KR102218211B1

KR102218211B1 - 조절 t 세포 배양액을 포함하는 상처치유용 조성물

Info

Publication number: KR102218211B1
Application number: KR1020200053233A
Authority: KR
Inventors: 황성환; 강정화
Original assignee: 주식회사 이뮤니스바이오
Priority date: 2020-05-04
Filing date: 2020-05-04
Publication date: 2021-02-22
Also published as: WO2021225260A1

Abstract

본 발명은 조절 T 세포(Regulatory T cell, Treg cell)를 배양한 후 원심분리하여 얻은 조절 T 세포 배양액(Treg cell-conditioned media)을 유효성분으로 함유하는 상처치유용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조절 T 세포 배양액은 IL-6. IL-8, IL-13 등의 다양한 사이토카인과 성장인자를 함유하고, EMT를 확인하는 마커 단백질인 E-카드헤린의 발현을 투여량 의존적으로 감소시켜 세포의 이동에서 필수적으로 발생하는 EMT를 촉진시킴으로써 세포가 이동성을 가지도록 하여 세포증식에 영향을 주지 않으면서 케라티노사이트의 세포이동을 증가시키며, MMP-1의 발현 및 방출을 증가시켜 세포이동과 세포외기질의 분해에 영향을 미치므로, 본 발명의 조절 T 세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 조성물은 상처치유용으로 유용하게 사용될 수 있고, 상처치유를 통한 민감성 피부 진정 및 아토피 완화용으로도 유용하게 사용될 수 있다.

Description

조절 T 세포 배양액을 포함하는 상처치유용 조성물 {Healing composition comprising regulatory T cell-conditioned media}

본 발명은 상처치유효과를 가진 조절 T 세포 배양액에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 조절 T 세포를 배양하여 얻은 상처치유효과를 가진 조절 T 세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 상처치유용 조성물에 관한 것이다.

피부는 인체에서 가장 거대한 기관 중 하나로 외부 손상이나 온도변화, 환경변화 등으로부터 인체를 보호하는 것을 주된 기능으로 한다. 피부는 표피(Epidermis)와 진피(Dermis)의 두 층으로 구성되어 있다. 표피는 피부의 가장 바깥 층으로 대부분 케라티노사이트(Keratinocyte)로 구성되어 있고 기저층에서 세포가 증식하여 바깥쪽의 각질층으로 이동하면서 자연탈락하게 된다. 진피는 피부의 안쪽 층으로 세포외기질(Extracellular matrix, ECM)로 지지되어 피부의 쿠션기능과 인장력을 제공한다.

상처는 외상이나 질병과 같은 원인에 의해서 발생하는 피부의 비정상상태로 정의되는데 상처가 지속되면 피부가 온전한 기능을 수행할 수 없게 되므로 상처치유과정은 매우 중요하다.

상처치유과정은 간단하게 지혈(Hemostasis), 염증(Inflammation), 재상피화(Re-epithelialization), 조직 재구조화(Tissue remodeling)로 구분할 수 있다.

재상피화(Re-epithelialization) 과정은 상피세포(Epithelial cell)가 상처의 표면으로 이동하여 상처를 덮는 과정이다. 이 재상피화단계에서는 표피의 케라티노사이트가 상처부위로 이동하여 주로 관여한다. 상처부위에 새로운 상피(Epithelium)를 생성하기 위하여 케라티노사이트는 이동(Migration), 분화(Differentiation) 및 증식(Proliferation)의 과정을 거친다. 케라티노사이트가 이동성을 가지기 위해서는 EMT(Epithelial-Mesenchymal Transition, 상피-간엽 전이)가 필수적으로 동반되는데, 케라티노사이트는 EMT 과정을 거쳐 부착성 표현형(Adherent phenotype)에서 이동성 표현형(Migratory phenotype)으로 변화한다.

EMT 과정은 상처치유과정에서 필수적이며, EMT는 이동성을 가지게 하고 상피세포 마커 단백질의 발현을 감소시키며 간엽세포 마커 단백질의 발현을 증가시킨다. EMT 과정은 매트릭스 메탈로프로테이나제(Matrix metalloproteinases; MMPs), E-카드헤린과 같은 부착성 연접 단백질(Aadherent junction protein), Twist, Snail과 같은 전사인자(Transcription factor) 등에 의하여 반응이 조절된다.

