KR20190061370A - 대나물 지상부 추출물 및 분획물을 포함하는 피부염 치료용 조성물 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 대나물(Gypsophila oldhamiana Miq) 지상부의 추출물, 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부염을 치료하기 위한 조성물 및 제조 방법에 관한 것이다.

Description

대나물 지상부 추출물 및 분획물을 포함하는 피부염 치료용 조성물 및 그의 용도{A composition for treating dermatitis comprising aerial part of Gypsophila oldhamiana Miq. extract and fractions and use thereof}
대나물 지상부 추출물, 또는 그의 분획물을 포함하는 피부염을 예방 또는 치료하기 위한 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다.
의학 사전에서의 아토피 피부염(Atopic dermatitis, AD)에 대한 정의는 만성적이고 재발성의 염증성 피부질환으로 건조하고 각질이 많은 비늘피부, 염증, 증가된 피부 투과성과 일반적이고 무해한 인자에 대해 민감하게 반응하는 증상을 보이며, 표면 감염에 취약하다는 특징을 갖는다(Bieber, 2010; Ann. Dermatol. 22(2):125-137). 대표적인 특징으로는 심각한 발적과 가려움이 있다.
아토피 피부염의 발병 원인은 명확하게 설명하기는 어려우나 면역 이상을 유발하는 유전적 요인뿐만 아니라 환경적 요인과 더불어 다양한 유발 요인이 복잡하게 작용해 아토피 피부염의 병변을 발달시키는 것으로 알려져 있다. 이와 같이 아토피 피부염은 복합적 요인이 관여하여 발생하는 다인자성 질환임은 분명하며, 특히 부모의 질병 유무와 밀접하게 연관되어 있어, 유전인자가 아토피 피부염 발달에 중요하다고 알려져 있다.
아토피 질환은 아토피에 의해 임상적 증상으로 발현되는 경우를 의미하며, 여기에는 아토피 피부염, 천식, 알레르기 비염, 알레르기 결막염 등의 질환들이 모두 포함된다. '아토피 피부염'이라는 용어가 길어서 짧게 '아토피'라고 하지만 두 용어의 정의는 의학적으로 분명히 다르다. 아토피 질환은 상호작용하면서 동시에 또는 시간차를 두고 발현되는 경향을 보이기 때문에 '알레르기 행진'이라는 특성으로 설명하기도 한다. 알레르기 행진은 어린 영아가 성장하면서 아토피 피부염, 식품 알레르기, 천식 및 알레르기 비염의 순서로 알레르기 질환을 앓게 되는 현상을 말하며, 알레르기 유발원에 대한 감작의 진행과 관련이 있다. 국내 연구에 의하면, 유전적 요인에 의한 아토피 피부염 발생률은 부모 모두 아토피 질환이 있는 경우 41.7%, 부모 모두 알레르기 병력이 없을 경우 14.7%로 나타나 아토피 피부염 발생과 부모의 알레르기 질환력 사이의 연관성을 보여주고 있다.
아토피 피부염은 알레르기 행진이 일어나는 첫 번째 질환으로 인식되고 있고, 아토피성 질환이 발생할 것을 예측할 수 있는 지표로 이용되고 있다. 아토피 피부염 시기에 면역반응을 조절하지 않을 경우 알레르기 행진이 가속화되는 것으로 추정되므로 천식, 비염 등을 예방하기 위해서라도 아토피 피부염 조절이 필요하다. 아토피 피부염의 병인은 크게 피부장벽과 연관된 병인(outside-in model)과 비정상적인 면역반응과 연관된 병인(inside-out model)으로 나누고 있으며, 유전과 환경적인 요인에 대한 통합적인 고려가 필요하다.
현재 사용 중인 아토피 질환 치료제는 알레르기 반응의 최종산물인 히스타민 분비를 억제하거나 알레르기 증상의 하나인 염증반응을 억제하는 효과를 가진 스테로이드제 및 항히스타민제에 치중되며, 일부 면역조절제와 광선치료법이 사용되고 있다. 기존 치료제의 경우 알레르기 증상 완화에 효과가 있으나 근본적인 치료방법이 아니며 장기적인 사용시 약물의 효능 감소 및 다양한 부작용 발생의 위험이 있다. 스테로이드제의 부작용은 비만, 당뇨, 고혈압, 우울증 등이 있으며, 항히스타민제의 부작용은 우울증, 집중력 장애, 무기력증, 졸림, 성기능 장애 등이 있으며, 면역억제제의 부작용은 국소자극, 고혈압, 신장독성 등이 있다. 이러한 점에서 스테로이드제, 항히스타민제, 면역억제제를 대체할 수 있는 혹은 기존 치료제의 사용을 낮출 수 있어 장기간 사용시 부작용이 적은 신개념 치료 소재의 개발 필요성이 대두되고 있다.
