KR20140076198A

KR20140076198A - 성체줄기세포 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20140076198A
Application number: KR1020120144498A
Authority: KR
Inventors: 강수경
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2012-12-12
Filing date: 2012-12-12
Publication date: 2014-06-20

Abstract

본 발명은 지방조직유래줄기세포 추출물을 유효성분으로 하는 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로써, 구체적으로, 본 발명의 성체줄기세포 추출물은 병소 표피의 염증성 인자를 감소시키고 면역조절인자는 증가를 시킴으로써 염증 진정효과를 보이며, 아토피성 피부염에 관한 임상지표를 개선하므로 아토피성 피부염 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

성체줄기세포 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Composition for treating or preventing atopic dermatitis comprising adult stem cells extracts}

본 발명은 성체줄기세포의 추출물을 유효성분으로 함유하는, 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

아토피성 피부염은 표피 장벽 기능의 장애의 특징을 나타내는 염증성 피부질환이고 염증 반응 및 각질세포(keratinocyte)의 자가세포사(apoptosis)가 만성적으로 재발하는 것이 일반적이다. T-헬퍼 2형(Th2) 사이토카인 인터루킨-4(IL-4), IL-5, IL-6 및 IL-13는 아토피성 질환의 일반적인 마커인 체액성 면역(humoral immunity) 및 면역글로블린 E(IgE) 생성을 제공한다. 최근 알레르기 임상 연구는 낮은 수준의 알레르기 항원에 대해 반응하는 IgE 항체를 생산하는 개인 또는 가족성 경향을 나타낸다. IgE와 함께, 아토피성 질환 가능성을 진단하는 기준의 하나인 호산구(eosinophils)를 포함하는 매우 끈적한 점막성 물질의 분비물이 있는 것이다. Wright et al.은 IL-5의 발현 증가 및 IL-4, IL-6와 종양 괴사 인자-α(TNF-α)와 같은 알레르기 매개체가 유의한 증가를 포함하는 호산구의 증가가 알레르기를 갖는 개체의 특징인 것을 제안했다. Sobol et al.은 호산구, 마스트 세포, 호염기구(basophils), IL-4, IL-5, 호산구성 양이온 단백질의 증가를 포함하고, 상당히 높은 비율의 T-림프구를 포함하는 아토피성 마커를 제안했다. 최근 연구에 있어서 인돌라민 2,3-디옥시게네이즈(indoleamine 2, 3-dioxygenase;IDO) 경로가 알레르기 염증반응의 조절에 기여하는 것 또한 보고되었다. 발병한 아토피성 피부에 있어서 T 헬퍼 세포 유형, IL-2, 인터페론-γ(IFN-γ)와 TNF-α의 발현이 증가가 관찰되었다. 만성 인간 아토피성 피부염 부위에서 IL-4, IL-13, IL-5, IFN-γ 및 IL-12의 발현 또한 관찰되었다. 이러한 발현 중에, IL-12는 T 헬퍼 1형(Th1)의 분화 인자이다. 뚜렷한 톨 라이크 수용체(Toll Like Receptors;TLRs)와 함께 IDO 경로는 다른 면역활성 경로와는 보완적이고 알레르기성 염증반응 및 다른 질환을 포함하는 자가면역질환 극복 활성에 도움이 된다. 그러나, 활성화(regulatory) T-세포의 유도는 알레르기성 염증반응을 조절하는 주요 인자다. 높은 친화력을 지닌 IgE 수용체를 통한 신호전달은 Fc￡R1는 IgE가 매개하는 알레르기 반응의 구성요소이다. 피부와 특이적 물질(알레르기 항원)사이의 접촉은 피부상 염증반응의 다양한 형태 패턴의 결과로 피부에 과민반응성 반응을 유발한다. 니켈 특이적 CD4 + T-세포는 피부 아토피에 IL-17을 생산할 수 있다. IL-17 결함 마우스에서 염증성 세포의 침윤이 유의하게 감소했고 헵튼(hapten)-처리 귀에 감소 호중구 침윤을 포함한 케모카인(chemokine) 및 ICAM-1의 수준이 감소했다. 한편, Th1 특성을 지닌 사이토카인 IFN-γ는 아토피성 피부염 환자의 피부에 지배적이다. 피부 감염에 동반된 IFN-γ 또는 다른 사이토카인의 발현 증가는 아토피성 질환(AD)이 있는 환자의 병변에서 각질세포의 자가세포사와 연관된 질병을 유발한다. 각질세포의 자가세포사로 인한 사멸은 리간드에 의해 활성화된 세포사멸 수용체를 통해 매개된다. 아토피성 각질세포 세포 사멸 신호 리간드 일부는 종양괴사인자-α(TNF-α) 및 TNF-α 수용체, TNF-α와 관련된 자가세포사 유도 리간드(TRAIL)1 및 2, 섬유 아세포 성장 인자 유도하는 14 및 TNF 수용체 superfamily member 6 (FAS)이다. 최근 Ana Rebane et al.는 IFN-γ 가 각질세포에 세포 사멸 수용 및 리간드의 발현에 영향을 준다고 보고했다. 이 연구 결과에 일치함에 있어서, NOD2, DUSP1 및 ADM은 인간 각질세포의 IFN-γ에 의해서 활성화되는 것으로 나타났다. 사실은, IFN-γ로 유도된 각질세포의 자가세포사는 아토피성 피부염 환자들에게 아토피성 피부로 발달하는 습진성 병변부위에 영향을 미친다.

한편, 아토피성 피부염은 재발되기 쉬운 만성 피부질환으로서, 유전적 소인, 환경적 원인, 면역학적 원인, 피부장벽 기능 이상 등의 내, 외부의 여러 요인이 복합적으로 관여하여 발생하는 질환으로 생각되고 있으며, 2차적으로 나타나는 증상으로 세균의 침입, 정신적 스트레스 등이 나타난다. 주요 원인으로 환경공해로 인한 알레르기 물질 증가 등이 아토피 피부염과 밀접한 관련이 있는 것으로 추정된다고 보고되고 있으나, 아직 구체적인 원인은 밝혀져 있지 않다. 현재 아토피성 피부염 치료를 위하여 사용되는 치료제들로는 국소 스테로이드제, 면역억제제, 항히스타민제, 그리고 세균감염을 예방하기 위해 항생제 연고 등이 사용되고 있으나, 이들 약물들의 사용으로 인한 다양한 부작용이 보고되고 있을 뿐만 아니라, 아토피성 피부염에 대한 근본적인 치료제는 아니므로 이들을 병소에 지속적으로 적용하기가 곤란하다.

한편, 최근 발표된 연구 결과들에 따르면, 줄기세포가 피부 조직의 재생을 촉진하며, 이는 줄기세포에서 분비되는 복합단백질(protein complex)에 의한 작용 (paracrine effect)이라 보고되고 있다(Pankaj K.M. J. Cardiovascular Medicine, 2008). 상기 복합 단백질의 대부분은 성장인자들로 알려져 있으며, 최근 이들 성장인자들에 대한 활발한 연구가 진행되고 있다. 성장인자란 체내에 소량 존재하는 신호전달 물질들로 이러한 성장인자들은 나이가 증가함에 따라 그 체내 농도가 감소하게 되며, 체내 성장인자 농도의 감소는 노화와 밀접한 관계가 있다는 것이 밝혀진 바 있다(Waisbourd M. et al., Drungs Aging, 2007). 현재 성장인자를 외부에서 공급하여 생체의 노화를 억제하려는 다양한 연구들이 진행되고 있으며, 아울러 개별 성장인자들의 구체적인 효과에 대한 연구도 진행되고 있다. 근래의 연구 보고들에 의하면 피부 주변 줄기세포에서 분비되는 성장인자들이 상처치료, 미백, 항산화 등의 효과를 나타내는 것으로 보고되고 있다(Kim et al., J Dermatol Sci., 2007; Kim et al., J Dermatol Sci., 2008). 또한, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSC)가 면역억제 작용을 나타내는 것으로 보고되고 있으며, 이는 MSC가 마이토젠(mitogen)이나 동종 세포로 자극된 T-세포의 증식을 억제함으로써 면역반응을 억제시키는 것으로 보고되고 있다(Djouad F. et al., Blood 2003). 그러나, 아토피성 피부염이 면역반응과 관련된 알러지 뿐만 아니라, 다양한 원인에 의해 발생하므로, 특정 성장인자를 분리하여 임상에 적용할지라도 안정적인 치료 효과를 기대하기가 곤란하다. 또한, MSC의 면역억제 기능을 이용할 경우에도 세포를 직접 사용하여야 하므로 안정성 등의 문제로 통상의 방법에 의한 제제화가 곤란할 뿐만 아니라 세포의 원천(source)에 따라 다양한 개체편차를 나타내어 목적하는 치료 효과를 동일하게 나타내는 것이 여전히 곤란하다.

이에, 본 발명자들은 성체줄기세포를 이용한 피부염 치료용 조성물 개발에 노력하던 중, 개 지방유래줄기세포를 파쇄하여 수득한 추출물이 과민성 면역 반응의 효과적인 억제효과, 산화적 스트레스 및 자가세포사멸에 대한 각질세포를 효과적으로 보호효과를 나타내므로, 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 이용할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 성체줄기세포 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부염 예방 및 치료용 약학적 조성물, 피부염 예방 및 개선용 피부 외용제, 화장료 조성물 및 건강 식품을 제공하는 것이다.

상기목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 성체줄기세포 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부염 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 성체줄기세포 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부염의 예방 및 개선용 피부 외용제를 제공한다.

