution 1 바이알(1mL)을 추가하고 가볍게 흔들어 준 후 배양기에 넣어 배양을 계속하였다.
4. Day 2: 제2단계가 수행된 배지에 D유닛의 항체-사이토카인혼합용액을 첨가하는 제3단계를 다음과 같이 수행하였다.
배양 중인 T25 플라스크에 D solution 1 바이알(1mL)을 추가하고 가볍게 흔들어 준 후 배양기에 넣어 배양을 계속하였다.
5. Day 3: 제3단계가 수행된 배지에 C1-1유닛의 사이토카인1-1용액을 첨가한 다음 자가혈장을 첨가하는 제4단계를 다음과 같이 수행하였다.
배양 중인 T25 플라스크에 C1-1 solution(day3) 1바이알(4.5mL)을 추가하고 0.5mL의 자가 혈장을 첨가한 후 조심스럽게 흔들어 준 후 배양기에서 배양을 지속하였다.
6. Day 4: 제4단계가 수행된 배지에 A2유닛의 항체2용액을 첨가한 다음 자가혈장 또는 FBS를 첨가하는 제5단계를 다음과 같이 수행하였다.
배양 중인 T25 플라스크의 바닥을 scraper로 잘 긁어모아 모든 세포를 T75 플라스크로 옮긴다. 여기에 A2 solution(day4) 1바이알(9mL)과 자가혈장 또는 FBS(또는 이와 유사한 것) 1mL를 추가하고 부드럽게 흔들어 준 후 배양기에 넣어 배양을 지속하였다.
7. Day 5: 제5단계가 수행된 배지에 C2유닛의 사이토카인2용액을 첨가한 다음 자가혈장 또는 FBS를 첨가하는 제6단계를 다음과 같이 수행하였다.
배양 중인 T75 플라스크에 C2 solution 1 바이알(9mL)과 자가혈장 또는 FBS(또는 이와 유사한 것) 1mL를 추가하고 부드럽게 흔들어 준 후 배양기에 넣어 배양을 지속하였다.
8. Day 6: 제6계가 수행된 배지에 A2유닛의 항체2용액 및 자가혈장 또는 FBS를 첨가하는 제7단계를 다음과 같이 수행하였다.
배양 중인 T75 플라스크의 바닥을 scraper로 잘 긁어 모아 모든 세포를 T150 플라스크에 옮긴다. 여기에 A2 solution 1 바이알(27mL)과 자가혈장 또는 FBS(또는 이와 유사한 것) 3mL를 추가하고 부드럽게 흔들어 준 후 배양기에 넣어 배양을 지속하였다.
9. Day 7: 제7단계가 수행된 배지에 B유닛의 기본용액 및 자가혈장 또는 FBS를 첨가하는 8단계를 다음과 같이 수행하였다.
배양 중인 T150 플라스크에 B solution 1바이알(36mL)과 자가혈장 또는 FBS(또는 이와 유사한 것) 4mL를 추가하고 부드럽게 흔들어 준 후 배양기에 넣어 배양을 지속하였다.
10. Day 8 ~ Day 14: 제8단계가 수행된 배지에 자가혈장 또는 FBS를 첨가한 후 세포배양배지가 들어있는 대용량세포배양용기에 넣고 배양하는 제9단계(대량배양 후 세포수확 단계)를 다음과 같이 수행하였다.
- Day 8 : 배양 중인 T150 플라스크의 바닥을 scraper로 긁어모아 이 단계에서 세포를 수확할 수도 있으나 본 연구에서는 세포 확인 후 바로 이 세포와 배양액에 남은 자가 혈장 모두 또는 FBS(또는 이와 유사한 것) 10㎖를 추가하여 세포 현탁액을 만든 다음, 세포배양배지가 들어있는 1L CO2투과성 배양백의 1/3을 집게로 집은 후 세포현탁액을 첨가하여 세포배양배지와 잘 섞이도록 마사지 해준 후 37℃, 5% CO₂배양기에 고르게 펴 넣어 배양한다.