아토피 피부염의 병인 중 유전적인 요소가 매우 중요한 역할을 하는데, T세포 과다 활성화를 유발하는 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-5(IL-5), 및 인터루킨-13(IL-13)은 Th2 세포에 의해 분비되며 면역글로불린E(IgE)의 합성을 조절하여 아토피 피부염의 시작에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
무모 마우스에서 2,4,-디니트로클로로벤젠(2,4-dinitrochlorobenzene, DNCB)과 아세톤을 이용하여 등 피부에 자극을 주면 자극된 국소 부위에 지연형 알러지 반응을 유도하게 되고 비정상적인 면역기능을 일으키고 피부장벽을 망가트릴 수 있다. 이처럼 DNCB를 이용하여 아토피 피부염과 유사한 모델을 만들어 그 개체의 피부장벽기능과 면역기능에 관련된 인 비보 모델을 만들 수 있다. DNCB로 아토피 피부염을 유도한 마우스의 경표피 수분손실량(TEWL)과 pH는 증가하며 수화(hydration)는 감소하게 된다.
만약 DNCB 등으로 아토피 피부염과 같은 병변을 유도 한 후 피부장벽 기능이나, 귀 두께, 면역학적 기능을 정상작동 하게 하는 물질이 있다면 아토피 피부염에 대한 치료 또는 예방에 매우 바람직한 후보가 될 수 있을 것이다.
대나물은 학명이 Gypsophila oldhamiana Miq.로서 석죽과 (Caryophyllaceae)에 속하며 여러해살이풀이다. 대나물 식물의 키는 50~100 cm이고 줄기는 윗부분에서 가지가 갈라지고 전체에 털이 없다. 뿌리 잎은 피침형으로 3개의 잎맥이 뚜렷하고 끝이 뾰족하며 엽병은 없으나 밑부분이 좁아져서 엽병처럼 되고 가장자리는 밋밋하며 중앙부의 잎은 길이 6cm, 폭 5~10cm 정도이다. 꽃은 6~7월에 피며 백색이고 가지 끝과 원줄기 끝에서 산방상 취산꽃차례로 많은 꽃이 달린다. 열매는 삭과로 둥근 모양이고, 4개로 갈라진다. 꽃을 보려고 심어 기르며 어린잎을 나물로 먹고 뿌리는 거담제로 이용하는 것으로 알려져 있어, 지상부와 뿌리의 용도가 다른 것으로 알려져 있다.
그러나, 대나물 지상부에 대한 연구는 미비하며, 대나물 지상부의 추출물이 IL-4의 발현을 저해시켜 아토피 피부염에 효능이 있다는 것에 대하여는 알려진 바 없다.
일 양상은 대나물 (Gypsophila oldhamiana Miq .) 지상부의 추출물, 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부염을 예방 또는 치료하기 위한 조성물을 제공한다.
다른 양상은 대나물 지상부를 물, C1 내지 C6의 알코올 또는 이들의 혼합물과 접촉시키는 단계를 포함하는 대나물 지상부 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상은 상기 조성물을 피부염을 예방 또는 치료시키기에 유효한 양으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 피부염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상은 상기한 조성물을 피부염을 개선하기에 유효한 양으로 개체의 피부에 적용하는 단계를 포함하는 개체의 피부 보습을 위하여 화장하는 방법을 제공한다.
제1 양상은 대나물 (Gypsophila oldhamiana Miq.) 지상부의 추출물, 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부염을 예방 또는 치료하기 위한 조성물을 제공한다.
상기 대나물 지상부는 잎, 꽃, 줄기, 새싹 또는 그 조합일 수 있고, 건조 추출물일 수 있다.