또한, 본 발명은 성체줄기세포 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부염 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명은 성체줄기세포 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부염 예방 및 개선용 건강식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 성체줄기세포 추출물은 병소 표피의 염증성 인자를 감소시키고 면역조절인자는 증가를 시킴으로써 염증 진정효과를 보이며, 아토피성 피부염에 관한 임상지표를 개선하므로 아토피성 피부염 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 개의 복부 지방조직유래줄기세포 추출물의 아토피성 증후군을 효과적인 개선 및 피부의 시토케라틴(cytokeratin) 보존을 나타내는 도이다.
(A) 개 복부지방조직에서 유래한 줄기세포의 5번째 계대 배양 후, 다양한 기능적인 사이토카인(cytikoine)의 발현.
(B) 개의 아토피 피부 병소에 개의 지방조직유래줄기세포 추출물 처리 후 개 피부의 형태변화를 나타낸 사진.
(C) 개의 지방조직유래줄기세포 추출물 처리 후 개의 피부에서 아토피 환자에 대한 진단 지표들의 차이.
(D) 개의 지방조직유래줄기세포 추출물 처리 후 피부 각질세포 발현을 면역조직분석을 사용해서 분석한 결과.
(E) 개의 지방조직유래줄기세포 추출물 처리 후 피부 각질세포 발현을 최적화된 다중(multiplex) PCR을 사용해서 분석한 결과;
(각질세포 머커 KRT6A : 각질세포 6A, KRT6B : 각질세포 6B 및 KRT16 : 각질세포 16).
도 2는 개의 복부 지방조직유래줄기세포 추출물의 개 아토피 피부염 피부에서 인터페론-감마(IFN-γ), 인간형질전환성장인자-베타 1(TGF-β1) 및 인터루킨-10(IL-10)의 발현에 대한 효과를 나타내는 도이다.
(A) 개의 지방조직유래줄기세포 추출물을 하루에 한번 3일간 개의 피부의 아토피 병소에 처리 후, CD3+, CD4+ 및 CD8+ 면역세포 발현의 차이.
(B) 개의 지방조직유래줄기세포 추출물을 하루에 한번 3일간 개의 피부의 아토피 병소에 처리 후, IFN-γ의 발현의 차이.
(C) 개의 지방조직유래줄기세포 추출물을 하루에 한번 3일간 개의 피부의 아토피 병소에 처리 후, TGF-β1의 발현의 차이.
(D) 개의 지방조직유래줄기세포 추출물을 하루에 한번 3일간 개의 피부의 아토피 병소에 처리 후, IL-10의 발현의 차이.
도 3은 대식세포 및 미세아교세포적(microglial) 불활성에 있어서 개의 지방조직유래줄기세포 추출물의 분자적 기능 및 염증반응 인자 발현의 억제를 나타내는 도이다.
(A) 개의 지방조직유래줄기세포 추출물의 대식세포 및 미세아교세포(microglial)의 침윤 또는 증식에 관한 유전자 발현에 대한 억제효과.
(B) 개의 지방조직유래줄기세포 추출물의 대식세포 및 미세아교세포(microglial)의 침윤 또는 증식에 대한 억제효과를 단백질 수준에서 분석한 결과.
(C) 개의 지방조직유래줄기세포 추출물의 아토피 피부염 피부에서 염증성 인자 및 TGF-β1의 발현의 차이.
(D) 개의 지방조직유래줄기세포 추출물의 개 아토피 피부에서 염증반응 사이토카인 발현에 대한 억제효과를 전사적 수준에서 분석한 결과.
(E) 개의 지방조직유래줄기세포 추출물의 개 아토피 피부에서 염증반응 사이토카인 발현에 대한 억제효과를 단백질 수준에서 분석한 결과.
(F) 개의 지방조직유래줄기세포 추출물의 개 아토피 피부에서 STAT3 및 ERK 1/2의 인산화에 대한 효과를 단백질 수준에서 분석한 결과.
도 4는 개의 지방조직유래줄기세포 추출물의 개 아토피 피부에서 핵 전사인자 카파-B(NF-kappa-B)에 대한 효과를 나타내는 도이다.
(A) 개의 지방조직유래줄기세포 추출물의 개 아토피 피부에서 핵 전사인자 카파-B(NF-kappa-B)에 작용하는 IκB 키나제 (IKK)에 대한 발현율의 시간별 효과.
(B) 개의 지방조직유래줄기세포 추출물의 개 아토피 피부에서 핵 전사인자 카파-B(NF-kappa-B)를 구성하고 있는 하부 구조에 대한 발현율의 시간별 효과.
도 5는 개의 아토피성 피부염이 유도한 각질세포의 자가세포사멸을 하는 동안 ROS-매개한 p38/JNK 활성을 나타내는 도이다.
(A) 개의 지방조직유래줄기세포 추출물의 개 아토피 피부에서 산화 화원 스케빈저(redox scavenger) 유전자들에 발현율에 대한 효과.
(B) 개의 지방조직유래줄기세포 추출물의 개 아토피 피부에서 p38/JNK의 인산화에 대한 효과.
(C) 개의 지방조직유래줄기세포 추출물의 개 아토피 피부에서 ROS-매개한 반응에 대한 각질세포 보호효과.
(D) 개의 지방조직유래줄기세포 추출물의 개 아토피 피부에서 ROS-매개한 반응에 대한 각질세포 보호효과.
도 6은 개의 지방조직유래줄기세포 추출물의 아토피성 피부염 치료에 있어서 IL-10 및 TGF-β1의 기능을 나타내는 도이다.
(A) 아토피성 피부염 치료에 있어서 항-인터루킨-10(anti-IL-10), 항-인간형질전환성장인자-베타 1(anti-TGF-β1)과 개의 지방조직유래줄기세포 추출물을 혼합 사용했을 때 개 피부의 형태변화를 나타낸 사진.
(B) 아토피성 피부염 치료에 있어서 anti-IL-10, anti-TGF-β1과 개의 지방조직유래줄기세포 추출물을 혼합 사용했을 때 개의 피부에서 아토피 환자에 대한 진단 지표들의 차이.
도 7은 개의 지방조직유래줄기세포 추출물이 아토피성 피부염 치료를 하는 동안 anti-IL-10 및 anti-TGF-β1 발현의 조절 및 분자적 기능을 나타내는 도이다.
(A) anti-IL-10, anti-TGF-β1과 개의 지방조직유래줄기세포 추출물을 혼합 사용했을 때 아토피성 피부염 치료를 하는 동안 IL-10 및 TGF-β1 발현의 조절에 대한 효과.
(B) anti-IL-10, anti-TGF-β1과 개의 지방조직유래줄기세포 추출물을 혼합 사용했을 때 아토피성 피부염 치료를 하는 동안 인터페론-감마(IFN-γ) 및 활성화 세포 마커 ED1의 발현의 조절에 대한 효과.
도 8은 anti-IL-10, anti-TGF-β1과 개의 지방조직유래줄기세포 추출물을 혼합 사용했을 때 아토피성 피부염 치료를 하는 동안 염증반응 사이토카인 발현에 대한 억제효과.
도 9는 개의 지방조직유래줄기세포 추출물이 개의 아토피성 피부염 치료를 하는 동안 IL-10 및 TGF-β1의 아토피성 피부염 피부에서 염증성 인자 발현에 관한 효과를 나타내는 도이다.
(A) 개의 지방조직유래줄기세포 추출물이 개의 아토피성 피부염 치료를 하는 동안 IL-10 및 TGF-β1의 아토피성 피부염 피부에서 염증성 인자들의 발현에 관한 효과를 단백질 수준에서 분석한 결과.
(B) 개의 지방조직유래줄기세포 추출물이 개의 아토피성 피부염 치료를 하는 동안 IL-10 및 TGF-β1의 아토피성 피부염 피부에서 염증성 인자들의 발현에 관한 효과를 단백질 수준에서 분석한 결과.
(C) 개의 지방조직유래줄기세포 추출물이 개의 아토피성 피부염 치료를 하는 동안 IL-10 및 TGF-β1의 아토피성 피부염 피부에서 핵 전사인자 카파-B(NF-kappa-B)에 작용하는 IκB 키나제 (IKK) 및 핵 전사인자 카파-B(NF-kappa-B)를 구성하고 있는 하부 구조에 발현에 대한 시간별 효과.
(D) 개의 지방조직유래줄기세포 추출물이 개의 아토피성 피부염 치료를 하는 동안 IL-10 및 TGF-β1의 아토피성 피부염 피부에서 ROS-매개한 반응에 대한 각질세포 보호효과.
도 10은 anti-IL-10, anti-TGF-β1과 개의 지방조직유래줄기세포 추출물을 혼합 사용했을 때 아토피성 피부염 치료를 하는 동안 피부 각질세포 발현을 단백질 수준에서 분석한 결과;
(각질세포 머커 KRT6A : 각질세포 6A, KRT6B : 각질세포 6B 및 KRT16 : 각질세포 16.)

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 성체줄기세포 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부염 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 성체 줄기세포는 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간의 성체 세포로부터 유래된 중복성(multipotency)을 갖는 미분화 세포를 말하며, 예를 들어, 골수, 혈액, 뇌, 피부, 지방(즉, 지방조직 또는 지방세포), 제대혈, 제대의 바르톤 젤리(Wharton's jelly), 신경, 상피 또는 피부 등의 다양한 성체 세포로부터 유래될 수 있으며, 지방조직 또는 골수 유래인 것이 보다 바람직하며, 지방조직 유래인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

상기 지방유래 줄기세포는 골수에서 추출하는 것보다 훨씬 쉽게 추출할 수 있으며, 또한, 지방유래 줄기세포의 경우 이미 많은 연구를 통해 임상에 적용 가능한 의약품으로 개발이 활발히 진행되고 있고, 대량배양 기술 등이 많이 확립이 되어있다. 또한, 골수유래 줄기세포의 경우 혈액세포로의 분화로 한정적으로 이용되어 지고 있는 것에 비해 지방유래 줄기세포의 경우 연골, 뼈, 뿐만 아니라 심장세포와 신경세포로의 분화에 더욱 유리한 것으로 알려져 있으며, 임상에도 적용하기 위해 많은 연구가 진행되고 있다.

상기 성체줄기세포 추출물은 성체줄기세포의 내부물질을 추출한 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

상기 성체줄기세포 추출물은 액체질소를 이용하여 급속동결과 해동을 반복하여 세포막을 약화시켜 파쇄하는 방법으로 제조하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

상기 성체 줄기세포 추출물은 인터루킨-10(IL-10), 인간 형질전환 성장인자-베타 1(TGF-β1)을 유효성분으로 함유하는 추출물인 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

상기 피부염은 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염(contact dermatitis), 지루성 피부염(seborrhea) 및 여드름으로 구성된 군에서 선택된 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명자들은 성체줄기세포를 얻고자 개의 피하(subdermal)에서 지방조직을 분리하였고, 얻어진 지방조직에 콜라게네이즈를 처리하고 원심분리하여서 세포 펠렛(pellet)을 얻었다. 상기 얻어진 세포 펠렛을 적혈구 용해 완충용액으로 희석해서 순수한 줄기세포 펠렛을 수득하였고, 지방조직유래줄기세포(canine adipose tissue-derived stem cells;cATSC)를 분리하였다. 상기 줄기세포는 10% FBS를 포함하는 α-MEM 배지(Gibco BRL 사, 미국)배지로 사용하여 약 37℃, 약 5% CO₂ 세포 배양기에서 24 시간 동안 배양한 후, 비접착성 세포들을 제거하여 지방 줄기세포를 단리(collected)하였다.

