KR101705361B1 - Ｅｇｃｇ를 유효성분으로 함유하는 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Ｅｇｃｇ를 유효성분으로 함유하는 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 EGCG(epigallocatechin gallate)를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 EGCG를 유효성분으로 함유하는 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스의 예방 또는 치료용 조성물, EGCG를 이용한 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제하는 방법, 조절 T 세포를 활성화시키는 방법, 면역억제용 조성물 및 기능성 건강식품에 관한 것이다. 본 발명에 따른 EGCG 화합물은 염증성 사이토카인을 생성 및 분비하는 세포 독성 Th17 세포의 분화를 억제하는 효과가 우수하고, 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하고 염증 반응을 제어하는 특성을 갖는 면역조절 T 세포(Treg)는 활성화 시키는 효과가 우수하므로 면역반응의 조절 이상으로 유발되는 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스를 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물 및 면역억제제로 사용할 수 있으며, 나아가 이러한 질환들을 개선 및 예방할 수 있는 식품용 조성물로도 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

ＥＧＣＧ를 유효성분으로 함유하는 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating Sjogren's syndrome, Behcet's syndrome, Ankylosing spondylitis or Systemic lupus erythematosus comprising EGCG as an active ingredient}
본 발명은 EGCG(epigallocatechin gallate)를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 EGCG를 유효성분으로 함유하는 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
각종 병원체에 대한 생체 방어 시스템으로 면역계에서 중심적 역할을 담당하는 세포군의 하나로 T 세포가 있다. T 세포는 인체의 흉선에서 생성되며 일련의 분화 과정을 거치면서 고유의 특성을 지닌 T 세포로 분화하게 되는데, 분화를 완료한 T 세포는 그 기능에 따라 크게 1형 보조 세포(Th1)와 2형 보조 세포(Th2)로 구분된다. 이 중에서 Th1 세포의 주된 기능은 세포 매개성 면역에 관여하고, Th2 세포는 체액성 면역에 관여하며, 면역계에서 이러한 두 세포 집단은 서로 과 활성화되지 않도록 서로 견제를 통해 면역계의 균형을 유지하고 있다.
따라서 면역 질환의 대부분은 이러한 두 면역 세포간의 불균형에 기인하는 것으로 볼 수 있는데, 예를 들어 Th1 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 자가면역질환이 발생할 수 있고, Th2 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 과민반응에 의한 면역질환이 발생하는 것으로 알려져 있다.
한편, Th1 세포의 분화에 대한 최근 연구 결과에 따르면, Th1 세포의 활성을 조절할 수 있는 새로운 그룹인 면역조절 T 세포(Treg)의 존재가 알려지면서 이를 이용한 면역질환의 치료에 대한 연구가 대두되고 있는데, Treg 세포는 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하여 염증 반응을 제어하는 특성이 있어, Treg 세포의 활성을 증가시키는 작용을 통해 면역질환과 염증질환을 치료하는 실험들이 많이 보고되고 있다.
또한, Treg 세포 이 외에 분화 과정에서 만들어지는 또 다른 그룹으로 Th17 세포가 있는데, Th17 세포는 미분화 T세포의 분화 과정에서 Treg 세포의 분화와 유사한 과정을 거치며 형성되는 것으로 알려져 있다. 즉, Treg 세포와 Th17 세포의 분화는 공통적으로 TGF-β의 존재 하에서 이루어지지만 Treg 세포의 경우 IL-6을 필요로 하지 않는 반면, Th17 세포의 경우에는 TGF-β와 함께 IL-6가 존재하는 상황에서 분화를 한다. 또한, 분화된 Th17 세포는 IL-17을 분비하는 것을 특징으로 한다.
Th17 세포는 Treg 세포와는 달리 면역질환에서 보이는 염증반응의 최전방에서 관여하여 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시키는 것이 밝혀지고 있다. 그러므로 자가면역질환 중 Treg 세포에 의해 제어되지 않는 자가면역질환의 경우, Th17 세포 활성의 억제를 표적으로 한 자가면역질환의 치료제 개발이 크게 부각되고 있다.
현재 사용되고 있는 면역질환치료제로는 T 세포에서의 신호변환 경로를 차단하는 면역 억제제가 가장 많이 사용되고 있는데, 이러한 면역억제제들은 독성, 감염, 임파종, 당뇨병, 진전(tremor), 두통, 설사, 고혈압, 오심, 신기능 장애 등의 부작용이 발생하는 문제점이 있다.
또한, T 세포의 활성화를 억제하는 방법을 통해 면역질환을 치료하는 방법 이외에도 면역 세포로부터 분비되는 사이토카인의 양을 조절하는 치료법 및 면역 세포로부터 분비되는 사이토카인을 표적으로 하는 항체를 이용한 치료법이 개발 중에 있다. 그러나 이러한 방법은 실제적으로 임상실험을 거쳐 환자들에게 적용하기까지 많은 시간이 소요되어야 하고, 항체를 이용하는 방법은 항체 제작 과정에서 너무 많은 비용이 든다는 문제점이 있다.
따라서 부작용이 없고 저렴하면서도 치료 효과가 우수한 새로운 면역질환 및 염증질환 치료제의 개발이 필요한 실정이다.
