KR20120035741A

KR20120035741A - 퀘르세타제틴을 함유하는 아토피피부염의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20120035741A
Application number: KR1020100097449A
Authority: KR
Inventors: 유은숙; 강경진; 한상철; 이은주; 홍정연; 강희경
Original assignee: 제주대학교 산학협력단
Priority date: 2010-10-06
Filing date: 2010-10-06
Publication date: 2012-04-16

Abstract

본 발명은 퀘르세타제틴(Quercetagetin) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 아토피피부염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 퀘르세타제틴(Quercetagetin) 화합물은 아토피피부염을 유발하는 것으로 알려진 중요 케모카인(chemokine) 중 하나인 MDC(Macrophage-derived chemokine) 생성을 억제하는 효과가 유수하고, 더불어 또 다른 케모카인인 TARC(Thymus and activation-regulated chemokine)의 생성 또한 억제하는 효과가 우수하므로 과도한 면역반응으로 유발되는 아토피피부염 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물 및 MDC 단백질 생성 또는 MDC 유전자 발현 억제용 조성물로 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 퀘르세타제틴 화합물은 천연물에서 추출 가능한바, 약물에 대한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있고 체내에 안정한 효과가 있다.

Description

퀘르세타제틴을 함유하는 아토피피부염의 예방 또는 치료용 조성물 {Composition comprising quercetagetin for preventing or treating atopic dermatitis}

본 발명은 만성 재발성 피부염인 아토피 피부염을 효과적으로 예방하고 치료하는데 사용될 수 있는 아토피 피부염의 예방 또는 치료를 목적으로 한 약학 조성물에 관한 것이다.

아토피(atopy)는 '이상한' 또는 '괴상한'의 의미의 라틴어 'atopia'에서 유래한 말로, 음식물 혹은 흡입성 물질에 대한 알레르기 반응을 일컫는다. 아토피성 피부염(atopic dermatitis, AD)은 유아와 소아에서 가장 흔한 염증성 피부질환으로 심한 소양감, 홍반, 부종, 삼출 가피, 인설 태선화 등을 특징으로 하며(Novenbre 등, 2001; Leung과 Bieber, 2003; Leung 등, 2004; Boguniewicz와 Leung 2006), 재발이 잦고 만성으로 경과하며 반복적인 소파로 인한 참상과 태선화 등 2차적인 병변이 특징적으로 나타난다. 또한 천식, 알레르기 비염이나 식품 알레르기와도 연관이 많은 만성적인 피부의 염증성 질환이다.

대개 아토피 피부염은 흔히 태열이라 부르는 영유아기 습진으로부터 시작하는데, 급성기에는 피부가 가렵고, 붉어지거나 붓거나 좁쌀처럼 돋아 오르거나, 작은 물집이 잡히거나 습하고 딱지가 앉는 등의 증상을 보이며, 만성기에는 가렵고, 피부가 딱딱하게 되거나 두꺼워지거나 줄이 가거나 쌀가루 같은 비늘이 앉거나 검어지거나 또는 희게 탈색되는 등의 증상을 보인다.

과거 1970년대 까지는 아토피피부염의 발생 빈도가 6세 이하의 어린이의 경우 약 3% 정도로 보고되었으나 최근에는 전세계적으로 어린이에게서 20% 이상, 성인에서도 1~3%정도 발생하는 것으로 추정하고 있다(Wuthrich, 1999; Willams&Wuthrich, 2000; Wuthrich&Schmid-Grendelmeier, 2003). 대한 소아 알레르기 호흡기 학회에서 우리나라 초등학생, 중학생을 대상으로 아토피피부염으로 진단받은 비율을 조사한 결과, 1995년 19.7%에서 10년이 지난 2005년에 29.2%로 상승하였으며, 1년 동안 아토피 피부염으로 치료받은 경험을 조사한 결과 1995년 9.3%에서 2005년 14.5%로 증가하였다(Nam 등, 2005). 동 단체에서 2000년에 초, 중학생을 대상으로 한 역학조사에서는 초등학생의 24.9%, 중학생의 12.8%가 아토피피부염으로 진단받은 것으로 나타나(Kim 등, 2003) 그 사회적 심각성을 유추해 볼 수 있다. 최근에는 성인에서도 아토피피부염이 증가하고 있으며, 성인 아토피피부염의 위험 인자로 얼굴과 목에 병변이 있는 경우나 동물, 꽃가루, 니켈 알레르기가 있는 경우, 형제가 아토피피부염 환자인 경우 등이 제시되고 있다(Sandstrom&Faergmann, 2004).

현재까지 아토피피부염의 원인은 명확히 규명되어 있지 않지만, 환경적인 요소와 유전적인 소인이 모두 관여하는 복합적인 질환으로 알려져있다. 통상적으로 아토피 피부염을 앓고 있는 사람은 집 먼지, 진드기, 동물의 털, 음식물, 꽃가루 또는 곰팡이 등과 같이 외부환경의 이물질에 대해 쉽게 알러지 반응을 나타내며, 알러지성 비염, 천식, 결막염, 장관염 등을 동반하는 면역 체계의 교란에 의하여 발생하는 것으로 추정되기 때문이다. 더불어 최근 아토피피부염의 발생률 증가에 영향을 미치는 요인으로는 대기오염, 핵가족화, 모유 수유의 감소, 수입과 교육수준의 증가, 항생제 사용의 증가로 인한 항원에 대한 노출의 증가, 주거 환경의 변화, 공업 발달로 인한 새로운 항원 물질의 등장 등이 관여하는 것으로 생각된다(Wollenberg 등, 2000).