또한, 본 발명자들은 지방조직유래줄기세포의 분비물(secretome)의 발현을 확인하기 위하여, 상기 줄기세포를 5회 계대 배양 후, 줄기세포에서 수득한 총 RNA을 이용한 최적화된 다중 PCR (optimized multiplex PCR) 분석을 통해 확인한 결과 개의 복부지방조직에서 분리된 줄기세포는 면역조절 인자인 인터루킨-10(IL-10) 및 인간 형질전환 성장인자-베타 1(TGF-β1)이 확인이 되었고, 부가적으로, 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF) 및 내피세포 성장인자(EGF)와 같은 인자들도 확인이 되었다(도 1A 참조).

이에, 개의 지방조직유래줄기세포(canine adipose tissue-derived stem cells;cATSC)가 생산하는 면역조절 인자 및 성장인자의 발현을 탐색하였고, 보다 구체적으로는 ATSCs가 면역조절 인자인 IL-10 및 TGF-β1이 확인이 되었고, 부가적으로, bFGF 및 EGF와 같은 인자들을 생산하는 것을 확인하였고, 이는 ATSCs가 생산하는 인자들이 세포증식(proliferation), 항-염증반응/면역조절(anti-inflammatory/immunoregulatory) 및 항-자가세포사멸(anti-apoptotic)의 매개물로 유용하게 이용할 수 있다.

또한, 본 발명자들은 cATSC의 추출물의 아토피성 피부염 대한 치료효과를 확인하기 위해서, 집먼지 진드기를 알러지 항원으로 사용해서 유도한 염증성 피부염에 cATSC의 추출물을 처리하여 확인한 결과, cATSC 추출물을 처리한 급성 염증이 생긴 개의 피부의 병소 부위가 눈에 띄게 개선되는 것을 관찰하였고(도 1B 참조), 아토피성 피부염 임상 평가 지수가 유의하게 감소하는 것을 확인하였다(도 1C 참조). 그러나, 대조적으로 PBS를 사용한 음성 대조군 및 하이드로코르티손 아세포네이트(hydrocortisone aceponate;HA)를 사용한 양성대조군에서는 임상적인 개선을 확인하지 못했다.

또한, 본 발명자들은 cATSC의 추출물을 처리한 급성 염증이 생긴 개의 피부에서 각질세포(keratinocytes)의 보호 효과를 확인하기 위해서, cATSC의 추출물 처리 후, 피부 각질세포 발현율을 면역조직분석 및 최적화된 다중(multiplex) PCR을 사용해서 분석한 결과, cATSC 추출물을 처리한 급성 염증이 생긴 개의 피부의 각질세포군(KRT6A, KRT6B 및 KRT16)은 유의하게 보호되었고, 대조적으로 음성대조군(PBS 처리군) 및 양성대조군(HA 처리군)은 정상피부보다 각질세포가 오히려 감소하였다(도 1D 및 도 1E 참조).

또한, 본 발명자들은 cATSC의 추출물을 처리한 급성 염증이 생긴 개의 피부에서 각질세포 사이의 T-세포 침윤(infiltration) 및 증식(propagation)을 확인하기 위해서, 상기와 같이 처리한 개의 피부 병소부위에서 면역조직병리학적 방법을 통해 분석을 수행한 결과, 정상 피부(Normal)와 비교해 볼 때, 아토피 피부염 자체는 상피(epithelium)에 이동한 CD3+, CD4+ 및 CD8+ 면역세포의 증식을 활성하였고, 양성대조군(HA 처리군)에서는 아토피성 피부염 병소 부위에 있어서 면역세포의 군집을 증가시킨 반면에, cATSC 추출물을 처리한 피부 병소 부위에서는 효과적으로 CD3, CD4 및 CD8 세포의 이동을 조절하는 것을 확인하였다. 더 구체적으로, 양성대조군(HA 처리군)에서는 CD4 및 CD8+ 세포들의 수가 급격하게 증가된 반면에, cATSC 추출물을 처리한 피부 병소 부위에서는 CD4+ 및 CD8+ 면역세포의 수가 정상피부의 수로 평준화(mormalized) 되었음을 확인하였다(도 2A 및 표 1 참조).

또한, 본 발명자들은 cATSC의 추출물을 처리한 급성 염증이 생긴 개의 피부에서 각질세포 사이의 기능적인 면역조절인자들의 발현을 확인하기 위해서, 상기와 같이 처리한 개의 피부 병소부위에서 면역조직병리학적 방법을 통해 분석을 수행한 결과, 염증반응(inflammatory) 인자인 인터페론-감마(IFN-γ)가 cATSC의 추출물을 처리한 아토피성 피부염 병소 부위에서 효과적인 감소를 하였고, 대조적으로 음성대조군(PBS 처리군)과 양성대조군(HA 처리군)에서는 IFN-γ의 발현이 증가되는 것을 확인하였고(도 2B 참조), 면역조절(immunomodulatory)인자인 인터루킨-10(IL-10) 및 인간 형질전환 성장인자- 베타 1(TGF-β1)이 유의하게 증가되는 것을 확인하였다(도 2C 및 도 2D 참조).

또한, 본 발명자들은 cATSC 추출물의 처리에 따른 염증성 환경 개선효과를 확인하기 위해서, cATSC 추출물의 처리한 실험군 피부에서 염증인자 발현을 확인한 결과, 전사적 수준에서, 아토피 피부염 피부 샘플은 미세교아세포(microglial) 및 대식세포(macrophage)의 마커(marker)인 ED1 및 Iba1의 발현이 유의하게 증가하는 것을 확인하였다. Cox2 및 MPO는 양성대조군(HA 처리군)의 개의 피부에서 오히려 정상 개의 피부와 비교해서 상향 조절되었다. 그러나, cATSC 추출물을 가지고 치료함에 있어서, cATSC의 추출물은 전사적 수준(도 3A 참조) 및 단백질 수준(도 3B 참조)에서의 아토피 피부염 대조군과 비교해 볼 때, ED1, Cox2, MPO, 및 Iba1의 발현을 효과적으로 하향조절했다. 한편, 양성대조군(HA 처리군)은 개의 아토피 피부염에 있어서 면역 조절 효과를 나타내지 않는 것을 확인하였다.

또한, 단백질 수준에서, cATSC 추출물을 가지고 치료함에 있어서 아토피 피부염-유도된 피부에서의 염증성 iNOS, eNOS 및 NOX4의 발현은 유의하게 감소하는 것을 확인하였다(도 3E 참조).

또한, 본 발명은 개의 아토피 피부염 피부에서 pERK1/2/ED1, pERK1/2/Iba1 및 pSTAT3/ED1의 공존(colocalized)을 발견했다. 아토피 피부염 유도된 개의 피부에서는 pERK1/2, pSTAT3-매개 미세아교세포(microglial) 및 대식세포가 유의적으로 증식(proliferation)을 하나, 본 발명의 cATSC의 추출물은 pSTAT3 및 pERK1/2를 효과적으로불활성을 시켜서 염증반응 세포의 증식이 감소하는 것을 확인하였다(도 3F 참조).

또한, 본 발명자들은 cATSC 추출물을 처리한 실험군 피부에서 염증성 인자 발현을 확인한 결과, 아토피 피부염 피부 샘플에서 정상 개의 피부와 비교해 볼 때, 높은 수준의 IL-1β, IL-4, IL-6, IL-12α 및 IL-12β의 발현이 존재하나, cATSC 추출물을 가지고 처리한 결과, 개의 표피(epidermis)에 있는 염증성 사이토카인의 발현을 효과적으로 조절하는 것을 확인하였다. 한편, 대조적으로, 양성대조군(HA 처리군)은 아토피 피부염 동물에서 염증성 인자의 발현을 불러 일으키는 것을 확인하였다(도 3D 참조).

또한, cATSC 추출물의 처리시 아토피 피부염 병소의 병리학적 미세환경 분석하기 위해서, cATSC 추출물을 처리한 실험군의 동결된 피부조직의 면역조직병리학적 분석을 위한 면역염색을 수행하였고, TGF-β1 및 MPO 또는 ED1, Cox2 (cyclooxygenase 2)및 Iba1 발현 양상에 있어서 확인한 결과, 아토피 피부염이 있는 개의 피부는 정상 피부와 비교해 볼 때, TGF-β1의 발현이 유의한 하향조절을 나타냈다. 그러나 cATSC의 추출물을 가지고 처리한 후 TGF-β1의 발현은 회복하는 것을 확인하였다. 상기 조직에서 Cox2 및 미세교아세포의 마커인 IBa1 또한, 정상 피부와 비교해 볼 때, 유의하게 증가하는 것을 확인하였다.

대조적으로, cATSC의 추출물을 가지고 아토피 피부염을 치료함에 있어서, Iba1 및 Cox2+ 염증반응 세포의 수는 유의하게 감소하는 동안 효과적으로 TGF-β1의 발현을 상향 조절했다. 또한, 양성대조군(HA 처리군)의 개 피부 또한 Iba1 및 Cox2 발현 감소를 보이는 동시 TGF-β1의 발현 감소하는 것을 확인하였다(도 3C 및 표 2 참조). 또한, 아토피로 유도된 NFκB, RelA 및 RelB는 cATSC 추출물 처리에 의해서 음성적으로 조절되는 것을 확인하였다(도 4A 및 도 4B 참조).

또한, 본 발명자들은 cATSC의 추출물의 각질세포의 자가세포사멸에 대한 보호 효과를 확인하기 위해서, 산화환원 조절 유전자(redox regulatory gene) 발현과 각질 보호 효과와 관계를 cATSC 추출물의 처리한 실험군 피부에서 산화환원 조절 유전자의 발현을 확인한 결과, 아토피 피부염 피부 조직은 정상 피부보다 전사적 수준에서 산화환원 소기 유전자(redox scavenger gene)(GPx3, SEPN1, TXNL1, 및 SOD1, 2)의 유의적인 낮은 발현을 확인하였다. 대조적으로, cATSC의 추출물을 가지고 치료함에 있어서 활성산소종 소기 유전자(ROS scavenging genes)의 발현, 특히 TXNL1 및 SOD2을 효과적으로 회복하는 것을 확인하였다. 양성대조군(HA 처리군)은 GPx3, TXNL1 또는 SOD1의 발현 변화는 없었지만 SEPN1 및 SOD2의 발현은 평준화되는 것을 확인하였다(도 5A 참조).

또한, 본 발명자들은 cATSC의 추출물을 처리한 실험군의 피부세포의 각질세포 세포사멸에 관련된 단백질의 변화를 확인한 결과, 개의 아토피 피부염 피부 및 양성대조군(HA 처리군)의 아토피 피부염 피부에서 p38/JNK의 활성 또한 유의하게 증가하는 것을 확인하였다. 그러나 아토피 피부염 피부에서 cATSC 추출물 치료는 p38/JNK의 활성을 유의하게 희석하는 것을 확인하였다(도 5B 참조).