상기 추출물은 친수성 용매 (hydrophilic solvent)로 하여 추출된 것일 수 있다. 상기 친수성 용매는 물, C1 내지 C10의 알코올 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 상기 알코올은 C1 내지 C10, C1 내지 C6 또는 C1 내지 C4의 하나 이상의 -OH기를 갖는 화합물일 수 있다. 상기 알코올은 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, sec-부탄올, 이소부탄올, tert-부탄올 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
상기 대나물 지상부 추출물은 조추출물, 분획물, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 조추출물은 상기 대나물 지상부를 추출 용매와 접촉시켜 얻어지는 것으로서 특정 성분을 포함하는 것으로 분리하지 않은 것을 말한다. 상기 분획물은 상기 조추물에 대하여 특정 성분을 포함하는 물질을 분리한 것을 말한다. 상기 분리는 유기 용매를 사용한 분리, 크로마토그래피 또는 여과일 수 있다. 상기 크로마토그래피는 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, HPLC, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 추출은 상기 대나물 지상부를 상기 추출 용매 중에서 인큐베이션하는 것일 수 있다. 상기 대나물 지상부는 세절되거나 분쇄되어 미분화된 입자의 형태를 가질 수 있다. 상기 대나물 지상부는 건조되거나 세척된 것일 수 있다. 상기 인큐베이션은 실온 내지 환류 온도에서 교반 또는 교반 없이 수행되는 것일 수 있다. 인큐베이션 온도는 선택되는 용매에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 실온 내지 환류 온도, 30 ℃ 내지 환류 온도, 40 ℃ 내지 환류 온도, 50 ℃ 내지 환류 온도, 60 ℃ 내지 환류 온도, 또는 65 ℃ 내지 환류 온도일 수 있다. 상기 추출 시간은 추출 조건에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 추출 시간은 2 내지 4시간, 예를 들면 2.5 내지 3.5 시간일 수 있다. 상기 추출 용매는 대나물 지상부의 5 내지 15배, 예를 들면, 5 내지 13배, 5 내지 11배, 8 내지 15배, 8 내지 13배, 8 내지 11배, 또는 9 내지 11배일 수 있다. 상기 추출은 1회 이상, 예를 들면 1 내지 5회, 1 내지 4회, 1 내지 3회, 2 내지 5회, 또는 2 내지 4회 추출되는 것일 수 있다. 얻어진 조추출물은 여과, 농축 및 건조될 수 있다. 상기 건조는 감압 건조될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 추출물은 초음파 조사하에 추출된 것일 수 있다. 상기 초음파 조사는 실온, 10 내지 25℃, 10 내지 30℃, 10 내지 40℃, 10 내지 45℃, 10 내지 50℃, 10 내지 55℃, 10 내지 60℃, 10 내지 65℃, 또는 10 내지 70℃에서 수행되는 것일 수 있다. 조사 시간은 10 내지 30분. 10 분 내지 1시간, 10 분 내지 2시간, 10 분 내지 3시간, 10 분 내지 4시간, 10 분 내지 5시간, 10 분 내지 6시간, 10 분 내지 9시간, 10 분 내지 12시간, 10 분 내지 24시간 동안 수행되는 것일 수 있다. 상기 초음파 조사는 밀폐된 용기 중에 수행되는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 추출물은 유기 용매를 사용하여 더 추출될 수 있다. 상기 유기용매는 에틸아세테이트, 헥산, 디클로로메탄, 부탄올, 아세톤, 아세토니트릴 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 유기 용매에 의한 추출은 상기 추출물을 상기 유기 용매 중에 첨가하여 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 추출 조건은 선택되는 용매에 따라 적절하게 선택할 수 있으며, 상기 인큐베이션은 실온 내지 환류 온도에서 교반 또는 교반 없이 수행되는 것일 수 있다. 인큐베이션 온도는 선택되는 용매에 따라 적절하게 선택될 수 있고, 예를 들면, 실온 내지 환류 온도, 30℃ 내지 환류 온도, 40℃ 내지 환류 온도, 50℃ 내지 환류 온도, 60℃ 내지 환류 온도, 또는 65℃ 내지 환류 온도일 수 있다. 상기 추출 시간은 추출 조건에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 추출 시간은 2 내지 4시간, 예를 들면 2.5 내지 3.5 시간일 수 있다. 상기 추출 용매는 대나물 지상부의 5 내지 15배, 예를 들면, 5 내지 13배, 5 내지 11배, 8 내지 15배, 8 내지 13배, 8 내지 11배, 또는 9 내지 11배일 수 있다. 상기 추출은 1회 이상, 예를 들면 1 내지 5회, 1 내지 4회, 1 내지 3회, 2 내지 5회, 또는 2 내지 4회 추출되는 것일 수 있다. 얻어진 추출물은 여과, 농축 및 건조될 수 있다. 상기 건조는 감압 건조될 수 있다.
상기 추출은 조추출물, 또는 그 분획물을 HPLC하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 HPLC는 반분취 (semi-preparative) HPLC일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 대나물 지상부 추출물을 분획화하여 수득된 분획물을 유효성분으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 분획물은 상기 대나물 지상부 추출물을 물에 현탁시킨 후, 메틸렌클로리드(CH2Cl2), 에틸아세테이트(EtOAc) 또는 부탄올 (n-BuOH)을 분획화 용매로 하여 추출함으로써 얻어진 것으로서, 상기 분획물은 분획화 용매에 따라 메틸렌클로리드 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 또는 부탄올 분획물일 수 있다.
