CN111148520B - 包含来源于脂肪来源干细胞的外排体作为有效成分的组合物在改善皮炎中的用途 - Google Patents

包含来源于脂肪来源干细胞的外排体作为有效成分的组合物在改善皮炎中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于预防、改善、减轻或治疗皮炎的包含来源于脂肪来源干细胞的外排体作为活性成分的组合物。本发明的组合物能够作用于引起皮炎的多种细胞因子靶标，并且因此广泛应用于由多种因素导致的皮炎，并且有效地抑制和减轻皮炎。

Description

包含来源于脂肪来源干细胞的外排体作为有效成分的组合物 在改善皮炎中的用途
技术领域
本发明涉及包含来源于脂肪来源干细胞的外排体作为活性成分的组合物在改善皮炎中的用途。
此外，本发明涉及用于预防、改善、减轻或治疗皮炎的包含以上组合物的药物组合物、皮肤外用制剂和化妆品组合物。
此外，本发明涉及能够获得大量来源于脂肪来源干细胞的外排体的在临床上和商业上相关的技术，所述外排体在临床上可应用于预防、改善、减轻或治疗皮炎并且具有高纯度和均一颗粒尺寸分布，其中所述技术可以以低成本大量提供包含具有优异功能活性的所获得外排体作为活性成分的组合物。
背景技术
人体的皮肤是在物理上和化学上保护机体免受外界影响并进行全身代谢所需的生化功能的器官。通常，出现在人皮肤上的炎性皮肤病称为皮炎。相对常见的皮炎包括特应性皮炎、接触性皮炎、脂溢性皮炎等。
接触性皮炎是由与外来物质接触而引起的皮炎。根据发生机制，接触性皮炎被分类为刺激性接触性皮炎和变应性接触性皮炎，并且一种类型的物质可同时引起这两种反应。引起接触性皮炎的大多数物质是有机化合物。已知，当引起皮炎的物质再次与对该物质过敏的皮肤接触时，记忆细胞识别该物质而分泌多种引起炎症的化学物质。
特应性皮炎是一种慢性炎性皮肤病，其特征在于发痒和湿疹病变。先前的研究已表明，特应性皮炎的发生涉及多种因素。当发生特应性皮炎时，在病变部位观察到炎症相关细胞，例如嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和肥大细胞，并且由肥大细胞产生的免疫球蛋白IgE增多。此外，出现T细胞的异常增殖，并且在该过程中，炎性细胞因子IL-4、IL-5、IL-13等增多，从而放大了免疫应答。最近，已知，胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic stromallymphopoietin，TSLP)与皮炎的严重程度相关并且引起特应性皮炎的发痒症状。此外，脂溢性皮炎是一种慢性炎性皮肤病，其发生于：头皮；面部，尤其是眉毛、鼻、唇周围皮肤和耳；腋窝；胸部；和腹股沟区；在这些地方，由于皮脂腺活性提高，皮脂分泌增多。
基于上述研究结果，已致力于开发通过炎症和免疫抑制来治疗皮炎的皮炎治疗剂。迄今为止所开发的皮炎治疗剂包括类固醇、抗组胺药和免疫抑制剂例如环孢素A。但是，这些药剂的问题在于它们引起严重的副作用，例如皮肤萎缩、血管舒张、色素脱失、注射部位的超敏反应、抗性、中性粒细胞减少等。此外，这些药剂具有以下局限性：它们仅有助于将症状控制在适当的水平，而不是根治。
鉴于这些问题，已积极进行了对基于天然物质的皮炎治疗剂的研究。在基于这些天然物质的皮炎治疗剂的情况下，天然提取物中活性成分的量低，并且因此需要使用大量的天然提取物以获得治疗皮炎的效果。在大多数情况下，在营销中已强调了这些组合物是基于天然物质的事实，但是需要对天然物质对治疗皮炎的实际效力进行更多的科学研究。
同时，已提出了使用干细胞来再生和治疗皮肤的方法。胚胎干细胞或胎儿组织来源干细胞具有优异的分化能力以及优异的再生和治疗能力，并且引起较低的排斥，但是由于伦理问题和潜在的肿瘤形成风险，这些干细胞在临床上不适用。作为对其的替代方案，已提出了使用成体干细胞来再生和治疗皮肤的方法。然而，使用同种异体成体干细胞(不是患者的自体成体干细胞)可造成引起移植物抗宿主病的风险。当使用自体成体干细胞进行治疗时，产生以下问题：必需进行培养从患者分离的成体干细胞的过程，这是复杂且昂贵的。
近年来，鉴于干细胞的上述问题，已尝试使用通过培养成体干细胞而获得的条件培养基来再生或治疗皮肤。然而，成体干细胞的条件培养基不仅包含由成体干细胞分泌的多种蛋白质、细胞因子和生长因子，而且还包含例如在细胞生长期间分泌的废物、为防止污染而添加的抗生素、动物来源血清等组分。因此，当将条件培养基用于皮肤上时，皮肤极有可能暴露于多种风险。
最近，有报道称细胞分泌组(secretome)包含调节细胞行为的多种生物活性分子。特别地，细胞分泌组包含具有细胞间信号传导功能的“外排体(exosome)”，并且因此已积极地对其组分和功能进行了研究。
细胞将多种膜囊泡脱落到其细胞外环境中，并且这些释放的囊泡通常称为细胞外囊泡(extracellular vesicle，EV)。细胞外囊泡也被称为细胞膜来源囊泡、核外粒体、脱落囊泡、微粒、外排体等，并且在一些情况下也与外排体区别使用。
外排体是尺寸为数十至数百纳米的囊泡，其由与细胞膜具有相同结构的磷脂双层膜组成。该外排体包含被称为外排体货物的蛋白质、核酸(mRNA、miRNA等)等。已知，外排体的货物包括广泛多种信号传导因子，并且这些信号传导因子对细胞类型具有特异性且根据分泌细胞的环境而不同地调节。已知，外排体是由细胞分泌的细胞间信号传导介质，并且通过其传递的多种细胞信号调节细胞行为，包括靶细胞的活化、生长、迁移、分化、去分化、凋亡和坏死。根据外排体来源于的细胞的性质和状态，外排体包含特定的遗传物质和生物活性因子。来源于增殖干细胞的外排体调节细胞行为，例如细胞迁移、增殖和分化，并且重现参与组织再生的干细胞的特征(Nature Review Immunology 2002(2)569-579)。
然而，尽管已进行了表明使用外排体来治疗一些疾病的可能性的多种研究，但需要更详细的临床和非临床研究，而且特别地，需要开发可通过科学地鉴定外排体所作用的多种靶标而将外排体应用于多种疾病的治疗的技术。
本发明人已致力于开发与伴随有发痒和炎症的皮炎的已知常规治疗剂相比更优异且更安全的治疗剂。因此，本发明人已对来源于脂肪来源干细胞的外排体的新用途进行了大量的研究，并且作为结果，已发现从脂肪来源干细胞的条件培养基中分离的外排体可解决如上所述的干细胞本身或条件培养基的安全性问题，并且有效地用于预防、改善、减轻或治疗皮炎，从而完成了本发明。
同时，应理解，作为背景技术描述的内容仅旨在帮助理解本发明的背景，并不被认为是针对本发明的现有技术。
发明内容
技术挑战
本发明的一个目的是提供包含来源于脂肪来源干细胞的外排体作为活性成分的组合物在改善皮炎中的用途。特别地，本发明的一个目的是提供以下组合物，其能够作用于诱发皮炎的多种细胞因子靶标，并且因此被广泛地应用于由多种因素引起的皮炎、有效地抑制和减轻皮炎。
本发明的另一个目的是提供用于预防、改善、减轻或治疗皮炎的包含以上组合物的药物组合物、皮肤外用组合物和化妆品组合物。
本发明的另一个目的是获得大量具有高纯度和均一颗粒尺寸分布的来源于脂肪来源干细胞的外排体，并提供包含具有优异功能活性的所获得外排体作为活性成分的组合物。
本发明的另一个目的是提供使用所述组合物来预防、改善、减轻或治疗皮炎的方法。
本发明的又一个目的是除治疗目的之外，提供用于通过使用所述组合物来调节哺乳动物皮肤状况的美容方法。
然而，如上所述的本发明目的是举例说明性的并且本发明的范围不受此限制。此外，通过以下描述、所附权利要求书和附图，本发明的其他目的和优点将更加明显。
本发明的具体描述