또한, 본 발명자들은 아토피성 피부염 모델에서 cATSC의 추출물의 각질세포의 보호효과 확인를 확인하기 위하여, TUNEL 분석을 통한 각질세포의 자가세포사를 확인한 결과, 양성대조군(HA 처리군) 아토피 피부염 유도된 피부는 TUNEL+ 자가세포사멸적 세포사 증가를 보이는 ROS (DCFDA+)의 유의한 응집(accumulation)을 나타냈다(도 5C). TUNEL+ 자가세포사멸적 세포사의 수준은 cATSC의 추출물을 가지고 치료함에 있어서 음성대조군(PBS 처리군) 샘플과 비교해 볼 때 유의하게 감소하는 것을 확인하였다(도 5D 참조).

또한, 본 발명자들은 cATSC의 추출물의 IL-10 및 TGF-β1의 면역조절 및 치료기능을 확인하기 위해서 음성대조군(PBS 처리군), IL-10를 처리한 아토피 피부염 동물, TGF-β1를 처리한 아토피 피부염 동물, 항-IL-10를 처리한 아토피 피부염 동물, 항-TGF-β1를 처리한 아토피 피부염 동물, cATSC추출물을 처리한 아토피 피부염 동물, 항-IL-10 및 cATSC추출물을 처리한 아토피 피부염 동물, cATSC추출물 및 항-TGF-β1를 처리한 아토피 피부염 동물 및 양성대조군(HA 처리군)에서 아토피 피부염 개선정도를 확인한 결과, 아토피 피부염 대조군 동물은 전통적인 아토피 피부염 형질(phenotype)을 나타냈지만, TGF-β1 및 cATSC의 추출물 처리 아토피 피부염 동물은 아토피 피부염 증후군이 유의하게 개선되는 것을 나타냈다(도 6A 참조). 또한, 음성대조군(PBS 처리군)의 아토피 피부염 피부는 IL-10 또는 TGF-β1의 처리에 의해서 아토피성 피부염이 완화되었다. 그러나, 양성대조군(HA 처리군)은 아토피 피부염의 찰과(scratching) 및 적색 점의 존재를 포함해서 유의한 개선을 나타내지 않았다. 또한, 보습도(moisture content), 산도(pH) 및 TEWL 수치는 cATSC의 추출물에 처리에 의해서 개선되는 것을 확인하였다(도 6B 참조).

또한, 본 발명자들은 cATSC의 추출물에 있는 기능적 인자들 가운데 키 면역조절인자(key immunomodulatory factor)를 확인하였다. 상기 실시예에서 확인한 바와 같이, cATSC의 추출물은 IL-10 및 TGF-β1등의 기능적인 사이토카인들을 발현한다. 상기 결과를 기초해서, 본 발명은 cATSC의 추출물에 포함된 IL-10 및 TGF-β1의 면역조절기능을 확인한 결과, IL-10 또는 TGF-β1을 아토피 피부염 병소 부위 피부에 처리하면 IL-10 및 TGF-β1의 발현이 유의하게 상향 조절되었으나(도 7A 참조), INF-γ의 발현은 유의하게 하향조절되었고, ED1+ 세포의 수는 감소하는 것을 확인하였다(도 7B 참조).

또한, IL-10을 아토피 피부염 병소에 처리하면 강한 면역조절 형질을 나타내는 IL-1β, IL-4, IL-6, IL-12α 및 IL-12β의 유의적인 감소 및 각질세포 보호를 포함하는 강력한 면역조절효과를 확인하였다(도 8 참조). 그러나, 양성대조군(HA 처리군)은 염증성 인자의 상향조절이, 아토피 피부염 대조군 동물과 비슷하게, 유의하게 증가하는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명자들은 cATSC의 추출물 및 IL-10 또는 TGF-β1을 처리한 아토피 피부 병소 조직에 염증반응 관련 단백질의 발현을 확인한 결과, IL-10 또는 TGF-β1을 아토피 피부염 에 처리한 피부 샘플에서 ED1, Cox2 및 MPO+ 군집 존재가 유의하게 감소하였고, iNOS, eNOS 및 Nox4은 단백질 수준에서 발현이 감소하는 것을 확인하였다(도 9A 및 도 9B 참조). TGF-β1 치료 또한 음성대조군(PBS 처리군)과 비교해 볼 때, 아토피 피부염 개 피부에서 RelA 및 RelB의 발현을 유의하게 감소시키는 것을 확인하였다(도 9C 참조).

또한, 본 발명자들은 cATSC의 추출물, IL-10 또는 TGF-β1을 처리한 아토피 피부염 피부에서 각질세포(keratinocytes)의 보호 효과를 확인하기 위해서, cATSC의 추출물, IL-10 또는 TGF-β1을 처리 후, 피부 각질세포군의 발현을 분석한 결과, cATSC 추출물, IL-10 또는 TGF-β1을 처리한 피부의 각질세포군(KRT6A, KRT6B 및 KRT16)은 유의하게 보호되었고, 대조적으로 음성대조군(PBS 처리군) 및 양성대조군(HA 처리군)은 정상피부보다 각질세포가 오히려 감소하는 것을 확인하였다(도 10 참조).

또한, 본 발명자들은 IL-10 또는 TGF-β1의 처리 후의 아토피 피부염 병소에서 효과를 확인하기 위하여, 각각의 피부 조직에서 면역염색을 수행한 결과, 일반적으로, 음성(PBS 처리군) 또는 양성(HA 처리군)-처리 아토피 피부염 유도 피부 세포는 쉽게 DCFDA+ ROS를 과생산하지만, IL-10 또는 TGF-β1을 처리한 경우 ROS 생산을 유의하게 감소 또는 활성산소종 소기 단계(ROS scavenging process)를 활성하는 것, 부가적으로 ROS-매개 자가세포사적 세포 사에 대하여 증가된 보호를 나타내는 것을 확인하였다(도 9D 및 표 3 참조).

또한, 본 발명자들은 cATSC의 추출물의 아토피 개에 대한 임상적 가능성 확인하기 위해서, 본 발명자들은 이중 블라인드(double blind), 위약 대조군(placebo controlled) 실험을 5마리의 아토피 개에 있어서 수행한 결과, cATSC의 추출물 적용 3일 후, 아토피 피부염의 임상적 증후가 임상적 평가 및 피부 수화가 음성대조군(PBS 처리군)과 비교하여 유의적으로 개선된 것을 확인하였다(표 4 참조).

따라서, 본 발명의 cATSC의 추출물을 이용한 아토피 피부염의 치료를 통해, 병소 표피의 염증성 인자를 감소시키고 면역조절인자는 증가를 시킴으로써 염증 진정효과를 보이고, 아울러 아토피성 피부염에 관한 임상지표를 개선해서 치료 효과를 나타낸 것임을 알 수 있었다. 현재까지 뚜렷한 약물 개발이 전무한 상태에서 독성이 없으면서 만성적인 면역질환과 아토피성 피부염 예방 및 치료용 조성물에 본 발명의 추출물을 이용할 수 있다.

본 발명의 성체줄기세포 추출물은 아토피 피부염에 대한 화장품, 의약품 등에 치료제 또는 치료 보조제로 유용하게 사용될 수 있으며 이러한 아토피 피부염에는 알러지 피부염, 습진, 건선, 여드름 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 성체줄기세포 추출물을 함유하는 조성물은 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

즉, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 성체줄기세포 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 비경구 투여시 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사를 통할 수 있다.

투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배를 함유하거나 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 구체적으로 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다. 본 발명의 조성물의 유효용량은 0.0001 ~ 10 g/일 수 있고, 구체적으로 0.001 ~ 1 g/kg일 수 있으며, 하루 1 ~ 6회 투여될 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 성체줄기세포 추출물을 유효성분으로 함유하는, 피부염의 예방 및 개선용 피부 외용제를 제공한다.

상기 성체줄기세포 추출물은 액체질소를 이용하여 급속동결과 해동을 반복하여세포박을 약화시켜 파쇄하는 방법으로 제조하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

상기 cATSC의 추출물을 이용한 아토피 피부염의 치료를 통해, 병소 표피의 염증성 인자를 감소시키고 면역조절인자는 증가를 시킴으로써 염증 진정효과를 보이고, 아울러 아토피성 피부염에 관한 임상지표를 개선해서 치료 효과를 확인함으로써, 피부염 예방 및 개선용 피부 외용제에 본 발명의 추출물을 이용할 수 있다.

상기 피부 외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화액, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대 또는 분무제일 수 있다.

상기 피부 외용제는 임상 투여시에 약제학적으로 허용가능한 통상의 담체, 부형제, 결합제, 붕해제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다. 상기 피부 외용제에서, 본 발명에 따른 혼합미셀 조성물의 유효용량은 0.01 내지 300 mg/cm²이고, 바람직하게는 10 내지 50 mg/cm²이며, 하루 1-4 회 투여될 수 있다.

단, 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

또한, 본 발명은 성체줄기세포 추출물을 유효성분으로 함유하는, 피부염 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 cATSC의 추출물을 이용한 아토피 피부염의 치료를 통해, 병소 표피의 염증성 인자를 감소시키고 면역조절인자는 증가를 시킴으로써 염증 진정효과를 보이고, 아울러 아토피성 피부염에 관한 임상지표를 개선해서 치료 효과를 확인함으로써, 피부염 예방 및 개선용 화장료 조성물에 본 발명의 추출물을 이용할 수 있다.

상기 화장료 조성물은, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은 본 발명의 성체줄기세포 추출물에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.

본 발명의 성체줄기세포 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 있어서, 통상적으로 함유되는 화장료 조성물에 본 발명의 추출물이 1 내지 15 중량%, 바람직하게는 2 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있다.

아울러, 본 발명은 성체줄기세포 추출물을 유효성분으로 함유하는, 피부염 예방 및 개선용 건강식품을 제공하는 것이다.

상기 cATSC의 추출물을 이용한 아토피 피부염의 치료를 통해, 병소 표피의 염증성 인자를 감소시키고 면역조절인자는 증가를 시킴으로써 염증 진정효과를 보이고, 아울러 아토피성 피부염에 관한 임상지표를 개선해서 치료 효과를 확인함으로써, 피부염 예방 및 개선용 건강식품에 본 발명의 추출물을 이용할 수 있다.

본 발명의 건강식품은 성체줄기세포 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 성체줄기세포 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 설탕과 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.