일 구체예에서 상기 대나물 지상부 추출물 또는 그의 분획물은 면역세포의 과활성화를 억제시켜 면역기능을 안정화 또는 회복시키거나, 인터루킨-4(Interleukin-4, IL-4)의 발현을 저해함으로써 피부염을 예방, 개선 또는 치료하는 것일 수 있다.
상기 피부염은 피부 소양증, 지루성 피부염, 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 당뇨병성 피부염, 모낭염, 여드름, 알레르기성 피부염 및 신경성 피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
따라서 상기 조성물 중에 상기 대나물 지상부 추출물 또는 그의 분획물은 세포에서 IL-4의 발현을 억제시키거나, 피부염을 개선시키거나, 특히 아토피성 피부염을 개선시키기에 유효한 양으로 포함될 수 있다. 상기 유효한 양은 당업자가 선택되는 세포 또는 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 유효한 양은 상기 조성물 당 0.1 mg 내지 1,000 mg, 예를 들면, 0.1 mg 내지 500 mg, 0.1 mg 내지 100 mg, 0.1 mg 내지 50 mg, 0.1 mg 내지 25 mg, 1 mg 내지 1,000 mg, 1 mg 내지 500 mg, 1 mg 내지 100 mg, 1 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 25 mg, 5mg 내지 1,000 mg, 5 mg 내지 500 mg, 5 mg 내지 100 mg, 5 mg 내지 50 mg, 5 mg 내지 25 mg, 10mg 내지 1,000 mg, 10 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 100 mg, 10 mg 내지 50 mg, 또는 10 mg 내지 25 mg일 수 있다. 상기 조성물은 인 비트로 또는 개체 중의 세포에서 IL-4의 발현을 억제시키기 위한 것일 수 있다. 개체 중의 세포는 예를 들면 IL-4 발현 증가에 의하여 피부염이 진행되고 있는 부위, 또는 IL-4의 침적에 의하여 염증이 과도하게 진행되어 외부적으로 피부염 증상을 보이는 부위에 위치하는 것일 수 있다. 상기 피부염은 아토피성 피부염일 수 있다. 또한, 상기 피부염은 아토피성 피부염 환자에서 피부장벽 기능 약화로 인한 피부 감염증일 수 있다.
상기 조성물은 화장품학적으로, 약학적으로, 또는 식품적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물은 약학, 식품 또는 화장료 조성물일 수 있다.
상기 식품 조성물은 대나물 지상부 추출물 또는 그의 분획물을 단독 또는 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 약학적 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
상기 음료수는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카리드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카리드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카리드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
상기 식품 조성물은 또한 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제, 또는 그 조합을 함유할 수 있다. 상기 식품 조성물은 또한, 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육, 또는 그 조합을 함유할 수 있다. 이러한 첨가제는 조성물 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.
상기 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 경구 투여 제형은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 건조시럽제, 또는 그 조합일 수 있다. 경구 투여 제형은 주사제, 또는 피부 외용제일 수 있다. 피부 외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 피부 외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부 외용제에 사용되는 성분, 예컨대 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제등을 필요에 따라서 적절하게 배합할 수 있다.
상기 피부 외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류등도 적절하게 배합할 수 있다.
상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 조성물은 피부염을 예방 또는 치료하기 위한 화장용 조성물일 수 있다. 상기 화장용 조성물은 피부 보습용일 수 있다. 상기 화장용 조성물은 피부 염증이없는 영역에 국소적으로 적용하는 것일 수 있다. 상기 화장용 조성물은 피부염 치료용 약학 조성물과는 별개로 사용될 수 있다.
상기 조성물은 피부염을 예방 또는 치료하기 위한 식품용 조성물일 수 있다.
제2 양상은 대나물 지상부를 물, C1 내지 C6의 알코올 또는 이들의 혼합물과 접촉시키는 단계를 포함하는 대나물 지상부 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 접촉은 초음파 조사하에 또는 환류하에 수행될 수 있다. 또한 상기 방법은 상기 추출물을 물에 현탁시킨 후 메틸렌클로리드, 에틸아세테이트, 부탄올 또는 이들의 조합으로 분획화하는 단계를 더 포함할 수 있다.