为了实现以上目的，本发明提供了用于预防、改善、减轻或治疗皮炎的组合物，其包含来源于脂肪来源干细胞的外排体作为活性成分。
本发明还提供了能够获得大量来源于脂肪来源干细胞的外排体的在临床上和商业上相关的新技术，所述外排体在临床上可应用于预防、改善、减轻或治疗皮炎并且具有高纯度和均一颗粒尺寸分布，其中所述技术可以以低成本大量提供包含具有优异功能活性的所获得外排体作为活性成分的组合物。
本文中使用的术语“外排体”是指尺寸为数十至数百纳米(优选地，约30至200nm)的囊泡，其由与细胞膜具有相同结构的磷脂双层膜组成(然而，根据外排体分离自的细胞的类型、分离方法和测量方法，外排体的颗粒尺寸是可变的)(Vasiliy S.Chernyshev etal.，“Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes”，Anal Bioanal Chem，(2015)DOI 10.1007/s00216-015-8535-3)。这些外排体包含被称为外排体货物的蛋白质、核酸(mRNA、miRNA等)等。已知，外排体的货物包括广泛多种信号传导因子，并且这些信号传导因子对细胞类型具有特异性且根据分泌细胞的环境而不同地调节。已知，外排体是由细胞分泌的细胞间信号传导介质，并且通过其传递的多种细胞信号调节细胞行为，包括靶细胞的活化、生长、迁移、分化、去分化、凋亡和坏死。
本文中使用的术语“离子透入(iontophoresis)”是指以下方法：使微电流流过已施加有活性成分的皮肤，从而产生电位差并改变皮肤的电环境，由此允许电离的活性成分通过电斥力渗透皮肤。在本发明的一个实施方案中使用的离子透入的一些实例包括：通过允许微电流从外部电源流入到在皮肤上的电极贴片中而将微电流引入到皮肤中的方法，所述微电流由外部电源产生；将微电流引入到皮肤中的方法，所述微电流由设置在皮肤上电极贴片中的电池产生；以及通过在皮肤上的设置有反向电渗析装置的贴片将微电流引入到皮肤中的方法，所述微电流通过反向电渗析装置中高浓度电解质溶液与低浓度电解质溶液之间的浓度差产生。然而，本发明不限于此，并且当然可使用多种类型的离子透入。
报道了来源于脂肪来源干细胞的外排体对皱纹改善和皮肤再生的有限作用。此外，已报道，来源于神经干细胞而不是脂肪来源干细胞的外排体有效地用于治疗脑损伤和治疗由干细胞移植排斥引起的炎性疾病。然而，尚不知道从脂肪来源干细胞的条件培养基中分离和纯化的外排体的使用对于“皮炎治疗”等是有效的。
到目前为止，尚未开发出使得可以将外排体在临床上应用于治疗皮炎的治疗剂，其中所述外排体是从在培养可大量培养的脂肪来源干细胞之后获得的脂肪来源干细胞的条件培养基中经济地大量分离和纯化的。脂肪干细胞可通过简单过程例如吸脂来大量获得。脂肪具有的干细胞比骨髓、脐带或脐带血具有的干细胞高约40倍。因此，这些脂肪来源干细胞具有最低的商业成本并且大量获得。然而，由于脂肪包含大量杂质例如细胞碎片、废物、蛋白质和大颗粒，因此难以从脂肪来源干细胞的条件培养基中经济地分离大量具有高纯度和均一颗粒尺寸分布的外排体。因此，显然，在经济性方面，从脂肪来源干细胞的条件培养基中分离大量具有高纯度和均一颗粒尺寸分布的外排体存在技术障碍。
当本发明的组合物用作药物组合物例如可注射制剂或皮肤外用制剂时，组合物中包含的作为活性成分的来源于脂肪来源干细胞的外排体对预防、改善、减轻或治疗皮炎表现出显著效果，并且可克服干细胞本身或干细胞的条件培养基的安全性问题。因此，根据本发明的用于预防、改善、减轻或治疗皮炎的组合物中包含的来源于脂肪来源干细胞的外排体通过与常规技术中已知的有限皱纹改善和皮肤再生的机制完全不同的机制来预防、减轻或治疗皮炎，并且应理解，这些效果根本不能够从常规技术中预测。
根据本发明一个实施方案的用于预防、改善、减轻或治疗皮炎的组合物包含来源于脂肪来源干细胞的外排体作为活性成分。
在根据本发明一个实施方案的组合物中，外排体可通过进行以下步骤获得：(a)向脂肪来源干细胞的条件培养基添加海藻糖；(b)过滤其中已添加有海藻糖的条件培养基；(c)通过切向流过滤(Tangential Flow Filtration，TFF)从经过滤的条件培养基中分离外排体；以及(d)向用于渗滤的缓冲液添加海藻糖，并使用其中已添加有海藻糖的该缓冲液通过TFF对分离的外排体进行渗滤。
在根据本发明一个实施方案的组合物中，当在步骤(d)中向用于渗滤的缓冲液添加海藻糖时，可有效获得具有均一颗粒尺寸分布和高纯度的外排体(参见图6A至6E)。
同时，在本发明中，海藻糖用于有效地将外排体与杂质例如细胞碎片、废物、蛋白质和大颗粒区分开。
在根据本发明一个实施方案的组合物中，渗滤可连续或不连续地进行。渗滤可使用体积为分离的外排体的至少4倍、优选至少6至10倍、更优选至少12倍的缓冲液来进行。
在根据本发明一个实施方案的组合物中，TFF可使用0.05μm过滤器或者截留分子量(molecular weight cutoff，MWCO)为100,000Da(道尔顿)、300,000Da、500,000Da或750,000Da的TFF过滤器来进行。
在根据本发明一个实施方案的组合物中，步骤(c)还可包括通过TFF将分离的外排体浓缩至1/100至1/25的体积。
在根据本发明一个实施方案的组合物中，外排体可降低皮肤组织或皮肤细胞中IL-4和IL-31的表达水平。此外，外排体可降低皮肤组织或皮肤细胞中选自IL-23和TNF-α的至少一种的表达水平。
在根据本发明一个实施方案的组合物中，外排体可降低血液中IgE的水平以及血液中白细胞和嗜酸性粒细胞的数目。
在根据本发明一个实施方案的组合物中，外排体可降低皮肤组织中肥大细胞、CD86+细胞和CD206+细胞的数目。
在根据本发明一个实施方案的组合物中，脂肪来源干细胞的类型没有特别限制，只要其不造成感染病原体的风险并且不引起免疫排斥即可，但是其可优选地是人脂肪来源干细胞。
根据本发明一个实施方案的组合物可有效地用于预防、改善、减轻或治疗伴随有发痒的多种类型的皮炎。优选地，所述组合物可用于：接触性皮炎、刺激性接触性皮炎、变应性接触性皮炎、光毒性和光变应性接触性皮炎、接触性荨麻疹综合征、特应性皮炎、脂溢性皮炎、自身敏感性皮炎、自身免疫性孕酮性皮炎、瘀滞性皮炎、痤疮或湿疹。更优选地，所述组合物可用于特应性皮炎、痤疮或湿疹。
根据本发明一个实施方案的组合物可制备成药物组合物。当根据本发明一个实施方案的组合物制备成药物组合物时，根据本发明一个实施方案的组合物可以是用于经口或肠胃外施用的任何制剂。
根据常规方法，根据本发明一个实施方案的药物组合物可包含可药用的载体、赋形剂或稀释剂。载体、赋形剂和稀释剂包括但不限于：乳糖、右旋糖、海藻糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、金合欢胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、碳酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。为了使用，根据本发明一个实施方案的药物组合物可配制成：经口剂型，例如散剂、丸剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、颗粒剂、酏剂、气雾剂等；皮肤外用制剂；栓剂；或无菌可注射溶液剂。
根据本发明一个实施方案的药物组合物的施用意指通过任何合适的方法将期望的物质引入到患者中，并且药物组合物可通过任何一般途径来施用，只要物质可到达靶组织即可。例如，根据本发明一个实施方案的药物组合物可经口或肠胃外施用。用于肠胃外施用的途径可包括经皮施用、腹膜内施用、静脉内施用、动脉内施用、肌内施用、皮下施用、皮内施用、表面施用、直肠内施用等。然而，本发明的范围不限于此，并且不排除本领域中已知的多种施用方法。此外，根据一个实施方案的药物组合物可通过可将活性成分递送到靶组织或细胞中的任何装置来施用。此外，根据本发明一个实施方案的药物组合物的有效量意指为了达到治疗疾病的效果而需要施用的量。
