KR20150088374A

KR20150088374A - 인체 지방-유래 줄기세포를 이용한 주요 세포성장인자를 포함하는 줄기세포 배양액 및 아토피 개선 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20150088374A
Application number: KR1020140008503A
Authority: KR
Inventors: 이홍기; 이종수; 윤진상; 김근호
Original assignee: 주식회사 이에이치엘바이오
Priority date: 2014-01-23
Filing date: 2014-01-23
Publication date: 2015-08-03

Abstract

본 발명은 CD73, CD90, CD105는 발현하고 CD34, CD45가 발현되지 않는 인체 지방-유래 줄기세포 배양액으로서 EGF, VEGF, TGF, FGF 및 HGF와 같은 세포성장인자를 포함하는 인체 지방-유래 줄기세포 배양을 효율적으로 진행할 수 있는 배지 조성을 제공하며, 이와 같은 유효성분을 포함하는 아토피 질환 예방 및 치료용 의약 조성물에 관한 것으로, 본 발명에서 사용한 인체 지방-유래 줄기세포의 양성 표면마커인 CD73, CD90 및 CD105와 특이하게 발현하고 음성 표면마커인 CD34 및 CD45를 발현하지 않는 줄기세포의 배양액은 아토피 증상을 억제하고, IgE 농도를 낮출 수 있다.
본 발명은 세포성장인자의 특이적 조성을 갖는 줄기세포 배양액을 생산할 수 있는 줄기세포 배지를 제공하며 주요 세포성장인자를 유효성분으로 포함하는, 아토피성 피부염(atopic dermatitis)의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 줄기세포의 배양액 또는 그의 동결건조물을 포함하는, 아토피성 피부염의 개선 또는 증상완화용 화장료 조성물을 제공하는 것이 특징이다.

Description

인체 지방-유래 줄기세포를 이용한 주요 세포성장인자를 포함하는 줄기세포 배양액 및 아토피 개선 화장료 조성물{Stem cell medium containing cell growth factors from human adipose derived stem cells and cosmetic composition for improvement atopic syndrom prepared therefrom}

본 발명은 특징적인 세포성장인자를 포함하는 인체 지방-유래 줄기세포의 배양액(이하 "줄기세포 배양액"이라 함)을 생성할 수 있는 인체 지방-유래 줄기세포{이하 'hAdSC'(Human Adipose-derived Stem Cells) 또는 단순히 ‘줄기세포’라 함}를 효과적으로 증식할 수 있는 배지 조성과 그 배양액에 관한 것으로서, 특히 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는, 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 아토피성 피부염의 개선 또는 증상완화용 화장료 조성물에 관한 것이다.

아토피 질환은 유아 및 어린이에게서 높은 빈도(전 인구의 0.5％, 어린이 경우 5 ∼ 10％)로 나타나고 있는 피부염증으로 유전적 요소와 면역계 이상에 의한 발병도 주요 원인이 되겠지만, 외부로부터의 균에 의한 감염, 정서적 요인 그리고 환경적 요인은 현대사회에서 더욱 문제가 되고 있는 실정이다.

특히 재발성의 만성 피부질환으로서 최근에는 청소년 이후, 성인에 이르기까지 고통을 겪고 있는 사회적 이슈라 할 수 있겠다. 일반적으로 건조한 피부와 아토피성 염증질환은 피부 각질의 손상을 야기함으로써 피부의 고유한 보호기능을 손상시킨다. 또한 손상된 피부는 쉽게 균에 감염되기 때문에 증상이 악화 되게 된다.

현재 아토피성 피부염 치료를 위하여 사용되는 치료제들로는 국소 스테로이드제, 면역억제제, 항히스타민제, 그리고 세균감염을 예방하기 위해 항생제 연고 등이 사용되고 있으나, 이들 약물들의 사용으로 인한 다양한 부작용이 보고되고 있을 뿐만 아니라, 아토피성 피부염에 대한 근본적인 치료제는 아니므로 이들을 지속적으로 적용하기가 곤란하다.

또한, 약물 요법 이외에 아토피성 피부염의 개선이나 증상완화의 목적으로 상대적으로 부작용이 적은 화장료도 연구되고 있으며, 상기 화장료에는 주로 보습제 성분이 함유되어 있으며, 예를 들어 세포막을 구성하는 인지질 성분인 세라마이드를 함유한다.

보습제 이외에 천연 식물 추출물이나 심층수로부터 분리한 천연 미네랄 등을 함유하는 기능성 화장료가 시판 중에 있다. 그러나 보습제, 천연 추출물, 혹은 미네랄 등을 함유하는 화장료에 있어서도, 아직 구체적인 임상적 활성이 명확하게 검증되어 있지는 않다.

이와 같은 상황에서 현재까지 아토피의 치료방법으로는 상기 언급한 스테로이드성 물질이 가장 효능이 뛰어나지만 장기간 사용할 경우 소아의 성장 장애, 비만, 당뇨병, 정신적 장애, 백내장 등의 부작용으로 인하여 그 사용이 제한되고 있다.

실제로 스테로이드제(예를 들어, 부신피질 호르몬제 등)는 비장, 림프노드 및 골수에 있는 림프구, 단핵구를 고갈시켜 이들 세포들이 염증부위에 이르는 양을 줄이거나 대식세포와 중성구 및 항원항체의 면역작용을 방해함으로써, 염증반응을 억제한다.

그러나, 아토피성 피부염은 만성 피부 질환이기 때문에, 스테로이드제의 장기간 및 고용량 사용으로 인하여 다양한 부작용이 나타나는 문제가 있다. 또한, 내성이 생겨 사용할수록 효과가 떨어지게 되며, 고용량으로 사용하게 됨으로써 감염에 대한 감수성이 증가하여 흔히 보기 힘든 별난 감염을 일으키게 된다.