따라서 본 발명의 목적은 면역반응 이상으로 유발되는 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있도록, EGCG 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 미분화 T 세포에 EGCG를 처리하는 단계를 포함하는 시험관(in vitro)내에서 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 시험관(in vitro)내에서 EGCG를 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)에 처리하는 단계를 포함하는 조절 T 세포를 활성화시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 EGCG 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스 증상의 개선 또는 예방을 위한 기능성 건강식품을 제공하는 것이다.
나아가 본 발명의 다른 목적은 EGCG 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 면역억제용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 EGCG(epigallocatechin gallate) 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스 병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 EGCG는 미분화 T 세포가 Th17 세포로 분화되는 것을 감소 또는 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 EGCG는 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성 또는 증폭을 촉진 또는 증가시키는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 미분화 T 세포에 EGCG(epigallocatechin gallate) 화합물 또는 그의 염을 처리하는 단계를 포함하는 시험관(in vitro)내에서 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화 감소 또는 억제는 IL-17 사이토카인의 생성 억제를 통해 이루어지는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 시험관(in vitro)내에서 EGCG(epigallocatechin gallate) 화합물 또는 그의 염을 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)에 처리하는 단계를 포함하는 조절 T 세포를 활성화시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 활성화된 조절 T 세포는 Foxp3의 발현이 증가되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 EGCG(epigallocatechin gallate) 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스 병의 개선 또는 예방을 위한 기능성 건강식품을 제공한다.
나아가 본 발명은 EGCG(epigallocatechin gallate) 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 면역억제용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 EGCG 화합물은 염증성 사이토카인을 생성 및 분비하는 세포 독성 Th17 세포의 분화를 억제하는 효과가 우수하고, 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하고 염증 반응을 제어하는 특성을 갖는 면역조절 T 세포(Treg)는 활성화 시키는 효과가 우수하므로 면역반응의 조절 이상으로 유발되는 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스를 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물 및 면역억제제로 사용할 수 있으며, 나아가 이러한 질환을 개선 및 예방할 수 있는 식품용 조성물로도 사용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에서, 마우스로부터 분리한 비장세포를 Th17 분화조건으로 처리함과 동시에 각 농도별로 EGCG를 처리한 후 생성되는 IL-17 사이토카인의 분비량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에서, 마우스로부터 분리한 비장세포를 Th17 분화조건으로 처리함과 동시에 각 농도별로 EGCG를 처리한 후 발현된 IL-17 및 Foxp3의 발현정도(mRNA)를 RT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 것으로서, 2a는 IL-17 mRNA의 양을 측정한 결과이고, 2b는 Foxp3 mRNA의 양을 측정한 결과이다.
도 3은 루프스 증후군 마우스를 대상으로 EGCG를 처리한 군과 처리하지 않은 군을 대상으로 각 마우스의 비장 조직에서 분화된 Th17 세포 및 Treg 세포의 증폭정도를 CD4, CD25, Foxp3, IL-17에 대한 항체를 이용하여 면역염색한 후, 공초점 현미경을 통해 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 4는 루프스 증후군 마우스로부터 분리한 비장세포를 Treg 분화 조건으로 자극함과 동시에 EGCG를 처리한 후 발현되는 Foxp3 및 Treg의 발현정도를 CD4, CD25, Foxp3에 대한 항체를 이용하여 면역 염색한 후 유세포분석기(FACs,fluorescent-activated cell sorter)를 통해 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 EGCG, 즉 (-)-에피갈로카테킨 갈레이트((-)-epigallocatechin gallate)를 유효성분으로 함유하는 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스 병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.
본 발명에 따른 상기 조성물의 유효성분인 EGCG는 차과(茶科)에 속하는 차나무에 함유되어 있는 여러 활성 성분 중 폴리페놀(polyphenol)류의 일종으로, 가장 활성도가 높은 주요 성분이며 녹차의 효과를 담당하는 물질로 알려져 있다. 이러한 EGCG는 구조상 두 개의 트리페놀기(triphenolic group)을 가지고 있는데 이 구조가 강력한 약리 작용을 담당하는 것으로 알려져 있다(Matsuo,N. et al., Allergy, 52(1997) 58-64). 이러한 EGCG의 약리작용은 주로 강력한 항산화 작용(Guo.G. et al., Biochim . Biophys , Acta , 1304(1996) 210-222), 항균작용 및 항 돌연변이 작용이 있는 것으로 알려져 있다.
또한, 대한민국 공개특허 제2002-55735호에는 일과성 전뇌허혈에 대한 신경세포 손상 예방 또는 치료제로서 EGCG를 사용하는 것에 대해 개시하고 있으며, 대한민국 등록특허 제449228호에는 니코틴산류와 EGCG를 반응시켜 제조한 EGCG의 유도체를 사용한 화장료 조성물에 대해서도 개시하고 있고, 대한미국 등록특허 제633357호에는 에피갈로카테킨 갈레트 및 코코아 추출물을 포함하는 항암제에 대한 내용이 개시되어 있는 등, EGCG는 매우 다양한 분야에서 다양한 용도로 사용됨이 공지되어 있다. 그러나 이러한 선행문헌 모두에는 EGCG를 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군 또는 루프스 병의 치료를 위한 용도로 사용될 수 있다는 내용에 대해서는 전혀 언급된 바가 없다.