현재 아토피피부염 치료약으로는 스테로이드제, 항히스타민제, 면역조절제 등이 사용되고 있으나, 그 중 스테로이드계 약품이 소염 효과 및 면역 억제 효과가 가장 우수한 것으로 알려져 있다. 그러나 스테로이드제를 장기간 사용하면 바른 부위의 피부에서 털이 나고 피부가 위축되며, 피부 색소가 적어지고 피부가 얇아지는 등 부작용을 일으키는 것으로 보고되고 있다.

그리하여 기존 화학 약품의 부작용을 최소화하면서도, 최근 급증하고 있는 아토피피부염을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 우수한 효능의 새로운 약학적 조성물을 찾고자 하는 노력이 계속되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 퀘르세타제틴(quercetagetin) 화합물이 아토피피부염을 유발하며, 그 증상을 악화시킨다고 알려진 케모카인(chemokine)인 MDC(Macrophage-derived chemokine) 단백질의 생성을 저해하고, TARC(Thymus and activation-regulated chemokine) 단백질의 생성 또한 억제하는 작용이 있다는 사실을 최초로 규명함으로서, 퀘르세타제틴 화합물을 아토피피부염의 치료제로 사용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 아토피피부염을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있도록, 퀘르세타제틴 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 아토피피부염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 퀘르세타제틴 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 MDC(Macrophage-derived chemokine) 단백질 생성 또는 MDC 유전자 발현 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 퀘르세타제틴 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 아토피피부염의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 퀘르세타제틴(quercetagetin) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 아토피피부염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

<화학식 1>

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 퀘르세타제틴 화합물은 감귤 미숙과로부터 유래된 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 퀘르세타제틴 화합물은 MDC(Macrophage-derived chemokine) 유전자의 발현 또는 MDC(Macrophage-derived chemokine) 단백질의 생성을 억제 또는 감소시킬 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 퀘르세타제틴을 10~100μM의 농도로 함유할 수 있다.

또한, 본 발명은 퀘르세타제틴(quercetagetin) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 MDC(Macrophage-derived chemokine) 단백질 생성 또는 MDC(Macrophage-derived chemokine) 유전자 발현 억제용 조성물을 제공한다.

나아가, 본 발명은 퀘르세타제틴 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 아토피피부염 예방 또는 개선용 기능성 식품을 제공한다.

본 발명에 따른 퀘르세타제틴(Quercetagetin) 화합물은 아토피피부염을 유발하는 것으로 알려진 중요 케모카인(chemokine) 중 하나인 MDC MDC(Macrophage-derived chemokine) 생성을 억제하는 효과가 우수하고, 더불어 또 다른 케모카인인 TARC(Thymus and activation-regulated chemokine)의 생성 또한 억제하는 효과가 우수하므로 과도한 면역반응으로 유발되는 아토피피부염 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물 및 MDC(Macrophage-derived chemokine) 단백질 생성 또는 MDC 유전자 발현 억제용 조성물로 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 퀘르세타제틴 화합물은 천연물에서 추출 가능한바, 약물에 대한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있으며 체내에 안정한 효과가 있다.

도 1은 퀘르세타제틴 및 플라보노이드 화합물들이 MDC 생성량에 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 퀘르세타제틴 화합물에 따른 HaCaT 세포에서의 MDC 생성량을 ELISA를 통해 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 퀘르세타제틴 화합물에 따른 HaCaT 세포에서의 MDC mRNA 생성량을 RT-PCR을 통해 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 퀘르세타제틴 및 플라보노이드 화합물들이 TARC 생성량에 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 퀘르세타제틴 화합물에 따른 HaCaT 세포에서의 TARC 생성량을 ELISA를 통해 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6는 퀘르세타제틴 화합물에 따른 HaCaT 세포에서의 TARC mRNA 생성량을 RT-PCR을 통해 측정하여 나타낸 그래프이다.

본 발명은 퀘르세타제틴(Quercetagetin) 화합물이 아토피피부염의 유발인자인 MDC(Macrophage-derived chemokine) 및 TARC(Thymus and activation-regulated chemokine)의 발현을 억제하는 작용을 통해 아토피피부염을 예방 또는 치료할 수 있는 효과가 있음을 최초로 규명하였으며, 퀘르세타제틴(Quercetagetin) 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 아토피피부염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명자들은 아토피피부염 치료를 위한 새로운 치료용 조성물을 개발하기 위해 퀘르세타제틴(Quercetagetin) 화합물에 주목하였는데, 퀘르세타제틴은 플라보노이드계 화합물 중 플라보놀(flavonol)의 일종으로, 소곡정(Eriocaulon) 속의 식물에 함유되어 있다고 알려져 있으며(J. B. Harborne 등, Quercetagetin and patuletin in Eriocaulon, Phytochemistry, Vol.8, 1969, 1035-1037), 그 화학명은 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,6,7-tetrahydroxy-4-benzopyrone 이고, 그 화학구조는 하기의 화학식1과 같다.

<화학식 1>

퀘르세타제틴(Quercetagetin)은 PIM2 및 그 밖의 7개의 다른 세린-트레오닌 키나아제(serine-threonine kinase)와 구별되는 PIM1 유전자만의 매우 우수한 선택적 억제제이다(Mol Cancer Ther, 2007;6(1):16372). PIM1 유전자는 프로토-발암 유전자(Proto-oncogene)로, 세린-트레오닌 키나아제인 Pim-1 단백질을 발현하는데, Pim-1은 세린-트레오닌 키나아제(serine-threonine kinase)로 여러 사이토카인에 의해 유도되는 신호를 전달하고 세포사멸의 억제하거나 여러 전사인자를 활성하는 역할을 통해, 암 발생에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀져 있다(Meeker TC 등, Characterization of the human PIM-1 gene: a putative proto-oncogene coding for a tissue specific member of the protein kinase family. Oncogene Res. 1 (1): 87101).