상기 외에 본 발명의 셍체줄기세포 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 성체줄기세포 추출물은 천연 과일 주스, 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 지방조직유래줄기세포의 면역 인자의 수반 및 사이토카인의 발현 효과 확인

<1-1> 지방조직에서 줄기세포( canine adipose tissue - derived stem cells;cATSC)의 분리와 배양

개 지방 조직은 표준화된 수술 방법 및 메드토미딘(medetomidine)(체중 kg 당 0.1 ml)의 약한 진정제(mild sedation)를 사용해서 견갑골(intracapular) 부위로부터 피하 조직(subcutaneous tissue)으로부터 수득하였다. 이후, 상기 지방조직에서 줄기세포를 분리하기 위하여, 상기 조직을 0.075% 4형 콜라게네이즈(collagenase IV)(Sigma 사, 미국)를 처리하고 1,200 g에서 10분 동안 원심 분리하여 고농도의 세포 펠렛(cell pellet)을 수득하였다. 상기 펠렛을 적혈구 용해 완충용액(red blood cell (RBC) lysis buffer) (Biowhittaker 사, 미국)으로 희석시킨 후, 오염된 적혈구들을 용해하기 위해서 실온에서 10분간 방치하였다. 상기 처리 후, 줄기세포 펠렛은 10% FBS를 포함하는 α-MEM 배지(GibcoBRL 사, 미국)배지로 사용하여 약 37℃, 약 5% CO₂ 배양기에서 24 시간 동안 배양한 후, 비접착성 세포들을 제거하여 지방 줄기세포를 단리(collected)하였다. 또한, 본 발명은 서울대학교 연구심의위원회(Seoul National University Institutional Review Board;IRB No. 0603/001-002)및 윤리 위원회(ethics committee)에서 방법을 승인받았다.

<1-2> cATSCs 의 파쇄추출물 준비

지방조직유래 줄기세포를 배양한 후, 약 5 X 10⁶개의 상기 배양된 세포를 1.5㎖ 미세튜브(microtube)에 회수하였고, 상기 회수된 세포에 무혈청(serum free) MEM 배지 100㎕를 첨가하여 액체질소가 담긴 통에 담구고 미세튜브를 37℃ 수조( waterbath)에 담구고 진동혼합(voltexing)하는 과정을 순환반복을 통하여 세포를 파쇄하였다. 그리고 상기 파쇄된 세포를 4℃에서 13,000 rpm으로 10분간 원심분리(centrifuge)한 후, 상층액을 회수하여 파쇄 추출액을 수득하였다.

<1-3> RNA 분리 및 RT - PCR 을 통한 cATSC 의 면역인자 발현 분석

cATSC의 염증 인자의 수반 및 사이토카인의 발현을 확인하기 위하여, cATSC의 총 세포 RNA를 RT-PCR을 사용해서 확인하였다. 상기 실시예 <1-1>에 기재된 방법에 따라 분리된 세포를 배양 개시 일주일 후, 배양된 ATSCs세포에서 Trizol(Life Technologies 사, 미국)시약을 가지고 총 세포 RNA를 추출했다. 총 RNA를 분리한 후, 올리고-dT(oligo-dT)를 사용해서 첫 번째 가닥 cDNA를 역전사했고, 상기 cDNA는 제조사에 지시된 유전자 특이적 프라이머 20 pM을 사용해서 PCR를 사용해서 증폭했다. 상기 PCR 반응은 ABI 7700 프리즘 서열 검출 시스템(Prism Sequence Detection System) 및 사이버그린 검출 키트(SYBER green detection kit)(Applied Biosystems 사,미국)를 사용해서 수행했다. 상기 PCR 반응 조건은 94℃에서 5분 동안 초기 변성(denaturation)후, 94℃에서 30초 동안 변성과정, 각 프라이머 세트에 적합한 어닐링 온도(annealing temperature)에서 30초 동안 어닐링(annealing)과정 및 72℃에서 30초 동안 연장(extension)과정, 상기 과정을 35 사이클(cycle)을 반복 수행한 후, 72℃에서 5분 동안 최종 연장(final extension)과정을 통하여 수행하였다. 상기 PCR 반응에 사용한 프라이머는 유전자 은행(GenBank)으로부터 얻은 유전자 서열을 이용해서 프라이머 고속 소프트웨어(Primer Express software) (PE-Applied Biosystems 사, 영국)를 이용 설계하였고 각각의 서열은 아래와 같다.

그 결과, 도 1A에 나타낸 바와 같이, 개의 피하 지방-유래된 cATSC는 면역조절 인자인 인터루킨-10(IL-10) 및 인간 형질전환 성장인자-베타 1(TGF-β1)을 발현하는 것을 확인이 하였고, 부가적으로, 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF) 및 내피세포 성장인자(EGF)도 발현하는 것을 확인하였다(도 1A).

< 실시예 2> 아토피성 피부염 모델에서 cATSC 추출물의 효과 확인

<2-1> 아토피 피부염 동물 모델 제작

자연적으로 아토피성 피부염(atopic dermatitis;AD)이 발생한 개는 서울대학교 수의교육병원으로 입수하였다. 그런 다음, 상기 개들은 병력(history), 임상적 징후, 알레르기항원 특이적 면역글로블린-E(IgE) 시험법 및 진피내 피부 시험법(intradermal skin test) 양성 결과의 조합으로 진단하였다. 상기의 개들 가운데 소양증(pruritus)의 경우는 실험에서 제외했다. 클루티코르티코이드(Glucocorticoids) 및 항-히스타민(anti-histamines)의 사용은 진피 내 피부 시험법, 알러지항원 특이적 IgE 시험법 및 조사를 위하여 적어도 3주 전에 사용을 중지했다. 상기의 개들은 피부 문제를 제외하고는 건강했다. 상기 개들은 실험 전에 적어도 2주 동안 일반 식이를 제공하여 안정시켰고, 실험을 진행하는 동안 제공한 식이를 바꾸지 않았다. 또한, 대조군으로는 소양증의 역학적 또는 임상적 징후를 갖지 않는 것, 가능한 면역 기능의 변화를 하지 않은 5마리의 건강한 비글(beagles)을 사용하였다. 본 발명의 모든 실험방법은 서울대학교 실험동물 자원 연구소(Institute of Laboratory Animal resources of Seoul National University)에서 제공을 받았다(과제 번호: SNU-120316-1).

<2-2> 아토피성 피부염 모델에 cATSC 추출물 처리에 의한 아토피 피부염에 대한 효과 확인

cATSC 추출물의 아토피성 피부염에 대한 효과를 확인하기 위해서, 개에게 아토피성 피부염을 급성으로 유발시킨 후, cATSC 추출물을 처리하여 효과를 확인하였다.

구체적으로, 상기 아토피성 피부염의 급성 유발을 위해서 아토피성 개는 집먼지 진드기(Dermatophagoides farinae)를 경피적으로(epicutaneously) 감작하였다. 실험에 사용한 집먼지 진드기 용액은 전통적인 방법을 사용해서 준비하였다. 특별하게, 집먼지 진드기의 순수 배양(그리어 실험실 방법; 99% 이상 순도, 전체가 꽉 찬, 자연적 가공된 집먼지 진드기)은 멸균된 생리식염수(saline)를 가지고 최종적 400 mg/ml 농도로 얻었다. 상기 개의 옆구리 털을 면도기(오스터 프로사, 미국)를 가지고 제거했고, 상기와 같이 준비된 집먼지 진드기 용액을 도포하였다. 상기 집먼지 진드기 용액에 의한 성공적인 감작은 아토피 피부염이 갖는 임상적으로 확인 가능한 피부염 유발 정도에 의해서 확인하였다. 상기와 같이 아토피성 급성(acute) 피부염이 유도된 개의 피부 병소 부위에 cATSC 추출물 5, 10 또는 30 ng을 Finn chamber(Epitest 사, 핀란드)를 사용해서 24시간 동안 염증이 생긴 피부에 도포했다. 인산완충용액(PBS) 및 0.0584% 하이드로코르티손 아세포네이트(hydrocortisone aceponate;HA)(1.3 ㎕/1.13 cm²)(Cortavance 사, 프랑스)를 각각 음성 대조군 및 양성 대조군으로 사용했고, 상기와 같은 방법을 사용해서 급성 염증이 생긴 개의 피부에 적용했다. 적용 후 0일째 및 3일째에, 임상적 중증도를 개 아토피 피부염의 변형된 범위 및 중증도 지표(modified Canine Atopic Dermatitis Extent and Severity Index;CADESI) 조사를 사용해서 분석했고, 피부의 생리학적 단계를 측정했다. 피부 샘플은 3일째 임상적 심각도 평가 후, 피부 생체조직검사(biopsy)(5 mm 구멍 조직검사; Miltex 사, 호주)를 통해 얻었다. 냉동 절단(cryosectioning)을 위해서 피부 샘플의 절반은 10% 포르말린 용액으로 고정했고, 샘플의 남은 절반은 사이토카인(cytokine) 분석을 위해서 -70℃에 즉시 동결했다.

그 결과, 도 1B에 나타낸 바와 같이, 아토피 피부에 처리된 인산완충용액을 처리한 음성대조군과 하이드로코르티손 아세포네이트을 처리한 양성대조군과 비교해 볼 때, cATSC의 추출물을 처리한 개의 피부는 형태학적으로 유의적인 아토피 피부염을 개선하는 것을 확인하였다(도 1B).

<2-3> 아토피성 피부염 모델의 cATSC 추출물 처리에 대한 임상적 평가

아토피성 피부염 모델의 cATSC 추출물 처리에 대한 임상적 평가를 위해서, 상기 실시예 <2-2>에 기재된 방법으로 아토피 피부염이 유도된 개에서 아토피 피부염 범위 및 중증도 지표(modified Canine Atopic Dermatitis Extent and Severity Index;CADESI)를 측정하였다.

구체적으로, 0에서 5(0=정상, 5=심각)까지 점수를 매겨진 홍반(erythema), 태선화(lichenification), 찰과(excoriation) 및 피부의 자가 유도 탈모(alopecia)의 중증도는 20의 총점수를 주었다. 상기 피부의 생리적 단계는 변형된 표피 수분 결손(transepidermal water loss;TEWL), 정전 용량(capacitance) 및 산도(pH)의 측정을 통해서 확인하였다. 상기 실험된 개의 피부에서 변형된 표피 수분 결손은 증발메터(evaporimeter)(델핀 기술 사, 필란드)를 사용해서 측정했고, 측정한 결과들은 g/m²/h로 나타냈다. 또한, 각질층(stratum corneum)의 전기적 정전 용량은 정전 용량 메터(capacitance meter)(코라즈 & 카자카 사, 독일)을 가지고 측정했고 임의적 단위로 나타냈다. 그리고 피부 산도(pH)는 피부표면에 산도 탐지자 및 메터(probe and meter)(코라즈 & 카자카 사, 독일)을 사용해서 기록했다. 모든 방법은 측정기의 제조사에서 지시한 방법을 따라 측정하였다.