메탈로프로테이나제(Metalloproteinase; MMP)는 세포외기질을 분해하는 역할을 하여 조직 재구조화 단계에서 케라티노사이트와 세포외기질의 부착을 줄여줌으로써 케라티노사이트의 이동을 허용하고 조직을 재구조화할 수 있도록 한다. 또한 MMP는 상피 및 간질 세포외기질 성분(Epithelial and interstitial extracellular matrix components)을 제거하거나 재구조화함으로써 세포이동과 조직 재구조화를 가능하게 하여 상처 치유의 모든 단계에서 중요한 역할을 수행한다. 세포외기질은 다양한 프로테이나제에 의하여 분해되는데, 피부에 가장 풍부하게 존재하는 Type I 콜라겐은 대부분의 효소에 저항성을 가진다. 매트릭스 메탈로프로테이나제-1(MMP-1)은 피부에 가장 풍부하게 존재하고 세포외기질의 대다수를 차지하는 콜라겐, 특히 Type I 콜라겐을 분해하는데, Type I 콜라겐을 절단하여 절단된 단편을 생성하고 접착성이 약한 결합리간드가 되도록 함으로써 세포외기질과의 결합을 느슨하게 하여 세포이동이 일어나게 한다. 또한 MMP-1은 다양한 성장인자와 사이토카인의 분비에 관여하여 세포 신호전달에서 중요한 역할을 수행한다. MMP의 발현은 매우 복잡하게 조절되는데, 일반적인 조건에서는 기저수준(Basal level)을 유지하고, 조직 재구조화가 필요한 경우에만 선택적으로 발현되어 활성화된다.

E-카드헤린(E-cadherin)은 부착성 연접 단백질(Adherant junction protein)의 하나로 세포간 접합과 상피 표현형을 유지하는 기능이 있으며, EMT를 확인하는 EMT 마커 단백질로 사용된다.

EMT가 진행되는 동안에, 상피세포에서는 세포골격 재배열(Cytoskeleton rearrangement)이 일어나고, 세포와 세포연접(Cell junction)과 심첨부-기저부 극성(Apical-basal polarity)이 약해지며 세포외기질과의 결합이 변화하게 된다. 그리고 간엽성 특징(Mesenchymal feature) 중 하나인 이동성을 얻게 된다 (Thiery et al., 2009; Lim and thiery, 2012; Lamouille et al, 2014; Niero et al., 2016). EMT 과정 중에는 부착성 연접(Adherent junction)이 불안정한 상태로 되어 E-카드헤린이 다운 레귤레이션(Down-regulation)된다.

면역세포(Immune cell)는 상처치유과정에서 매우 중요한 역할을 수행한다. 면역세포들은 상처가 나서 염증반응이 일어날 때 외부 항원을 제거하는데 기여하고, 상처치유과정에서 다양한 성장인자(Growth factor)와 사이토카인(Cytokine)을 분비하여 조직 재구조화와 세포이동에 영향을 준다. 면역체계는 매우 복잡한 상호작용(Cross-talk)으로 조절되며, 신체의 항상성을 유지하기 위해서는 면역체계가 잘 조절되는 것이 매우 중요하다.

조절 T 세포(Regulatory T cells, Treg cells)는 T 세포의 소집단(Subpopulation)으로서 면역반응 조절과정에서 매우 중요한 역할을 한다. 조절 T 세포는 면역시스템의 활성화를 조절하고 병리학적 자가반응(Pathological self-reactivity)인 자가면역질환(Autoimmune disease)을 예방하는 자가면역관용(Self-tolerance)효과를 보인다. 또한 조절 T 세포는 CTLA-4에 의한 직접적인 작용 이외에도 사이토카인, 성장인자 등과 같은 다양한 물질을 분비하여 주변 세포에 영향을 줄 수 있다. 사이토카인은 면역(Immunity), 염증(Inflammation), 조혈(Hematopoiesis) 등을 조절하는 신호전달분자의 카테고리로 면역세포 서로간의 상호작용 및 정보전달에 필수적인 물질이며 세포이동, 증식 및 염증성 반응에 관여한다. 예를 들어, IL-8의 경우 케라티노사이트의 이동을 상당히 증가시키는 것으로 보고되고 있다.