따라서 본 발명에서는 EGCG 화합물이 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스를 예방 또는 치료하기 위한 용도로 사용할 수 있으며, 특히 EGCG가 병원성 세포인 Th17 세포 분화는 억제시키는 동시에 면역조절 T 세포의 활성은 촉진시키는 기작을 통해 상기 질환의 예방 또는 치료 효과를 유도할 수 있다는 사실을 최초로 규명하였다.
한편, 면역계는 정상상태에서는 자가항원에 대한 특이적 면역반응을 제어하고 있으며, 외부항원에 대한 면역반응도 억제하고 있는 경우가 있는데, 예컨대 임산부의 태아에 대한 반응 및 만성감염 상태에 있는 미생물에 대한 면역반응을 들 수 있다. 이러한 현상들은 항원 특이적 면역관용이 유도될 수 있는 기전으로 클론 제거(clonal deletion), 클론 무반응(anergy) 및 면역조절 T 세포(Treg)에 의한 능동적 통제에 의해 유도되는 것으로 알려져 있다. 이식항원에 대한 면역관용이 우연히 획득된 일부 환자나 실험적으로 면역관용을 유도한 동물모델을 조사해 보면 위의 세 가지 기전 모두 이식면역관용에 관여한다는 사실이 확인되고 있고, 특히 최근에는 면역조절 T 림프구가 이식면역반응 뿐만 아니라 자가면역, 종양면역, 감염면역반응 등 생체의 거의 모든 면역반응을 통제하는데 관여하는 중요한 세포로 주목받고 있다.
최근 그 존재가 밝혀진 면역조절 T 세포, 즉, 면역조절 T 림프구(Treg)는 크게 자연성(natural) Treg와 적응성(adaptive) Treg 세포로 나눌 수 있으며, 자연성 Treg인 CD4+ CD25+ T 세포는 이 세포가 흉선에서 새로이 만들어질 때부터 면역억제기능을 부여받게 되며, 정상개체의 말초 CD4+ T 림프구 중 5~10%의 빈도로 존재한다. 아직까지 이 세포의 면역억제 기전은 정확히 파악되지 못하고 있지만, Foxp3라는 유전자의 발현 제어 인자가 이 세포의 분화와 활성에 중요한 역할을 수행한다는 사실이 최근에 밝혀졌다. 또한, 말초 자연성 T 세포는 특정 환경하에서 자가 또는 외부항원의 자극을 받으면 면역억제효과를 나타내는 세포로 분화될 수 있는데, 이를 적응성(adaptive) 또는 유도성(inducible) Treg로 부르며, IL-10을 분비하는 Tr1, TGF-β를 분비하는 Th3 및 CD8 Ts등이 여기에 해당한다.
또한, 앞서 종래기술에도 기술한 바와 같이, T 세포는 Treg 세포 이 외에 분화 과정을 통해 Th17 세포로도 분화되는데, Th17 세포는 Treg 세포와 공통적으로 TGF-β의 존재 하에서 이루어지지만 Treg 세포의 경우 IL-6을 필요로 하지 않는 반면, Th17 세포의 경우에는 TGF-β와 함께 IL-6가 존재하는 상황에서 분화하고, IL-17을 분비하는 것을 특징으로 한다.
또한, Th17 세포는 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시키는 세포독성을 가지는 특성이 있다. 따라서 Th17 세포로의 분화 또는 활성의 억제는 면역질환을 치료할 수 있는 방법 중 하나이다.
이에 본 발명자들은 본 발명의 EGCG 화합물이 T 세포의 조절, 구체적으로 미분화된 T 세포가 Treg 세포 및 Th17 세포로의 분화를 조절함을 통해 면역 또는 염증관련 질환을 치료할 수 있는지를 확인하였는데, 즉, 본 발명의 일실시예에 따르면, 마우스로부터 분리한 비장 세포를 대상으로 비장에 존재하는 미분화된 T 세포가 Th17 세포로 분화될 수 있는 자극조건을 처리함과 동시에 EGCG 화합물을 각 농도별로 처리하고 배양한 다음, 세포내에서 발현되는 IL-17 사이토카인의 양을 측정하였다. 일반적으로 염증성 사이토카인인 IL-17은 Th17 세포로부터 생성되는 것으로서 생성된 IL-17의 양을 통해 미분화된 T 세포의 Th17 세포로의 분화정도를 측정할 수 있다.
그 결과, EGCG를 처리하지 않은 대조군의 경우에는 Th17 세포분화 조건에 의해 Th17 세포로 분화가 되어 IL-17 사이토카인의 생성량이 아무것도 처리하지 않은 군에 비해 현저히 증가된 것으로 나타난 반면, EGCG를 처리한 군의 경우에는 IL-17 사이토카인의 생성이 EGCG를 처리하지 않은 군에 비해 현저하게 감소하는 것으로 나타났다. 또한, 생성된 IL-17 사이토카인의 양은 처리한 EGCG의 농도에 비례하여 감소하는 것으로 나타났다(도 1 참조).