- Day 9: 배양 중인 세포들이 잘 자라도록 배양 bag을 충분히 마사지 한 후, 37℃, 5% CO₂배양기에서 배양한다.
- Day 10: 배양백을 1/3으로 집었던 집게를 2/3까지 풀고 충분히 마사지 한 후, 37℃, 5% CO₂배양기에서 지속 배양한다.
- Day 11: 배양백을 2/3으로 집었던 집게를 모두 풀고 충분히 마사지 한 후, 37℃, 5% CO₂배양기에서 지속 배양한다.
- Day 14 : 배양이 끝난 최종배양액을 원심분리튜브에 담아 여러 번의 원심분리를 통해 세포를 수확하였다. 수확된 세포를 생리식염수 백에 포장하여 냉장보관하거나 동결하여 보관이 가능하다.
실시예 3
실시예2에서 수행된 제1단계 내지 제7단계를 동일하게 수행한 후 다음 단계를 더 수행하였다.
1. Day 7: 제7단계가 수행된 배지를 세포와 혈청배양액으로 분리하는 제10단계를 다음과 같이 수행하였다.
배양 중인 T150 플라스크의 배양액을 면역세포와 혈청배양액으로 분리하기 위해 원심분리하였다.
2. Day 7: 제10단계에서 분리된 세포를 세척하는 제11단계를 다음과 같이 수행하였다.
원심분리된 면역세포를 PBS로 3회 이상 세척하였다.
3. Day 7: 제11단계에서 세척된 세포를 새로운 배양용기에 넣고 B유닛의 기본용액을 첨가하여 배양하는 제12단계를 다음과 같이 수행하였다.
세척된 면역세포를 T150 플라스크에 넣고 여기에 B solution 100㎖를 첨가한 후 CO₂ Incubator에서 배양하였다.
4. Day 8 ~ Day 11: 제12단계가 수행된 배지를 세포배양배지가 들어있는 대용량세포배양용기에 넣고 C1-2유닛의 사이토카인1-2용액을 첨가하여 배양하는 제13단계를 다음과 같이 수행하였다.
- Day 8: 세포 배양 배지가 들어 있는 1L 배양 bag의 절반을 집게로 집은 후 T150 플라스크의 배양 중인 세포가 포함된 배양액을 이 bag에 넣고 C1-2유닛의 사이토카인1-2용액 50mL를 넣어 37℃, 5% CO₂ incubator에 넣어 배양하였다.
- Day 9 : 배양 중인 세포들이 잘 자라도록 충분히 마사지 한 후, 37℃, 5% CO₂배양기에서 지속 배양한다.
- Day 10 : 반을 집게로 집었던 1ℓ CO₂투과 bag에서 집게를 제거하고 지속 배양한다.
5. Day 11 ~ Day 14 : 제13단계가 수행된 배지를 세포와 무혈청1차배양액으로 분리하는 제14단계 및 제14단계에서 분리된 세포를 B유닛의 기본용액을 첨가하여 세포배양배지가 들어있는 대용량세포배양용기에 넣고 C1-2유닛의 사이토카인1-2용액을 첨가하여 배양하는 제15단계를 다음과 같이 수행하였다.
- Day 11 : 세포를 포함한 1차 배양액을 원심분리(400xg)를 통해 면역세포와 무혈청1차배양액으로 분리하여 무혈청1차배양액을 수거하여 냉장 보관한다.
2차 세포배양 : 1차 배양액에서 수확된 면역세포를 B solution 100㎖에 풀어 넣는다. 세포 배양 배지가 들어 있는 1L 배양 bag의 절반을 집게로 집은 후 세포가 포함된 배양액을 이 bag에 넣고 C1-2유닛의 사이토카인1-2용액 50mL를 넣어 37℃, 5% CO₂ incubator에 넣어 배양한다.
-Day 12 : 배양 중인 세포들이 잘 자라도록 충분히 마사지 한 후, 37℃, 5% CO₂배양기에서 지속 배양한다.