그 결과, 도 1C에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 cATSC 추출물의 처리 후, 급성으로 유도된 피부염 병소에서 임상적인 지수들이 감소하는 결과를 확인하였다.구체적으로, TEWL의 수치가 보통의 피부의 수준으로 평준화되었고, 피부 수화(hydration)역시 PBS 처리군과 비교함에 있어서도 유의적으로 평준화되었다. 양성대조군으로 사용한 하이드로코르티손 아세포네이트를 처리한 군은 피부 수화 및 TEWL의 수치가 cATSC 처리군에 비하여 유의적인 개선된 수치를 나타내지 않는 것을 확인하였다(도 1C).

<2-4> cATSC 추출물 처리에 의한 각질세포( keratinocyte ) 보호효과 확인

상기 cATSC의 추출물을 처리한 급성 염증이 생긴 개의 피부에서 각질세포(keratinocytes)의 보호 효과를 확인하기 위해서, cATSC의 추출물 처리 후, 피부 각질세포 발현율을 최적화된 다중(multiplex) PCR을 사용해서 분석하였다.

그 결과, 도 1D에 나타낸 바와 같이, cATSC 추출물을 처리한 급성 염증이 생긴 개의 피부의 각질세포군(KRT6A, KRT6B 및 KRT16)은 유의하게 보호되었고, 대조적으로 음성대조군(PBS 처리군) 및 양성대조군(HA 처리군)은 유의적인 효과를 나타내지 않은 것을 확인하였다(도 1D).

< 실시예 3> cATSC 추출물에 의한 T-세포 침윤과 증식에 대한 효과 확인

<3-1> 면역조직병리학적 방법을 통한 T-세포 침윤과 증식에 대한 효과 확인

cATSC의 추출물을 처리한 급성 염증이 생긴 개의 피부에서 각질세포 사이의 T-세포 침윤(infiltration) 및 증식(propagation)을 확인하기 위해서, 상기 실시예와 같이 처리한 개의 피부 병소부위에서 면역조직병리학적 방법을 통해 분석을 수행하였다. 구체적으로, 상기 동결된 피부 조직의 면역조직학적 분석을 위해서, 조직 절편들은 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)에서 고정했다. 상기 절편들은 PBS로 세척하였고, 비특이적인 결합은 10% 일반 말 혈청을 가지고 억제했다. 상기 절편은 다음과 같은 항체를 가지고 4℃에서 밤새 반응했다; 항-CD3(MACS 사, 독일), 항-CD4(MACS 사, 독일), 항-CD8 (MACS 사, 독일). 일차 항체를 세척한 후, 상기 절편은 1 시간 동안 방치했다. PBS로 과량 세척 후, 상기 절편에 세포는 FITC 또는 Texas Red가 결합된 2차 항체 (invitrogen 사, 미국)를 가지고 30분 동안 반응하였다. 일차 항체에 있어서, 대조군은 생략했거나 어떠한 검출 염색을 보이지 않는 반응성과 무관한 IgG를 가지고 대체했다. 또한, 상기 면역화학적분석은 적어도 세 번 반복했고 3개의 레이저가 장착된 라이카 TCS sp2 레이저 스캐닝 현미경(Leica TCS sp2 laser scanning microscope)(Leica 사, 미국)을 사용해서 공초점 현미경(confocal microscopy)을 통해 확인하였다.

그 결과, 도 2A 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 정상 피부(Normal)와 비교해 볼 때, 아토피 피부염 자체는 상피(epithelium)에서 이동한 CD3, CD4 및 CD8 면역세포의 증식을 유도하였고, 양성대조군(HA 처리군)에서는 아토피성 피부염 병소 부위에 있어서 면역세포의 CD3+, CD4+ 및 CD8+ 군집을 증가시킨 반면에, cATSC 추출물을 처리한 피부 병소 부위에서는 효과적으로 CD3, CD4 및 CD8 세포를 이동을 조절하는 것을 확인하였다. 더 구체적으로, 양성대조군(HA 처리군)에서는 CD4 및 CD8+ 세포들의 수가 급격하게 증가된 반면에, cATSC 추출물을 처리한 피부 병소 부위에서는 CD4+ 및 CD8+ 면역세포의 수가 정상피부의 수로 평준화(mormalized) 되었음을 확인하였다(도 2A 및 표 1).

<3-2> cATSC 추출물 처리 후 염증인자 발현 분석

cATSC 추출물을 처리한 실험군에서 병소의 염증인자 발현을 비교하기 위해서, 상기 실시예 <1-2>에 기재된 RT-PCR 방법에 따라 전사적 수준에서 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 2B 내지 2D에 나타낸 바와 같이, cATSC 추출물을 처리한 아토피성 피부염 병소 부위에서 염증반응(inflammatory) 인자인 인터페론-감마(IFN-γ)가 효과적인 감소를 하였고, 대조적으로 음성대조군(PBS 처리군)과 양성대조군(HA 처리군)에서는 IFN-γ의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 2B). 한편, cATSC 추출물을 처리한 아토피성 피부염 병소 부위에서 면역조절(immunomodulatory)인자인 인터루킨-10(IL-10) 및 인간 형질전환 성장인자(TGF-β1)가 유의하게 증가되는 것을 확인하였다(도 2C 및 도 2D).

< 실시예 4> cATSC 추출물의 처리에 따른 염증성 환경 개선효과 확인

<4-1> cATSC 추출물의 처리에 따른 아토피 피부염 염증인자 발현 확인

cATSC 추출물의 처리가 아토피 피부염으로 인한 염증성 환경을 개선시키는 것을 확인하기 위하여, 상기 실시예 <1-2>에 기재된 RT-PCR 방법 및 웨스턴 블랏 방법에 따라 상기 cATSC 추출물의 처리한 실험군 피부에서 염증인자 발현을 확인하였다.

구체적으로 웨스턴 블랏은 상기 피부 조직은 500㎕의 용해완충용액(lysis buffer)(20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM EGTA, 1 mM glycerophosphate, 1 mM Na₃VO₄, and 1 mM PMSF)을 가지고 용해시켰다. 상기 용해된 혼합물을 10분 동안 15,000 g에서 원심분리해서 상층액을 수집하였다. 총 단백질의 농도를 Bio-Rad 단백질 정량 키트(Bio-Rad 사, 이탈리아)를 사용해서 결정했다.웨스턴 블랏팅을 위해서, 동일한 양의 시료 용해물(40 ㎍)을 10% SDS-PAGE로 분리하였고 전기영동 후에, 나이트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)에 이동시켰다. 상기 막을 상기 막을 TBST 세척 완충액(10 mM Tris, 150 mM NaCl, 1%, pH 7.4)안의 0.1% Tween-20이 있는 5% 스킴 밀크(skim milk)로 1 시간 동안 차단하였고, 그 후에 마우스를 인식하는 1차 항체인 5% 스킴 밀크에 있는 항-ED1 (1:100, AbD Serotec 사, 영국), COX2 (1:200, Santa Cruz 사, 미국), MPO (1:500, DAKO 사, 덴마크), RelA (1:1000, Cell Signaling 사, 미국), RelB (1:200, Santa Cruz 사, 미국), iNOS (1:2000, BD Bioscience 사, 미국), eNOS (1:2500, BD Bioscience 사, 미국), NOX4 (1:200, Santa Cruz 사, 미국), p-STAT3 (1:1000, Cell Signaling 사, 미국), p-Erk (1:1000, Cell Signaling 사, 미국), p-p38 (1:1000, Cell Signaling 사, 미국), p-JNK (1:1000, Cell Signaling 사, 미국) 및 β-actin (1:500, Millipore 사, 미국) 항체와 하룻밤 동안 배양하였다. 배양된 막을 TBST로 10분 동안 3회 막을 세척하였고 적절한 2차 항체와 함께 2~4 시간 동안 배양한 후 TBST로 다시 3회 세척하였다. 상기 막을 ECL을 이용하여 현상하였다. 동일한 단백질의 양을 β-actin (1:500, Millipore 사, 미국) 항체를 이용하여 확인하였다. 상기 현상된 막을 Quality-one 1-D 분석 소프트웨어(Bio-Rad 사, 미국)를 사용해서 밴드의 강도를 결정했다.

그 결과, 도 3A 및 도 3B에 나타낸 바와 같이, 전사적 수준에서, 아토피 피부염 피부 샘플은 미세교아세포(microglial) 및 대식세포(macrophage)의 마커(marker)인 ED1 및 Iba1의 발현이 유의하게 증가하는 것을 확인하였다. Cox2 및 MPO는 양성대조군(HA 처리군)의 개의 피부에서 오히려 정상 개의 피부와 비교해서 상향 조절되었다. 그러나, cATSC 추출물을 가지고 치료함에 있어서, cATSC의 추출물은 전사적 수준(도 3A) 및 단백질 수준(도 3B)에서의 아토피 피부염 대조군과 비교해 볼 때, ED1, Cox2, MPO, 및 Iba1의 발현을 효과적으로 하향조절했다. 한편, 양성대조군(HA 처리군)은 개의 아토피 피부염에 있어서 면역 조절 효과를 나타내지 않는 것을 확인하였다.

또한, 도 3E단백질 수준에서, cATSC 추출물을 가지고 치료함에 있어서 아토피 피부염-유도된 피부에서의 염증성 iNOS, eNOS 및 NOX4의 발현은 유의하게 감소하는 것을 확인하였다(도 3E).

또한, 본 발명은 개의 아토피 피부염 피부에서 pERK1/2/ED1, pERK1/2/Iba1 및 pSTAT3/ED1의 공존(colocalized)을 발견했다. 아토피 피부염 유도된 개의 피부에서는 pERK1/2, pSTAT3-매개 미세아교세포(microglial) 및 대식세포가 유의적으로 증가하나, 본 발명의 cATSC 추출물은 pSTAT3 및 pERK1/2를 효과적으로 불활성을 시켜서 염증반응 세포의 증식이 감소하는 것을 확인하였다(도 3F).

<4-2> cATSC 추출물의 처리에 의한 염증성 인자 발현 확인

상기 실시예 <1-2>에 기재된 RT-PCR 방법에 따라 상기 cATSC 추출물의 처리한 실험군 피부에서 염증성 인자 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 3D에 나타낸 바와 같이, 아토피 피부염 피부 샘플에서 정상 개의 피부와 비교해 볼 때, 높은 수준의 IL-1β, IL-4, IL-6, IL-12α 및 IL-12β의 발현이 존재하나, cATSC 추출물을 처리한 결과, 개의 표피(epidermis)에 있는 염증성 사이토카인의 발현이 효과적으로 조절되는 것을 확인하였다. 한편, 대조적으로, 양성대조군(HA 처리군)은 아토피 피부염 동물에서 염증성 인자의 발현을 불러 일으키는 것을 확인하였다(도 3D).