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 EGCG 화합물이 미분화된 T 세포가 염증성 사이토카인인 IL-17을 생성하는 병원성 세포인 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제한다는 사실을 알 수 있었다.
또한, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, EGCG 화합물이 면역조절 T 세포(Treg)의 활성 또는 증식에 미치는 영향을 조사하기 위해 마우스로부터 분리한 비장세포에 Th17 세포로 분화될 수 있는 자극조건을 처리함과 동시에 EGCG 화합물을 각 농도별로 처리하고 배양한 다음, 분화된 Treg 세포의 증폭 또는 활성 정도를 발현된 Foxp3의 양을 측정함으로써 확인하였는데, 상기 Foxp3는 흉선(thymus)으로부터 유래하는 면역조절 T 세포(Regulatory T cell)에 주로 존재하고, CD4+ CD25+ 표지 항원을 가진 세포에 존재하는 전사 조절 인자 (transcriptional factor)로서, 그 기능은 Foxp3를 발현하는 T 세포에 대한 항원 인지시 항원에 대해 저반응성을 가짐과 동시에 흉선으로부터 분화되어 나온 Foxp3를 발현하지 않는 CD4+ CD25- T 세포 중 잠재적으로 자가 면역증을 유발할 수 있는 T 세포들에 대하여 IL-2의 생성과 세포분열 현상을 억제하는 억제자 T 세포 (suppressor T cell)로서의 역할을 가지고 있다. 또한, Foxp3는 Foxp3를 발현하는 조절 T 세포 및 이와 세포-세포간 접촉(cell-cell contact)을 통해 CD25- T 세포에 대하여서는 IL-2 뿐만이 아니라 전사인자인 NFAT의 영향을 받는 IL-4, IFN-감마 등의 전사 조절을 억제하는 기능을 하는 것으로 밝혀져 있다. 따라서 상기와 같은 작용을 하는 Foxp3를 발현하고 있는 T 세포의 경우, 면역반응을 억제 또는 조절하는 작용을 통해 면역질환을 치료하는데 응용되고 있고, 또한, 인간에 존재하는 Foxp3를 발현하는 CD4 T 세포의 자가 항원 특이적인 T 세포(self-antigen specific T cell clone)를 고농도의 IL-2 사이토카인 처리 및 항-CD3, 항-CD28 항체와의 조합처리를 통해서 그 수를 증가시켜 세포 치료방법으로 응용하고자 하는 시도들이 있어왔다. 따라서 Foxp3의 발현 확인은 Treg 세포의 활성 또는 증폭을 측정할 수 있는 지표가 된다.
분석 결과, EGCG를 처리한 군의 경우, Treg 세포에서 발현된 Foxp3의 mRNA 양은 EGCG를 처리하지 않은 군에 비해 현저하게 증가하는 것으로 나타났고, 그 증가 정도는 처리한 EGCG의 농도에 비례하는 것으로 나타났다(도 2 참조).
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 EGCG 화합물이 미분화 T 세포를 Th17 세포로 분화되는 것을 억제 또는 감소시키는 작용을 함과 동시에 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)를 활성 또는 증폭시키는 작용을 한다는 사실을 알 수 있었다.
그러므로 본 발명의 EGCG는 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성 또는 증폭을 촉진 또는 증가시키는 작용 또는/및 병원성 세포인 Th17 세포로의 분화 억제를 통해 면역 또는 염증과 관련된 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 특징이 있다.
본 발명에서 상기 EGCG의 약리작용으로 예방 또는 치료할 수 있는 면역 또는 염증 관련 질환은 바람직하게 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스병일 수 있다.
상기 쇼그렌 증후군은 인체 밖으로 액체를 분비하는 외분비샘에 림프구가 스며들어 침과 눈물 분비가 감소하여 구강 건조 및 안구 건조 증상이 특징적으로 나타나는 만성 자가면역 질환으로서, 외부로부터 인체를 지키는 면역계에 이상이 생겨 오히려 자신의 신체를 공격하는 현상이 나타나는데, 쇼그렌 증후군의 발병 원인은 유전적인 원인, 감염에 대한 이상 면역반응, 자율신경계 장애, 호르몬 이상 등이 발병 원인으로 생각되고 있지만 아직까지 명확한 원인은 밝혀지지 않고 있다. 현재, 쇼그렌 증후군을 치료하는 방법으로는 외분비샘 증상의 치료방법에 있는데, 즉, 인공 눈물, 인공 타액, 질 윤활제 등과 같은 대치물을 사용하여 환자가 느끼는 불편함을 줄이는 것 및 인공 눈물 외에 사이클로스포린(cyclosporine) 점안액이 안구 건조증 증상 개선에 사용되고 있고, 증상이 심할 경우에는 눈물점 소작술 또는 바깥쪽 눈꺼풀 봉합술 등의 시술을 시행하기도 한다. 또 다른 치료방법으로는 외분비샘 외 증상의 치료방법에 있는데, 이는 관절통과 근육통에 사용하는 비스테로이드성 항염제나 항말라리아제를 사용하는 방법이다.