그 밖에도 퀘르세타제틴은 알도오즈 리덕테아제 활성에 대한 억제효과를 지니고 있어 당뇨성합병증의 예방효과가 있는 것으로 알려져 있으며(Li S, Mao W 등, Inhibition of rat lens aldose reductase by quercetagetin and patuletin, 1991, 7(1): 29-30), 높은 자유라디칼 소거활성이 있어 우수한 항산화 물질로도 보고된 바 있다(Parejo I 등, Acylated quercetagetin glycosides with antioxidant activity from Tagetes maxima. Phytochemistry, 2005, 66: 2356-2362).

한편, 본 발명에서는 상기와 같이 다양한 생리 활성을 가진 퀘르세타제틴이 아토피 유발인자로 알려진 케모카인인 MDC(Macrophage-derived chemokine)와 TARC(Thymus and activation-regulated chemokine)의 생성을 억제시키는 활성을 통해 아토피피부염 질환을 예방 또는 치료할 수 있다는 사실을 규명하였다.

따라서 본 발명은 퀘르세타제틴(Quercetagetin) 화합물을 유효성분으로 하는 아토피피부염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

아토피피부염의 발병은 면역학적 이상이 중요 요인으로 손꼽힌다. 아토피피부염 환자의 골수를 이식받은 사람에게 아토피피부염이 옮겨질 수 있다는 것은 아토피피부염의 원인이 피부 자체보다는 골수에서 발생하는 면역세포의 이상과 같은 면역학적 기전이 중요하다는 사실을 뒷받침해 준다. 아토피피부염 환자는 피부에서 다양한 알레르기원인 물질을 처음으로 인식한 세포(랑게르한스 세포)로부터 특이적인 면역 반응 유발에 중요한 면역 세포인 T 림프구에 알레르기원인 물질을 전달하는 능력이 정상인보다 증가되어 있다. 아토피피부염 환자에서는 T 림프구 아형 중 주로 2형의 보조 T 림프구가 활성화되어 있어 알레르기성 면역반응에 관여하는 다양한 면역학적 매개 물질(사이토카인, 케모카인)을 분비하게 되고, 이를 통해 아토피피부염 증상을 유발하며 악화시키게 된다고 알려져 있다.

케모카인(chemokine)은 6-15kD의 분자량을 갖고 각종 세포 예컨대 마크로파지, 단구, 호산구, 호중구, 선유아세포, 혈관내피세포, 평활근세포 및 비만세포에 의해 염증 부위에서 생산되는 일군의 염증/면역제어 폴리펩티드의 총칭이다. 케모카인은 4개가 보존된 시스테인(cys) 잔기의 위치의 공통성 및 케모카인을 코딩하는 유전자의 염색체 위치의 상이함에 따라 CXC 케모카인(또는 α 케모카인)과 CC 케모카인(또는 β 케모카인)의 2개의 큰 서브그룹으로 분류된다. CXC 케모카인의 최초 2개의 시스테인은 1개의 아미노산으로 떨어져 있지만, CC 케모카인의 경우 동 시스테인은 인접한다. 예컨대 IL-8 등은 CXC 케모카인인 한편, MIP-1α/β(macrophage inflammatory protein-1α/β의 약칭), MCP-1(monocyte chemoattractant protein-1의 약칭), RANTES(regulated upon activation normal T-cell expressed and secreted의 약칭) 등과 본 발명의 대상이 되는 MDC(macrophage-derived chemokine) 및 TARC(Thymus and activation regulated chemokine)는 CC 케모카인에 해당된다. 케모카인은 세포 유주를 촉진시키고 인테그린(integrin) 등과 같은 세포 접착 분자의 발현 증가를 통한 세포 접착 증강 작용을 갖고 있어 염증조직 등의 병변부위에 대한 백혈구 등의 접착?침윤에 밀접한 관련을 갖는 단백질 인자로 여겨진다.

한편, MDC(macrophage-derived chemokine)는 인간 B 세포에서 합성되며 분비되는 케모카인으로, CCR4 리셉터와의 상호작용을 통해 선택적 혹은 만성적으로 림포구(lymphocyte)들을 활성화시킨다. CCR4 리셉터는 MDC 이외에도 TARC(Thymus and activation regulated chemokine)와도 결합하는 것으로 알려져 있으며, 상기 CC 케모카인들의 생성량은 T 세포와 B 세포의 상호작용에 중요한 역할을 한다. 특히 혈청 내의 TARC 및 MDC의 레벨은 아토피피부염 환자들에게서 매우 높게 유지된다고 알려져 있으며, 그 중증도에 비례하여 TARC 및 MDC의 레벨도 증가한다. 또한, 인간 B 세포에서 생성된 TARC와 MDC는 알레르기 질병의 발병과정 및 T-B 세포 상호작용을 통한 특정한 항원 특이적 IgE의 생성에 중요한 역할을 한다고 보고된 바 있다(Lin L 등, J Med Dent Sci., 2003, Mar;50(1):27-33).

따라서 MDC 및 TARC의 생성정도는 아토피피부염의 질병활성 및 질병의 중증도와 긴밀한 관계가 있는바(Kakinuma T 등, Clin Exp Immunol, 2002, Feb;127(2):270-3), 본 발명자들은 아토피피부염 환자들에게서 과다 발현되고 있는 MDC 및 TARC를 아토피피부염 질환을 예방 또는 치료하고 그 증상을 완화시킬 수 있는 단백질 타겟으로 삼고 연구를 진행하였다.