-Day 13 : 반을 집게로 집었던 1ℓ CO₂투과 bag에서 집게를 제거하고 지속 배양한다.
-Day 14 : 배양 중인 세포들이 잘 자라도록 충분히 마사지 한 후, 37℃, 5% CO₂배양기에서 지속 배양한다.
6. Day 15 ~ Day18 : 2차 세포 수확 후 3차 배양 및 무혈청 면역세포 배양액 수거
- Day 15 : 제15단계가 수행된 세포를 포함한 2차배양액을 원심분리(400xg)를 통해 면역세포와 배양액으로 분리한다. 분리한 배양액은 무혈청 면역세포 배양액으로서 냉장 보관한다.
3차 세포배양 : 2차 배양액에서 수확된 면역세포를 B solution 100㎖에 풀어 넣는다. 세포 배양 배지가 들어 있는 1L 배양 bag의 절반을 집게로 집은 후 세포가 포함된 배양액을 이 bag에 넣고 C1-2유닛의 사이토카인1-2용액 50mL를 넣어 37℃, 5% CO₂ incubator에 넣어 배양한다.
-Day 16 : 배양 중인 세포들이 잘 자라도록 충분히 마사지 한 후, 37℃, 5% CO₂배양기에서 지속 배양한다.
-Day 17 : 반을 집게로 집었던 1ℓ CO₂투과 bag에서 집게를 제거하고 지속 배양한다.
-Day 18 : 배양 중인 세포들이 잘 자라도록 충분히 마사지 한 후, 37℃, 5% CO₂배양기에서 지속 배양한다.
7. 6.에 기재된 과정을 세포 상태에 따라 1 ~ 2 번 이상 더 반복하여 무혈청 배양액을 한 뱃치에 총 4리터 이상을 얻을 수 있다.
실시예 4
실시예2에서 수행된 제1단계 내지 제8단계를 동일하게 수행한 후 다음 단계를 더 수행하였다.
1. Day 8 ~ Day 10 : 제8단계가 수행된 배지에 자가혈장 또는 FBS를 첨가한 후 세포배양배지가 들어있는 대용량세포배양용기에 넣고 배양하는 제9단계(대량배양 후 세포수확 단계)를 다음과 같이 수행하였다.
- Day 8 : 배양배지에 남은 자가 혈장 모두 또는 FBS(또는 이와 유사한 것) 10㎖를 넣는다. 세포배양배지가 들어 있는 1ℓ CO₂투과 배양 bag의 절반을 집게로 집은 후 세포가 포함된 배양 중인 세포를bag에 넣고 37℃, 5% CO₂ incubator에 넣어 배양한다.
- Day 9 : 배양 중인 세포들이 잘 자라도록 배양 bag을 충분히 마사지 한 후, 37℃, 5% CO₂배양기에서 배양한다.
- Day 10 : 배양백을 반으로 집었던 집게를 풀고 충분히 마사지 한 후, 37℃, 5% CO₂배양기에서 지속 배양한다.
2. Day 11 부터 실시예 3에서 수행된 제10단계 내지 제15단계를 동일하게 수행하여 혈청배양액, 1차무혈청배양액 내지 4차무혈청배양액을 얻었다.
비교예
실시예2에서 제1단계를 수행하지 않은 것을 제외하면 실시예2와 동일한 방법을 수행하여 비교예배양액을 얻었다.
실험예 1
실시예2에서 얻어진 배양액과 비교예에서 얻어진 비교예배양액에서 총세포수와 NK세포비율을 분석하고 그 결과를 표 1에 나타내었다.