예를 들어, 당뇨, 백내장, 고혈압을 악화시키고, 혈액 내 콜레스테롤과 중성지방의 수치를 증가시키며, 어린이에 있어서는 성장을 억제하고 6개월 이상 복용 시 어른이 되었을 때의 키가 줄어들기도 한다. 또한, 고관절, 견관절, 슬관절, 기타 다른 관절에서 뼈의 무혈관성 괴사를 일으킬 수 있으며, 위장관으로부터 칼슘의 흡수를 억제함으로써 뼈를 약화시켜 부러지기 쉽게 하고, 골다공증을 일으키기도 한다.

한편, 줄기세포가 피부에 미치는 영향에 관련된 최근 발표된 연구 결과들에 따르면, 피부 조직의 재생을 촉진하며, 이는 줄기세포에서 분비되는 복합단백질(protein complex)에 의한 작용(paracrine effect)이라 보고되고 있다(Pankaj K.M. J. Cardiovascular Medicine , 2008). 상기 복합 단백질의 대부분은 성장인자들로 알려져 있으며, 최근 이들 성장인자들에 대한 활발한 연구가 진행되고 있다.

성장인자란 체내에 소량 존재하는 신호전달 물질들로 이러한 성장인자들은 나이가 증가함에 따라 그 체내 농도가 감소하게 되며, 체내 성장인자 농도의 감소는 노화와 밀접한 관계가 있다는 것이 밝혀진 바 있다(Waisbourd M. et al., Drungs Aging , 2007).

현재 성장인자를 외부에서 공급하여 생체의 노화를 억제하려는 다양한 연구들이 진행되고 있으며, 아울러 개별 성장인자들의 구체적인 효과에 대한 연구도 진행되고 있다. 근래의 연구 보고들에 의하면 피부 주변 줄기세포에서 분비되는 성장인자들이 상처 치료, 미백, 항산화 등의 효과를 나타내는 것으로 보고되고 있다(Kim et al., J Dermatol Sci., 2007; Kim et al., J Dermatol Sci., 2008).

또한, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSC)가 면역억제 작용을 나타내는 것으로 보고되고 있으며, 이는 MSC가 마이토젠(mitogen)이나 동종 세포로 자극된 T-세포의 증식을 억제함)으로써 면역반응을 억제시키는 것으로 보고되고 있다(Djouad F. et al., Blood 2003).

이런 관점에서 면역반응과 관련된 어떤 인자들을 발견하여 피부에 적용하는 것은 생리학적으로 중요한 의미를 가지며, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSC)는 골수, 제대혈, 지방, 근육 등의 조직으로부터 분리될 수 있는 다분화능을 가진 세포로서, MSC의 기능에 관하여 다양한 연구가 그동안 진행되어, 위에 언급한 외에, Nauta 등도 MSC의 면역조절기능을 보고한바 있는데(Nauta AJ, et.al, Immunomodulatory properties of mesenchymal stromal cells, Blood 2007 Nov 15; 110(10): 3499-3506), MSC는 말초 관용(peripheral tolerance), 자가면역(autoimmunity), 종양 억제(tumor evasion) 등의 유지에 있어서 면역조절제로서 기능할 수 있다.

인간, 비비(baboon), 쥐에서, MSC는 T-임파구의 in vitro 활성화 및 증식을 억제함으로써 면역억제 기능을 가지며, 이러한 억제 기능은 동종항원(alloantigen), 마이토젠(mitogen)에 유도되는 T-세포의 증식 및 CD3 및 CD28 항체에 의한 T-세포 활성화에 영향을 준다. MSC는 세포독성 T-임파구(cytotoxic T lymphocytes, CTL)의 세포독성(cytotoxicity)을 저해하며, 이는 세포독성 자체를 직접 억제하는 것이 아니라, CTL의 증식을 억제함으로 이루어진다.

이러한 저해는 직접적인 세포-세포 접촉에 의한 것이 아니라 수용성 인자들(soluble factors)을 매개로 이루어지며, 이러한 수용성 인자들은 MSC와 임파구(lymphocyte)의 직접 접촉을 통해서 만들어지게 되고, TGF-β 및 HGF(hepatocyte growth factor)가 주요 억제 인자 중 하나임이 밝혀진 바 있다.

그러나, 아토피성 피부염은 면역반응과 관련된 알러지 뿐만 아니라, 다양한 원인에 의해 발생하므로, 특정 성장인자만을 분리하여 임상에 적용할지라도 안정적인 치료 효과를 기대하기가 곤란하다. 또한, 줄기세포의 면역억제 기능을 이용할 경우에도 세포를 직접 사용하여야 하므로 안정성 등의 문제로 통상의 방법에 의한 제제화가 곤란할 뿐만 아니라 세포의 원천(source)에 따라 다양한 개체편차를 나타내어 목적하는 치료효과를 동일하게 나타내는 것이 여전히 곤란하다.

따라서, 줄기세포 배양액에 포함되어 있는 다양한 세포성장인자와 기타 싸이토카인류를 복합적으로 사용한다면, 특히 특정 세포성장인자가 풍부하게 함유된 줄기세포 배양액 자체를 피부에서 나타나는 자가면역 질환의 예방 및 치료 효과를 가질 것으로 예측되어 최근 크게 주목을 받고 있다.

특허 제 10 - 0719761 - 0000 호 특허 제 10 - 0743205 - 0000 호 특허 제 10 - 1037415 - 0000 호 특허 제 10 - 1183893 - 0000 호 특허 제 10 - 1244172 - 0000 호

본 발명자들은 상기한 선행기술들의 문제점을 개선하면서, 안정적으로 아토피성 피부염을 예방 또는 치료할 수 있는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과 놀랍게도, 인체 지방-유래 줄기세포(Human Adipose-derived Stem Cells, hAdSC)를 자체적으로 개발한 배지에서 배양하였을 때 그 배양액이 아토피 유발 모델을 사용한 동물실험에서 효과를 나타낸다는 것을 발견하였다.