<4-3> 면역조직병리학적 방법을 통한 cATSC 추출물의 처리 아토피 피부염 병소의 병리학적 미세환경 분석

cATSC 추출물의 처리 아토피 피부염 병소의 병리학적 미세환경 분석하기 위해서, 상기 실시예 <3-2>에 기재된 방법에 따라 상기 cATSC 추출물을 처리한 실험군의 동결된 피부조직의 면역조직병리학적 분석을 위한 면역염색을 수행하였다. 상기 조직 절편들은 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)에서 30분 동안 고정했다. 상기 고정된 절편들은 PBS로 세번 세척하였고, 비특이적인 결합은 10% 일반 말 혈청을 가지고 억제했다. 그 후, 상기 절편은 다음과 같은 항체를 가지고 4℃에서 밤새 반응했다:항-TGF-β1 (Santa cruz 사, 미국), 항-ED1 (SeroTech 사, 영국), 항-COX2 (Santa cruz 사, 미국), 항-MPO (Dako 사, 덴마크), 항-Iba1 (Wako 사, 일본), 항-CD3 (MACS사,독일), 항-CD4 (MACS 사, 독일), 항-CD8 (MACS 사, 독일), 항-Cytokeratin14 (밀리포어 사, 미국). 일차 항체를 세척한 후, 상기 절편은 1 시간 동안 방치했다. 반응이 끝난 절편은PBS로 과량 세척 후, 상기 절편에 세포는 FITC 또는 Texas Red가 결합된 2차 항체 (invitrogen 사, 미국)를 가지고 30분 동안 반응하였다. 일차 항체에 있어서 대조군은 생략했거나 어떠한 검출 염색을 보이지 않는 반응성과 무관한 IgG를 가지고 대체했다. 상기 피검물을 라이카 형광 현미경(Leica fluorescence microscope)(Leica 사, 미국)을 사용해서 평가했다. 면역화학적분석은 적어도 세 번 반복했고 3개의 레이저가 장착된 라이카 TCS sp2 레이저 스캐닝 현미경(Leica TCS sp2 laser scanning microscope)(Leica 사, 미국)을 사용해서 공초점 현미경(confocal microscopy)을 가지고 검출했다. 이중 또는 단일-표지된 세포는 1 ㎛의 절단 크기로 절편화를 통해서 영상화해서 확인했다. 양성세포의 정량화를 위해서, 조직의 부분을 계산했다. 상기의 각 부분에 있어서, 샘플된 5개의 인접한 영역을 상부 및 하부 블레이드(blades)를 결합을 시작했다. 부분당 5개의 인접한 영역에서의 양성세포 평균을 항체 양성세포의 비율을 가지고 계산했다. 에러 막대는 표준 편차(standard deviations)를 나타냈다.

또한, 상기 아토피성 피부염 피부에 cATSCs의 추출물 처리 전 및 후에 있어서, 염증성 인자 및 TGF-β1의 발현을 확인하였다. TGF-β1 및 MPO 또는 ED1, Cox2 (cyclooxygenase 2)및 Iba1 발현 양상에 있어서 상기에 기재된 방법에 따라 면역조직병리학적 분석을 통해 확인하였다.

그 결과, 도 3C 및 표 2에 나타낸 바와 같이, 아토피 피부염이 있는 개의 피부는 정상 피부와 비교해 볼 때, TGF-β1의 발현이 유의한 하향조절을 나타냈다. 그러나 cATSC의 추출물을 가지고 처리한 후 TGF-β1의 발현은 회복하는 것을 확인하였다. 상기 조직에서 Cox2 및 미세교아세포의 마커인 IBa1 또한, 정상 피부와 비교해 볼 때, 유의하게 증가하는 것을 확인하였다.

대조적으로, cATSC의 추출물을 가지고 아토피 피부염을 치료함에 있어서, Iba1 및 Cox2+ 염증반응 세포의 수는 유의하게 감소하는 동안 효과적으로 TGF-β1의 발현을 상향 조절했다. 또한, 양성대조군(HA 처리군)의 개 피부 또한 Iba1 및 Cox2 발현 감소를 보이는 동시 TGF-β1의 발현 감소하는 것을 확인하였다(도 3C 및 표 2).

또한, 도 4A 및 도 4B에 나타낸 바와 같이, 아토피로 유도된 NFκB, RelA 및 RelB는 cATSC 추출물 처리에 의해서 음성적으로 조절되는 것을 확인하였다(도 4A 및 도 4B).

< 실시예 5> 아토피성 피부염 모델에서 cATSC 의 추출물의 각질세포의 자가세포사멸에 대한 보호효과 확인

<5-1> 아토피성 피부염 모델에서 cATSC 의 추출물의 산화환원 소기 유전자의 수반 및 p38 / JNK 불활성을 통한 효과확인

본 발명은 아토피 피부염에 있어서 산화환원 조절 유전자(redox regulatory gene)발현과 각질 보호 효과와 관계를 확인하기 위해서, 상기 실시예 <1-2>에 기재된 RT-PCR 방법에 따라 상기 cATSC 추출물의 처리한 실험군 피부에서 산화환원 조절 유전자의 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 5A에 나타낸 바와 같이, 아토피 피부염 피부 조직은 정상 피부보다 전사적 수준에서 산화환원 소기 유전자(redox scavenger gene)(GPx3, SEPN1, TXNL1, 및 SOD1, 2)의 유의적인 낮은 발현을 확인하였다. 대조적으로, cATSC의 추출물을 가지고 치료함에 있어서 활성산소종 소기 유전자(ROS scavenging genes)의 발현, 특히 TXNL1 및 SOD2을 효과적으로 회복하는 것을 확인하였다. 양성대조군(HA 처리군)은 GPx3, TXNL1 또는 SOD1의 발현 변화는 없었지만 SEPN1 및 SOD2의 발현은 평준화되는 것을 확인하였다(도 5A).

<5-2> 웨스턴 블랏(western blot)을 통한 아토피성 피부염 모델에서 cATSC 의 추출물의 각질세포의 보호효과 확인

아토피성 피부염 모델에서 cATSC의 추출물이 각질세포를 보호하는 것을 확인하기 위해서, 상기 실시예 <3-2>에 기재된 방법에 따라, 상기 cATSC의 추출물을 처리한 실험군의 피부세포의 각질세포 세포사멸에 관련된 단백질의 변화를 확인하였다.

그 결과, 도 5B에 나타낸 바와 같이, 개의 아토피 피부염 피부 및 양성대조군(HA 처리군)의 아토피 피부염 피부에서 p38/JNK의 활성 또한 유의하게 증가하는 것을 확인하였다. 그러나 아토피 피부염 피부에서 cATSC 추출물 치료는 p38/JNK의 활성을 유의하게 희석하는 것을 확인하였다(도 5B).

<5-3> TUNEL 분석을 통한 아토피성 피부염 모델에서 cATSC 의 추출물의 각질세포의 보호효과 확인

아토피성 피부염 모델에서 cATSC의 추출물의 각질세포의 보호효과 확인를 확인하기 위하여, TUNEL 분석을 통한 각질세포의 자가세포사를 확인하였다.

상기 자가세포사멸적 피부 조직의 파괴는 MTT 염색제((3, 4, 5-dimethyl thiazol-2-yl) -2, 5-diphenyl tetrazolium bromide)(Sigma 사, 미국)를 이용하여 상기 염색제가 청보라 포마잔(formazan)결정으로 감소되는 정도에 따라 피부의 활성을 추정했다. 세포 사멸의 유발에 있어서 과산화수소수(H₂O₂)의 효과는 제조사의 권장에 따라 사용한 TdT in situ 자가세포사 검출 키트 (Roche 사, 미국)를 가지고 결정하였다. 상기 피부 조직을 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)를 가지고 고정한 후, TdT 및 바이오틴이 결합된 dUTP가 들어간 디옥시뉴클레오티딜 전환효소(deoxynucleotidyl transferase;TdT)완충용액을 포함하는 TUNEL 반응 혼합물에 배양했다. 37℃의 습윤한 공기 중에서 90분 동안 반응시켰다. 그리고 상기 조직을 PBS를 가지고 세척하였다. 상기 조직은 항-고추냉이 퍼옥시데이즈 결합된(horseradish peroxidase-conjugated) 항체를 가지고 실온에서 30분간 반응하고 신호는 디아미노벤지딘(diaminobenzidine)을 가지고 가시화했다. 그 결과들은 형광 현미경(Leica 사, 독일)을 사용해서 분석했다. TUNEL-양성 자가세포사멸 세포는 양성으로 염색된 세포들을 계수하여 정량화했다. 100배의 3차원 현미경 이미지는 양성 세포를 가지고 있는 영역을 무작위로 촬영했다. 세개의 이미지의 각 각의 양성으로 염색된 세포들의 수를 평균화했다.

그 결과, 도 5C 및 도 5D에 나타낸 바와 같이, 양성대조군(HA 처리군) 아토피 피부염 유도된 피부는 TUNEL+ 자가세포사멸적 세포사 증가를 보이는 ROS (DCFDA+)의 유의한 응집(accumulation)을 나타냈다(도 5C). TUNEL+ 자가세포사멸적 세포사의 수준은 cATSC의 추출물을 가지고 치료함에 있어서 음성대조군(PBS 처리군) 샘플과 비교해 볼 때 유의하게 감소하는 것을 확인하였다(도 5D).

< 실시예 6> 아토피 피부염 병소에서 IL -10 및 TGF -β1의 효과 확인

cATSC의 추출물의 IL-10 및 TGF-β1의 면역조절 및 치료기능을 확인하기 위해서 음성대조군(PBS 처리군), IL-10를 처리한 아토피 피부염 동물, TGF-β1를 처리한 아토피 피부염 동물, 항-IL-10를 처리한 아토피 피부염 동물, 항-TGF-β1를 처리한 아토피 피부염 동물, cATSC추출물을 처리한 아토피 피부염 동물, 항-IL-10 및 cATSC추출물을 처리한 아토피 피부염 동물, cATSC추출물 및 항-TGF-β1를 처리한 아토피 피부염 동물 및 양성대조군(HA 처리군)에서 아토피 피부염 개선정도를 확인하였다.

그 결과, 도 6A에 기재된 것과 같이, 아토피 피부염 대조군 동물은 전통적인 아토피 피부염 형질(phenotype)을 나타냈지만, TGF-β1 및 cATSC의 추출물 처리 아토피 피부염 동물은 아토피 피부염 증후군이 유의하게 개선되는 것을 나타냈다(도 6A). 또한, 음성대조군(PBS 처리군)의 아토피 피부염 피부는 IL-10 또는 TGF-β1의 처리에 의해서 아토피성 피부염이 완화되었다. 그러나, 양성대조군(HA 처리군)은 아토피 피부염의 찰과(scratching) 및 적색 점의 존재를 포함해서 유의한 개선을 나타내지 않았다. 또한, 보습도(moisture content), 산도(pH) 및 TEWL 수치는 cATSC의 추출물에 처리에 의해서 개선되는 것을 확인하였다(도 6B).