구분 초기세포수 2주 배양 후 총 세포수 2주 배양 후 NK세포 비율
비교예 1.0 x 10^7 195 x 10^7 40.2%
실시예2 1.0 x 10^7 250 x 10^7 60.5%
표 1로부터, 환자로부터 채혈후 1일이 도과한 혈액에서 분리된 림프구와 같이 약해진 면역세포의 경우 본 발명과 같이 사이토카인을 이용하여 약해진 림프구를 활성화시켜 회복시킨 후 항 CD16, 항 CD56로 자극하는 것이 증식되는 세포수를 증가시키는 것은 물론 NK세포 비율까지도 증가시킬 수 있는 것을 알 수 있다.
실험예 2
실시예3에서 얻어진 혈청배양액, 1차 무혈청배양액, 2차 무혈청배양액,3차 무혈청배양액, 4차 무혈청배양액에서 배양된 총세포수와 인터루킨-8 및 인터페론 감마의 함량 및 NK세포비율을 분석하고 그 결과를 표 2에 나타내었다.
표 2로부터, 4차까지 배양해도 총세포수와 인터루킨-8 및 인터페론 감마의 함량 및 NK세포비율면에서 적합한 성능을 갖는 배양액을 얻을 수 있음을 알 수 있다.
혈청배양액 1차무혈청 배양액 2차무혈청 배양액 3차무혈청 배양액 4차무혈청 배양액
배양 일수(day) day7 day11 day15 day19 day23
배양액수득량(L) 0.06 1.1 1.1 1.1 1.1
세포수(x 10^7) 11.5 120 150 140 125
IL-8 (ng/mL) 36.1 7.8 8.4 6.2 5.1
INF-g (ng/mL) 1250 121.1 113.2 57.95 32.1
NK세포(%)(CD16+, CD56+) 21.2 34.6 46.72 56.17 55.2
혈청(유, 무) 유 무 무 무 무
실험예 3.
실시예4에서 얻어진 혈청배양액, 1차무혈청배양액, 2차무혈청배양액, 3차무혈청배양액, 4차무혈청배양액에서 배양된 총세포수와 인터루킨-8 및 인터페론 감마의 함량 및 NK세포비율을 분석하고 그 결과를 표 3에 나타내었다.
상술된 표2 및 하기 표 3으로부터 알 수 있듯이, 실시예3과 비교하여 배양기간이 7일 늦은 4차 무혈청배양액까지 얻게 되는 경우, 총세포수나 NK세포 비율은 차이가 없고, 배양되는 면역세포의 활력의 감소로 인한 것인지 인터루킨-8 및 인터페론 감마의 함량은 약 절반수준으로 떨어지는 것을 알 수 있지만, 기존방법으로 얻어진 배양액과 비교하여 본 발명에 의하면 무혈청이면서도 사이토카인의 함량도 적합한 무혈청면역세포배양액을 얻을 수 있는 것이 분명하다.
혈청배양액 1차 무혈청 배양액 2차무혈청배양액 3차무혈청 배양액 4차무혈청 배양액
배양 일수(day) day11 day15 day19 day23 day27
배양액수득량(L) 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1
세포수(x 10^7) 210 410 390 350 245
IL-8 (ng/mL) 3.8 4.4 4.2 3.8 2.5
INF-g (ng/mL) 49.7 126.3 55.6 30.6 15.2
NK세포(%)(CD16+, CD56+) 34.6 46.72 56.1 55.7 56.2
혈청(유, 무) 유 무 무 무 무
이상의 실험결과로부터 면역세포의 2차 대사산물인 여러 싸이토카인의 함량은 배지 교체 후 약 2일 째 급격히 증가하여 약 3일째에 거의 최고치에 이르는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명에서는 싸이토카인의 함량이 풍부한 면역세포배양액을 2차 배양액으로부터 3~4일 간격으로 배지를 갈아주면서 얻을 수 있다. 본 발명의 면역세포배양액은 다량의 Cytokine 들을 함유하고 있어 피부미백, 색소침착제거, 피부재생 효과가 탁월하여 치료제 또는 미용소재로서 경쟁력 있는 소재가 될 수 있다.
실시예 5
실시예 3에서 얻어진 무혈청면역세포배양액을 5중량% 포함하는 하기의 표4와 같은 조성의 화장료 조성물을 제조하였다.