따라서 본 발명자들은 자체 개발한 줄기세포 배양용 배지의 특성에 따라 줄기세포가 증식 중에 분비하는 유효성분이 존재할 것이라는 가정 하에 줄기세포 배양액에 존재할 수 있는 세포성장인자(Cell growth factor)의 정량적 측정을 통하여 특정 세포성장인자들의 생성에 뚜렷한 차이가 있음을 발견하고 이와 같은 조성의 줄기세포 배양액이 아토피 모델에 효과가 있을 것이라는 연관성을 알게 되었다.

결과적으로, 본 발명자들이 개발한 줄기세포 배양용 배지와 hAdSC를 일정기간 배양하였을 때 얻어지는 배양액은 세포성장인자 면에서 특성을 나타내며 이러한 세포성장인자가 포함된 줄기세포 배양액은 아토피 유발모델의 동물실험을 통하여 아토피 예방 및 치료효과가 있다는 지견을 얻게 되었다.

특히 아토피성 피부염을 유발시킨 마우스에 hAdSC 배양액을 피부 도포하여 관찰한 결과, 일정 기간 후의 외견상 변화와 함께 놀랍게도 투여 초기에는 면역글로불린의 양이 증가하다가 서서히 면역글로불린의 양이 감소하는 형태를 나타냄으로써 아토피성 피부염이 치료된다는 것을 발견하였다.

이러한 사실은 면역억제가 온화하게 이루어짐으로써, 전신 투여에 의한 급격한 면역억제에 따라 발생할 수 있는 부작용(side effects)을 회피할 수 있는 장점이 있다.

따라서, 본 발명은 hAdSC 배양액을 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 아토피성 피부 증상을 완화시킬 수 있는 화장품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 아토피 질환 예방 및 치료용 의약 조성물 또는 아토피성 피부 증상을 완화시킬 수 있는 화장품 조성물은 줄기세포의 표면마커인 CD73, CD90, CD105(이상, 양성 마커)는 발현되고 CD34, CD45(이상, 음성 마커)는 발현되지 않는 줄기세포를 배양하였을 때 얻어지는 배양액을 여과 또는 원심분리하여 상기 줄기세포를 제거한 여액인 배양액 및 그 동결건조물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 결과에 따라, 인체 지방-유래 줄기세포 배양액 또는 그 동결건조물을 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 동일 증상과 유사한 피부 현상 완화에 도움을 줄 수 있는 화장품 조성물로서 피부 도포용 조성물이 제공된다.

상기 줄기세포 배양액은 hAdSC를 수확(harvest)하였을 때 줄기세포 수가 1 × 10⁵ ∼ 10 × 10⁹ 인 범위에서 유효하며, 1 × 10⁷ ∼ 5 × 10⁸ 범위에서 바람직하고, 약 5 × 10⁷ ∼ 3 × 10⁸ cells 이 더욱 바람직하다.

또한 상기와 같이 hAdSC를 얻기 위하여는 배양용 배지로서 DMEM 배지를 기본 배지로 하고, 여기에 주요 배지 성분으로 다음과 같은 성분이 포함되어야 한다: FBS 농도는 1 ∼ 20％, 인슐린의 농도는 0.1 ∼ 500ng/㎖, 아스코르브산의 농도는 1 ∼ 100ug/㎖, 에스트라디올의 농도는 0.1 ∼ 10ng/㎖, 하이드로코티손의 농도는 0.1 ∼ 100ng/㎖, EGF 농도는 0.1 ∼ 200ng/㎖ 의 범위가 유효하며, 바람직하게는 FBS 농도는 1 ∼ 20%, 인슐린의 농도는 0.1 ∼ 500ng/㎖, 아스코르브산의 농도는 1 ∼ 100ug/㎖, 에스트라디올의 농도는 0.1 ∼ 10ng/㎖, 하이드로코티손의 농도는 0.1 ∼ 100ng/㎖, EGF 농도는 1 ∼ 200ug/㎖ 의 범위에서, 더욱 바람직하게는 FBS 농도는 1 ∼ 20％, 인슐린의 농도는 1 ∼ 100ng/㎖, 아스코르브산의 농도는 1 ∼ 100ug/㎖, 에스트라디올의 농도는 0.1 ∼ 10ng/㎖, 하이드로코티손의 농도는 0.1 ∼ 100ng/㎖, EGF 농도는 1 ∼ 50ng/㎖ 의 범위가 적절하다.

상기의 조건에서 배양된 hAdSC 배양액의 세포성장인자는 EGF는 1 ∼ 10ng/㎖, VEGF는 0.1 ∼ 100ng/㎖, HGF는 0.01 ∼ 10ng/㎖, TGF는 1 ∼ 100pg/㎖, bFGF는 0.01 ∼ 20ng/㎖, PDGF는 0.01 ∼ 10ng/㎖,의 농도범위를 갖는다는 것을 발견하였으며 각 세포성장인자가 갖는 피부 보호작용을 검토하여 아토피성 피부염을 완화시킬 수 있는 해결 수단으로 적용할 수 있었다.

본 발명에서 얻어진 줄기세포 배양액은 약학 조성물 또는 화장품 조성물로서 사용될 수 있는데, DNCB(dinitrochloro benzene)에 의해 Nc/Nga 마우스에서 유발된 아토피성 피부염에 대하여 바람직하게 적용될 수 있었고, 그 결과에 따라 아토피 질환 환자 또는 경미한 증상의 잠재적 아토피 증상을 보유하고 있는 일반인에게 적용될 수 있다.