<6-1> RT - PCR 을 통한 아토피 피부염 병소에서 IL -10 및 TGF -β1의 효과 확인

cATSC의 추출물에 있는 기능적 인자들 가운데 키 면역조절인자(key immunomodulatory factor)를 확인하였다. 상기 실시예에서 확인한 바와 같이, cATSC의 추출물은 IL-10 및 TGF-β1등의 기능적인 사이토카인들을 발현한다. 상기 결과를 기초해서, 본 발명은 cATSC의 추출물에 포함된 IL-10 및 TGF-β1의 면역조절기능을 확인하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, IL-10 또는 TGF-β1을 아토피 피부염 병소 부위 피부에 처리하면 IL-10 및 TGF-β1의 발현이 유의하게 상향 조절되었으나(도 7A), INF-γ의 발현은 유의하게 하향조절되었고, ED1+ 세포의 수는 감소하는 것을 확인하였다(도 7B).

또한, IL-10을 아토피 피부염 병소에 처리하면 강한 면역조절 형질을 나타내는 IL-1β, IL-4, IL-6, IL-12α 및 IL-12β의 유의적인 감소 및 각질세포 보호를 포함하는 강력한 면역조절효과를 확인하였다(도 8). 그러나, 양성대조군(HA 처리군)은 염증성 인자의 상향조절이, 아토피 피부염 대조군 동물과 비슷하게, 유의하게 증가하는 것을 확인하였다.

<6-2> 웨스턴 블랏(western blot)을 통한 아토피 피부염 병소에서 IL -10 및 TGF-β1의 효과 확인

아토피 피부염 병소에서 IL-10 및 TGF-β1의 효과를 단백질 수준에서 확인하기 위하여, 상기 실시예 <3-2>에 기재된 방법에 따라, 상기 cATSC의 추출물 및 IL-10 또는 TGF-β1을 처리한 아토피 피부 병소 조직에 염증반응 관련 단백질의 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, IL-10 또는 TGF-β1을 아토피 피부염 에 처리한 피부 샘플에서 ED1, Cox2 및 MPO+ 군집 존재가 유의하게 감소하였고, iNOS, eNOS 및 Nox4은 단백질 수준에서 발현이 감소하는 것을 확인하였다(도 9A 및 도 9B). TGF-β1 치료 또한 음성대조군(PBS 처리군)과 비교해 볼 때, 아토피 피부염 개 피부에서 RelA 및 RelB의 발현을 유의하게 감소시키는 것을 확인하였다(도 9C).

또한, 상기 cATSC의 추출물, IL-10 또는 TGF-β1을 처리한 아토피 피부염 피부에서 각질세포(keratinocytes)의 보호 효과를 확인하기 위해서, cATSC의 추출물, IL-10 또는 TGF-β1을 처리 후, 피부 각질세포군의 발현을 분석하였다.

그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, cATSC 추출물, IL-10 또는 TGF-β1을 처리한 피부의 각질세포군(KRT6A, KRT6B 및 KRT16)은 유의하게 보호되었고, 대조적으로 음성대조군(PBS 처리군) 및 양성대조군(HA 처리군)은 정상피부보다 각질세포가 오히려 감소하는 것을 확인하였다(도 10).

<6-3> 면역조직병리학적 방법을 통한 아토피 피부염 병소에서 IL -10 및 TGF -β1의 효과 확인

IL-10 또는 TGF-β1의 처리 후의 아토피 피부염 병소에서 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 <3-2>에 기재된 방법에 따라, 각각의 처리된 피부 조직에서 면역염색을 수행하였다.

상기 피부 조직에서 세포 내부의 활성 산소종(ROS)의 수준은 형광 탐지자(fluorescent probe) DCFDA [5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate] 를 사용해서 평가하였다. 형광 현미경을 이용한 시각화를 위해서, 세포들은 유리 바닥 디쉬(dishes)에서 배양하였고 0.3 mM H₂O₂를 6시간 동안 처리하였다. 상기 처리된 세포를 세척한 다음 10μM DCFDA를 가지고 30 분 동안 37℃에서 처리하였고 형광현미경을 사용해서 (ex/em = 495/525 nm)조건에서 영상화했다. ROS 생산의 정량적 분석을 위해서, 96-웰 플레이트에 있는 제대혈 유래 중간엽줄기세포(UCB-MSCs)를 HBSS를 가지고 세척하고 10 μM DCFDA를 가지고 30 분 동안 37℃에서 처리했다. 상기 처리된 세포를 HBSS를 가지고 3회 세척하고 100 μM tBHP 단독 또는 SS-31를 가지고 조합해서 노출 처리했다. 485/530 nm의 여기/방출(excitation/emission)파장 조건을 사용해서 마이크로 플레이트 분광형광미터(microplate spectrofluorometer)(Molecular Devices 사, 미국)로 실시간으로 DCF의 산화(oxidation)를 모니터하였다.

그 결과, 도 9D 및 표 3에 나타낸 바와 같이, 일반적으로, 음성(PBS 처리군) 또는 양성(HA 처리군)-처리 아토피 피부염 유도 피부 세포는 쉽게 DCFDA+ ROS를 과생산하지만, IL-10 또는 TGF-β1을 처리한 경우 ROS 생산을 유의하게 감소 또는 활성산소종 소기 단계(ROS scavenging process)를 활성하는 것, 부가적으로 ROS-매개 자가세포사적 세포 사에 대하여 증가된 보호를 나타내는 것을 확인하였다(도 9D 및 표 3).

< 실시예 7> cATSC 의 추출물의 아토피 개에 대한 임상적 가능성 확인

cATSC의 추출물의 아토피 개에 대한 임상적 가능성 확인하기 위해서, 본 발명자들은 이중 블라인드(double blind), 위약 대조군(placebo controlled) 실험을 5마리의 아토피 개에 있어서 수행하였다.

구체적으로, cATSC 추출물의 200 ng 또는 음성대조군(PBS 처리군)을 아토피 개의 병소 피부 하나에 처리하였다. 상기 처리는 3일 연속적으로 수행하였다. 상기 적용된 부위는 4 X 4 센티미터(㎝)의 넓이이다. 처리 후, 0일 및 3일째에 임상적 평가 점수에 의해 치료효과를 확인하였고 피부의 생리학적 단계를 측정하였다. 임상적인 평가에 있어서 동일한 사람이 평가하였으며, 피부의 생리학적 단계는 TWEL, 피부 수화도(hydration) 및 피부 산도(pH)를 측정하였다.

그 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이, cATSC의 추출물 적용 3일 후, 아토피 피부염의 임상적 증후가 임상적 평가 및 피부 수화가 음성대조군(PBS 처리군)과 비교하여 유의적으로 개선된 것을 확인하였다(표 4).

<110> Seoul National University <120> Composition for treating or preventing atopic dermatitis comprising adult stem cells extracts <130> 12p-09-11 <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-10 forward <400> 1 gtccctgctg gaggacttta aga 23 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-10 reverse <400> 2 tggtcggctc tcctacatct cg 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-beta 1 forward <400> 3 tcgacatgga actggtgaag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-beta 1 reverse <400> 4 cggagctctg atgtgttgaa 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INF-gamma forward <400> 5 tcggacggtg ggtctctttc g 21 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INF-gamma reverse <400> 6 cactttgatg agttcattta tcgcc 25 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta forward <400> 7 catatgagct tcgggctctc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta reverse <400> 8 tatatcctgg ccacctctgg 20 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-4 forward <400> 9 taaagggtct cacctcccaa ctg 23 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-4 reverse <400> 10 tagaacaggt cttgtttgcc atgc 24 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 forward <400> 11 caccaggaac gaaagagagc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 reverse <400> 12 tggaagcatc catcttttcc 20 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-12A forward <400> 13 agcctcaccg agcccagga 19 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-12A reverse <400> 14 taaggcacag gaccgtcata aaag 24 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-12B forward <400> 15 tgacatgtgg agcagtgaca 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-12B reverse <400> 16 ggtggaacct aactgcagga 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin forward <400> 17 gacgggcagg tcatcactat 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin <400> 18 acatttgctg gaaggtggac 20

Claims

성체줄기세포 추출물을 유효성분으로 함유하는, 피부염 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 성체줄기세포는 지방 또는 골수 유래인 것을 특징으로 하는 피부염 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 성체줄기세포 추출물은 성체줄기세포의 내부 물질을 추출한 것을 특징으로 하는 피부염 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 성체줄기세포의 추출물은 성체줄기세포를 액체질소를 이용하여 급속동결 및 해동을 반복하여 세포막을 약화시켜 파쇄시키는 방법으로추출한 추출물인 것을 특징으로 하는 피부염 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 성체줄기세포의 추출물은 인터루킨-10(IL-10), 인간 형질전환 성장인자-베타 1(TGF-β1)을 유효성분으로 함유하는 추출물인 것을 특징으로 하는 피부염 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 피부염은 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염(contact dermatitis), 지루성 피부염(seborrhea) 및 여드름으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 피부염 예방 및 치료용 약학적 조성물.
성체줄기세포 추출물을 유효성분으로 함유하는, 피부염의 예방 및 개선용 피부 외용제.
제 7항에 있어서, 상기 성체줄기세포는 지방 또는 골수 유래인 것을 특징으로 하는 피부염 예방 및 개선용 피부 외용제.
제 7항에 있어서, 상기 피부염은 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염(contact dermatitis), 지루성 피부염(seborrhea) 및 여드름으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 피부염 예방 및 개선용 피부 외용제.
성체줄기세포 추출물을 유효성분으로 함유하는, 피부염 예방 및 개선용 화장료 조성물.
제 10항에 있어서, 상기 성체줄기세포는 지방 또는 골수 유래인 것을 특징으로 하는 피부염 예방 및 개선용 화장료 조성물.
제 10항에 있어서, 상기 피부염은 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염(contact dermatitis), 지루성 피부염(seborrhea) 및 여드름으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 피부염 예방 및 개선용 화장료 조성물.
성체줄기세포 추출물을 유효성분으로 함유하는, 피부염 예방 및 개선용 건강식품.
제 13항에 있어서, 상기 성체줄기세포는 지방 또는 골수 유래인 것을 특징으로 하는 피부염 예방 및 개선용 건강식품.
제 13항에 있어서, 상기 피부염은 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염(contact dermatitis), 지루성 피부염(seborrhea) 및 여드름으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 피부염 예방 및 개선용 건강식품.