제3 양상은 상기한 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 피부염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 피부염이 존재하는 부위 또는 피부 건조가 있거나 건조하여 지기 쉬운 부위에 국소적으로 투여하는 것일 수 있다. 국부 투여의 일 예는 피부에 적용하는 것일 수 있다.
상기 조성물은 개체의 피부염을 효율적으로 개선시키기 위해 스테로이드, 항염증제, 항히스타민제, 항생제, 및 항진균제와 같은 다른 약물과 함께 투여될 수 있다. 상기 투여는 순차적, 동시적, 또는 개별적으로 개체에 투여되는 것일 수 있다.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 아토피 피부염과 같은 피부염의 개선을 필요로 하는 개체일 수 있다.
상기 투여는 대나물 지상부 추출물 또는 그의 분획물을 개체당 일당 0.1 mg 내지 1,000 mg, 예를 들면, 0.1 mg 내지 500 mg, 0.1 mg 내지 100 mg, 0.1 mg 내지 50 mg, 0.1 mg 내지 25 mg, 1 mg 내지 1,000 mg, 1 mg 내지 500 mg, 1 mg 내지 100 mg, 1 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 25 mg, 5mg 내지 1,000 mg, 5 mg 내지 500 mg, 5 mg 내지 100 mg, 5 mg 내지 50 mg, 5 mg 내지 25 mg, 10mg 내지 1,000 mg, 10 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 100 mg, 10 mg 내지 50 mg, 또는 10 mg 내지 25 mg을 투여하는 것일 수 있다.
제4 양상은 상기한 조성물을 피부염을 개선하기에 유효한 양으로 개체의 피부에 적용하는 단계를 포함하는 개체의 피부 보습을 위하여 화장하는 방법을 제공한다.
일 양상에 따른 개체에서 피부염을 예방 또는 치료하기 위한 조성물에 의하면, 아토피 피부염과 같은 피부염을 예방 또는 치료시키는데 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 대나물 지상부 추출물을 제조하는 방법에 의하면, 대나물 지상부의 추출물, 또는 그의 분획을 효율적으로 제조할 수 있다.
또 다른 양상에 따른 개체의 피부염을 예방 또는 치료하는 방법에 의하면,개체의 상기 질환을 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
또 다른 양상에 따른 개체의 피부 보습을 위하여 화장하는 방법에 의하면, 개체의 피부 보습을 효율적으로 유지할 수 있다.
도 2는 무모 마우스에서 대나물 지상부 및 지하부 추출물 처리 후 시간 경과에 따른 경피 수분 손실량(TEWL)을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3는 무모 마우스에서 대나물 지상부 및 지하부 추출물을 처리한 후 수분 함유량(hydration)을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4은 무모 마우스에서 대나물 지상부 및 지하부 추출물을 처리한 후 혈청내 IgE 및 IL-4 의 단백질 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 대나물 지상부 및 지하부 추출물 및 그의 분획물의 제조 및 그 효과의 확인
본 실시예에서는 대나물 지상부 및 지하부 추출물 및 그의 분획물을 제조하고, 상기 추출물 및 그의 분획물이 아토피 피부염 개선에 미치는 효과를 확인하였다.
1. 대나물 추출물 및 그의 분획물의 제조
(1) 대나물 추출물의 제조
본 실시예에서 사용된 대나물의 지상부, 지하부는 대한민국 강원도 강릉시 대전동 일대에서 직접 채집하여 건조하여 사용하였다.
(1.1) 대나물 지상부-에탄올 추출물의 제조
대나물 지상부 500 g을 직경 0.5 cm 이하로 세절하여 유리 용기 중 에탄올 1.5 L에 담그고 3 시간 동안 초음파추출법으로 추출하였다. 이렇게 얻은 추출액을 감압 건조하여 농축함으로써 농축물 22.2 g (이하 '대나물 지상부-에탄올 추출물'이라 한다)을 얻었다.
(1.2) 대나물 지상부-에탄올 추출물의 분획물의 제조
(1.1) 절에서 제조한 대나물 지상부-에탄올 추출물 20.0 g을 50 ml의 증류수에 현탁시키고 계통학적 분획방법에 따라 동량의 메틸렌클로리드(CH2Cl2), 에틸아세테이트(EtOAc) 및 부탄올 (n-BuOH)로 각각 3회씩 추출하여 분획한 후 감압농축하여 메틸렌클로리드 층 5.6 g, 에틸아세테이트 층 3.2 g, 부탄올 층 3.6 g, 및 물 층 3.2 g을 획득하여 각각 메틸렌클로리드(CH2Cl2) 분획, 에틸아세테이트(EtOAc), 부탄올 (n-BuOH) 분획 및 물 분획으로 하였다.