성분 함량(단위 : 중량%)
면역세포배양액리포좀(배양액으로서%) 5.0
화장료성분 Water 적량
Dimethicone 1.000
Cyclopentasiloxane 3.000
Caprylic/Capric Triglyceride 3.000
Squalane 5.000
Butylene Glycol 5.000
Glycereth-26 1.000
Dimethicone/Vinyl Dimethicone Crosspolymer 1.000
Cetyl PEG/PPG-10/1 Dimethicone 1.000
Mineral Oil 2.000
Cetyl Ethylhexanoate 3.000
Glycerin 5.000
Beta-Glucan 2.000
Macadamia Integrifolia Seed Oil 0.500
Prunus Armeniaca (Apricot) Kernel Oil 0.500
Lecithin 0.800
Hydrogenated Lecithin 3.000
Oligopeptide-1 1.000
Acetyl Hexapeptide-1 1.000
Stearalkonium Chloride 0.500
Dipeptide Diaminobutyroyl Benzylamide Diacetate 0.500
Phenoxyethanol 0.500
Chlorphenesin 0.200
Sodium Hyaluronate 0.100
Tocopheryl Acetate 0.100
Disodium EDTA 0.050
향, 방부제 적량
계 100
실험예 4
실시예 5에서 얻어진 화장료조성물의 염증개선효과 및 색소침착개선효과를 확인하기 위하여 2명의 여드름 부위에 세안 후 화장료조성물을 아침저녁으로 2회씩 도포하여 7일 및 16일차의 경과를 보여주는 사진을 각각 도 1 및 도 2에 도시하였다.
도 1 및 도 2로부터, 처음에는 여드름이 매우 심하였으나 시간이 지남에 따라 여드름이 많이 개선되었고 침착된 색소도 많이 제거된 것을 확인 할 수 있다.
실험예 5
실시예 5에서 얻어진 화장료조성물의 염증개선 및 색소침착제거효과를 확인하기 위하여 산 벌레에 물려 생긴 붉은 반점 부위에 화장료조성물을 아침저녁으로 2회씩 도포하여 경과를 보여주는 사진을 도 3에 도시하였다.
도 3에 도시된 바와 같이 2일 만에 염증이 빠르게 제거되고 가려움증도 없어졌으며 붉은 반점도 사라짐을 확인할 수 있었다.
실험예 6
실시예 5에서 얻어진 화장료조성물의 염증개선 및 색소침착제거효과를 확인하기 위하여 알러지 발생 부위에 화장료조성물을 아침저녁으로 2회씩 도포하여 경과를 보여주는 사진을 도 4에 도시하였다.
도 4에 도시된 바와 같이 고름은 도포한지 하루 안에 없어졌으나, 도시하지는 않았지만 색소가 없어지기까지는 약 1주 정도 소요되었다.
실험예 7
실시예 5에서 얻어진 화장료조성물의 염증개선 및 색소침착제거효과를 확인하기 위하여 여러 개의 알러지가 시간차를 두고 발생한 넓은 부위에 화장료조성물을 아침저녁으로 2회씩 도포하여 경과를 보여주는 사진을 도 5에 도시하였다.
도 5에 도시된 바와 같이 염증과 색소가 없어지기까지 약 1주 정도 소요되었다.
실시예 6
실시예 3에서 얻어진 무혈청면역세포배양액을 20중량% 포함하는 약학적 조성물을 제조하였으며 조성은 실시예3의 표4에서 무혈청면역세포배양액을 20중량%로 하고 나머지는 동일하게 제조하였다.
실험예 8
실시예 6에서 얻어진 약학적조성물의 피부재생효과를 확인하기 위하여 화상을 입은 부위에 약학적조성물을 아침저녁으로 2회씩 도포하여 경과를 보여주는 사진을 도 6에 도시하였다.