본 발명에서 발견한 인체 지방-유래 줄기세포(hAdSC) 배양용 배지 조성은 줄기세포가 특정한 세포성장인자를 특이적으로 분비하게 되어 특성에 따라 적응증을 확대할 수 있으나, 본 발명에 따른 약학 조성물 및 화장품 조성물은 유효성분으로서 인체 지방-유래 줄기세포(hAdSC) 배양액 또는 그 동결건조물을 포함하는 피부 도포용 조성물로 사용될 수 있어, 아토피성 피부염의 예방 및 치료 또는 완화 작용에 도움을 주는데 유용하게 적용될 수 있다.

도 1은 인체 지방에서 분리한 줄기세포를 자체 개발한 배지에서 배양한 후 현미경으로 hAdSC의 외관을 관찰한 사진.
도 2는 hAdSC를 수득(harvest)한 후, 유세포 분석기(Flow cytometry)로 분석하여 줄기세포임을 확인한 사진.
도 3은 DNCB를 이용하여 아토피성 피부염을 유발한 마우스의 사진.
도 4 (a,b,c)는 상기 아토피성 피부염 유발 마우스에 지방 유래 줄기세포 배양액을 도포한 후 날짜별로 외관상 변화를 측정한 사진이다. 왼쪽은 대조군이고, 오른쪽은 상기 분획물을 투여한 처리군을 나타낸 사진.
도 5는 줄기세포 배양액을 아토피 유발 마우스에 도포하였을 때의 IgE 농도억제효과를 나타낸 그래프.
도 6은 본 발명에서 사용된 줄기세포 배양액의 세포성장인자의 정량적 측정 결과를 나타낸 그래프.

이하 첨부되는 도면과 관련하여 상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 바람직한 예를 살펴보면 다음과 같다.

도 1은 인체 지방에서 분리한 줄기세포를 자체 개발한 배지에서 배양한 후 현미경으로 hAdSC의 외관을 관찰한 사진, 도 2는 hAdSC를 수득(harvest)한 후, 유세포 분석기(Flow cytometry)로 분석하여 줄기세포임을 확인한 사진, 도 3은 DNCB를 이용하여 아토피성 피부염을 유발한 마우스의 사진, 도 4 (a,b,c)는 상기 아토피성 피부염 유발 마우스에 지방 유래 줄기세포 배양액을 도포한 후 날짜별로 외관상 변화를 측정한 사진이다. 왼쪽은 대조군이고, 오른쪽은 상기 분획물을 투여한 처리군을 나타낸 사진, 도 5는 줄기세포 배양액을 아토피 유발 마우스에 도포하였을 때의 IgE 농도억제효과를 나타낸 그래프, 도 6은 본 발명에서 사용된 줄기세포 배양액의 세포성장인자의 정량적 측정 결과를 나타낸 그래프로서 함께 설명한다.

본 발명은 인체 지방-유래 줄기세포(hAdSC)를 이용한 주요 세포성장인자를 포함하는 줄기세포 배양액의 생산 및 아토피에 도움을 주는 화장료 조성물로서, 아토피성 피부염의 예방 및 치료 또는 완화 작용에 도움을 주는데 유용하게 약학 또는 화장품 조성물을 제공한다.

또한 상기와 같은 줄기세포 배양액을 얻기 위해서는 일정한 줄기세포 배양용 배지가 필요하며, 본 발명에서는 그와 같은 hAdSC 배양용 배지 조성을 제공한다.

줄기세포 배양액의 피부질환 관련 적용 가능성에 대하여는 줄기세포가 증식하는 동안에 분비하는 인자(Secretory factors)에 대한 보고를 통하여 기대되어 왔다. I. Ohno 등은 환자의 피부 상처부위에 대한 치유효과를 TGF-α와 IL-6 같은 인자로 판단했으며(J. Derm. Sci. (1995) 10, 241-245), W. Kim 등은 AdSC가 증식 중에 분비하는 세포성장인자에 대하여 상처치유효과가 있다고 보고하였는데, DMEM 배지를 사용하여 6-well plate에서 AdSC를 증식하였을 때, PDGF, FGF, KGF, TGF, HGF 및 VEGF가 분비된다고 하였지만 그 양은 수십 ~ 수백 pg/㎖ 농도로 미량이었다(J. Derm. Sci. (2007) 48, 15-24).

한편, G. Kilroy 등은 EGF와 bFGF를 AdSC 배양에 가하였을 때, 줄기세포가 분비하는 세포성장인자로서 혈관생성에 영향을 주는 HGF가 주로 생성된다는 보고하였다(J. Cell. Physio. (2007) 212, 702.709). 최근 H. Lee 등은 아토피 유발 동물 모델에 대한 AdSC 배양액의 효과를 제시하였는데, 배양액의 특성에 관하여는 규명하지 못하였다(Ann. Derm. (2012) 24, 181-188).

상기와 같이 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSC)로서 hAdSC를 효과적으로 배양하여 얻는 일과 특징적인 세포성장인자를 다량 함유하여 특정 질환에 효과를 갖는 배양액을 얻는 일은 신규한 의료용 원료 물질을 제공한다는 의미를 부여하고 있으며, 실질적으로 특정 질환에 대한 신규한 치유 효과를 규명하는 일은 향후 줄기세포 치료제 또는 그 배양액의 의약품화를 향한 목표라고 할 수 있다.

따라서 본 발명자들은 특정 조성의 배지를 통하여 배양된 줄기세포에 대하여 그 확인을 거친 후, 배양 결과로부터 얻어지는 배양액의 실제적인 의약용 물질로서의 가능성을 염두에 두고, hAdSC의 분화 특성을 고려하여 면역 이상과 관련된 피부 질환에 대하여 수년간 연구를 거듭한 끝에 아토피 질환 동물 모델에서 본 발명의 배양액의 아토피 치유 효과를 발견하게 되었다.