根据本发明的药物组合物的用于肠胃外施用的制剂可以是经灭菌的水溶液剂、非水溶液剂、混悬剂、乳剂、冻干制剂、或栓剂。根据本发明一个实施方案的药物组合物的用于肠胃外施用的制剂还可制备成可注射制剂。根据本发明一个实施方案的可注射制剂可以是水性可注射制剂、非水性可注射制剂、水性混悬注射剂、非水性混悬注射剂、在溶解或混悬之后使用的固体可注射制剂等，但不限于此。根据本发明一个实施方案的可注射制剂根据其类型还可包含以下中的至少一种：注射用蒸馏水、植物油(例如，花生油、芝麻油、山茶油等)、甘油单酯、甘油二酯、丙二醇、樟脑、苯甲酸雌二醇、次水杨酸铋、偶砷苯钠、硫酸链霉素，并且还可任选地包含稳定剂或防腐剂。
制剂中根据一个实施方案的药物组合物的含量可根据如上所述的另外组分的种类、量、形式等适当地选择。例如，基于可注射制剂的总重量，本发明的药物组合物可以以约0.1wt％至99wt％、优选约10wt％至90wt％的量包含在内。此外，根据本发明一个实施方案的药物组合物的合适剂量可根据以下进行调整：患者的疾病的种类，疾病的严重程度，制剂的类型，配制方法，患者的年龄、性别、体重、健康状况、饮食、排泄率、施用时间和施用方案。例如，当将根据本发明一个实施方案的药物组合物施用于成人时，其可以以每天0.001mg/kg至100mg/kg的剂量施用一次至数次。
同时，当将根据本发明一个实施方案的组合物制备成皮肤外用制剂和/或化妆品组合物时，在不损害本发明效果的范围内，根据需要，其可适当地包含在化妆品产品或皮肤外用制剂中通常使用的组分，例如，保湿剂、抗氧化剂、油性组分、UV吸收剂、乳化剂、表面活性剂、增稠剂、醇、粉组分、着色剂、水性组分、水、以及多种皮肤营养物等。
此外，在不损害来源于脂肪来源干细胞的外排体的作用(即抑制皮炎和瘙痒的作用等)的范围内，除来源于脂肪来源干细胞的外排体之外，根据本发明一个实施方案的皮肤外用制剂还可包含在本领域中使用的皮炎治疗剂和/或保湿剂。例如，本发明的外排体可包含在以下中的至少一种中或与以下中的至少一种混合：水凝胶、透明质酸、透明质酸的盐(例如，透明质酸钠等)或透明质酸凝胶。在根据本发明一个实施方案的皮肤外用制剂中，水凝胶的种类没有特别限制，但是水凝胶可优选地通过将胶凝聚合物分散在多元醇中来获得。胶凝聚合物可以是选自以下的至少一种：普朗尼克、纯化琼脂、琼脂糖、结冷胶、藻酸、卡拉胶、肉桂胶、黄原胶、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖、果胶、纤维素、瓜尔胶和槐豆胶，并且多元醇可以是选自以下的至少一种：乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇、异丁二醇、二丙二醇、山梨糖醇、木糖醇和甘油。
根据本发明一个实施方案的皮肤外用制剂和/或化妆品组合物可以以多种形式使用，例如，贴片、片装面膜、面膜巾、霜、活肤水、软膏、混悬液、乳液、糊剂、化妆水、凝胶剂、油剂、剥撕式面膜、喷雾剂、气雾剂、雾剂、粉底、粉和油纸。例如，皮肤外用制剂和/或化妆品组合物可被施加至贴片、片装面膜或面膜巾的至少一个表面或浸在贴片、片装面膜或面膜巾的至少一个表面中。
当将根据本发明一个实施方案的皮肤外用制剂制备成化妆品组合物时，其用于预防、改善或减轻皮炎或使皮炎恢复至正常状况的目的，并且化妆品组合物可制备成本领域中通常制备的任何制剂。例如，其可配制成：贴片、片装面膜、面膜巾、皮肤软化剂、营养品、收敛化妆水、滋养霜、按摩霜、眼霜、清洁霜、精华、眼部精华、清洁化妆水、清洁泡沫、清洁水、防晒霜、唇膏、肥皂、洗发剂、含表面活性剂的清洁剂、浴用制剂、身体乳、身体霜、身体油、身体精华、身体清洁剂、染发剂、护发素等，但不限于此。
根据本发明一个实施方案的皮肤外用制剂和/或化妆品组合物包含通常在皮肤外用制剂和/或化妆品产品中使用的组分。例如，皮肤外用制剂和/或化妆品组合物可包含常规的辅料和载体，例如抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、色素和香料。此外，根据皮肤外用制剂和/或化妆品组合物的类型或预期用途，本领域技术人员可毫无困难地适当选择皮肤外用制剂和/或化妆品组合物的每种制剂中的其他组分。
本发明的另一个实施方案提供了除治疗目的之外，用于通过使用化妆品组合物调节哺乳动物皮肤状况的美容方法。在本发明的美容方法中，调节皮肤状况意指改善皮肤状况和/或预防性地调节皮肤状况，并且改善皮肤状况意指皮肤组织的外观和感觉发生视觉上和/或触觉上可感知的积极变化。
根据本发明一个实施方案的美容方法包括：(a)直接将化妆品组合物施加至哺乳动物皮肤；或者(b)使贴片、片装面膜或面膜巾与哺乳动物皮肤接触或附着至哺乳动物皮肤，所述贴片、片装面膜或面膜巾具有向其施加的或浸在其中的化妆品组合物；或者依次进行(a)和(b)。
根据本发明一个实施方案的美容方法还可包括通过允许微电流流过已施加有化妆品组合物的哺乳动物皮肤来进行离子透入。此外，根据本发明一个实施方案的美容方法还可包括使离子透入装置与哺乳动物皮肤接触或附着至哺乳动物皮肤。
在根据本发明一个实施方案的美容方法中，离子透入装置可包含选自以下的至少一种电池：柔性电池、锂离子二次电池、碱性电池、干电池、汞电池、锂电池、镍-镉电池和反向电渗析电池，或者可包含设置有所述至少一种电池的贴片、片装面膜或面膜巾。
本发明的另一个实施方案提供了用于预防、改善、减轻或治疗皮炎的方法，其包括向哺乳动物施用治疗有效量的药物组合物。
在根据本发明的用于预防、改善、减轻或治疗皮炎的方法中，哺乳动物可以是人、狗、猫、啮齿动物、马、牛、猴或猪。
有益效果
本发明的组合物能够降低引起皮炎的多种炎性细胞因子和炎症相关因子的产生，并通过抑制炎症相关免疫细胞的活性或参与来预防、改善、减轻或治疗皮炎。
特别地，本发明的组合物能够作用于诱发皮炎的多种细胞因子靶标，并且因此被广泛地应用于由多种因素引起的皮炎且有效地抑制和减轻皮炎。此外，本发明的组合物能够调节表达模式根据皮炎的轻度、中度或重度阶段而不同的细胞因子靶标，并且因此可应用于预防、改善、减轻或治疗轻度、中度或重度皮炎。此外，本发明的组合物能够调节表达模式根据皮炎的急性或慢性状态而不同的细胞因子靶标，并且因此可应用于预防、改善、减轻或治疗急性和慢性皮炎。
因此，本发明的组合物可用作用于预防、改善、减轻或治疗皮炎的药物组合物、皮肤外用制剂和化妆品组合物。
此外，根据本发明，可以以低成本大量获得具有均一颗粒尺寸分布和高纯度的来源于脂肪来源干细胞的外排体。因此，本发明可以以低成本大量提供包含具有优异功能活性的来源于脂肪来源干细胞的外排体作为活性成分的组合物。此外，本发明使得可以扩大工艺，并且还适合于良好生产规范(Good Manufacturing Practice，GMP)。
应理解，本发明的范围不限于前述效果。
附图说明
图1是举例说明根据本发明一个实施方案在由脂肪来源干细胞的培养基制备外排体的方法中分离和纯化外排体的方法的流程图。
图2示出了测量根据本发明一个实施方案在由脂肪来源干细胞的培养基制备外排体的每个步骤中溶液中包含的蛋白质的相对量的结果。每个步骤中蛋白质的相对量表示为每个步骤的溶液中蛋白质的总量与干细胞的条件培养基中蛋白质的总量的相对比。所示实验结果是分别从两个不同批次获得的结果。