구체적으로 경과를 설명하면 도 6에 도시된 사선모양의 상처는 1차로 2016년 6월 말경 제빵기 오븐에 팔을 데인 후이고 수직방향 상처는 8월 31일 또 데인 경우이다. 이와 같이 화상을 입은 부위에 약학적조성물을 아침, 저녁으로 2회씩 도포하여 16일차의 경과를 보면, 상한 표피가 회복되고 침착 되었던 색소가 없어지는 것을 확인할 수 있고 화상을 입자마자 약학적조성물을 도포하게 되면 그 치료 효과가 더 좋음도 확인할 수 있었다.
본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시 예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시 예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.

Claims (19)

  1. IL-2, L-글루타민 및 세포배양용 배지를 포함하는 기본용액으로 구성된 B유닛;
    IL-12가 0.5∼5 ng/mL농도 및 IL-18가 2∼50 ng/mL 농도로 포함되도록 상기 IL-12 및 IL-18을 상기 기본용액에 용해시켜 형성된 사이토카인1-1용액으로 구성된 C1-1유닛;
    IL-12가 5.1∼15 ng/mL농도 및 IL-18이 30∼120 ng/mL 농도로 포함되도록 상기 IL-12 및 IL-18을 상기 기본용액에 용해시켜 형성된 사이토카인1-2용액으로 구성된 C1-2유닛;
    IL-15가 10~50ng/mL 농도로 포함되도록 상기 IL-15를 상기 기본용액에 용해시켜 형성된 사이토카인2용액으로 구성된 C2유닛;
    항CD16 및 항CD56이 각각 0.1 ~ 15ug/mL농도로 포함되도록 상기 항CD16 및 항CD56을 상기 기본용액에 용해시켜 형성된 항체1용액으로 구성된 A1유닛;
    상기 항체1용액: 상기 기본용액을 1:6~10의 부피비로 포함하는 항체2용액으로 구성된 A2유닛; 및
    항CD3가 1~12 ug/mL농도로 포함되도록 상기 항CD3를 상기 사이토카인1용액에 용해시켜 형성된 항체-사이토카인혼합용액으로 구성된 D유닛;을 포함하는 무혈청면역세포배양용 배지첨가키트.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 A1유닛이 상기 D유닛보다 림프구배양배지에 먼저 첨가되는 것을 특징으로 하는 무혈청면역세포배양용 배지첨가키트.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 A1유닛에 포함된 상기 항CD16, 항CD56 및 상기 기본용액이 분리 포장되고, 배지첨가단계에서 혼합되어 상기 항체1용액을 형성하는 것을 특징으로 하는 무혈청면역세포 배양용 배지첨가키트.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 A2유닛에 포함된 상기 항체1용액의 항CD16, 항CD56 및 상기 기본용액과, 상기 기본용액은 각각 분리 포장되고, 배지첨가단계에서 혼합되어 상기 항체2용액을 형성하는 것을 특징으로 하는 무혈청면역세포배양용 배지첨가키트.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 D유닛에 포함된 항CD3 및 상기 사이토카인1용액은 각각 분리 포장되고, 배지첨가단계에서 혼합되어 상기 항체-사이토카인혼합용액을 형성하는 것을 특징으로 하는 무혈청면역세포배양용 배지첨가키트.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 유닛들은 C1-1유닛, C2유닛, A1유닛, D유닛, C1-1유닛, A2유닛, C2유닛, A2유닛, B유닛 및 C1-2유닛의 순서, 또는
    C2유닛, C1-1유닛, A1유닛, D유닛, C1-1유닛, A2유닛, C2유닛, A2유닛, B유닛 및 C1-2유닛의 순서, 또는
    C1-1유닛, A1유닛, D유닛, C1-1유닛, A2유닛, C2유닛, A2유닛, B유닛 및 C1-2유닛의 순서, 또는
    C2유닛, A1유닛, D유닛, C1-1유닛, A2유닛, C2유닛, A2유닛, B유닛 및 C1-2유닛의 순서로
    림프구배양배지에 순차적으로 첨가되어 사용되도록 구성된 것을 특징으로 하는 무혈청면역세포배양용 배지첨가키트.