또한 이와 같은 치유 효과에 대한 의미를 규명하고자 하여 배양액에 존재할 것으로 예측되는 다양한 세포성장인자를 분석한 결과, 놀랍게도 본 발명자들이 개발한 배지를 사용하였을 때 생산되는 배양액으로부터는 특정 세포인자가 다량 함유된 사실을 규명하기에 이르러 향후 의약품화의 가능성을 기대하게 되었다.

상기와 같은 발명을 이루기 위하여 줄기세포에 대한 일반적 사실을 정리함으로써 본 발명의 이해를 돕고자 아래의 설명을 부가하고자 한다.

줄기세포는 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간의 골수, 제대혈, 지방(즉, 지방조직 또는 지방세포), 근육 등의 다양한 세포로부터 유래 될 수 있으며, 공지의 방법에 따라 쉽게 분리할 수 있다. 예를 들어, hAdSC는 통상적으로 흔히 시행되는 지방흡입 과정에서 폐기되는 지방조직을 사용하여 얻을 수 있으며, DMEM 배지와 같은 기존의 상품화된 배지를 이용하여 용이하게 배양할 수 있는데, 세포성장속도는 주어진 기본 배지에 첨가되는 첨가물질(supplement)에 따라 많은 차이를 보인다는 것이 알려져 있다.

보다 상세히 설명하면 hAdSC는 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간의 지방조직 또는 지방 세포로부터 공지의 방법(예를 들어, 국제특허공개 제WO2005/042730호)에 개시된 바에 따라, 지방흡입(liposuction) 및 침강, 콜라게나제(collagenase) 등의 효소처리, 원심분리에 의한 적혈구 등의 부유 세포 제거 등의 과정을 통하여 얻을 수 있다. 분리된 hAdSC는 통상의 줄기세포 배양용 배지를 사용하여 통상의 방법으로 배양될 수 있는데, 예를 들어, 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS) 15％, 페니실린과 스트렙토마이신 1％로 보충된 DMEM 배지를 사용할 수 있다. 배양된 hAdSC는 배지를 갈아주면서 연속적으로, 바람직하게는 약 3 ∼ 5계대(passage)로, 계대 배양될 수 있으며, 얻어진 hAdSC는 동결하여 보관되는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 hAdSC의 배양액이라 함은 일정 기간 배양하여 적정 수의 줄기세포가 증식되었을 때 얻어지는 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액을 의미하며, 필요에 따라서 상기 배양액의 농축물 또는 그 농축물의 동결건조물일 수 있다.

상기 줄기세포의 배양액은 성체 줄기세포를 혈청 배지 중에서 계대 배양한 후, 무혈청 배지 중에서 배양하여 얻어진 것일 수 있으며, 상기 혈청 배지는 584 mg/ℓ의 L-글루타민, 1000mg/ℓ의 D-글루코스, 110mg/ℓ의 소듐 피루베이트, 10％의 FBS, 및 1％의 항생제(100 IU/㎖)로 보충된 DMEM 일 수 있고, 상기 무혈청 배지는 DMEM 및 Ham's F-12 영양소 혼합액을 1 : 1의 중량비로 혼합한 배지에 365mg/ℓ의 L-글루타민, 15mM의 HEPES, 55mg/ℓ의 소듐 피루베이트가 보충된 배지일 수 있다.

이와 같은 공지의 사실로부터 hAdSC의 배양이 보편적인 방법으로 인식되어 왔으나, 본 발명자들의 연구에 의하면 hAdSC의 증식에 영향을 미치는 요소(여기서는 첨가물로서 상업화된 배지의 supplement)는 단순히 세포증식 속도뿐만 아니라 증식에 따라 세포가 분비하는 세포성장인자나 싸이토카인류에 있어서 의미 있는 차이가 있음을 알 수 있었다.

따라서 본 발명에서는 본 발명자들이 뛰어난 세포성장을 위하여 자체 개발한 배지에서 일정 기간 AdSC를 배양하였을 때 배양액에 분비되는 주요 세포성장인자의 특성을 밝혀내고 그 특성과 관련된 면역계 질환으로서 아토피 질환에 효과가 있음을 최초로 발견하게 된 것이다. 따라서 줄기세포 배양용 배지에 어떤 특정한 첨가물을 넣은 특성화된 배지는 hAdSC로부터 양적인 면과 종류에 있어서 특징적인 세포성장인자를 생성해 낼 수 있는 필수적인 요소라 할 수 있을 것이다.

이와 같은 줄기세포 배양액의 효과, 특히 특이적 조성의 세포성장인자를 포함한 줄기세포 배양액의 아토피 치료효과는 동물모델에 대하여 실시하고 그 결과를 동물 행동 관찰 및 규정에 의한 스코어링, 피부조직에 대한 관찰, 혈액 분석에 의한 면역관련 인자의 변화를 측정하여 판단하고, 그 조성에 관해서는 다섯 가지 세포 성장인자에 대하여 ELISA kit를 사용하여 측정하여 기존에 알려진 예와 비교분석하였다.

본 발명의 약학 조성물은 경피 도포용 약학 조성물로서, 상기 hAdSC 배양의 산물인 인체 지방-유래 줄기세포 배양액이며, hAdSC 배양 방법, hAdSC 분석, 줄기세포 배양액 조성 분석 및 아토피 치유 효과를 규명하는 실험에 사용한 동물 모델에 대한 도포 방법 등은 아래와 같으며 상세하게는 실시예를 통하여 설명하고자 한다.

인체 지방은 지방 흡입술을 통하여 건강한 여성으로부터 얻을 수 있었고 이 가운데 100g의 지방을 통상적인 방법으로 처리하여 줄기세포 분획으로 예상되는 부분을 줄기세포 배양용 플라스크로 옮기고, 약 2주 정도 통상의 줄기세포 배양방법에 따라 계대배양 한다.