이에, 본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 퀘르세타제틴 화합물이 MDC 및 TARC의 생성량을 감소시키는 효과가 있는지를 조사하기 위해, 우선 HaCaT 세포에 본 발명 따른 퀘르세타제틴 화합물과 그 외의 다른 플라보노이드계 화합물인 탄제레틴, 노빌레틴을 처리하고, MDC 생성량을 비교하였다. 또한 다른 일실시예에서는 HaCaT 세포에 퀘르세타제틴 화합물을 농도별로 처리하고, MDC 단백질의 생성량 및 유전자 발현 정도를 ELISA와 RT-PCR을 통해 확인하였다.

그 결과, 퀘르세타제틴을 투여한 군의 경우 아무것도 처리하지 않은 대조군 및 탄제레틴과 노빌레틴을 처리한 군에 비해 훨씬 탁월한 MDC 생성 억제효과를 나타내었으며(도 1 참조), MDC 생성 억제 효과는 퀘르세타제틴 화합물의 농도 의존적으로 비례하는 것으로 나타났다(도 2 및 3 참조).

또한, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 퀘르세타제틴 화합물이 TARC의 생성량을 감소시키는 효과가 있는지를 조사하기 위해, HaCaT 세포에 본 발명 따른 퀘르세타제틴 화합물과 그 외의 다른 플라보노이드계 화합물인 탄제레틴, 노빌레틴을 처리하고, TARC 생성량을 비교하였다. 한편, 또 다른 일실시예에서는 HaCaT 세포에 퀘르세타제틴 화합물을 농도별로 처리하고, TARC 단백질의 생성량 및 유전자 발현 정도를 ELISA와 RT-PCR을 통해 확인하였다.

그 결과, 퀘르세타제틴을 투여한 군의 경우 아무것도 처리하지 않은 대조군 및 탄제레틴과 노빌레틴을 처리한 군에 비해 훨씬 탁월한 TARC 생성 억제효과를 나타내었으며(도 4 참조), TARC 생성 억제 효과는 퀘르세타제틴 화합물의 농도 의존적으로 비례하는 것으로 나타났다(도 5 및 6 참조).

따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 퀘르세타제틴이 아토피피부염을 유발하며 그 증상의 악화시킨다고 알려진 케모카인인 MDC와 TARC의 생성을 동시에 억제하는 작용이 있음을 알 수 있었고, 이러한 작용을 통해 본 발명의 퀘르세타제틴이 아토피피부염을 예방 또는 치료할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명은 퀘르세타제틴(Quercetagetin) 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 아토피피부염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 MDC 유전자의 발현 또는 MDC 단백질의 생성을 억제 또는 감소시키는 작용을 갖는 퀘르세타제틴을 유효성분으로 함유하는 아토피피부염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 더불어, TARC 유전자의 발현 또는 TARC 단백질의 생성을 억제 또는 감소시키는 것을 특징으로 하는 아토피피부염의 예방 또는 치료용 조성물 또한 제공할 수 있다.

MDC 단백질은 상기에서 설명한 바와 같이 아토피피부염과 관련되어 그 발병 및 질환의 진행에 영향을 미친다고 알려져 있으나, 그 외에도 MDC의 질환과의 관련성을 연구한 결과들에서 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis) 환자의 윤활액(synovial fluid)에서 높은 MDC 레벨로 존재함이 밝혀져 상기 질환들의 발병에 관련이 있음이 밝혀졌으며(Helene Aarslev Flytlie 등, Cytokine, 49(2010), 249), MDC가 다발성 경화증(multiple sclerosis) 질환의 진행 및 증상 악화에 중요한 역할을 한다고 보고된 바 있고(D. Galimberti 등, Mult Scler, 2008, 14: 547), 폐암 종양 조직에 MDC 유전자의 발현이 과발현 되어 MDC가 폐암의 발병 및 병의 진행과 관련이 있음이 밝혀져 폐암 예후 예측인자로서도 사용될 수 있음이 밝혀진 바 있다(Toru Nakanishi 등, Cancer Immunol Immunother (2006) 55: 1320329).

따라서 CC 케모카인 중 하나인 MDC는 아토피피부염 뿐만 아니라 관절염, 암, 다발성 경화증 등에 이르기까지 여러 질환의 발병과 그 진행에 영향을 미치는 중요 케모카인(chemokine)인바, MDC 유전자의 발현 또는 MDC 단백질의 생성을 억제 또는 감소시킨다면 각종 질환의 진행 및 발병을 억제하고 질병을 치료할 수 있는 방법을 제공할 수 있을 것이다.

그리하여, MDC 단백질 생성 및 MDC 유전자의 발현을 억제 또는 감소시키는 작용을 하는 본 발명에 따른 퀘르세타제틴 화합물은 MDC의 생성과 연관되어 있다고 알려진 각종 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 퀘르세타제틴 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 MDC 단백질 생성 또는 MDC 유전자 발현 억제용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 퀘르세타제틴은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

본 발명에 따른 퀘르세타제틴은 천연으로부터 분리되거나 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조하여 사용할 수 있다.

바람직하게, 본 발명의 퀘르세타제틴은 종래의 물질을 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있다. 즉, 종래의 물질을 추출하고 분리하는 방법을 이용하여 식물 또는 식물의 일부로부터 수득될 수 있다. 줄기, 뿌리 또는 잎은 목적하는 추출물을 획득하기 위하여 적절히 건조하여 침연(macerated)하거나 단지 건조시켜 적절한 유기용매로 추출하고, 목적하는 추출물은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려진 정제 방법을 이용하여 정제될 수 있다. 보다 바람직하게는 본 발명의 퀘르세타제틴 화합물은, 감귤로부터 분리 및 정제할 수 있으며, 가장 바람직하게는 감귤 미숙과로부터 분리 및 정제할 수 있다.