(1.3) 대나무 지하부-에탄올 추출물의 제조
대나물의 지하부-은시호 뿌리 1.2 kg을 100 % 에탄올 12 L에 담구고 3 시간 동안 초음파 기기(ENDELIN SONOREX)를 사용하여 초음파를 조사하여 대나물의 지하부-추출물을 추출하였다. 이를 3회 반복하여 얻은 추출액을 감압건조하여 농축하여 농축물 34.7 g (이하 '대나물 지하부-에탄올 추출물'이라 한다)을 얻었다.
(1.4) 대나물 지하부-에탄올 추출물의 분획물의 제조
(1.3)절에서 제조한 대나부 지하부-에탄올 추출물 34.7 g을 500 ml의 증류수에 현탁시키고 계통학적 분획방법에 따라 동량의 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 부탄올 (n-BuOH)로 각각 3회씩 추출하여 분획한 후 감압농축하여 헥산 층 1.98g, 디클로로메탄층 0.77 g, 에틸아세테이트층 0.45 g, 및 부탄올층 4.93 g을 획득하여 각각 메틸렌클로리드(CH2Cl2) 분획, 에틸아세테이트(EtOAc), 부탄올 (n-BuOH) 분획 및 물 분획으로 하였다.
2. 대나물 추출물 및 그의 분획물이 IL-4 발현에 미치는 영향
본 실험에서 사용한 랫트 호염기성 백혈병 세포(rat basophilic leukemia cell)인 RBL-2H3 세포는 한국세포주은행 (Korea Cell Line Bank; Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다.
RBL-2H3 세포를 웰당 5x105개 농도로 6공 평판 배양기 (6-well plate)의 각 웰에 접종하여 10 % 우태아혈청 (fetal bovine serum: FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신이 함유된 DMEM (Dulecco' Modified Eagle Medium) 배지 중에서 37 ℃, 5 % CO2 조건의 인큐베이터에서 배양하고, 16 시간 후에 1 μM의 시클로스포린(cyclosporine) A와 시료를 10 μg/ml의 농도로 첨가하고 1 시간 동안 배양하여 전처리하였다. 시료는 1절에서 제조된 대나물 지상부 추출물 또는 그의 분획물이다. 다음으로, 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(phorbol 12-myristate 13-acetate: PMA) 50 ng/ml와 이오노미신(ionomycin) 1 μM을 첨가하고 동일한 조건에서 9 시간 동안 배양하였다. PMA와 이오노미신은 인터페론, 페르포린, IL-2, 및 IL-4와 같은 시토킨의 세포내 생산을 자극하기 위하여 사용된다.
세포는 RNeasy mini kit (Qiagen)을 사용하여 QIAsymphony 또는 QIAQube (Qiagen) 기기에 장착하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 Agilent 2100 BioAnalyzer (Agilent Technologies, SantaClara, CA, USA)를 사용하여 견고성(integrity)을 확인하였다. cDNA는 ImProm-II Reverse Transcription System (Promega, Madison, WI, USA)을 이용하여 1 ㎍의 RNA를 cDNA로 합성하였다. PCR은 GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하여 수행하였다.
PCR 반응은 0.02 ㎕ Ex taq 폴리머라제(TAKARA, Otsu, Shiga, Japan), 2 ㎕ Ex taq 폴리머라제 버퍼, 1.6 ㎕ dNTP (10 mM), 2 ㎕ 포워드 프라이머 (20 uM), 2 ㎕ 리버스 프라이머 (20 uM), 11.38 ㎕ 물과 1 ㎕의 합성한 제1 가닥 cDNA를 잘 섞어 총 20 ㎕ 용량의 반응 혼합물에 대하여 PCR을 수행하였다.
IL-4의 PCR 조건은 94 ℃에서 4분 (1 회), 94 ℃에서 30 초, 60 ℃에서 30 초 그리고 72 ℃에서 30 초 (25 회), 72 ℃에서 5 분 (1 회)이었고, 베타-액틴 조건은 94 ℃에서 4 분 (1 회), 94 ℃에서 30 초, 55 ℃에서 30 초 그리고 72 ℃에서 30 초 (20 회), 72 ℃에서 5 분 (1 회)이었다. RT-PCR 결과는 QIAxcel advanced (Qiagen) 기기를 사용하여 밴드의 강도를 측정하였다. 효능에 대한 분석은 [PMA + 이오노미신](PI) 처리군의 비율을 100으로 하여 이와 비교하여 결정하였다. RT-PCR에 사용된 프라이머는 표 1에 나타낸 바와 같다.