상처치유과정은 다양한 인자가 관여하여 매우 복잡하고 정교하게 조절되며, 상처치유가 제 기능을 하지 못하면 만성적인 염증반응과 같은 질병적인 문제뿐 아니라 흉터생성과 같은 미용적인 측면의 문제에도 영향을 미칠 수 있다.

대한민국 특허공개 제10-2018-0057359호 대한민국 특허공개 제10-2019-0076692호 미국 특허공개 US2014/0112898

Immune Cell-Conditioned Media Suppress Prostate Cancer PC-3 Cell Growth Correlating With Decreased Proinf lammatory/Anti-inflammatory Cytokine Ratios in the Media Using 5 Selected Crude Polysaccharides, Hsiao-Chien Lin et al., Integrative Cancer Therapies 2016, Vol. 15(4) NP13-NP25. 'Repair' Treg Cells in Tissue Injury, Chaoqi Zhanga et al., Cell Physiol Biochem 2017;43:2155-2169

상기 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 면역세포의 일종인 조절 T 세포를 배양한 배양액(Conditioned media)이 상처치유효과를 가지는 것을 확인하여 이를 유효성분으로 포함하는 상처치유용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 조절 T 세포를 배양한 후 원심분리하여 얻은 조절 T 세포 배양액을 유효성분으로 함유하는 상처치유용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은, 조절 T 세포 배양액을 조성물 중 1~10중량% 함유하는 것이 바람직하다.

상기 조성물에서, 상기 조절 T 세포 배양액은,

상기 혈액으로부터 PBMC를 분리하는 단계; 상기 분리한 PBMC에서 CD8+ 세포를 제거하는 단계; 상기 CD8+ 세포가 제거된 PBMC를 37℃, 5% CO₂ 조건으로 1~3일 동안 배양하는 단계; 상기 배양 후 2~3일 간격으로 계대배양하면서 12~16일 동안 배양하여 배양액을 얻는 단계; 및 상기 배양액을 원심분리하여 조절 T 세포를 제거하고 조절 T 세포 배양액을 얻는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 것임이 바람직하다.

상기 조성물에서, 상기 세포 배양용 배지는 무페놀레드 및 무항생제 배지를 사용하는 것이 바람직하다.

상기 조성물에서, 상기 배지는 항-CD2, 항-CD3, 항-CD7, 항-CD8, 항-CD28, 항-CD30L, 항-CD40, 항-CD70, 항-CD80, 항-CD83 및 항-CD86으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 항체; 인터류킨-2, 인터류킨-4, 인터류킨-7, 인터류킨-12, 인터류킨-15, 인터류킨-34 및 TGF-β로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 사이토카인; 및 SOD(Superoxide dismutase)를 더 포함할 수 있다.

상기 조성물에서, 상기 CD8+ 세포는 MACS 버퍼 내 세포현탁액과 CD8 마이크로 비드를 혼합하고 MS 칼럼을 이용하여 제거하는 것이 바람직하다.

상기 조성물에서, 상기 PBMC는 1.0×10⁷ 내지 3.0×10⁷ cells/flask의 농도로 배양하는 것이 바람직하다.

상기 조성물에서, 상기 계대배양은 세포의 농도가 0.5×10⁶내지 2.0×10⁶cells/mL가 되도록 배지를 추가하거나 플라스크 면적을 넓혀 주면서 배양하는 것이 바람직하다.

상기 조성물에서, 상기 원심분리는 100~1,000×g로 실시하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 조절 T 세포를 배양한 후 원심분리하여 얻은 조절 T 세포 배양액을 유효성분으로 함유하는, 상처치유를 통한 민감성 피부 진정 및 아토피 완화용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조절 T 세포 배양액은 IL-6. IL-8, IL-13 등의 다양한 사이토카인과 성장인자를 함유하고, EMT를 확인하는 마커 단백질인 E-카드헤린의 발현을 투여량 의존적으로 감소시켜 세포의 이동에서 필수적으로 발생하는 EMT를 촉진시킴으로써 세포가 이동성을 가지도록 하므로 세포증식에 영향을 주지 않으면서 케라티노사이트의 세포이동을 증가시키며, MMP-1의 발현 및 방출을 증가시켜 세포이동과 세포외기질의 분해에 영향을 미친다.