한편, 상기 “감귤”이란 운향과 감귤아과에 속하는 식물을 말하며, 감귤로 취급하는 것은 감귤속(citrus), 금귤속(Fortumella), 탱자나무속(Poncirus) 및 클리메니아(Clymennia)의 4개의 속이다. 원산지는 인도로부터 중국 중남부에 이르는 아시아 대륙의 동남부와 그 주변으로 추정되고 있으며, 남쪽으로는 인도차이나, 말레이 반도를 거쳐 전파되었고 동쪽으로는 중국을 거쳐 우리나라와 일본에까지 전파되었으며, 국내에서는 제주도가 유일한 산지이다.

또한, 상기 “미숙과”란, 일반적으로 감귤류는 과육과 과피가 미분화된 상태에서 분화되어 가는 과정을 거치며 성숙해간다. 과육과 과피가 분화된 후에도 과피는 전체적으로 녹색을 유지하며 과실의 생체량이 증가하는 단계를 거치다가 과실의 생체량의 증가가 정점에 이르면 온도의 변화, 일조량의 변화 등에 의하여 당도가 점차적으로 증가함과 함께 과실의 과피가 부분적으로 담황색을 띠며 성숙해 간다. 이러한 성숙 과정은 과실 전체의 과피가 짙은 담황색을 띠게 되는 완숙과에 이를 때까지 계속되게 된다.

따라서 감귤의 성숙 과정은 (i) 과육과 과피가 분화되기까지의 단계(과실의 과육과 과피가 미분화된 상태로서 서로 결합되어 있는 과실), (ii) 과육과 과피가 분화된 후 과피가 녹색인 상태에서 과실의 생체량이 증가하는 단계 및 (iii) 과실 생체량의 증가가 정점에 이른 후 녹색의 과피가 점차적으로 담황색으로 변해가면서 과피 전체가 담황색을 띠게 되는 단계로 구분해 볼 수 있다.

본 명세서에서 감귤 미숙과란 상기 단계 (i) 및 (ii)까지의 감귤을 의미하며, 바람직하게는 단계 (i)의 감귤들을 의미한다. 그것은 하기 실시예에서 개시되어 있지는 않지만, 본 발명자는 단계 (i)의 감귤 미숙과 추출물보다 단계 (ii)의 감귤 미숙과 추출물이 퀘르세타제틴 화합물이 다량 함유되어 있음을 확인한 바 있기 때문이다.

한편, 상기 천연으로부터 퀘르세타제틴을 추출하기 위한 적절한 용매로는 이에 제한되지는 않으나, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다.

또한, 천연으로부터 추출된 추출물로부터 퀘르세타제틴의 분리 및 정제는 당업계에 공지된 분리 및 정제 방법, 예컨대, 실리카겔(silica gel)이나 활성 알루미나(alumina)등의 각종 합성수지를 충진한 컬럼 크로마토그라피(column chromatography) 및 고속액체크로마토그라피(HPLC) 등을 단독으로 혹은 병행하여 사용할 수 있다. 그러나 유효성분의 추출 및 분리정제 방법은 반드시 상기한 방법에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에서는 감귤 미숙과에서 추출한 퀘르세타제틴을 정제하여 사용하였다.

한편, 통상 아토피 피부염은 그 발병 시기 또는 그 발명 대상에 따라 유아형 아토피 피부염과 소아형 아토피 피부염과 성인형 아토피 피부염 그리고 임산부 아토피 피부염으로 분류된다. 따라서 본 명세서에서 상기 “아토피피부염”은 이러한 모든 유형의 아토피 피부염을 포함하는 것으로서 정의된다.

그러므로 본 발명에 따른 퀘르세타제틴(Quercetagetin) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 아토피피부염의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 조성물에 함유되는 퀘르세타제틴은 10~100μM의 농도로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 25~50μM의 농도로 포함될 수 있다.

상기 “치료”란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 “치료”란 용어는 “치료하는”이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 아토피피부염의 “치료” 또는 “치료요법”은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:

(1) 아토피피부염의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴,

(2) 아토피피부염의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함,

(3) 아토피피부염을 경감시킴.

(4) 아토피피부염의 재발을 예방함, 및

(5) 아토피피부염의 증상을 완화함(palliating).

본 발명에 따른 아토피피부염의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 퀘르세타제틴 화합물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 아토피피부염의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

본 발명에 따른 퀘르세타제틴의 약학적으로 유효한 양은 0.5~100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5~5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 아토피피부염 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서 약학적으로 허용되는이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

본 발명에 따른 아토피피부염의 예방 또는 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다.

또한, 본 발명의 아토피피부염의 예방 또는 치료용 조성물은 아토피피부염의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

따라서 본 발명은 퀘르세타제틴 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 아토피피부염의 증상을 예방 및 치료할 수 있는 약제를 제공할 수 있다.

나아가 본 발명의 아토피피부염의 예방 또는 치료용 조성물은 상기 기술한 바와 같이 아토피피부염의 증상을 예방 및 개선하기 위한 약학적 조성물로 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 아토피피부염 이상을 개선할 수 있는 건강기능식품의 제조를 위한 식품용 조성물로도 사용할 수 있다.

그러므로 본 발명은 퀘르세타제틴 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 아토피피부염 개선을 위한 식품용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 식품용 조성물은 아토피피부염 증상의 예방 및 개선에 효과가 있는 식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 용이하게 활용할 수 있다.