또한, 상기 베체트 증후군은 구강 궤양, 음부 궤양, 안구 증상 외에도 피부, 혈관, 위장관, 중추신경계, 심장 및 폐 등 여러 장기를 침범할 수 있는 만성 염증성 질환으로서, 각 증상의 기본적인 특징은 혈관에 염증이 생기는 혈관염(vasculitis)이다. 베체트 증후군의 정확한 발병 원인은 아직 밝혀져 있지 않지만, 오래 전부터 유전적인 소인이 있는 환자에서 환경적인 요인이 더해지면서 면역반응이 활성화되고, 그 결과 여러 가지 증상이 나타난다고 알려져 있다. 따라서 과도한 면역반응을 억제함과 동시에 염증반응을 감소시킬 경우 베체트 증후군의 증상을 예방 또는 치료할 수 있다.
또한, 상기 루프스는 전신성 홍반성 루푸스라고 불리며, 주로 가임기 여성을 포함한 젊은 나이에 발병하는 만성 자가면역질환으로서, 외부로부터 인체를 방어하는 면역계가 이상을 일으켜 오히려 자신의 인체를 공격하여 발생하며, 이로 인해 피부, 관절, 신장, 폐, 신경 등 전신에서 염증 반응이 일어나게 된다. 루푸스는 만성적인 경과를 거치며 시간에 따라 증상의 악화와 완화가 반복되기도 한다. 이러한 루푸스는 몇 가지 유전자와 호르몬, 환경적 요인이 복합적으로 작용하여 발생하는 것으로 알려져 있지만 구체적인 관계는 아직 확실하지 않다. 한편, 루푸스는 아직 완치할 수 있는 방법이 없으므로 과도한 면역반응을 억제시켜 질환의 증상을 경감시키거나 또는 예방하는데 그치고 있다.
또한, 강직성척추염의 경우, 강직이란 오랜 기간의 염증 후 관절에 변화가 일어나 관절의 움직임이 둔해지는 것을 의미하고, 척추염이란 척추에 염증이 생기는 병이라는 뜻이다. 따라서 강직성 척추염은 '척추에 염증이 생기고 움직임이 둔해지는 병'이라고 할 수 있다. 강직성 척추염은 류마티스 인자(rheumatoid factor)가 음성인 ‘혈청음성 척추관절병증’이라는 질환군에서 가장 흔한 질환으로, 엉덩이의 천장관절과 척추관절을 특징적으로 침범하는 만성 염증성 질환이며, 면역계의 이상에 의해 발병한다. 발뒤꿈치, 앞가슴뼈와 같이 인대나 힘줄이 뼈에 붙는 부위에 염증이 생기는 골부착부염이 특징적이며, 관절 외에도 눈, 위장관계, 폐, 심장, 신장, 전립선 등 다른 장기도 침범할 수 있다. 현재, 강직성척추염의 치료를 위해 운동요법, 수술 및 면역억제제 등이 사용되고 있다.
이상 살펴본 바와 같이, 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 및 루프스병은 면역계의 이상, 특히 과도한 면역반응 또는 염증반응의 이상으로 유발되는 질환이므로, 이러한 면역반응 및 염증반응이 정상상태를 유지하도록 할 경우, 상기 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
따라서 본 발명에 따른 EGCG는 과도한 면역반응을 정상으로 조절할 수 있는 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)를 활성 또는 증폭시킬 수 있으며, 동시에 염증성 사이토카인을 분비하는 Th17 세포분화를 억제하는 활성이 우수하므로 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스를 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명에서 상기 조절 T 세포의 활성이란, 생체 내에서 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg), 즉, 자연성(natural) Treg 와 적응성(adaptive) Treg 세포를 모두 포함하는 Treg 세포가 가지는 모든 기작이 촉진 또는 증진되는 것을 말하며, 생체 내의 면역반응이 정상상태를 유지하도록 면역조절작용, 예컨대 면역억제반응이 촉진 또는 증진되는 것을 말한다.
또한, 상기 “증폭(expansion)”이란 미분화 T 세포가 조절 T 세포로 분화 및 증식되는 것을 말하는 것으로서, '분화(differentiation)'는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말하며, '증식(proliferation)' 은 세포가 분열되어 동질의 것이 불어나는 것으로서 보통 다세포생물의 체내에서 세포수가 증가되어 가는 것을 말한다.
그러므로 본 발명은 EGCG를 유효성분으로 함유하는 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스 병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 EGCG는 하기 화학식 1로 표시되는 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin gallate, EGCG, 갈산염-3-에피갈로카테킨)일 수 있다.
<화학식 1>
또한, 본 발명에 따른 상기 EGCG 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.
본 발명에 따른 EGCG 화합물은 천연으로부터 분리되거나 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조된 것을 사용할 수 있다.
바람직하게는 종래의 물질을 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 천연으로부터 수득한 것을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 녹차로부터 분리된 것을 사용할 수 있다. 그러나 본 발명에서 사용할 수 있는 EGCG 화합물은 상기 방법으로부터 수득하는 것으로 제한되지는 않는다. 본 발명의 일실시예에서는 시중에서 판매되고 있는 것을 구입하여 사용하였다.