이때 줄기세포 수를 측정하여 1 × 106cell 수준에서 자체 개발 배지를 사용하여 다시 2주 이상 배양함으로써 최종 3 × 108cell 이 되도록 증식시킨다. 적절히 배양된 줄기세포를 수득(harvest)하면서 얻어지는 줄기세포 배양액은 별도로 멸균된 용기에 잘 보관하여 분석 및 동물실험에 사용할 때까지 0 ∼ －20℃ 사이에서 냉동 보관한다.

본 발명의 약학 조성물 또는 화장품 조성물은 상기한 바와 같이 hAdSC의 배양액으로부터 얻어진 줄기세포의 배양액 또는 그의 동결건조물을 포함한다. 따라서 상기의 방법으로 얻어진 줄기세포 배양액은 통상적인 동결건조 방법에 따라서 얻어질 수 있으며 마찬가지로 0 ∼ －20℃ 사이에서 냉동 보관하여 필요할 때 사용한다.

본 발명의 약학 조성물은 다양한 원인에 의한 아토피성 피부염에 적용될 수 있으며, 아토피성 피부염의 증상을 갖는 피부 상태에 도움을 주는 보습용 화장품에 첨가될 수 있는 화장품 원료로서도 바람직하게 적용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 피부도포용을 기본으로 하나 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있으며, 통상의 방법에 따라 액상 주사제 형태로 제제화될 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline), 정제수, 멸균수 등의 수성 희석제 혹은 용제를 포함하며, 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일 등의 비수성 희석제 혹은 용제를 포함한다. 또한, 필요에 따라 보존제, 안정화제 등을 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시 예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 인체 지방 유래 줄기세포의 수득

피하지방 제거 시술을 받은 환자로부터 동의를 얻고, 해당 환자로부터 지방흡인(liposuction)방법을 통하여 제거되어 버려지는 지방조직을 수거하였다. 지방조직의 세포외기질을 약 37℃, 약 5％ CO₂ 배양기에서 45분간 0.075％ 콜라게나아제로 처리한 다음, 얻어진 지방조직을 약 1,200g에서 5분간 원심 분리하여 스트로마성 혈관 분획을 수득하였다.

얻어진 분획을 PBS로 세척하고 70㎛ 나일론 세포 여과기를 통하여 다른 조직을 제거한 후 Histopaque-1077로 적혈구를 포함한 세포파편과 단핵 세포를 분리하였다.

분리된 단핵세포를 10％ 소 태아 혈청((fetal bovine serum, FBS), 1％ 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)을 배지로 사용하여 약 37 ℃, 약 5％ CO₂ 배양기에서 24 시간 동안 배양한 후, 비접착성 세포들을 제거하여 지방 줄기세포를 단리 하였다.

실시예 2. 줄기세포의 배양

실시예 1에서 얻어진 1.5 × 105cells의 지방 줄기세포를 증식하기 위한 배양용 배지로서 DMEM 배지를 기본 배지로 하는데, 여기에 주요 배지 성분으로는 다음과 같은 성분을 첨가하여 사용하였다: FBS 농도는 10％, 인슐린의 농도는 10ng/㎖, 아스코르브산의 농도는 10ug/㎖, 에스트라디올의 농도는 0.5ng/㎖, 하이드로코티손의 농도는 1 ng/㎖, EGF 농도는 1ng/㎖. 또한 1000mg/ℓ의 D-글루코스, 584 mg/ℓL의 L-글루타민, 110mg/ℓ의 소듐 피루베이트 10％, 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지에 가하고, 약 90％의 습도 및 약 37℃ 온도 조건 하에서 5％ CO₂ 배양기에서 10일 동안 계대 배양하였다.

파이펫을 사용하여 계대 배양된 배양물로부터 배양액을 제거한 후, 인산화 완충 용액으로 3 회 세척한 후, 365mg/ℓ의 L-글루타민, 15mM의 HEPES, 55mg/ℓ의 소듐 피루베이트로 보충된 DMEM 및 Ham's F-12 영양소 혼합액의 1:1(중량비) 혼합 배지 중에서 1.5 × 107cell/flask의 농도로 접종하여 저산소(Hypoxia) 조건으로 10일 동안 배양하였다.

실시예 3. 인체 지방-유래 줄기세포의 유세포 분석

실시예 1에서 제 4 계대 후 얻어진 hAdSC의 표면항원을 유세포 분석기를 사용하여 분석하였다. hAdSC를 DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)로 2회 세척한 다음, 약 1×107개의 세포를 에펜도르프 시험관(Eppendorf tube) 중에서 FACS 완충액[FBS 40㎖ (최종 4％), 5％ NaN₃ (5 g/100㎖) 10㎖ (소듐 아지드, 최종 0.05％), 10 x PBS 100㎖ (최종 1 x), D.W. 850㎖] 50㎕에 현탁시켰다.

hAdSC에 대하여 알려진 양성 표면마커인 CD73, CD90 및 CD105와 음성 표면마커인 CD34 및 CD45 각각에 대해 1㎕를 가한 다음, 차가운 얼음 중에 30분 동안 암소에서 방치하였다. 상기 FACS 완충액을 가하여 5,000rpm으로 약 4분 동안 원심분리하여 세척하였으며, 상기 세척과정을 추가로 2회 수행하였다. 얻어진 세포를 상기 FACS 완충액 300㎕에 재현탁 시키고, 유세포 분석기 시험관에 옮긴 다음, 유세포 분석을 실시하였다. 유세포 분석결과는 도 2와 같다.