图3示出了测量根据本发明一个实施方案获得的外排体的生产率和纯度的结果。将外排体的生产率以每mL干细胞条件培养基(CM)获得的外排体颗粒的数目进行计算，并且将外排体的纯度以最终级分中包含的每μg蛋白质的外排体颗粒的数目进行计算。所示实验结果是分别从五个不同批次获得的结果。
图4A至4E示出了分析根据本发明一个实施方案获得的外排体的物理特性的结果。“图4A”示出了通过可调电阻脉冲传感(tunable resistive pulse sensing，TRPS)分析获得的颗粒尺寸分布和颗粒数目。“图4B”示出了通过纳米粒追踪分析(nanoparticletracking analysis，NTA)获得的颗粒尺寸分布和颗粒数目。“图4C”示出了通过透射电子显微术(transmitted electron microscopy，TEM)分析获得的不同放大率的颗粒图像。“图4D”示出了根据本发明一个实施方案获得的外排体的Western印迹分析的结果。“图4E”示出了根据本发明一个实施方案获得的外排体的标志物的分析中CD63和CD81的流式细胞术的结果。
图5A至5C示出了颗粒尺寸分布的NTA分析的结果，其显示通过添加海藻糖获得了具有均一颗粒尺寸分布和高纯度的外排体。随着添加的海藻糖的量提高，可获得具有单峰的颗粒尺寸分布。
图6A至6C示出了NTA分析的结果，其显示根据本发明一个实施方案取决于在制备外排体的过程中是否添加海藻糖而获得的颗粒尺寸分布。“图6A”示出了在整个制备过程中添加海藻糖时所获得的结果；“图6B”示出了在条件培养基被冷冻储存并解冻，并随后向经解冻培养基添加海藻糖的情况下获得的结果；并且“图6C”示出了在未添加海藻糖时获得的结果。“图6D”示出了将通过图6A至6C的方法分离的外排体的相对生产率和相对浓度进行比较的结果。“图6E”示出了通过图6A至6C的方法分离的外排体的平均尺寸。
图7示出了显示根据本发明一个实施方案的外排体具有降低NO形成(一种炎性反应)的作用的实验结果。在图7中，PBS表示磷酸盐缓冲盐水；DEX表示地塞米松；EXO表示外排体；CM表示脂肪来源干细胞的条件培养基；并且CM-EXO表示脂肪来源干细胞的外排体耗尽的条件培养基。
图8A至8C示出了将根据本发明一个实施方案分离的外排体的NO形成降低作用与通过常规沉淀法(PPT)分离的外排体的NO形成降低作用进行比较的实验结果。图8A示出了通过常规沉淀法分离的外排体的NTA分析的结果；图8B示出了通过根据本发明一个实施方案的方法分离的外排体的NTA分析的结果；并且图8C是比较NO形成降低作用的图。NO形成降低的程度表示为与通过作为阳性对照的地塞米松(dexamethasone，Dex)的NO形成降低程度的相对比(％)。
图9示出了显示当用根据本发明一个实施方案的外排体处理特应性诱导小鼠(皮炎诱导动物模型1)时，特应性症状得到减轻的结果。
图10描绘了显示实时PCR结果的图，进行该实时PCR以检测在用根据本发明一个实施方案的外排体处理在其中已诱导特应性的小鼠之后，从皮炎诱导动物模型1的皮肤病灶获得的样品中炎性细胞因子IL-4和IL-31的mRNA表达水平的变化。
图11示出了显示当用根据本发明一个实施方案的外排体处理特应性诱导小鼠(皮炎诱导动物模型2)时，特应性症状以依赖于外排体剂量的方式减轻的结果。
图12描绘了量化和比较图11中所示结果的图。
图13描绘了显示实时PCR结果的图，进行该实时PCR以检测在用根据本发明一个实施方案的外排体处理在其中已诱导特应性的小鼠之后，从皮炎诱导动物模型2的皮肤病灶获得的样品中炎性细胞因子IL-4、IL-31、TNF-α和IL-23的mRNA表达水平的变化。
图14描绘了显示在用根据本发明一个实施方案的外排体处理皮炎诱导动物模型2之后，测量血液中存在的IgE(A)、白细胞(B)和嗜酸性粒细胞(C)的结果的图。
图15示出了测量荧光强度以鉴定经PKH67染色的外排体的结果。
图16描绘了显示将经荧光染色的本发明外排体递送到猪皮肤组织中的程度的荧光显微图像。该荧光显微图像在用缓冲剂稀释经荧光染色的本发明外排体并将该稀释剂施加于猪皮肤表面之后的某一时间获得。
图17描绘了显示将经荧光染色的本发明外排体递送到小鼠皮肤组织中的程度的共聚焦荧光显微图像，以及将通过测量每个图像上的荧光强度获得的总荧光强度进行比较的图。图17的顶部描绘了在用缓冲剂稀释经荧光染色的本发明外排体并将该稀释剂施加于小鼠皮肤表面之后一定时间之后获得的共聚焦荧光显微图像。
图18示出了显示在用根据本发明一个实施方案的外排体处理人成纤维细胞HS68细胞之后该外排体不具有细胞毒性的结果。
图19描绘了显示以下的照片：作为向人皮肤(受影响部分)施加包含根据本发明一个实施方案的外排体的组合物并随后进行离子透入以允许微电流流过已施加有该组合物的人皮肤(受影响部分)的结果，具有严重皮炎的人皮肤(受影响部分)上的红斑等明显改善。
图20描绘了显示以下的照片：作为将包含根据本发明一个实施方案的外排体的组合物皮下注射到患有天然严重特应性皮炎的喜乐蒂牧羊犬(Shetland Sheepdog)中的结果，特应性症状明显改善。
具体实施方式
在下文中，将参照以下实施例更详细地描述本发明。然而，以下实施例仅是举例说明本发明并且不旨在限制或约束本发明的范围。本领域技术人员可从本发明的发明详述和实施例中容易地推断出的那些被解释为落入本发明的范围内。本发明中提及的参考文献通过引用并入本文。
在本说明书通篇，应理解，除非另有指明，否则当任何部分被提及“包含/包括”任何组分时，其不排除其他组分，而是还可包含/包括其他组分。
实施例
实施例1：细胞培养
RAW 264.7细胞(小鼠巨噬细胞系)购自韩国细胞系库(Korean Cell Line Bank)并进行培养。对于细胞培养，将细胞在包含10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS；购自ThermoFisher Scientific)和1％抗生素-抗真菌剂(购自ThermoFisher Scientific)的DMEM(购自ThermoFisher Scientific)培养基中在37℃、5％CO2下进行传代培养。
将购自ATCC的人真皮成纤维细胞HS68细胞在包含10％胎牛血清(FBS；购自ThermoFisher Scientific)和1％抗生素-抗真菌剂(购自ThermoFisher Scientific)的DMEM(购自ThermoFisher Scientific)培养基中在37℃、5％CO2下进行传代培养。
根据本发明所属技术领域中已知的细胞培养方法，在37℃、5％CO2下培养脂肪来源干细胞。接下来，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(购自ThermoFisher Scientific)洗涤，并随后用无血清、无酚红的培养基替代该培养基，并将细胞培养1至10天。回收上清液(在下文中称为“条件培养基”)。
为了在外排体分离过程中获得具有均一颗粒尺寸分布和高纯度的外排体，向条件培养基添加2wt％的海藻糖。在添加海藻糖之后，通过0.22μm过滤器过滤条件培养基以去除杂质，例如细胞碎片、废物、大颗粒等。立即从经过滤的条件培养基中分离外排体。此外，将经过滤的条件培养基储存在冰箱(10℃或低于10℃)中，并随后用于外排体分离。此外，将经过滤的条件培养基冷冻储存在-60℃或低于-60℃的超低温冷冻箱中，解冻，并随后进行外排体分离。此后，通过TFF从条件培养基中分离外排体。
实施例2：通过TFF方法的外排体分离和纯化