상기 천연으로부터 EGCG 화합물을 추출하기 위해 사용할 수 있는 적절한 용매로는 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 방법으로 수득한 추출물로부터 본 발명의 EGCG 화합물의 분리 및 정제는 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 실리카겔(silica gel)이나 활성 알루미나(alumina)등의 각종 합성수지를 충진한 컬럼 크로마토그라피(column chromatography) 및 고속액체크로마토그라피(HPLC) 등을 단독으로 혹은 병행하여 사용할 수 있다. 그러나 유효성분의 추출 및 분리정제 방법은 반드시 상기한 방법에 한정되는 것은 아니다.
한편, 본 발명에 따른 EGCG 화합물이 치료 효과를 유도할 수 있는 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스병은 면역질환 또는 염증질환에 속하는 질환으로서, 상기 “면역질환”은 포유류 면역계의 구성성분들이 포유류의 병리상태를 야기하거나, 매개하거나 또는 기타 공헌하는 질환을 의미한다. 또한, 면역 반응의 자극 또는 중단이 그 질병의 진행에 보상적인 효과를 갖는 질환을 말하며, 본 발명에서는 특히 과민성 면역반응으로 인해 야기되는 질환들을 일컫는다.
또한, 모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중의 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 비자기(non-self) 항원들에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있는 능력을 가지고 있다. 이처럼 자기항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라고 한다.
그러나 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는데 이러한 과정에 의해 발생되는 질환을 “자가면역질환“이라고 한다.
또한, “염증성 질환”이란 염증유발인자 또는 방사선조사 등 유해한 자극으로 인해 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1(interleukin-1), IL-6, 프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 또는 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증유발물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 말한다.
그러므로 본 발명에 따른 상기 조성물은 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
상기 '치료'란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 '치료'란 용어는 '치료하는'이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스의 "치료" 또는 "치료요법" 은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:
(1) 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴,
(2) 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스의 확산을 예방함,
(3) 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스를 경감시킴,
(4) 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스의 재발을 예방함, 및
(5) 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스의 증상을 완화함(palliating).
본 발명에 따른 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 EGCG 화합물 또는 그의 염을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.
본 발명에 따른 EGCG 화합물 또는 그의 염의 약학적으로 유효한 양은 0.5 ~ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5 ~ 5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 상기에서 약학적으로 허용되는이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스의 예방 또는 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스의 예방 또는 치료용 조성물은 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
따라서 본 발명은 EGCG 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 포함하는 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스의 예방 또는 치료용 약제를 제공할 수 있으며, 나아가 본 발명은 EGCG 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 면역억제용 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 미분화 T 세포에 EGCG 화합물을 처리하는 단계를 포함하는 시험관(in vitro)내에서 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제하는 방법을 제공할 수 있으며, 상기 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화 감소 또는 억제는 IL-17 사이토카인의 생성 억제를 통해 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명은 시험관(in vitro)내에서 EGCG 화합물을 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)에 처리하는 단계를 포함하는 조절 T 세포를 활성화시키는 방법을 제공할 수 있으며, 본 발명에 따라 활성화된 상기 조절 T 세포는 Foxp3의 발현이 증가된다.
본 발명에 따른 상기 시험관(in vitro)내에서 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제하는 방법, 및 조절 T 세포를 활성화시키는 방법에 있어서 EGCG 화합물을 세포에 처리하는 방법은 상기 세포를 배양하는 배지에 EGCG 화합물을 직접 처리하거나 또는 상기 본 발명에 따른 EGCG 화합물을 유효성분으로 하는 조성물을 배양 배지에 처리하는 것일 수 있다. 또한, 이때 상기 배양 배지에 처리할 수 있는 EGCG 화합물의 농도는 최종농도가 1uM~100uM이 되도록 처리할 수 있으며, 본 발명의 일실시에에서는 EGCG 화합물의 농도가 최종 1uM, 10uM 및 50uM이 되도록 세포의 배양 배지에 첨가하였다.
나아가 본 발명에 따른 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스의 예방 또는 치료용 조성물은 면역 조절 T 세포(Treg)의 활성 또는 증폭 효과가 우수하고, 염증성 사이토카인을 생성하는 병원성 세포인 Th17 세포 분화를 억제하는 효과가 우수할 뿐만 아니라, 약물에 대한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 특히 본 발명의 조성물에 함유된 유효성분인 EGCG 화합물은 대부분 천연식물, 예컨대 녹차에 많이 존재하고 있어, 천연으로부터 수득한 EGCG 화합물을 사용할 경우에는 체내에 대해 더욱 안정한 특징이 있다.
따라서 본 발명은 EGCG 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스의 증상을 개선 또는 예방할 수 있는 식품용 조성물을 제공할 수 있으며, 본 발명에 따른 상기 식품용 조성물은 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스 증상의 개선 또는 예방에 효과가 있는 식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 용이하게 활용할 수 있다.
본원에서 상기 “식품”이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.