따라서 본 발명의 조절 T 세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 조성물은 상처치유용으로 유용하게 사용될 수 있으며, 상처치유를 통한 민감성 피부 진정 및 아토피 완화용으로도 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 CD8+ 제거된 PBMC로부터 분리된 조절 T 세포를 유세포분석하여 CD4, CD25 분자의 표면발현과 Foxp3의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 조절 T 세포 배양액 내 사이토카인을 분석한 결과이다.
도 3은 조절 T 세포 배양액이 HaCaT 케라티노사이트의 세포증식에 미치는 효과를 확인한 결과이다.
도 4는 조절 T 세포 배양액이 HaCaT 케라티노사이트의 세포이동에 미치는 효과를 확인한 결과이다.
도 5는 조절 T 세포 배양액이 HaCaT 케라티노사이트에서 E-카드헤린의 다운레귤레이션에 미치는 효과를 확인한 결과이다.
도 6은 조절 T 세포 배양액이 HaCaT 케라티노사이트에서 MMP-1 발현과 분비에 미치는 효과를 확인한 결과이다.

본 발명은 조절 T 세포를 배양한 후 원심분리하여 얻은 조절 T 세포 배양액을 유효성분으로 함유하는 상처치유용 조성물에 관한 것이다.

조절 T 세포 배양액은,

상기 혈액으로부터 PBMC를 분리하는 단계; 상기 분리한 PBMC에서 CD8+ 세포를 제거하는 단계; 상기 CD8+ 세포가 제거된 PBMC를 37℃, 5% CO₂ 조건으로 1~3일 동안 배양하는 단계; 상기 배양 후 2~3일 간격으로 계대배양하면서 12~16일 동안 배양하여 배양액을 얻는 단계; 및 상기 배양액을 원심분리하여 조절 T 세포를 제거하고 조절 T 세포 배양액을 얻는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 조절 T 세포를 배양한 후 원심분리하여 얻은 조절 T 세포 배양액을 유효성분으로 함유하는, 상처치유를 통한 민감성 피부 진정 및 아토피 완화용 조성물에 관한 것이다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

혈액으로부터 PBMC(Peripheral blood mononuclear cells, 말초 혈액 단핵세포)를 분리한다.

분리한 PBMC는 세척하는 것이 바람직하다. 통상의 세척용 버퍼를 사용하여 세척하며, MACS 버퍼를 사용하여 세척하는 것이 바람직하다.

분리한 PBMC에서 CD8+ 세포를 제거한다. CD8+ 세포는 MACS 버퍼 내 세포현탁액과 CD8 마이크로 비드(Micro beads)를 혼합하고 MS 칼럼(Miltenyi Biotec)을 이용하여 제거하는 것이 바람직하다. MACS 버퍼 내 세포현탁액과 CD8 마이크로 비드는 4:1의 비율(v/v)로 혼합하는 것이 바람직하다.

분리한 PBMC에서 CD8+ 세포를 제거하는 다른 방법으로는 RosetteSep Human CD8 Depletion Cocktail(STEMCELL technologies)을 이용하는 방법, MojoSort Human CD8 T Cell Isolation Kit(BioLegend)를 이용하는 방법, Dynabeads CD8(ThermoFisher scientific)을 이용하는 방법 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

CD8+ 세포가 제거된 PBMC는 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로 1~3일 동안 배양하며, 2일 동안 배양하는 것이 보다 바람직하다.

이때 세포 배양용 배지로는 무페놀레드(Phenol red free) 및 무항생제(Antibiotics free) 배지를 사용하는 것이 바람직하다.

PBMC의 배양에 통상적으로 사용되는 배지는 MEM(Minimal Essential Medium), DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI, MEM-α(Minimal Essential Medium-α), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, Swim's S-77 배지, CTS OpTmizer, EBM(Endothelial Basal Medium) 배지 및 X-Vivo 배지로 이루진 군으로부터 선택된 하나 이상의 배지를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 배지에 항-CD2, 항-CD3, 항-CD7, 항-CD8, 항-CD28, 항-CD30L, 항-CD40, 항-CD70, 항-CD80, 항-CD83 및 항-CD86으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 항체; 인터류킨-2, 인터류킨-4, 인터류킨-7, 인터류킨-12, 인터류킨-15, 인터류킨-34 및 TGF-β로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 사이토카인; 및 SOD(Superoxide dismutase)를 첨가하면 조절 T 세포의 분화효과가 보다 우수해진다. 이는 인터류킨은 조절 T 세포의 발달, 유지, 생존 및 확장을 촉진하고, 항-CD 항체는 조절 T 세포의 중요한 공동자극분자(Costimulatory molecules) 및 조절자이며, SOD는 과량으로 존재하는 경우 세포 생존과 분화에 영향을 미치는 ROS를 제거하여 감소된 세포 생존과 세포분화능력을 향상시키기 때문이다.

