KR101231446B1 - 복합 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 알러지성 또는 비알러지성 피부 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품 - Google Patents

Abstract

본 발명은 부평초, 사상자, 백부근으로 조성된 생약 추출물은 가려움증 감소, 피부염증, 홍반, 부종 두께 증가와 같은 병리적 손상의 발생 억제를 확인함으로써 알러지성 또는 비알러지성 피부질환의 치료 및 예방에 유용한 조성물을 제공할 수 있다.

Description

복합 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 알러지성 또는 비알러지성 피부 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품 {Pharmaceutical Composition and heath care food comprising the extract of complex herb an active ingredient for preventing and treating allergic or non-allergic skin disease}

본 발명은 부평초, 사상자 및 백부근의 복합 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 알러지성 또는 비알러지성 피부 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

[문헌 1] Incorvaria C et al., Allergy and the skin Clin Exp Immunol 153 suppl 1:27-29 (2008)

[문헌 2] Anna Paula Galli Snchez, Immunopathogenesis of psoriasis An Bras Dermatol 85(5):747-9 (2009)

[문헌 3] Werfel T, Wittmann M., T cell regulation in allergy, asthma and atopic skin disease Chem Immunol Allergy 94:101-11 (2008)

[문헌 4] Asnis L.A et al., Cutaneous reaction to recombinant cytokine therapy J Am Acad Dermatol 24, 915-926, 1995

[문헌 5] 정보섭 외 1인, 향약 대사전, 영림사, pp.277~278, 1998

[문헌 6] 정보섭 외 1인, 향약 대사전, 영림사, pp.416~418, 1998

[문헌 7] 정보섭 외 1인, 향약 대사전, 영림사, pp.152~154, 1998

[문헌 8] (Matsuda, H et al., Development of atopic dermatitis like skin lesions with IgE hyperproduction in NC/Nga mice. Int Immunol. 9, 461-466, 1997)

[문헌 9](Oku H, Ishiguro, K Antipururitic and antidermatitic effects of extract and compounds of Impatients bal Samin L in atopic dermatitis model NC mice Phytother Res 15, 506-510, 2001

[문헌 10] Grimstad O et al., Anti-interleukin 31-antibodies ameliorate scratching behavior in NC/Nga mice; a model of atopic dermatitis Exp Dermatol 18(1), 35-43, 2009

[문헌 11] Takaoka A, Arai I et al., Expression of IL-31 gene transcripts in NC/Nga mice with atopic dermatitis Eur J Pharmacol 516(2), 180-181 2005

[문헌 12] 손미예, 남상해, 두충 추출물이 DNCB로 유발된 알레르기성 접촉피부염과 산화적 손상에 미치는 영향. 한국식품영양과학회지 36(12), 1517-1522, 2007

[문헌 13] 임금선등 BALB/c 및 Nc/Nga 마우스의 아토피성 피부 질환 모델에서 생약조성물 SPZZC의 치료 효능. 약학회지 52(3), 232-239, 2008

외부로부터의 자극과 항원에 대항하기 위하여 피부에는 다양한 면역세포가 존재하며 서로간의 복잡한 네트워크를 형성하며 항상성을 유지한다 (1). 상피조직은 주로 케라티노사이트로 구성되어있고 랑거한스 세포, T 세포와 대식 세포가 존재한다 (2). 대부분의 피부질환은 면역 세포에 의한 염증 반응을 특징으로 하며, 가려움, 부종, 홍반, 습진, 비늘화와 같은 임상 증상을 동반한다. 항원제시세포가 외부로부터 침입한 항원을 인지하면 화학유주인자가 분비되고 호산구와 비만세포가 유입되며, T 세포가 활성화되어 손상 조직으로 모여든다. 활성화된 T 세포로부터 분비되는 특정 사이토카인들이 과 발현되는 것은 피부염의 병리인자로서 작용한다는 것이 알려져 있다 (3). 이들은 가려움을 유발하고 염증세포의 유입을 증가시켜 아토피성 피부염, 접촉성 피부염뿐 만 아니라 건선과 같은 알러지성 혹은 비알러지성 피부 질환을 일으킨다(Incorvaria C et al., Allergy and the skin Clin Exp Immunol 153 suppl 1:27-29 (2008); Anna Paula Galli Snchez, Immunopathogenesis of psoriasis An Bras Dermatol 85(5):747-9 (2009); Werfel T, Wittmann M., T cell regulation in allergy, asthma and atopic skin disease Chem Immunol Allergy 94:101-11 (2008)).