본원에서 상기 “식품”이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.

본원발명에 따른 퀘르세타제틴을 유효성분으로 함유하는 아토피피부염 개선을 위한 식품용 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본원발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

또한, 상기 “기능성 식품”이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물 공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

또한, 본원발명에서 상기 “음료”란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 아토피피부염의 증상을 예방 및 개선하기 위한 조성물을 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

또한, 상기 기술한 것 이외에 본원발명의 아토피피부염 개선을 위한 식품용 조성물을 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

따라서 본 발명은 아토피피부염의 개선 효과를 나타내는 하기의 화학식 1로 표시되는 퀘르세타제틴 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 하는 기능성 식품을 제공할 수 있으며, 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강보조식품을 제공할 수 있다.

<화학식 1>

상기 건강보조식품의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태 일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 조성물의 경우, 본 발명의 퀘르세타제틴 또는 그의 염은 조성물 총 중량에 대해서 0.01~0.10 중량%의 양으로 포함될 수 있다.

또한, 본원발명의 아토피피부염 개선을 위한 식품용 조성물을 함유하는 식품에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001중량% 내지 90중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 40중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100ml를 기준으로 0.001g 내지 2g, 바람직하게는 0.01g 내지 0.1g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

퀘르세타제틴의 MDC 단백질 생성 억제효과 분석

본 발명에 따른 퀘르세타제틴이 MDC 단백질의 생성에 미치는 영향을 살펴보기 위하여, 다른 플라보노이드계 화합물과 함께 본 발명에 따른 퀘르세타제틴을 처리하여, 퀘르세타제틴의 뛰어난 MDC 단백질 생성 억제 효과를 살펴보고자 하였다. 그리하여 본 발명자들은 HaCaT세포에 IFN-γ(10ng/mL) 와 TNF-α(10ng/ml)를 사용하여 MDC 생성을 유도한 후, ELISA 방법을 통하여 MDC 생성량을 측정하였다.

MDC 생성량을 확인하기 위하여, HaCaT 세포(3.0× 10⁵cells/mL)를 18시간 전 배양하고 10배 농도로 조제된 퀘르세타제틴, 탄제레틴, 노빌레틴과 IFN-γ(10 ng/mL) 및 TNF-α(10ng/ml)를 동시에 처리하였다. 24시간 배양 한 후, 배양 상층액의 MDC 생성량을 duoset enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) development kit(R&D systems)를 이용하여 정량 하였으며, 표준물질에 대한 표준곡선의 r2 값은 0.97 이상이었다.

퀘르세타제틴을 포함한 플라보노이드계 화합물을 처리한 후, ADC 단백질의 생성량을 측정한 결과, 도 1에서와 같이 ADC의 발현은 퀘르세타제틴 화합물의 처리에 의해 유의적으로 감소되었으며, 이는 퀘르세타제틴의 농도에 의존적이었다. 특히, 퀘르세타제틴을 50μM 이상 처리하였을 때에 MDC가 생성되지 않는 것으로 나타나 퀘르세타제틴 화합물의 뛰어난 MDC 생성 억제효과를 확인할 수 있었다.

< 실시예 2>

HaCaT 세포에서의 퀘르세타제틴의 MDC 단백질 생성 억제효과 분석

본 발명자들은 본 발명에 따른 퀘르세타제틴 화합물에 의한 MDC 생성량 및 MDC mRNA 발현 저해정도를 살펴보기 위하여, HaCaT세포에 IFN-γ(10ng/mL)와 TNF-α(10ng/ml)를 사용하여 MDC의 생성을 유도한 후 ELISA 방법 및 RT-PCR을 통하여 MDC 생성량 및 발현 정도를 측정하였다.

<2-1> ELISA

MDC 생성량을 확인하기 위하여, HaCaT 세포(3.0× 10⁵cells/mL)를 18시간 전 배양하고, IFN-γ(10 ng/mL) 및 TNF-α(10ng/ml)에 퀘르세타제틴을 12.5, 25, 50μM을 각각 처리하였다. 24시간 배양 한 후, 배양 상층액의 MDC 생성량을 duoset enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) development kit(R&D systems)를 이용하여 정량 하였으며, 표준물질에 대한 표준곡선의 r2 값은 0.97 이상이었다.

퀘르세타제틴을 화합물을 처리한 후, ADC 단백질의 생성량을 측정한 결과 도 2에서와 같이 ADC의 발현은 퀘르세타제틴 화합물의 처리에 의해 유의적으로 감소되었으며, 이는 퀘르세타제틴의 농도에 의존적이었다. 특히, 퀘르세타제틴 화합물을 25μM 이상 처리하였을 때에 MDC가 전혀 생성되지 않는 것으로 나타나 퀘르세타제틴 화합물의 뛰어난 MDC 생성 억제효과를 확인할 수 있었다.