본원발명에 따른 상기 식품용 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본원발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
또한, 상기 “기능성 식품”이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
또한, 본원발명에서 상기“음료”란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스 증상의 개선 또는 예방용 조성물을 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
나아가 상기 기술한 것 이외에 본원발명의 쇼그렌 증후군, 베체트 증후군, 강직성척추염 또는 루프스 증상의 개선 또는 예방을 위한 식품용 조성물을 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본원발명의 식품용 조성물을 함유하는 식품에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001중량% 내지 90중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 40중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100ml를 기준으로 0.001g 내지 2g, 바람직하게는 0.01g 내지 0.1g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 1>
Th17 세포에서 EGCG 에 의한 IL -17 생성억제 활성 분석
본 발명자들은 EGCG 화합물이 병원성 세포인 Th17세포에서 염증성 사이토카인인 IL-17의 생성을 억제하는 활성이 있는지를 다음과 같은 방법으로 조사하였다. 이를 위해 먼저 마우스로부터 비장(spleen)세포를 수득하였는데, 즉, 마우스로부터 적출 된 비장은 유리 슬라이드를 이용하여(teasing slide) 비장 조직을 잘게 갈은 후 적혈구 용혈 용액으로 비장내의 적혈구를 제거하였다, 이후 PBS 완충 용액을 첨가하고 원심분리하여 세척함으로써 비장세포를 수득하였다. 그런 뒤, 상기 비장세포를 대상으로 Th17세포를 자극시킬 수 있는 조건인 anti-CD3 항체 2 ug/mL, anti-CD28 항체 1 ug/mL, anti-IFNr 항체 10 ug/mL, anti-IL-4 항체 10 ug/mL 및 TGF beta 2ng/mL를 동시에 함께 처리한 후, 3일 동안 세포를 배양하였으며, 이때 상기 세포에 EGCG 화합물을 각각 0uM, 1uM, 10uM 및 50uM의 농도로 처리하여 배양하였다. 이후, 3일 동안 배양한 상기 세포의 배양액을 수득한 후, 당업계에 공지된 ELISA 방법을 통해 배양액에 존재하는 IL-17 사이토카인의 양을 측정하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 병원성 세포인 Th17세포로부터 생성되는 염증성 사이토카인인 IL-17은 본 발명의 EGCG 화합물에 의해 생성이 억제되는 것으로 나타났으며, EGCG 농도 의존적으로 IL-17의 생성이 감소되는 것으로 나타났다.
< 실시예 2>
PCR 방법을 통한 Treg 세포에서 EGCG 의 영향 분석
제어성 T 림프구, 즉 Treg(regulatory T lymphocytes) 세포는 면역 관용의 유지에서 핵심적인 역할을 수행하는 것으로 알려져 있고(Nat. Rev. Immunol. 2009, 7:305), 주로 흉선에서 생산되고 전사 인자인 Foxp3의 발현이 요구되며, Foxp3는 염증성 사이토카인의 생성을 억제하는 역할도 하는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 본 발명에 따른 EGCG 화합물이 면역조절 세포인 Treg 세포의 활성을 활성화시키는 작용이 있는지를 조사하기 위해, 상기 실시예 1의 Th17세포 자극 조건으로 마우스의 비장 세포를 자극시킨 후, 상기 세포로부터 발현되는 IL-17 및 Foxp3의 발현 정도, 즉, mRNA를 역전사 중합효소 반응을 통해 측정하였다. 즉, Th17 분화조건에서 세포에 대해 EGCG를 0 ng/ml, 1 ng/ml, 10 ng/ml 및 50 ng/ml으로 각각 처리한 후, 상기 세포들로부터 당업계에 공지된 방법에 따라 RNA를 각각 추출한 다음, Foxp3 및 IL-17을 증폭할 수 있는 프라이머들을 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였으며, RT-PCR를 위한 반응 화합물은 총 25 μl가 되도록 하였고, 용액의 조성은 2.5 μl의 10x 반응버퍼, 0.5 mM의 dNTP 및 하기 표 1에 기재된 서열을 갖는 각각의 프라이머 쌍을 사용하였고, 증폭은 Dual-bay Thermal cycler system 기기를 사용하여 변성 단계에서 94℃ 30초, 어닐링 단계에서 60℃ 30초, 신장 단계에서 72℃ 30초간의 반응을 25회 반복하였다.
프라이머 서열
프라이머 프라이머 서열 서열번호
IL-17 센스 5’-CCACTCTGTAGCACCCCAATG-3‘ 1
IL-17 안티센스 5’-CCTGGAGATGTAGCCCTGGTC-3‘ 2
Foxp3 센스 5’-ATGCCTCCTCTTCTTCCTTGA-3‘ 3
Foxp3 안티센스 5’-TGAGAAGGGCAGGGCACAAT-3‘ 4
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, IL-17의 발현은 EGCG의 처리에 의해 농도 의존적으로 점점 감소하는 것으로 나타난 반면, Foxp3의 발현은 EGCG의 처리에 의해 농도 의존적으로 점점 증가하는 것으로 나타났다.