为了从实施例1中经通过0.22μm过滤器过滤的条件培养基中分离外排体、对其进行浓缩和渗滤，使用了TFF方法。在使用TFF分离和浓缩外排体之前，对经过滤的条件培养基进行声处理以使潜在的外排体聚集体变得松散。作为用于TFF方法的过滤器，使用了筒式过滤器(称为中空纤维过滤器；购自GE Healthcare)或盒式过滤器(购自Pall、Sartorius或Merck Millipore)。可选择具有不同截留分子量(MWCO)的TFF过滤器。使用具有所选MWCO的过滤器，将外排体分离并浓缩，并去除小于MWCO的颗粒、蛋白质、脂质、核酸、低分子量化合物等。
为了分离和浓缩外排体，使用MWCO为100,000Da(道尔顿)、300,000Da或500,000Da的TFF过滤器。通过TFF方法通过去除小于MWCO的物质并将条件培养基浓缩至约1/100至1/25的体积从条件培养基中分离外排体。
对分离并浓缩的外排体溶液另外进行渗滤。渗滤使用体积为分离的外排体的至少4倍、优选至少6至10倍、更优选至少12倍的缓冲液连续地(连续渗滤)或不连续地(不连续渗滤)进行。为了获得具有均一颗粒尺寸分布和高纯度的外排体，向缓冲液添加在PBS中的2wt％海藻糖。图6A至6E示出了通过添加海藻糖可以以高产率获得具有均一颗粒尺寸分布和高纯度的外排体的结果。
实施例3：分离的外排体的特征分析
使用BCA比色测定(购自ThermoFisher Scientific)或FluoroProfile荧光测定(购自Sigma)测量分离的外排体、条件培养基和TFF分离过程中级分的蛋白质的量。对于通过根据一个实施方案的TFF方法分离和浓缩的外排体，通过蛋白质测定监测蛋白质、脂质、核酸、低分子量化合物等被去除的程度，并且监测结果示于图2中。结果，可以看出，通过根据一个实施方案的TFF方法非常有效地去除了条件培养基中存在的蛋白质。
图3示出了当通过根据一个实施方案的TFF方法分离外排体时将五个独立批次中每一批次中外排体的生产率和纯度进行比较的结果。分析了从五个独立批次获得的结果，并且作为结果，确定通过根据一个实施方案的TFF方法非常稳定地分离了外排体。
分离的外排体的颗粒尺寸和浓度通过纳米粒追踪分析(NTA)仪器(购自Malvem)或可调电阻脉冲传感(TRPS)仪器(购自Izon Science)进行测量。分离的外排体的均一性和尺寸通过透射电子显微术(TEM)进行分析。图4A至图4C示出了通过根据本发明一个实施方案的分离方法分离的外排体的TRPS、NTA和TEM的结果。
在通过TFF方法分离外排体之后，根据是否添加海藻糖通过NTA分析外排体的尺寸分布。分析的结果示于图5A至5C中。海藻糖的浓度从0wt％提高至1wt％和2wt％(在图5A至5C中从顶部到底部)，并且实验重复进行3次。经确定，当不使用海藻糖时，观察到尺寸为300nm或更大的颗粒，然而随着添加的海藻糖的量提高，尺寸为300nm或更大的颗粒的数目降低并且外排体的尺寸分布变得均一。
另外检测了由于在通过TFF方法分离外排体的过程中添加海藻糖引起的作用。如图6A至6C中所示，当在整个制备外排体过程中添加在PBS中的2wt％海藻糖时，可获得具有均一尺寸分布的外排体(图6A)。然而，当使用在不添加海藻糖的情况下冷冻储存的条件培养基而仅在渗滤过程中添加海藻糖的情况下进行TFF过程，或者在未添加任何海藻糖的情况下进行TFF过程时，获得了包含大量大颗粒的不均一外排体(图6B和6C)。
对分离的外排体的相对生产率和浓度进行比较，并且作为结果，当在整个外排体产生过程中添加海藻糖时，可以以非常高的生产率获得外排体。所获得的外排体是对照(其中在整个外排体产生过程中未添加海藻糖)的浓度的至少5倍(图6D)。如NTA分析结果所示，确定当在整个外排体产生过程中添加海藻糖时，分离的外排体的平均尺寸是均一的(200nm)(图6E)。
图4D示出了通过根据本发明一个实施方案的分离方法分离的外排体的Western印迹分析的结果。如其中所示，确定了CD9、CD63、CD81和TSG101标志物的存在。作为针对每种标志物的抗体，分别使用抗CD9(购自Abcam)、抗CD63(购自System Biosciences)、抗CD81(购自System Biosciences)和抗TSG101(购自Abcam)。
图4E示出了通过根据本发明一个实施方案的分离方法分离的外排体的流式细胞术的结果。如其中所示，确定了CD63和CD81标志物的存在。为了分离CD63阳性外排体，根据制造商的说明书使用外排体-人CD63分离/检测试剂盒(购自ThermoFisher Scientific)。用PE-小鼠抗人CD63(购自BD)或PE-小鼠抗人CD81(购自BD)对标志物进行染色，并随后使用流式细胞仪(ACEA Biosciences)进行分析。
综合以上结果，可确定根据本发明一个实施方案的分离方法可通过在基于切向流过滤的分离和/或纯化过程中添加海藻糖来以高产率经济且有效地分离和纯化具有均一颗粒尺寸分布和高纯度的外排体。此外，可以看出，根据本发明一个实施方案的分离方法的工艺可扩大并且也适合于GMP。
实施例4：外排体处理之后细胞毒性的测量
为了评价通过根据本发明一个实施方案的分离方法分离的外排体在人皮肤成纤维细胞HS68细胞中的细胞毒性，将细胞用多种浓度的外排体处理，并检测细胞的增殖速率。具体地，将HS68细胞悬浮于含10％FBS的DMEM中，随后接种并培养至80％至90％汇合，并在37℃、5％CO2下在培养箱中培养24小时。在24小时之后，去除培养基，并用实施例2中制备的多种浓度的外排体处理细胞。然后，在细胞培养24至72小时时评价细胞的生存力。细胞生存力使用WST-1试剂(购自Takara)、MTT试剂(购自Sigma)、CellTiter-Glo试剂(购自Promega)或alamarBlue试剂(购自ThermoFisher Scientific)用微板阅读仪(购自MolecularDevices)进行测量。
使用未用外排体处理的在常规细胞培养基中培养的细胞作为对照。确定，本发明的外排体在该测试中使用的浓度范围内没有表现出细胞毒性(图18)。
实施例5：使用巨噬细胞系的炎性应答测量
将RAW 264.7细胞悬浮于含10％FBS的DMEM培养基中，并接种到多孔板的每个孔中，产生80％至90％汇合。第二天，将细胞用经在含有LPS的新鲜无血清培养基中稀释的合适浓度的本发明外排体(在实施例2中制备的外排体)进行处理，并与之一起培养1至24小时。培养完成之后，收集培养上清液，并测量培养基中存在的NO以检测炎性应答。使用NO检测试剂盒(购自Intronbio或Promega)测量培养基中的炎性应答。作为阳性对照，用地塞米松(购自Sigma)处理细胞。
如图7中所示，确定当在存在LPS时用本发明外排体处理小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞时，NO产生、LPS诱导的炎性应答以浓度依赖性方式降低。该结果表明，本发明的外排体具有可用于预防、改善、减轻或治疗皮炎的功能活性，即降低LPS诱导的炎性应答的活性，并且本发明的外排体可用作用于预防、改善、减轻或治疗皮炎的组合物中的活性成分。
实施例6：分离方法之间NO形成降低作用的比较
为了在分离方法之间比较外排体的NO形成降低作用，除了通过根据本发明一个实施方案的TFF分离和纯化获得的外排体之外，还制备了通过常规沉淀法分离的外排体。沉淀法根据制造商(System Biosciences)的方案进行。经确定，与通过本发明一个实施方案的TFF方法分离和纯化的外排体(参见图8B)相比，通过常规沉淀法分离的外排体(参见图8A)具有较低的颗粒尺寸分布均一性和多种颗粒尺寸。此外，如图8C中所示，确定通过本发明一个实施方案的TFF方法分离和纯化的外排体比通过常规沉淀法获得的外排体以明显更高的水平抑制NO形成。这些结果表明，在颗粒尺寸分布均一性和对NO形成的抑制方面，根据本发明一个实施方案分离和纯化的外排体优于根据常规方法分离的外排体。