PBMC는 1.0×10⁷ 내지 3.0×10⁷ cells/flask의 농도로 배양하는 것이 바람직하며, 2.0×10⁷ cells/flask의 농도로 배양하는 것이 보다 바람직하다.

상기 배양 후 2~3일 간격으로 계대배양(Subculture)하면서 12~16일 동안 배양하여 배양액을 얻는다. 14일 동안 배양하는 것이 특히 바람직하다. 계대배양은 세포의 농도가 0.5×10⁶내지 2.0×10⁶cells/mL가 되도록 배지를 추가하거나 플라스크 면적을 넓혀 주면서 배양한다.

조절 T 세포를 배양한 배양액을 원심분리하여 조절 T 세포를 제거하고 조절 T 세포 배양액(Treg cell-conditioned media)을 얻는다.

조절 T 세포를 배양한 후 CD4+CD25+ 조절 T 분화정도를 확인하고 70% 이상의 조절 T 분화정도(Position)가 확인되면 원심분리하는 것이 바람직하다.

원심분리는 100~1,000×g로 원심분리하는 것이 바람직하고, 300~700×g로 원심분리하는 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 조성물은 조절 T 세포 배양액을 조성물 중 1~10중량%로 포함하는 것이 바람직하고, 1~5중량%로 포함하는 것이 보다 바람직하며, 5% 농도로 포함하는 것이 특히 바람직하다. 상기 범위의 조절 T 세포 배양액을 포함하였을 때 상처치유효과가 우수하다. 특히, 조절 T 세포 배양액을 5중량% 포함하였을 때 세포의 생존율은 유의적인 차이 없이 약간 감소하지만 상처봉합(Wound closure) 속도는 최대인 것으로 확인되었다.

본 발명의 조절 T 세포 배양액(Treg cell-conditioned media)은 IL-6. IL-8, IL-13 등의 다양한 사이토카인과 성장인자를 함유하고, EMT를 확인하는 마커 단백질인 E-카드헤린의 발현을 투여량 의존적으로 감소시켜 세포의 이동에서 필수적으로 발생하는 EMT를 촉진시킴으로써 세포가 이동성을 가지도록 하여 세포증식에 영향을 주지 않으면서 케라티노사이트의 세포이동을 증가시키며, MMP-1의 발현 및 방출을 증가시켜 세포이동과 세포외기질의 분해에 영향을 미친다.

따라서 본 발명의 조절 T 세포 배양액은 상처치유효과가 우수하며, 본 발명의 조절 T 세포 배양액을 유효성분으로 함유하는 조성물은 상처치유용으로 유용하게 사용될 수 있고, 상처치유효과를 통한 민감성 피부 진정 및 아토피 완화용으로도 유용하게 사용될 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 이 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로서 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

재료

DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium), 페니실린 용액, 스트렙토마이신 용액 및 FBS(fetal bovine serum), MTT{3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide}, BCA(bicinchoninic acid) 용액, FITC-접합 2차 항체(fluorescein isothiocyanate-conjugated secondary antibody), SDS(sodium dodecyl sulfate), DMSO(Dimethyl sulfoxide), GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), E-카드헤린, MMP-1 항체 및 ECL(Enhanced chemiluminescence)을 이용하였다.

세포배양

HaCaT 세포(ATCC 12192)(Spontaneously immortalized human keratinocyte line)는 10%(v/v) FBS, 100U/L 페니실린, 100㎍/mL 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM(Full medium)에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양하였다. HaCaT 세포에 조절 T 세포 배양액을 처리하기 전 혈청기아(Serum starvation)를 진행하였다.