도 2에서 알 수 있듯이, 실시예 2에서 얻어진 hAdSC는, 보고된 바와 같이, CD73, CD90 및 CD105에 대해서는 양성이었으며 CD34 및 CD45에 대해서는 음성이었다. 따라서, 실시예 2에서 얻어진 세포는 중간엽 줄기세포의 특성을 가짐을 알 수 있다.

실시예 4. 줄기세포 배양액의 제조

실시예 2에서 최종적으로 얻어진 배양액 500㎖을 300g로 5 분간 원심분리하여 펠렛으로 가라앉는 줄기세포를 제거하였다. 얻어진 상층액을 0.22㎛ 실린지 필터로 여과하여 배양액에 존재할 수 있는 잔여 줄기세포 및 미지의 거대분자를 제거하였다. 얻어진 줄기세포 배양액을 0 ∼ －20℃에서 보관하고 포함되어 있는 세포성장인자의 측정에 일부를 취하여 사용하고 나머지는 아토피 유발 동물 모델에 대한 아토피 억제 실험에 사용하였다.

실시예 5. 인체 지방-유래 줄기세포 배양액의 아토피성 피부염 치료 활성 평가

(1) 아토피성 피부염 유발 및 줄기세포 배양액의 치유 효과

① 외형적 변화에 대한 평가

Yamamoto 등의 보고( Allergology International. 2007; 56: 139-148)에 따라, 5-6 주령된 female NC/Nga 마우스의 등 부위를 제모한 후, 아토피 유발물질을 등 부위와 귀 부위에 6회 도포하여 아토피를 유발시켰다.

피부 자극을 위해 사용한 DNCB(2,4-dinitrochlorobenzene)는 4:1 비율의 아세톤-올리브오일에 녹여 사용하였다. 먼저 피부감작을 위해 1％ DNCB 용액 100㎕를 제모 부위에 0일째와 3일째에 도포하였다. 7일째와 10일째에는 0.2％ DNCB 용액 100㎕를 이전과 같은 방법으로 도포하였다.

동물피부의 발진상태 등 아토피 증상 현상을 수일간 관찰하여 점수화한 후, 10점이 되었을 때 hAdSC 배양액의 도포시점을 결정하였고 아래 표 1에 하나의 예를 제시하였다.

표 1. 관능 평가에 의한 피부염의 Scoring

* 없음(0), 약함(1), 중증도(2), 심함(3)

* 10점이면 피부염이 최고조에 달했다고 판단하고, 줄기세포 배양액 도포

* 줄기세포 배양액 도포 : 1일 1회, 5일간 실시

등과 귀의 아토피성 피부염의 생성은 육안으로 보기에 알 수 있을 정도로 강력하였으나 생성된 정도의 개체 편차가 심한 편이었다[실험 1은 70％(7/10마리) 실험 2는 80％(8/10마리)].

줄기세포 배양액의 효과를 올바로 판정하기 위하여 제 1군은 인산화 완충 식염수를 투여한 대조군으로 마우스 2마리를 처리하고, DNCB에 의해 약 4주 후 아토피성 피부염이 충분히 유발된 마우스는 12마리로 선별한 후, 각각 6마리씩 2, 3군으로 나누어, 제 2군은 DNCB를 계속 도포한 음성 대조군으로 하고, 제 3군에는 실시예 1에서 제4 계대 후 hAdSC 세포수가 1 x 108개가 되었을 때 얻은 줄기세포 배양액을 1㎖ 씩 매일 1회 등과 귀 부분의 아토피 유발 부위에 균일하게 총 14일간 도포하였다. 이때 롤밀을 이용하여 피부흡수를 용이하게 하였다. 정상군의 경우 아무 처리를 하지 않았고, 비히클은 아세톤-올리브오일을 도포하였다. 대조군의 경우 아토피 피부염 유발 후 동량의 증류수를 처리하여 각 시험 물질의 아토피 개선 효능을 평가하였다.

마우스에 DNCB를 처리한 후에 표피가 손상된 화학적 아토피 피부염을 유발 시킨 결과는 도 3과 같으며, 상기 아토피성 피부염 유발 마우스에 인체 지방-유래 줄기세포(hAdSC) 배양액을 투여한 후 날짜별로 측정한 결과는 도 4와 같다. 도 4에서 위로부터 인산화 완충 식염수를 투여한 대조군, 두 번째는 DNCB 만을 계속 도포한 군이며, 세 번째는 상기 분획물을 도포한 처리군을 나타낸다.

② IgE 농도억제효과

도포 실험 종료 후, 마우스의 꼬리 정맥으로부터 혈액을 채취하여 혈중 IgE 농도를 IgE ELISA kit[ Shibayagi Co., Ltd. (Gunma Japan)]를 사용하여 측정하였다.

NC/Nga 마우스로부터 채취한 혈액은 채혈한 혈액을 6,000rpm으로 20분간 원심분리하여 혈청을 얻었다. 혈청내 total IgE는 mouse IgE ELISA kit(Biolegnd. Inc. San Diego. USA) 사용, 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 450㎚에서 광학도(optical density; O.D)를 측정하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.

ELISA방법을 이용하여 급성면역질환에 관여하는 IgE의 농도를 알아본 결과 대조군에 비해서 통계적 유의성을 보이며 2배 이상 DNCB를 처리한 실험군에서 IgE의 농도가 높게 나타났다(약 17ng/㎖에서 DNCB를 처리할 경우엔 40ng/㎖까지 IgE의 농도가 올라간다. P<0.01). 이런 실험군에 줄기세포 배양액(Culture Sup.)을 처리할 경우엔 실험군 보다 절반 정도 IgE의 농도가 줄어드는 경향을 알 수 있었다.