因此，根据本发明一个实施方案的分离方法获得的外排体具有优异的性能或功能活性(例如，颗粒尺寸分布均一性、对NO产生的抑制、炎性应答的降低等)，并且在预防、改善、减轻或治疗皮炎的效果方面，包含如上所述具有优异功能活性的干细胞来源外排体作为活性成分的本发明组合物优于常规技术。
实施例7：皮炎诱导动物模型1
购买雄性NC/Nga小鼠(16至18g，5周龄；购自Central Laboratory Animal Inc.)，使其适应7天，并随后用于该实验。在适应的小鼠中诱导皮炎之后，将小鼠分成如下五组。
(1)正常：正常对照组；
(2)载剂(皮炎诱导组)：阴性对照组，其中皮炎由屋尘螨提取物诱导；
(3)IV：测试组，其中在由屋尘螨提取物诱导皮炎之后，以2.8μg/头的剂量静脉内(intravenously，IV)注射在实施例2中制备的外排体，一周3次，持续2周；
(4)SC：测试组，其中在由屋尘螨提取物诱导皮炎之后，以2.8μg/头的剂量皮下(subcutaneously，SC)注射在实施例2中制备的外排体，一周3次，持续2周；以及
(5)Pred：测试组，其中在由屋尘螨提取物诱导皮炎之后，每天经口施用泼尼松龙(prednisolone)。
用剃刀剃每个NC/Nga小鼠(购自Central Laboratory Animal Inc.)的耳廓，并随后通过施加适量的脱毛剂对其进行脱毛。在擦拭掉脱毛剂之后，通过微量移液管尖端向耳廓均匀地施加AD诱导剂(屋尘螨提取物；购自BioStir Inc.)。在用剃刀剃毛之后，如果有必要的话，通过微量移液管尖端向耳廓均匀地施加150μL的4％SDS水溶液。在用来自烘干机的冷空气使耳廓干燥并进一步自然干燥约2至3小时之后，通过微量移液管尖端向耳廓均匀地施加AD诱导剂。所有预处理一周进行两次，持续3周，即总共六次。
在开始施用在实施例2中制备的外排体之前，进行临床皮肤评分评估。根据排名评分，将动物随机分组，以使得每组的平均评分尽可能均匀地分布。
图9A描绘了特应性诱导小鼠(未处理)的照片和显示根据本发明一个实施方案通过外排体处理(IV和SC)减轻特应性症状的照片。图9B是显示测试组(2)至(5)中每一个的特应性临床评分的图，并且如其中所示，确定用根据本发明一个实施方案的外排体处理的组的特应性临床评分得到改善。此外，图9C是显示与正常组(1)的耳厚度相比的在测试组(2)至(5)中每一个中测量的耳厚度的相对变化的图，并且如其中所示，确定用根据本发明一个实施方案的外排体处理的组的耳厚度降低。
综合来说，通过实验确定了在用本发明外排体处理的组(IV和SC二者)中皮肤临床评分和耳厚度降低。
实施例8：皮炎诱导动物模型2
为了评价外排体的剂量依赖性作用，如以上实施例7中所述，在诱导皮炎之后，将小鼠分成如下9组。
(1)正常：正常对照组(在图11中由“N”表示)；
(2)对照(皮炎诱导组)：阴性对照组，其中皮炎由屋尘螨提取物诱导(在图11中由“C”表示)；
(3)IV，L(外排体，低)：测试组，其中在由屋尘螨提取物诱导皮炎之后，以0.14μg/头的剂量静脉内(IV)注射在以上实施例2中制备的外排体，一周3次，持续4周；
(4)IV，M(外排体，中等)：测试组，其中在由屋尘螨提取物诱导皮炎之后，以1.4μg/头的剂量静脉内(IV)注射在以上实施例2中制备的外排体，一周3次，持续4周；
(5)IV，H(外排体，高)：测试组，其中在由屋尘螨提取物诱导皮炎之后，以10μg/头的剂量静脉内(IV)注射在以上实施例2中制备的外排体，一周3次，持续4周；
(6)SC，L(外排体，低)：测试组，其中在由屋尘螨提取物诱导皮炎之后，以0.14μg/头的剂量皮下(SC)注射在以上实施例2中制备的外排体，一周3次，持续4周；
(7)SC，M(外排体，中等)：测试组，其中在由屋尘螨提取物诱导皮炎之后，以1.4μg/头的剂量皮下(SC)注射在以上实施例2中制备的外排体，一周3次，持续4周；
(8)SC，H(外排体，高)：测试组，其中在由屋尘螨提取物诱导皮炎之后，以10μg/头的剂量皮下(SC)注射在以上实施例2中制备的外排体，一周3次，持续4周；以及
(9)Pred：测试组，其中在由屋尘螨提取物诱导皮炎之后，每天经口施用泼尼松龙(在图11中由“P”表示)。
如实施例7中所述进行皮炎诱导，并施加过量的AD诱导剂以使得在施用外排体时平均临床皮肤评分为9。在开始施用在实施例2中制备的外排体之前，进行临床皮肤评分评估。根据排名评分，将动物随机分组以使得每组的平均评分尽可能均匀地分布。
从图11的顶部的第一行和第二行是特应性诱导小鼠的照片(第0天)以及显示通过用根据本发明一个实施方案的外排体进行处理以剂量依赖性方式减轻特应性症状的照片(第28天)。图12A是显示测试组(2)至(9)中每一个的特应性临床评分的相对改善的图，并且如其中所示，确定用根据本发明一个实施方案的外排体处理的组(IV和SC)的特应性临床评分以剂量依赖性方式得到改善。
从图11的顶部的第三行和第四行示出了用H&E和甲苯胺蓝对耳皮肤组织切片进行染色的结果。用H&E对每只安乐死小鼠的耳皮肤组织进行染色，并随后测量耳皮肤组织的厚度。图12B是显示与正常组(1)的耳皮肤组织厚度相比在测试组(2)至(9)中每一个中测量的耳皮肤组织厚度的图，并且如其中所示，确定在用根据本发明一个实施方案的外排体处理的组(IV和SC)中，耳皮肤组织的厚度以剂量依赖性方式降低。此外，用甲苯胺蓝对每只安乐死小鼠的耳皮肤组织进行染色，并随后测量肥大细胞(一种炎性细胞)的浸润。图12C是显示与正常组(1)中肥大细胞数目相比在测试组(2)至(9)中每一个中测量的肥大细胞数目的图，并且如其中所示，确定在用根据本发明一个实施方案的外排体处理的组(IV和SC)中，肥大细胞的浸润以剂量依赖性方式降低。
从图11的顶部的第五行和第六行示出了对每只安乐死小鼠的耳皮肤组织进行用抗CD86抗体和抗CD206抗体的免疫组织化学染色的结果。已知，大量存在于皮炎病灶中而在正常皮肤中未发现的炎性树突状表皮细胞(inflammatory dendritic epidermal cell，IDEC)在其表面上展示CD86抗原和CD206抗原(J Invest Dermatol.2002；118：327-334；Arch Dermatol Res.2001；293：448-454)。因此，通过测量特应性皮炎病灶中CD86+细胞和CD206+细胞的数目，可确定皮炎症状改善的程度。
对每只安乐死小鼠的耳皮肤组织切片进行用抗CD86抗体和抗CD206抗体(Abcam，Cambridge，MA)的免疫组织化学染色，并随后对CD86+细胞的数目和CD206+细胞的数目进行计数。图12D和12E是显示与正常组(1)中CD86+细胞和CD206+细胞的数目相比在测试组(2)至(9)中每一个中测量的CD86+细胞和CD206+细胞的数目的图，并且如其中所示，确定在用根据本发明一个实施方案的外排体处理的组(IV和SC)中，CD86+细胞数目和CD206+数目以剂量依赖性方式降低。这些结果表明，特应性皮炎病灶中炎性树突状表皮细胞的浸润降低，并且皮炎症状得到了减轻或改善。
综合来说，通过实验确定了在用本发明外排体处理的组(IV和SC二者)中，皮肤临床评分、耳皮肤组织厚度、肥大细胞浸润和炎性树突状表皮细胞浸润以剂量依赖性方式降低。
实施例9：细胞因子的mRNA表达水平的测量