포워드 프라이머 리버스 프라이머
IL-4 서열번호 1 서열번호 2
β-액틴 서열번호 3 서열번호 4
표 2는 대나물 지상부, 지하부 추출물 및 분획물이 IL-4 발현에 미치는 영향을 PI 처리군을 100으로 하여 그에 대한 비율로 IL-4가 저해되는 정도를 나타낸 것이다.
시료 IL-4 발현 (%)
무처리군 13.51
PI 100
PI + CsA 29.5
PI+지상부 에탄올 추출물 31.4
PI+지상부 CH2Cl2분획 18.9
PI+지상부 EtOAc분획 16.2
PI+지상부 n-BuOH 분획 21.6
PI+지하부 에탄올 추출물 35.5
PI+지하부 CH2Cl2 분획 21.4
PI+지하부 EtOAc 분획 20.5
PI+지하부 n-BuOH 분획 15.4
도 1에서, CsA는 시클로스포린 A를 나타낸다. 표 2와 도 1에 나타낸 바와 같이, 대나물 각 추출물 및 분획물은 RBL-2H3 세포에서 IL-4의 발현을 저해시켰다.
그 중에서 대나물 지상부 추출물 및 분획물은 지하부에 비해 IL-4의 발현을 강하게 저해시켰다. 이는 대나물 지상부 추출물 및 분획물이 아토피 증상 완화에 도움이 될 수 있음을 보여주는 결과이다.
3. 대나물 지상부-에탄올 추출물이 DNCB 에 의하여 아토피 피부염 유도된 무모 마우스(hairless mouse)에서 피부 장벽기능에 미치는 영향
6 주령(암컷, 23-27g) 무모 마우스(hairless mouse, 오리엔트바이오에서 구입)를 4개의 군으로 분리하였다: 무처리군, 2,4-디니트로클로로벤젠(2,4-dinitrochlorobenzene: DNCB) 유도 후 비히클 처리군, DNCB 유도 후 대나물 지상부, 지하부 추출물 처리군. DNCB는 물 중 99 % 아세톤과 올리브 오일을 부피 기준으로 3:1로 섞은 용액을 용매로 사용하였다. 비히클은 프로필렌 글리콜과 에탄올을 부피 기준으로 7:3으로 섞은 것을 사용하였다. 군 분리 후 7일 동안 1일 1회 1 (w/v/)% DNCB 용액을 마우스 등에 200 ㎕ 씩 도포하였다. 마지막 도포 후 일주일 간 처리하지 않고 일주일 후 2일 간격으로 총 7번 0.1(w/v)% DNCB 용액을 위와 같은 방법으로 도포하였다. 0.1(w/v)% DNCB 용액을 도포하며 14일 동안 비히클을 용매로 한 대나물 지상부 및 지하부 추출물 1(w/v)% 용액과 비히클을 오전 및 오후로 나누어 1일 2회로 마우스 등에 200 ㎕ 씩 각각 도포하였다.
시료가 도포된 마우스 피부에 대하여, 경피수분손실량 (TEWL, Trans Epidermal Water Loss)은 AquaFlux (Biox, London, UK)를 이용해서 측정하였고, 피부 수분 함유량(hydration)과 pH는 Skin-O-Mat (COSMOMEP, Berlin, Germany)를 이용하여 측정하였다. 처음 DNCB에 의하여 아토피 피부염을 유도하기 전, 유도 후 7일 후, 14일 후 및 21일 후 측정하였다.
그 결과, 무모 마우스에서 대나물 지상부, 지하부 추출물 처리 후 시간 경과에 따른 경피 수분 손실량(TEWL) 차이를 나타낸 도 2에 나타낸 바와 같이, 대나물과 각 추출물은 무모 마우스에서 대조군인 비히클에 비해 경피 수분 손실량이 무처리군과 비슷한 정도로 낮아진 것을 확인할 수 있다. 따라서 대나물 지상부 추출물이 무모 마우스에서 비히클에 비해 확연하게 피부장벽 기능이 강화시키는 것을 알 수 있다.
또한 도 3에 나타낸 바와 같이, 대나물의 각 추출물이 무모 마우스에서 대조군인 비히클에 비해 수분함유량(hydration)을 높이는 것을 확인하였다. 그중 대나물 지상부 추출물은 지하부 추출물에 비해 수분함유량을 높였다. 따라서 대나물 지상부 추출물 무모 마우스에서 비히클 및 지하부에 비해 피부장벽 기능을 강화시키는 것을 알 수 있다.