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 EGCG 화합물의 경우, 병원성 세포인 Th17로의 세포 분화는 억제하고, 반면, Foxp3의 발현은 증가시키는 활성이 있음을 확인함에 따라 EGCG가 면역조절세포인 Treg 세포를 활성화시키는 작용을 통해 쇼그렌 증후군, 루프스 증후군, 강직성척추염, 베체트 증후군과 같은 염증성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
< 실시예 3>
동물모델을 대상으로 한 EGCG 의 영향 분석
나아가 본 발명자들은 상기 실시예 2를 통해 확인한 EGCG의 효과를 동물모델을 대상으로 하여 보다 확실히 확인하였는데, 즉, 루프스증후군을 유발시킨 마우스 군을 두 군으로 나눈 후, 이 중 한 군에 대해서는 EGCG를 10uM의 농도로 10회 복강내로 주사하였으며, 다른 한 군은 대조군으로서 EGCG를 주사하지 않은 것을 사용하였다. 투여가 끝난 후 각 마우스 군으로부터 상기 실시예 1의 방법과 동일하게 비장조직을 분리한 다음, Th17 세포군과, Treg 세포군을 비교 평가 하고자, Th17 세포 분화 확인을 위해 CD4, IL-17 항체로 면역 염색하였고, Treg 세포 확인을 위해서는 CD4, CD25, Foxp3 항체를 면역 염색한 후, 공초점 현미경으로 관찰 하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 루프스증후군 마우스 군에게 EGCG를 처리한 경우, 비장에서 Treg 세포가 활성화 되었음을 확인할 수 있었는데, 즉, 빨간색으로 염색된 CD4 및 파란색으로 염색된 CD25가 같이 발현되어 보라색을 띄는 것을 확인할 수 있었고, 핵안에는 녹색으로 염색된 Foxp3가 대조군에 비해 많이 발현된 것으로 나타났다. 반면, Th17 세포 분화 정도를 측정한 경우, EGCG를 처리하지 않은 대조군이 처리한 군에 비해 녹색의 IL-17이 더 많이 발현되어 있는 것으로 나타났다.
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 EGCG가 루프스증후군의 조직에서 Treg 세포는 활성화시키는 반면 병원성 세포인 Th17 세포의 분화는 감소시키는 작용이 있다는 사실을 알 수 있었으며, 따라서 이러한 EGCG의 작용에 의해 루프스증후군을 예방 또는 치료할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
< 실시예 4>
EGCG 에 의한 Treg 세포의 증가 효과
보다 구체적으로 본 발명의 EGCG에 의한 Treg 세포의 증가 효과를 확인하기 위해, 본 발명자들은 루프스 증후군의 마우스로부터 상기 실시예 1의 방법과 동일하게 비장세포를 수득한 후, 수득한 상기 비장세포에 anti-CD3 항체 2 ug/ml 및 TGF beta 5ng/ml을 처리하여 Treg 세포가 분화되는 조건을 주었으며, 이때 EGCG를 10ng/ml의 농도로 첨가한 후, 72시간 동안 배양하였다. 대조군으로는 EGCG를 첨가하지 않은 것을 사용하였다. 배양 후 EGCG에 의해 Treg의 세포군이 차이가 있는지를 비교 평가 하고자, 당업계에 공지된 방법으로 CD4, CD25, Foxp3에 대한 항체로 면역 염색한 후, 유세포분석기(FACs,fluorescent-activated cell sorter)를 이용하여 Treg 세포군을 분석 하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 10ng/ml의 EGCG를 처리한 경우, Foxp3의 발현은 21.57로 나타난 반면, 처리하지 않은 대조군은 2.69로 나타났다. 이러한 결과를 통해 EGCG의 처리는 처리하지 않은 군에 비해 Treg 세포를 약 10배 이상 증가시킬 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University <120> Composition for preventing or treating Sjogren's syndrome, Behcet's syndrome, Ankylosing spondylitis or systemic lupus erythematosus comprising EGCG as an active ingredient <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-17 sense primer <400> 1 ccactctgta gcaccccaat g 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-17 antisense primer <400> 2 cctggagatg tagccctggt c 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Foxp3 sense primer <400> 3 atgcctcctc ttcttccttg a 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Foxp3 antisense primer <400> 4 tgagaagggc agggcacaat 20

Claims (9)

  1. EGCG(epigallocatechin gallate) 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 베체트 증후군 또는 강직성척추염의 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 EGCG는 미분화 T 세포가 Th17 세포로 분화되는 것을 감소 또는 억제하는 것을 특징으로 하는 베체트 증후군 또는 강직성척추염의 예방 또는 치료용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 EGCG는 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성 또는 증폭을 촉진 또는 증가시키는 것을 특징으로 하는 베체트 증후군 또는 강직성척추염의 예방 또는 치료용 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. EGCG(epigallocatechin gallate) 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 베체트 증후군 또는 강직성척추염의 개선 또는 예방을 위한 기능성 건강식품.
  9. 삭제
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Effects of epigallocatechin gallate on regulatory T cell number and function in obese v. lean volunteers, British Journal of Nutrition, 103, 1771-1777(Published online: 2010.02.23.)*
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Green tea EGCG suppresses specific antigen driven T cell response and affects CD4+ T cell differentiation, The FASEB Journal, 24(1) supplement 326.8(2010.04.)*
Th17 and Natural Treg Cell Population Dynamics in Systemic Lupus Erythematosus, ARTHRITIS & RHEUMATISM, 60(5), 1472-1483(2009.05.)*

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