由通过对每只安乐死小鼠的皮肤病变组织进行研磨而获得的总RNA制备cDNA，并使用实时PCR方法测量为皮炎主要病因的多种炎性细胞因子的mRNA表达水平的变化。使用GAPDH基因作为用于使IL-4、IL-31、IL-23和TNF-α基因归一化的参照基因。在实时PCR中使用的引物的序列示于下表1中。
表1：在实时PCR中使用的引物的核苷酸序列
通过对以上动物模型1进行的实验，确定了在用本发明外排体处理的组(IV和SC二者)中，引起皮炎的炎症相关细胞因子IL-4和IL-31的mRNA表达水平降低(图10A和10B)。此外，通过对以上动物模型2进行的实验，确定了在用本发明外排体处理的组(IV和SC二者)中，引起皮炎的多种炎症相关细胞因子(即IL-4、IL-31、TNF-α和IL-23)的mRNA表达水平以剂量依赖性方式降低(图13A至13D)。
与对照和经泼尼松龙处理的组相比，用本发明外排体处理的组以剂量依赖性方式降低IL-4、IL-31、TNF-α和IL-23的mRNA表达水平，并且这些炎症相关细胞因子是皮炎相关治疗剂开发的主要靶标。这些多种靶标的表达水平的降低与皮炎的抑制和减轻有关。IL-4启动同种型类别转换为IgE并活化嗜酸性粒细胞。此外，已知IL-31影响同种型类别转换为IgE并将炎性细胞募集到皮肤中，并且提高的IL-31与皮炎的严重性相关。已知，IL-23诱导ThO型T细胞分化成产生TNF-α的致病性辅助性T细胞，并且TNF-α的高血浆浓度与皮炎的严重性相关。综合考虑这些方面，认为本发明的外排体通过抑制为皮炎的主要病因的多种细胞因子的表达来调节炎性应答。
因此，本发明的外排体能够作用于引起皮炎的多种炎性细胞因子(即IL-4、IL-31、IL-23和TNF-α)，并且因此被广泛地应用于由多种因素引起的皮炎且有效地抑制和减轻皮炎。
实施例10：血液测定
从每只安乐死小鼠的血液中分离血浆，并使用ELISA试剂盒测量血液中免疫球蛋白E(IgE)的浓度。通过实验，确定了在用实施例2中制备的外排体处理的组中，血液IgE水平以依赖于外排体剂量的方式降低(图14A)。
此外，使用每只安乐死小鼠的全血，对血细胞的数目进行计数。使用Cytospin(购自ThermoFisher Scientific)将预定量的全血细胞以1,000rpm离心10分钟，并随后进行玻片干燥，然后进行Diff-Quik染色。测量白细胞的数目和嗜酸性粒细胞的数目。通过实验，确定了在用实施例2中制备的外排体处理的组中，白细胞的数目和嗜酸性粒细胞的数目以依赖于外排体剂量的方式降低(图14B和14C)。
从上述结果可以看出，本发明的组合物降低了血液中引起皮炎的炎性应答因子IgE的水平，并且还降低了血液中白细胞的数目和嗜酸性粒细胞的数目。此外，本发明的组合物降低了多种炎性细胞因子和炎症相关因子的产生，并且抑制了炎症相关免疫细胞的活性或参与。因此，本发明的组合物可用作用于预防、改善、减轻或治疗皮炎的药物组合物、皮肤外用制剂和化妆品组合物。
实施例11：对于外排体的皮肤渗透能力的测试
为了制备经荧光染色的外排体，使用了PKH67染料(购自Sigma)。将1mM PKH67在稀释剂C(购自Sigma)中进行稀释以制备10μM的PKH67溶液。将该溶液与合适浓度的外排体溶液混合，并允许在室温下在遮光条件下反应10分钟。反应完成之后，使用MW3000离心柱(购自ThermoFisher Scientific)以从经PKH67染色的外排体(在下文中简称为“PKH-外排体”)中去除剩余的游离PKH67染料。在去除未与外排体反应的PKH67之后，使用荧光计(购自Molecular Devices)进行分析，并且作为结果，确认了在PKH-外排体中检测到具有足够强度的荧光(图15)。
将PKH-外排体以合适的浓度，例如1×105个颗粒/mL至1×109个颗粒/mL的浓度分散在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，并施加至猪皮肤的外表面。用非织造织物覆盖猪皮肤以防止PKH-外排体溶液变干，并随后允许PKH-外排体与皮肤组织反应合适的时间，例如30分钟至1小时，以使得PKH-外排体到达猪皮肤的皮下组织。反应完成之后，将猪皮肤组织在3.7％甲醛溶液中固定过夜，并用PBS洗涤3次，每次持续5分钟。将洗过的猪皮肤组织浸泡在30％蔗糖溶液中，并随后用OCT化合物进行处理。接下来，将组织用PBS洗涤3次，每次持续5分钟，并随后使用切片机进行切片。将组织切片放置在载玻片上。同时，可在将组织用甲醛溶液固定之前进行组织切片的制备。使用荧光显微镜观察到组织切片中从PKH-外排体检测到的荧光。作为结果，确认了PKH-外排体递送通过猪皮肤组织的表皮到皮下组织中(图16)。如图16中所示，本发明的外排体可有效地渗透通过皮肤屏障，以使得其可被深入地递送到皮肤组织中并被有效地吸收到皮肤中。因此，包含外排体作为活性成分的皮肤外用制剂或化妆品组合物将有效地在预防、改善、减轻或治疗皮炎中发挥作用。
接下来，解剖无毛小鼠的皮肤组织并将其放置在Franz扩散池的上室中。扩散池的内部填充有PBS。将PKH-外排体以合适的浓度，例如1×105个颗粒/mL至1×109个颗粒/mL的浓度分散在PBS中，并随后施加至小鼠皮肤组织的外表面。此时，为了防止PKH-外排体溶液变干，将非织造织物预先放置在小鼠皮肤组织的外表面上，并将PKH-外排体溶液注射在非织造织物与皮肤组织之间。然后，允许PKH-外排体与皮肤组织反应30分钟至1小时。反应完成之后，立即用共聚焦荧光显微镜(Leica，SP8X)观察递送到皮肤组织中的PKH-外排体，或者允许皮肤组织与PKH-外排体溶液再反应1至6小时，并随后用共聚焦荧光显微镜观察PKH-外排体。作为结果，确认了本发明的外排体能够有效地渗透通过皮肤屏障，以使得本发明的外排体能够被深入地递送到皮肤组织中并被有效地吸收到皮肤中(图17)。
因此，包含外排体作为活性成分的皮肤外用制剂或化妆品组合物将有效地在预防、改善、减轻或治疗皮炎中发挥作用。
实施例12：用包含外排体作为活性成分的组合物对人皮肤进行的处理
将包含根据本发明一个实施方案的分离方法获得的外排体的组合物(即包含外排体的混悬剂)施加至三名严重特应性患者的受影响部分(手、颈、臂等)，一周3次，持续1至2周，并随后使用离子透入装置进行离子透入从而允许微电流流过施加有组合物的受影响部分。作为结果，患者中的严重瘙痒显著减轻，并且患者中的皮炎相关红斑症状也显著改善(图19)。在已施加有包含本发明外排体的组合物的患者中，严重瘙痒和皮炎相关红斑症状得到减轻和改善，因此可停止这些患者的类固醇或抗组胺药的处方。
因此，可以看出，包含通过根据本发明一个实施方案的分离方法获得的外排体作为活性成分的皮肤外用制剂或化妆品组合物表现出预防、改善、减轻或治疗皮炎的作用，如通过上述临床测试所确认的。
实施例13：用包含外排体作为活性成分的组合物对犬进行的处理
对患有天然严重特应性皮炎的喜乐蒂牧羊犬(体重：13kg；9岁)进行实验。将包含根据本发明一个实施方案的分离方法获得的外排体(实施例2中制备的外排体)的组合物皮下注射到患有天然严重特应性皮炎的喜乐蒂牧羊犬中，共12次，持续5周。在一次注射中，以117μg/头的剂量注射在实施例2中制备的外排体。在第1和2周，一周3次地皮下注射组合物，并且在第3、4和5周，一周2次地皮下注射组合物。此外，在施用本发明外排体之后，停止其他药物的施用。
图20A描绘了在施用本发明外排体之前受影响部分的照片，并且如在其中可见的，腹部中的红斑和炎症是严重的。可以看出，从施用本发明外排体之后3天起，皮炎症状明显改善(图20B)，并且在施用之后10天时(图20C)和在施用之后2周时(图20D)，皮炎几乎消失。此外，在施用本发明外排体之后，受试喜乐蒂牧羊犬的活力明显提高，并且其体重增加至16kg。认为活力提高和体重增加是由于皮炎症状的改善。