(2) 아토피성 피부염 치료 활성 평가

상기 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 2일 후 육안으로도 상처의 크기가 뚜렷하게 작아진 것을 확인할 수 있었으며, 조직학적 검사에서 표피가 뚜렷하게 생성되었고 피하지방과 진피층 사이에 염증 세포들이 유의성 있게 줄어든 것을 확인할 수 있다. 이는 본 발명에 따른 줄기세포의 분획물이 아토피성 피부염으로 생긴 상처치료와 면역학적 염증 반응을 억제하여 아토피성 피부염의 예방 및 치료에 유용함을 나타낸다.

실시예 6. 인체 지방-유래 줄기세포(hAdSC) 배양액의 세포성장인자 측정

줄기세포 배양액에서 확인될 것으로 예상되는 주요 세포성장인자를 예상하고 그 인자들에 대한 항체가 포함된 ELISA 키트를 구입하고 통상의 ELISA 측정법을 통하여 각 세포성장인자의 정량실험을 수행하였다. 대조군으로서는 AdSC 배양 시, 어떤 세포성장인자도 가하지 않은 상태에서 배양하여 EGF의 생성 여부를 판단하였다.

그 결과 본 발명에서 자체적으로 개발한 배지로 hAdSC를 배양하였을 때 줄기세포 배양액에서는 VEGF와 bFGF가 특이적으로 생성되는 사실을 발견하였으며, 초기에 첨가된 EGF도 상당량 잔존하고 있음이 밝혀져 본 발명에서 사용된 줄기세포 배양액의 아토피 질환에 대한 치유효과는 이러한 세포성장인자의 특징적 생성에 기인하는 것으로 예상하게 되었다.

도 6에 본 발명에서 사용한 줄기세포 배양액의 세포성장인자 측정값을 표시하였다.

실시예 7. 인체 지방-유래 줄기세포(hAdSC) 배양액을 포함한 화장품 제조

줄기세포 배양액을 포함시킨 화장품 제조를 위하여 아래 표2과 같은 처방을 이용하였다. 피부 표면의 수분을 유지 시 피부전조 증세를 호전시키는 역할을 한다고 알려져 있으므로 각각 제형의 피부 보습력을 증가시키기 위하여 최적 보습제를 조사하여 적용하였다.

줄기세포 배양액을 제형에 첨가하여 잘 혼합한 후 30℃까지 냉각하고 탈기 하여 화장품의 안정성 및 자극성 등의 본 실험에 사용하였고 안전성에 문제점이 없는 처방으로 제품 사용 가능한 기본 처방으로 결정하였다.

표 2. 줄기세포 배양액이 첨가된 에센스 실험 처방

Claims

인체 지방-유래 줄기세포의 양성 표면마커인 CD73, CD90 및 CD105가 발현되고, 동일한 줄기세포의 음성 표면마커인 CD34 및 CD45가 발현되지 않는 것을 특징으로 하는 인체 지방-유래 줄기세포를 이용한 주요 세포성장인자를 포함하는 줄기세포 배양액.
제 1 항에 있어서;
인체 지방-유래 줄기세포 배양용 배지는 DMEM 배지를 기본배지로 하며, 효과적인 줄기세포 증식을 위하여 FBS, 인슐린, 아스코르브 산(ascorbic acid), 에스트라디올(estradiol), 하이드로코티손(hydrocortisone), EGF가 첨가된 것을 특징으로 하는 인체 지방-유래 줄기세포를 이용한 주요 세포성장인자를 포함하는 줄기세포 배양액배지 조성물.
제 2 항에 있어서;
줄기세포 배양용 배지에 대하여 FBS 농도는 1 ∼ 20％, 인슐린의 농도는 0.1 ∼ 500ng/㎖, 아스코르브산의 농도는 1 ∼ 100ug/㎖, 에스트라디올의 농도는 0.1 ∼ 10ng/㎖, 하이드로코티손의 농도는 0.1 ∼ 100ng/㎖, EGF 농도는 0.1 ∼ 200 ng/㎖의 범위인 것을 특징으로 하는 인체 지방-유래 줄기세포를 이용한 주요 세포성장인자를 포함하는 줄기세포 배양액.
제 3항의 농도 범위에서 인체 지방-유래 줄기세포를 배양하였을 때 생성되는 줄기세포 배양액을 포함하는 것을 특징으로 하는 인체 지방-유래 줄기세포를 이용한 주요 세포성장인자를 포함하는 줄기세포 배양액.
제 4 항에 있어서;
줄기세포 배양액은 EGF, VEGF, HGF, TGF, PDGF 및 bFGF와 같은 세포성장인자를 포함하는 것을 특징으로 하는 인체 지방-유래 줄기세포를 이용한 주요 세포성장인자를 포함하는 줄기세포 배양액.
제 5 항에 있어서;
줄기세포 배양액에 포함된 주요 세포성장인자로서 EGF는 0.1 ∼ 10ng/㎖, VEGF는 0.1 ∼ 100ng/㎖, HGF는 0.01 ∼ 10ng/㎖, TGF는 0.01 ∼ 10ng/㎖, PDGF는 0.01 ∼ 10ng/㎖, bFGF는 0.01 ∼ 20ng/㎖ 의 농도범위를 갖는 것을 특징으로 하는 인체 지방-유래 줄기세포를 이용한 주요 세포성장인자를 포함하는 줄기세포 배양액.
제 6 항의 농도범위의 세포성장인자를 포함하는 인체 지방-유래 줄기세포 배양액을 유효성분으로 하는 아토피 개선 화장료 조성물.
제 6 항의 농도범위의 세포성장인자를 포함하는 인체 지방-유래 줄기세포 배양액을 동결 건조하여 분말상으로 사용하는 것을 특징으로 하는 아토피 개선 화장료 조성물.
제 6 항의 농도범위의 세포성장인자를 포함하는 인체 지방-유래 줄기세포 배양액을 사용하는 아토피 개선 화장료 조성물.
제 7 항에 있어서;
인체 지방-유래 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 아토피 개선 화장료 조성물.