<실시예 1>

조절 T 세포 배양액의 제조

혈액으로부터 PBMC를 분리하고, 분리한 PBMC를 MACS 버퍼로 세척하였다. MACS 버퍼 내 세포현탁액과 CD8 마이크로 비드를 4:1의 비율(v/v)로 혼합한 후 MS 칼럼을 이용하여 CD8+ 세포가 제거된 PBMC를 얻었다.

CD8+ 세포가 제거된 PBMC는 무페놀레드, 무항생제 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양하였다. 세포가 증식함에 따라 배지를 적정한 세포 농도가 되도록 추가하면서 계대배양하였다. 14일 동안 배양한 후 조절 T 세포가 배양된 배양액을 원심분리하여 조절 T 세포가 제거된 조절 T 세포 배양액을 얻었다.

<실험예 1>

조절 T 세포의 유세포분석(Flow cytometry)

실시예 1에서 원심분리로 분리된 조절 T 세포를 모아 세척하고 원심분리하였다. 원심분리 후 아주 찬(Ice cold) FACS 버퍼에 재현탁시키고, 포화농도의 CD4와 CD25 항체가 존재하는 조건 하에서 배양하여 조절 T 세포를 염색(Staining)하였다. 염색된 조절 T 세포를 유세포분석하여 CD4 및 CD25 분자의 표면발현을 확인하였다.

상기 염색된 조절 T 세포를 세척한 후 세포내 고정 버퍼(intracellular fixation buffer)로 고정시켰다. 그 다음 세포를 투과화 버퍼(permeabilization buffer) 및 Foxp3 항체와 반응시켜 염색하였다. 염색된 세포를 FACS 분석법으로 분석하여 Foxp3의 발현을 유세포분석하였다. Foxp3(X chromosome-encoded forkhead transcription factor)는 조절 T 세포의 발달과 기능을 조절하는 조절성 경로에서의 주조절인자(Master regulator)로, CD4+CD25+ 조절 T 세포에서 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다.

CD8+ 세포가 제거된 PBMC로부터 분리된 조절 T 세포를 유세포분석하여 CD4 및 CD25 분자의 표면발현과 Foxp3의 발현을 확인한 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1의 결과에서와 같이, 조절 T 세포는 CD4와 CD25를 발현하지만 CD8은 발현하지 않았고, CD8+ 세포가 제거된 CD4+CD25+ 조절 T 세포는 PBMC에서 90.6% 분리되었다. 분리된 CD4+CD25+ 조절 T 세포에서 Foxp3가 발현되는 정도는 45.7%였다

<실험예 2>

조절 T 세포 배양액의 사이토카인 분석

조절 T 세포를 배양한 배양액에 포함된 사이토카인을 확인하기 위하여 사이토카인 분석을 실시하였다.

각 사이토카인 배열 막(Cytokine array membrane)을 블로킹해준 뒤 조절 T 세포 배양액으로 반응시켰다. 대조구는 배지 단독으로 반응시켰다. 세척버퍼로 세척하고, 비오티닐화된 항체 혼합제(Biotinylated antibody cocktail)로 반응시켰다. 세척 후 HRP-스트렙타비딘 용액(HRP-streptavidin solution)을 이용하여 반응시켰다. 반응이 끝난 막을 세척하고 검출혼합물 버퍼(detection mixture buffer)와 반응시킨 후 chemidoc을 이용하여 검출하였다.

조절 T 세포 배양액을 Chemidoc으로 검출한 결과를 도 2의 (A)에 나타내었고, 각 사이토카인의 상대 강도를 농도계 분석(Densitometric analysis)으로 확인한 결과를 도 2의 (B)에 나타내었다. 도 2의 (A)에서 왼쪽 이미지는 대조구로 배지를 단독으로 사용한 경우의 결과를 나타낸 것이고, 오른쪽 이미지는 조절 T 세포 배양액의 결과를 나타낸 것이며, 표는 각 점의 사이토카인 위치를 나타낸 것이다.

도 2의 결과에서와 같이, IL-6, IL-8, IL-10, IP-10, MCP-1, RANTES의 발현량이 상당히 증가하였다. IL-6, IL-8, IL-10, IP-10, MCP-1, RANTES는 모두 세포이동, 특히 케라티노사이트의 이동을 증가시켰다는 보고가 있다. 사이토카인 분석을 통하여 IL-6는 기저수준(Basal level)보다 70배 가량 증가하였고, IL-8, IL-10, IP-10, MCP-1, RANTES는 약 40배 증가하였음을 확인할 수 있다.