<2-2> RT - PCR

우선 RNA를 분리하기 위하여, HaCaT 세포(5.0× 10⁵cells/mL)를 18시간 전 배양하고, 10배 농도로 조제된 퀘르세타제틴과 IFN-γ(10ng/mL) 와 TNF-α(10ng/ml)를 동시 처리하여 24시간 배양 한 후, 총 RNA 추출은 TRI-시약(MRC)을 이용하여 분리하였다. 세포에 TRI-시약 400uL를 첨가하여 균질화한 후, 클로로포름을 첨가하여 원심분리 시킨 다음, 상층액에 동량의 이소프로판올을 첨가하여 원심 분리시켜 RNA를 침전시키고 75%의 DEPC 처리된 에탄올로 세척하였다. 그 후 건조시켜 DEPC 처리된 증류수에 녹인 다음, 260nm에서 흡광도를 측정하여 RNA를 정량하였고, A260/A280nm의 비율이 1.7~1.9 범위 내의 값을 갖는 RNA를 실험에 사용하였다. 모든 실험은 리보뉴클레아제-프리(RNase-free)한 조건 하에서 이루어졌다.

cDNA 합성은 1㎍의 총 RNA를 올리고(dT)₁₈ 프라이머(primer), dNTP(0.5 μM), 1 단위(unit) 리보뉴클레아제 저해제(RNase inhibitor) 및 M-MuLV 역전사 효소)(2U)로 70℃에서 5분, 26℃에서 5분, 37℃에서 60분, 및 70℃에서 10분 동안 가열시킴으로서 반응을 중지시켰다. PCR은 합성된 cDNA로부터 MDC, β-액틴(Actin)을 증폭시키기 위하여 2uL cDNA, 4μM의 5′와 3′ 프라이머(표 1 참조), 10x 완충용액(10mM Tris-HCl, pH8.3, 50mM KCl, 0.1% Triton X-100), 250μM dNTP, 25mM 염화마그네슘, 1단위 태그폴리머라아제(Taq polymerase)(Promega, USA)를 섞고 증류수로 전체를 25uL 로 맞춘 다음 PTC-100를 이용하여 PCR을 실시하였다. 이때 PCR 조건은 94℃에서 45초, 55~60℃에서 45초, 72℃에서 60초 동안 30회를 반복하였으며, PCR에 의하여 생성된 산물은 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동을 실시하고 에티디움 브로마이드(ethidium bromide(EtBr))로 염색하여 밴드 패턴를 확인하였다.

RT-PCR에서 사용된 프라이머의 서열목록 및 유전자 산물의 크기

유전자		프라이머의 서열	Fragment size(bp)	서열목록
MDC	정방향	5‘-GCATGGCTCGCCTACAGACT-3'	497	1
MDC	역방향	5'-GCAGGGAGGGAGGCAGAGGA-3'	497	2
TARC	정방향	5'-ATGGCCCCACTGAAGATGCT-3'	351	3
TARC	역방향	5'-TGAACACCAACGGTGGAGGT-3'	351	4
β-actin	정방향	5'-ATGGGTCACAAGGATTCCTATG-3'	588	5
β-actin	역방향	5'-CAGCTCGTAGCTCTTCTCCA-3'	588	6

상기의 방법을 통해 퀘르세타제틴 12.5, 25, 50μM을 처리한 후, HaCaT세포를 IFN-γ(10 ng/mL) 및 TNF-α(10 ng/ml)로 자극하여 발현되는 MDC의 량을 측정한 결과, 도 3에서와 같이 MDC mRNA 발현은 퀘르세타제틴 처리에 의해 감소됨을 알 수 있었고, 퀘르세타제틴의 농도 의존적으로 MDC 유전자의 발현이 억제됨을 확인할 수 있었다.

< 실시예 3>

퀘르세타제틴의 TARC 단백질 생성 억제효과 분석

본 발명에 따른 퀘르세타제틴이 TARC 단백질의 생성에 미치는 영향을 살펴보기 위하여, 다른 플라보노이드계 화합물과 함께 본 발명에 따른 퀘르세타제틴을 처리하여, 퀘르세타제틴의 뛰어난 TARC 단백질 생성 억제 효과를 살펴보고자 하였다. 그리하여 본 발명자들은 HaCaT세포에 IFN-γ(10ng/mL) 와 TNF-α(10ng/ml)를 사용하여 TARC 생성을 유도한 후, ELISA 방법을 통하여 TARC 생성량을 측정하였다.

TARC 생성량을 확인하기 위하여, HaCaT 세포(3.0× 10⁵cells/mL)를 18시간 전 배양하고 10배 농도로 조제된 퀘르세타제틴, 탄제레틴, 노빌레틴과 IFN-γ (10ng/mL) 및 TNF-α(10ng/ml)를 동시에 처리하였다. 24시간 배양 한 후, 배양 상층액의 TARC 생성량을 duoset enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) development kit(R&D systems)를 이용하여 정량 하였으며, 표준물질에 대한 표준곡선의 r2 값은 0.97 이상이었다.

퀘르세타제틴을 포함한 플라보노이드계 화합물을 처리한 후, TARC 단백질의 생성량을 측정한 결과, 도 4에서와 같이 TARC의 발현은 퀘르세타제틴 화합물의 처리에 의해 유의적으로 감소되었다. 특히, 퀘르세타제틴을 처리한 모든 군에서 TARC 단백질의 생성이 전혀 나타나지 않았음을 확인할 수 있었는 바, 퀘르세타제틴 화합물의 탁월한 TARC 생성 억제효과를 확인할 수 있었다.

< 실험예 4>

HaCaT 세포에서의 퀘르세타제틴의 TARC 단백질 생성 억제효과 분석

본 발명자들은 본 발명에 따른 퀘르세타제틴 화합물에 의한 TARC 생성량 및 TARC mRNA 발현 저해정도를 살펴보기 위하여, HaCaT세포에 IFN-γ(10ng/mL)와 TNF-α(10ng/ml)를 사용하여 TARC의 생성을 유도한 후 ELISA 방법 및 RT-PCR을 통하여 TARC 생성량 및 발현 정도를 측정하였다.