피부 장벽이 무너지면 피부 표면의 pH 값이 상승하게 되는데, 무모 마우스에서 대나물의 각 추출물을 처리 후 시간 경과에 따른 피부 pH 값을 측정한 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이, 대나물 지상부의 각 추출물은 무모 마우스에서 대조군인 비히클에 비해 pH 값이 크게 변하지 않는 것으로 보였다. 따라서 대나물의 지상부 추출물에 의해 피부 장벽 기능이 강화된 것을 알 수 있다.
0 일 21 일
CON 6.475 6.3375
비히클 6.5125 6.925
대나물 지상부 6.525 6.125
대나물 지하부 6.55 6.575
상기 혈액 중 혈장에서 아토피 피부염의 마커로 쓰이며 아토피 피부염에서 가장 중요한 요인 중 하나인 면역글로불린E(IgE)와 면역세포의 시토킨 중 하나인 인터루킨-4(IL-4)의 단백질 양을 ELISA 실험법을 이용하여 측정하였다.
구체적으로, 마우스 마취시킨 후에 0.18 M EDTA 30 ul가 들어있는 주사기를 이용하여 복부대동맥에서 혈액을 채취한다. 원심분리기를 이용하여 4 ℃ 8000 rpm에서 15 분간 원심분리한 후 혈장과 혈구를 분리한다. 이중 혈장에서 마우스 IgE ELISA quantitation kit (Bethy Laboratories, Montgomery, TX, USA)와 마우스 IL-4 ELISA quantitation kit (Bethy Laboratories, Montgomery, TX, USA)를 사용하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 대나물 지상부, 지하부 추출물은 무모 마우스에서 대조군인 비히클에 비해 혈장 내 IgE 단백질 양과 IL-4 단백질 양은 감소하는 경향을 확인하였다. 그 중 대나물 지상부 추출물은 다른 추출물에 비해 혈장 내 IgE 단백질 양을 현저히 감소시켰다.
<110> Korea Institute of Science and Technology <120> A composition for treating dermatitis comprising aerial part of Gypsophila oldhamiana Miq. extract and fractions and use thereof <130> PN120095KR <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ccaccttgct gtcaccctgt tctgct 26 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gtgttgtgag cgtggactca ttcacg 26 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 accgtgaaaa gatgacccag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tgtcagctgt ggtggtgaag 20

Claims (16)

  1. 대나물(Gypsophila oldhamiana Miq.) 지상부 추출물, 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부염을 예방 또는 치료하기 위한 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 대나물 지상부는 건조된 것인 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 추출물은 친수성 용매 중에서 추출된 것인 조성물.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 친수성 용매는 물, C1 내지 C6의 알코올 또는 이들의 혼합물인 것인 조성물.
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 알코올은 에탄올, 메탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, sec-부탄올, 이소부탄올, tert-부탄올 또는 이들의 혼합물인 것인 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 추출물은 환류 냉각에 추출된 것인 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 분획물은 상기 대나물 지상부, 지하부 추출물을 물에 현탁 시킨 후, 메틸렌클로리드(CH2Cl2), 에틸아세테이트(EtOAc) 또는 부탄올 (n-BuOH)로 추출하여 분획화하여 얻어진 메틸렌클로리드 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 또는 부탄올 분획물인 것인 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 추출물은 면역기능을 안정화시키는 것, 또는 IL-4의 발현을 저해하는 것인 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 피부염은 피부 소양증, 지루성 피부염, 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 당뇨병성 피부염, 모낭염, 여드름, 알레르기성 피부염 및 신경성 피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
  10. 청구항 1에 있어서, 화장품학적으로, 약학적으로, 또는 식품적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 더 포함하는 것인 조성물
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 약학, 식품 또는 화장 조성물인 것인 조성물.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 피부 보습용 화장 조성물인 것인 조성물.
  13. 초음파 조사하에 대나물 지상부를 물, C1 내지 C6의 알코올 또는 이들의 혼합물과 접촉시키는 단계를 포함하는 대나물 지상부 추출물을 제조하는 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 방법은 상기 추출물을 물에 현탁시킨 후 메틸렌클로리드, 에틸아세테이트, 부탄올 또는 이들의 조합으로 분획화하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  15. 청구항 1 내지 11 중 어느 하나의 조성물을 피부염을 치료하기에 유효한 양으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 피부염을 치료하는 방법.
  16. 청구항 12의 조성물을 피부염을 개선하기에 유효한 양으로 개체의 피부에 적용하는 단계를 포함하는 개체의 피부 보습을 위하여 화장하는 방법.
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