<실험예 3>

세포증식 분석(Cell proliferation assay)

조절 T 세포 배양액이 HaCaT 케라티노사이트의 증식에 미치는 영향을 확인하기 위하여 MTT 분석을 실시하였다.

HaCaT 세포를 96-웰 배양 플레이트에서 배양한 후 세포를 다양한 농도의 조절 T 세포 배양액으로 처리한 후 MTT 분석법을 이용하여 세포의 생존율(Viability)을 확인하였다. MTT 시약을 각 웰에 처리하여 배양한 후 생성된 포르마잔(Formazan)을 DMSO에 용해시키고 560nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 6번 실험의 평균±표준편차로 계산하여 도 3에 나타내었다.

도 3의 결과에서, 조절 T 세포 배양액으로 24시간 처리된 세포는 처리되지 않은 대조구 세포에 비해 세포증식이 약간 감소하였다. 즉, 조절 T 세포 배양액을 5% 농도로 처리하였을 때에는 약 5% 감소하였고, 20% 처리하였을 때에는 약 20% 감소한 것으로 확인되었다.

이러한 결과에 비추어볼 때 조절 T 세포 배양액은 HaCaT 세포의 증식을 촉진시키지 않는 것으로 확인된다.

<실험예 4>

세포이동 분석(Cell migration assay)

조절 T 세포 배양액이 HaCaT 케라티노사이트의 이동에 미치는 영향을 확인하기 위하여 스크래치 세포이동분석(Scratch cell migration assay)을 실시하였다.

다양한 농도의 조절 T 세포 배양액이 처리된 세포 단일층에 일직선의 스크래치를 형성하고 새 배지로 배양하였다. 24시간 후 Olympus CKX41 현미경과 IMT cam 3 디지털 카메라(Olympus Corp, Tokyo, Japan)를 이용하여 동일한 위치에서 이미지를 촬영하였다. 세포이동은 스크래치 영역의 감소를 측정하여 확인하였으며, 세포의 이동율은 스크래치 영역의 넓이 감소 속도로 확인하였다.

그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4의 (A)는 스크래치된 세포 단일층에 대하여 24시간 후 즉시 얻은 현미경 이미지를 나타낸 것이고, (B)는 스크래치된 영역의 감소를 측정하여 세포이동을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 결과는 6번 실험의 평균±표준편차로 나타내었다.

도 4에서와 같이, 조절 T 세포 배양액이 처리된 세포는 처리되지 않은 대조구에 비해 스크래치 영역이 감소하였고, 조절 T 세포 배양액을 전처리하였을 때 세포이동이 증가되었다. 이러한 결과로 본 발명의 조절 T 세포 배양액이 상처부위의 재상피화와 조절에 영향을 줄 수 있음을 알 수 있다.

<실험예 5>

E-카드헤린의 발현 분석

조절 T 세포 배양액이 HaCaT 케라티노사이트에서 EMT에 미치는 효과를 확인하기 위하여, EMT의 마커 단백질인 E-카드헤린의 발현을 다음과 같이 면역형광 염색(Immunofluorescence staining)으로 확인하였다.

6-웰 플레이트에서 HaCaT 세포 단일층에 직선으로 스크래치를 내어준 후 세척하고 새 배지로 24시간 동안 배양하였다. 세포 단일층을 파라포름알데하이드로 고정하였다. 그 후, BSA(Bovine serum albumin)로 배양하였다. E-카드헤린 항체와 및 FITC-접합 이차 항체(FITC-conjugated secondary antibody)와 반응시켜 면역염색(Immunostaining)하였다. FITC 형광 이미지는 LEICA DMi8 형광현미경(Leica microsystems, Wetzlar, Germany)을 이용하여 얻었다.

그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5의 (A)는 면역형광 염색으로 E-카드헤린을 검출한 결과이고, (B)는 농도계 분석으로 상대 강도를 확인한 결과이다.