  7. 분리된 림프구에 C1-1유닛의 사이토카인1-1용액 및 C2유닛의 사이토카인2용액 중 하나 이상을 첨가한 다음 자가혈장을 첨가하는 제1단계;
    상기 제1단계가 수행된 배지에 A1유닛의 항체1용액을 첨가하는 제2단계;
    상기 제2단계가 수행된 배지에 D유닛의 항체-사이토카인혼합용액을 첨가하는 제3단계;
    상기 제3단계가 수행된 배지에 C1-1유닛의 사이토카인1-1용액을 첨가한 다음 자가혈장을 첨가하는 제4단계;
    상기 제4단계가 수행된 배지에 A2유닛의 항체2용액을 첨가한 다음 자가혈장 또는 FBS를 첨가하는 제5단계;
    상기 제5단계가 수행된 배지에 C2유닛의 사이토카인2용액을 첨가한 다음 자가혈장 또는 FBS를 첨가하는 제6단계; 및
    상기 제6계가 수행된 배지에 A2유닛의 항체2용액 및 자가혈장 또는 FBS를 첨가하는 제7단계;를 포함하는 면역세포배양방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 제7단계가 수행된 배지에 B유닛의 기본용액 및 자가혈장 또는 FBS를 첨가하여 배양하는 제8단계; 및
    상기 제8단계가 수행된 배지에 자가혈장 또는 FBS를 첨가한 후 세포배양배지가 들어있는 대용량세포배양용기에 넣고 배양하는 제9단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 면역세포배양방법.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 분리된 림프구는 채혈 후 1일 이상 도과한 혈액으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 면역세포배양방법.
  10. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 제7단계 또는 제9단계가 수행된 배지를 세포와 혈청배양액으로 분리하는 제10단계;
    상기 제10단계에서 분리된 세포를 세척하는 제11단계;
    상기 제11단계에서 세척된 세포를 새로운 배양용기에 넣고 B유닛의 기본용액을 첨가하여 배양하는 제12단계; 및
    상기 제12단계가 수행된 배지를 세포배양배지가 들어있는 대용량세포배양용기에 넣고 C1-2유닛의 사이토카인1-2용액을 첨가하여 배양하는 제13단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 면역세포배양방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 제13단계가 수행된 배지를 세포와 무혈청1차배양액으로 분리하는 제14단계; 및
    상기 제14단계에서 분리된 세포를 B유닛의 기본용액을 첨가하여 세포배양배지가 들어있는 대용량세포배양용기에 넣고 C1-2유닛의 사이토카인1-2용액을 첨가하여 배양하는 제15단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 면역세포배양방법.
  12. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 자가혈장은 혈장 1ml당 헤파린이 40 usp unit이상 포함된 것을 특징으로 하는 면역세포배양방법.
  13. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 첨가되는 자가혈장 또는 FBS의 함량은 전체배지의 10부피% 미만인 것을 특징으로 하는 면역세포배양방법.
  14. 제 7 항 또는 제 8 항의 배양방법으로 배양된 면역세포배양액.
  15. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 배지첨가키트로 배양된 면역세포배양액 또는 제 10 항의 배양방법으로 배양된 면역세포배양액으로부터 얻어진 무혈청면역세포배양액.
  16. 제 15 항의 무혈청면역세포배양액; 및
    화장료베이스;를 포함하는 화장료조성물.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 무혈청면역세포배양액은 염증개선, 피부 미백, 색소 침착 제거, 피부재생 중 하나 이상에 유효성분으로 작용하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  18. 제 16 항에 있어서,
    상기 무혈청면역세포배양액은 전체 조성물 중량기준 50중량%이하로 포함되는 것을 특징으로 하는 화장료조성물.
  19. 제 15 항의 무혈청면역세포배양액을 포함하는 화상 및 창상을 포함하는 상처 또는 피부질환 치료용 약학적조성물.
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