<4-1> ELISA

TARC 생성량을 확인하기 위하여, HaCaT 세포(3.0× 10⁵cells/mL)를 18시간 전 배양하고, IFN-γ(10 ng/mL) 및 TNF-α(10ng/ml)에 퀘르세타제틴을 12.5, 25, 50μM을 각각 처리하였다. 24시간 배양 한 후, 배양 상층액의 TARC 생성량을 duoset enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) development kit(R&D systems)를 이용하여 정량 하였으며, 표준물질에 대한 표준곡선의 r2 값은 0.97 이상이었다.

퀘르세타제틴을 화합물을 처리한 후, TARC 단백질의 생성량을 측정한 결과 도 5에서와 같이 TARC의 발현은 퀘르세타제틴 화합물의 처리에 의해 매우 유의적으로 감소되었으며, 이는 퀘르세타제틴의 농도에 의존적이었다. 특히, 퀘르세타제틴 화합물을 12.5μM 처리하였을 때, TARC의 생성은 거의 나타나지 않았으며, 25μM 이상 처리하였을 때에 TARC가 전혀 생성되지 않는 것으로 나타나 퀘르세타제틴 화합물의 뛰어난 TARC 생성 억제효과를 확인할 수 있었다.

<4-2> RT - PCR

우선 RNA를 분리하기 위하여, HaCaT 세포(5.0×10⁵cells/mL)를 18시간 전 배양하고, 10배 농도로 조제된 퀘르세타제틴과 IFN-γ(10ng/mL)와 TNF-α(10ng/ml)를 동시 처리하여 24시간 배양 한 후, 총 RNA 추출은 TRI-시약(MRC)을 이용하여 분리하였다. 세포에 TRI-시약 400uL를 첨가하여 균질화한 후, 클로로포름을 첨가하여 원심분리 시킨 다음, 상층액에 동량의 이소프로판올을 첨가하여 원심 분리시켜 RNA를 침전시키고 75%의 DEPC 처리된 에탄올로 세척하였다. 그 후 건조시켜 DEPC 처리된 증류수에 녹인 다음, 260nm에서 흡광도를 측정하여 RNA를 정량하였고, A260/A280nm의 비율이 1.7~1.9 범위 내의 값을 갖는 RNA를 실험에 사용하였다. 모든 실험은 리보뉴클레아제-프리(RNase-free)한 조건 하에서 이루어졌다.

cDNA 합성은 1㎍의 총 RNA를 올리고(dT)₁₈ 프라이머(primer), dNTP(0.5 μM), 1 단위(unit) 리보뉴클레아제 저해제(RNase inhibitor) 및 M-MuLV 역전사 효소)(2U)로 70℃에서 5 분, 26℃에서 5 분, 37℃에서 60 분, 및 70℃에서 10분동안 가열시킴으로서 반응을 중지시켰다. PCR은 합성된 cDNA로부터 TARC, β-액틴(Actin)을 증폭시키기 위하여 2uL cDNA, 4μM의 5′와 3′ 프라이머(표 1 참조), 10x 완충용액(10mM Tris-HCl, pH8.3, 50mM KCl, 0.1% Triton X-100), 250μM dNTP, 25mM 염화마그네슘, 1단위 태그폴리머라아제(Taq polymerase)(Promega, USA)를 섞고 증류수로 전체를 25uL 로 맞춘 다음 PTC-100를 이용하여 PCR을 실시하였다. 이때 PCR 조건은 94℃에서 45초, 55~60℃에서 45초, 72℃에서 60초 동안 30회를 반복하였으며, PCR에 의하여 생성된 산물은 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동을 실시하고 에티디움 브로마이드(ethidium bromide(EtBr))로 염색하여 밴드 패턴를 확인하였다.

퀘르세타제틴 12.5, 25, 50μM에 대하여 HaCaT세포를 IFN-γ(10ng/mL) 와 TNF-α(10 ng/ml)로 자극하여 발현되는 TARC의 생성량을 상기의 방법을 통해 측정한 결과, 도 6에서와 같이 TARC mRNA 발현은 퀘르세타제틴 처리에 의해 감소됨을 알 수 있었고, 퀘르세타제틴의 농도 의존적으로 TARC 유전자의 발현이 억제됨을 확인할 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of JEJU University <120> Composition comprising quercetagetin for treating or preventing atopic dermatitis <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MDC sense primer <400> 1 gcatggctcg cctacagact 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MDC anti-sense primer <400> 2 gcagggaggg aggcagagga 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TARC sense primer <400> 3 atggccccac tgaagatgct 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TARC anti-sense primer <400> 4 tgaacaccaa cggtggaggt 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b-actin sense primer <400> 5 atgggtcaca aggattccta tg 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b-actin anti-sense primer <400> 6 cagctcgtag ctcttctcca 20

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 퀘르세타제틴(quercetagetin) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 아토피피부염의 예방 또는 치료용 조성물:
<화학식 1>

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제1항에 있어서,
상기 퀘르세타제틴 화합물은 감귤 미숙과로부터 유래된 것을 특징으로 하는 아토피피부염의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 퀘르세타제틴 화합물은 MDC(Macrophage-derived chemokine) 유전자의 발현 또는 MDC(Macrophage-derived chemokine) 단백질의 생성을 억제 또는 감소시키는 것을 특징으로 하는 아토피피부염의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 퀘르세타제틴을 10~100μM의 농도로 함유하는 것을 특징으로 하는 아토피피부염의 예방 또는 치료용 조성물.
퀘르세타제틴(quercetagetin) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 MDC(Macrophage-derived chemokine) 단백질 생성 또는 MDC(Macrophage-derived chemokine) 유전자 발현 억제용 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 퀘르세타제틴 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 아토피피부염 예방 또는 개선용 기능성 식품:
<화학식 1>

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