为了确认本发明外排体的皮炎治疗作用是否持续，在本发明外排体的施用结束之后，连续观察受试喜乐蒂牧羊犬的受影响部分。作为结果，可确认，即使在施用结束之后50天(图20E)和93天(图20F)时，仍然维持改善皮炎的作用。
因此，如通过上述对犬进行的动物测试所确认的，包含根据本发明一个实施方案的分离方法获得的外排体作为活性成分的组合物可有效地减轻或改善皮炎，并且其皮炎治疗作用可持续。
实施例14：包含本发明外排体的化妆品组合物的制备
将1704μg/mL的在以上实施例2中制备的外排体与下表2中所示的组分混合并悬浮在其中，从而制备化妆品组合物(化妆水)。每种组分的含量示于下表2中。
表2：包含本发明外排体的化妆水的组分及其含量
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尽管已参照一些实施方案描述了本发明，但是本发明的范围不限于这些实施方案。本领域的任何技术人员将理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可进行多种修改和改变，并且这些修改和改变也落入本发明的范围内。

Claims (29)

1.作为活性成分的来源于脂肪来源干细胞的外排体在制备用于预防、改善、减轻或治疗由IL-4介导的特应性皮炎的药物组合物中的用途，其中所述外排体分离自所述脂肪来源干细胞的条件培养基，其中通过切向流过滤(TFF)从所述条件培养基中分离外排体，并且其中使用0.05μm过滤器或者截留分子量(MWCO)为100,000Da、300,000Da、500,000Da或750,000Da的TFF过滤器进行所述TFF。
2.权利要求1所述的用途，其中所述外排体通过进行以下步骤获得：(a)向所述脂肪来源干细胞的条件培养基添加海藻糖；(b)过滤其中已添加有海藻糖的所述条件培养基；(c)通过切向流过滤(TFF)从经过滤的条件培养基中分离外排体；以及(d)向用于渗滤的缓冲液添加海藻糖，并使用其中已添加有海藻糖的所述缓冲液通过TFF对分离的外排体进行渗滤。
3.权利要求2所述的用途，其中所述渗滤是连续或不连续进行的。
4.权利要求2所述的用途，其中所述渗滤是使用体积为所分离的外排体至少4倍的缓冲液进行的。
5.权利要求2所述的用途，其中步骤(c)还包括通过所述TFF将所分离的外排体浓缩至1/100至1/25的体积。
6.权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述外排体降低皮肤组织或皮肤细胞中IL-4和IL-31的表达水平。
7.权利要求6所述的用途，其中所述外排体另外降低皮肤组织或皮肤细胞中选自IL-23和TNF-α的至少一种的表达水平。
8.权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述外排体降低血液中IgE的水平以及血液中白细胞和嗜酸性粒细胞的数目。
9.权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述外排体降低皮肤组织中肥大细胞、CD86+细胞和CD206+细胞的数目。
10.作为活性成分的来源于脂肪来源干细胞的外排体在制备用于预防、改善、减轻或治疗由IL-4介导的特应性皮炎的皮肤外用制剂中的用途，其中所述外排体分离自所述脂肪来源干细胞的条件培养基，其中通过切向流过滤(TFF)从所述条件培养基中分离外排体，并且其中使用0.05μm过滤器或者截留分子量(MWCO)为100,000Da、300,000Da、500,000Da或750,000Da的TFF过滤器进行所述TFF。
11.权利要求10所述的用途，其中所述外排体包含在以下中的至少一种中或与以下中的至少一种混合：水凝胶、透明质酸和透明质酸的盐。
12.权利要求10所述的用途，其中所述外排体包含在透明质酸凝胶中或与透明质酸凝胶混合。
13.权利要求11所述的用途，其中所述水凝胶通过将胶凝聚合物分散在多元醇中来获得。
14.权利要求13所述的用途，其中所述胶凝聚合物是选自以下的至少一种：普朗尼克、纯化琼脂、琼脂糖、结冷胶、藻酸、卡拉胶、肉桂胶、黄原胶、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖、果胶、纤维素、瓜尔胶和槐豆胶，并且所述多元醇是选自以下的至少一种：乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇、异丁二醇、二丙二醇、山梨糖醇、木糖醇和甘油。
15.作为活性成分的来源于脂肪来源干细胞的外排体在制备用于预防、改善或减轻由IL-4介导的特应性皮炎的化妆品组合物中的用途，其中所述外排体分离自所述脂肪来源干细胞的条件培养基，其中通过切向流过滤(TFF)从所述条件培养基中分离外排体，并且其中使用0.05μm过滤器或者截留分子量(MWCO)为100,000Da、300,000Da、500,000Da或750,000Da的TFF过滤器进行所述TFF。
16.权利要求15所述的用途，其中所述化妆品组合物以选自以下的至少一种形式使用：贴片、霜、软膏、混悬液、乳液、糊剂、化妆水、凝胶剂、油剂、剥撕式面膜、雾剂、粉和油纸。
17.权利要求15所述的用途，其中所述化妆品组合物作为片装面膜使用。
18.权利要求15所述的用途，其中所述化妆品组合物作为面膜巾使用。
19.权利要求15所述的用途，其中所述化妆品组合物作为活肤水使用。
20.权利要求15所述的用途，其中所述化妆品组合物作为喷雾剂使用。
21.权利要求15所述的用途，其中所述化妆品组合物作为气雾剂使用。
22.权利要求15所述的用途，其中所述化妆品组合物作为粉底使用。
23.权利要求16所述的用途，其中所述化妆品组合物被施加至所述贴片的至少一个表面或浸在所述贴片的至少一个表面中。
24.权利要求17所述的用途，其中所述化妆品组合物被施加至所述片装面膜的至少一个表面或浸在所述片装面膜的至少一个表面中。
25.权利要求18所述的用途，其中所述化妆品组合物被施加至所述面膜巾的至少一个表面或浸在所述面膜巾的至少一个表面中。
26.化妆品组合物在制备用于减轻由IL-4介导的特应性皮炎引起的皮肤红斑症状的美容方法的化妆品产品中的用途，所述美容方法包括：(a)直接将化妆品组合物施加至所述哺乳动物皮肤；或者(b)使贴片、片装面膜或面膜巾与所述哺乳动物皮肤接触或附着至所述哺乳动物皮肤，所述贴片、片装面膜或面膜巾具有已向其施加的或浸在其中的所述化妆品组合物；或者依次进行(a)和(b)，其中所述化妆品组合物包含作为活性成分的来源于脂肪来源干细胞的外排体，其分离自所述脂肪来源干细胞的条件培养基，其中通过切向流过滤(TFF)从所述条件培养基中分离外排体，并且其中使用0.05μm过滤器或者截留分子量(MWCO)为100,000Da、300,000Da、500,000Da或750,000Da的TFF过滤器进行所述TFF。
27.权利要求26所述的用途，所述方法还包括：(c)通过允许微电流流过已施加有所述化妆品组合物的所述哺乳动物皮肤来进行离子透入。
28.权利要求27所述的用途，所述方法还包括使离子透入装置与所述哺乳动物皮肤接触或附着至所述哺乳动物皮肤。
29.权利要求28所述的用途，其中所述离子透入装置包含选自以下的至少一种电池：柔性电池、锂离子二次电池、碱性电池、干电池、汞电池、锂电池、镍-镉电池和反向电渗析电池，或者包含设置有所述至少一种电池的贴片、片装面膜或面膜巾。
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