도 5의 결과에서와 같이, 조절 T 세포 배양액으로 전처리된 HaCaT 세포의 E-카드헤린은 투여량 의존방식으로 상당히 감소하였다. 이러한 결과에서 조절 T 세포 배양액은 상처부위에서 EMT를 촉진함으로써 케라티노사이트의 이동을 촉진하며 E-카드헤린의 다운 레귤레이션하는 효과가 있음을 확인할 수 있다.

<실험예 6>

MMP-1의 발현과 분비 분석

조절 T 세포 배양액이 MMP-1 발현에 미치는 효과를 웨스턴 블로팅(Western blotting)으로 확인하였다.

HaCaT 케라티노사이트에 프로테아제/포스파타제 저해제 혼합제가 포함된 RIPA(radioimmunoprecipitation assay) 용해버퍼를 처리하여 총세포 용해물(Whole cell lysate)을 얻은 후, BCA 시약으로 단백질 농도를 측정하였다.

간단하게 설명하면, 배지 단백질 또는 용해물 단백질을 SDS-PAGE(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) 겔로 분리하여 폴리비닐리덴 플루오라이드 막으로 트랜스퍼하였다. 단백질이 트랜스퍼된 막은 탈지우유(Skim milk)로 처리하여 비특이적 블로킹을 하였다. 블롯(Blot)은 1/4000로 희석된 1차 항체를 반응시킨 후 홀스래디시 퍼옥시다제-접합 2차 항체(Horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody)를 ECL 시약을 이용하여 검출하였다. 밴드는 농도계로 정량하였다.

조절 T 세포 배양액이 HaCaT 케라티노사이트에서 MMP-1 발현과 분비에 미치는 효과를 확인한 결과를 도 6에 나타내었다. MMP-1의 로딩 대조구로는 GAPDH를 사용하였다. 도 6에서 (A)는 총 세포 용해물(L)과 배지(M) MMP-1을 웨스턴 블로팅으로 분석한 결과이고, (B)는 농도계 분석으로 MMP-1의 상대 강도를 확인한 결과이다.

도 6의 결과에서, 24시간 동안의 조절 T 세포 배양액 처리가 MMP-1의 발현과 분비를 모두 투여량 의존방식으로 상당히 증가시키는 것을 보여준다. 따라서 조절 T 세포 배양액을 처리하였을 때 상처부위에서 ECM 분해와 재구조화가 활성화되고 MMP-1의 발현이 감소되는 것으로 확인된다.

Claims

조절 T 세포(Regulatory T cells, Treg cells)를 배양한 후 원심분리하여 얻은 조절 T 세포 배양액(Treg cell-conditioned media)을 조성물 중 1~10중량% 함유하고,
상기 조절 T 세포 배양액은,
혈액으로부터 PBMC(Peripheral blood mononuclear cells)를 분리하는 단계; 상기 분리한 PBMC에서 CD8+ 세포를 제거하는 단계; 상기 CD8+ 세포가 제거된 PBMC를 무페놀레드(Phenol red free) 및 무항생제(Antibiotics free) 배지에서 1~3일 동안 1.0×10⁷ 내지 3.0×10⁷ cells/flask의 농도로 배양하는 단계; 상기 배양 후 2~3일 간격으로 계대배양하면서 12~16일 동안 배양하여 세포의 농도가 0.5×10⁶내지 2.0×10⁶cells/mL인 배양액을 얻는 단계; 및 상기 배양액을 원심분리하여 조절 T 세포를 제거하고 조절 T 세포 배양액을 얻는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는, 상처치유용 조성물.
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제1항에 있어서,
상기 배지는 항-CD2, 항-CD3, 항-CD7, 항-CD8, 항-CD28, 항-CD30L, 항-CD40, 항-CD70, 항-CD80, 항-CD83 및 항-CD86으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 항체; 인터류킨-2, 인터류킨-4, 인터류킨-7, 인터류킨-12, 인터류킨-15, 인터류킨-34 및 TGF-β로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 사이토카인; 및 SOD(Superoxide dismutase)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 상처치유용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 CD8+ 세포는 MACS 버퍼 내 세포현탁액과 CD8 마이크로 비드를 혼합하고 MS 칼럼을 이용하여 제거하는 것을 특징으로 하는 상처치유용 조성물.
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제1항에 있어서,
상기 원심분리는 100~1,000×g로 실시하는 것을 특징으로 하는 상처치유용 조성물.
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