IL-31은 활성화된 T 세포 (Th2 세포에서 더 많이 발현됨)에서 생산되는데 IL-6 사이토카인 가족 (family)에 속한다. IL-31수용체는 gp-130수용체 (GPL, or IL-31RA) 와 oncostatin M receptor (OSMR)로 구성되며, 상피세포와 케라티노사이트에 상시 존재한다. 아토피 피부염 환자의 피부조직에서는 IL-31의 발현이 현저히 증가되어 있으며 IL-4 와 IL-13 같은 Th2 사이토카인 증가를 유도한다고 여겨진다. 이들 Th2 사이토카인은 B 세포에 작용하여 IgE의 생산을 증가 시킬 수 있으며, IgE는 비만세포에 존재하는 수용체에 결합하여 히스타민등의 유리를 매개 함으로서 염증 반응과 가려움증을 일으킨다. 더불어 아토피 피부염 환자의 상피와 케라티노사이트, 환자에서 분리된 대식세포에서 IL-31수용체의 발현이 증가한다고 알려졌다. 또한 IL-31을 생쥐의 피부에 주입하거나 IL-31을 계속 발현하는 transgenic 생쥐는 심한 가려움증을 나타내며 호산구, 비만 세포의 피부 조직으로의 현저한 유입이 관찰되는 바, 피부염을 심화시키는 주요 병리 인자임을 알 수 있다. 한편 T 세포로부터 분비되는 IL-2은 T 세포의 증식을 자극하고 활성화시킨다. IL-2로 치료 받는 암환자의 경우 심한 피부 소양증을 나타내며, 피부 조직의 부종, 홍반, 괴사, 두드러기, 수포등을 형성한다는 것이 알려져 있다 (Asnis L.A et al., Cutaneous reaction to recombinant cytokine therapy J Am Acad Dermatol 24, 915-926, 1995).

부평초(Spirodela polyrrhiza)는 천남성과의 다년생 초본으로서 수면에 뜨는 작은 풀로서 개구리밥에 전초를 부평초라고도 지칭하며, 산화칼륨 및 염화칼륨, 불소 등의 성분이 알려져 있고 강심작용, 해혈작용 등에 효과가 있는 것으로 알려진바 있다.(정보섭 외 1인, 향약 대사전, 영림사, pp.277~278, 1998년)

사상자(Torilis japonica DC)는 대한민국 중북부에 분포하는 미나리과의 일년생 초본인 벌사상자 및 동속 근연식물의 과실을 지칭하며, 피넨(l-pinene), 캄펜(l-camphene), 보르네올(borneol), 이소발레릭 에스테르(isovaleric ester)등 의 성분이 알려져 있으며 항트리코모나스 작용, 성호르몬과 같은 유사 작용 등의 약효가 알려진 바 있다(정보섭 외 1인, 향약 대사전, 영림사, pp.416~418, 1998년).

백부근(Stemona japonica MIQ)은 다년생 초본으로서 중국 원산지이며 백부 및 동속 근연식물의 괴근을 지칭하며 스테모닌(stemonine), 스테모니딘(stemonidine), 이소스테모닌(isostemonine)등의 성분으로 알려져 있으며 향균 작용, 살충작용등의 효능을 가진 것으로 알려진 바 있다(정보섭 외 1인, 향약 대사전, 영림사, pp.152~154, 1998년)

본 연구자는 부평초, 사상자, 백부근으로 조성된 생약 추출물 (MJ201)을 NC/Nga 아토피 피부염 생쥐에 경구 투여 하였을 때 가려움증이 현저히 감소하고 피부 조직의 홍반과 부종이 억제 된 것을 확인하였고 epidermis와 dermis의 두께가 증가하는 것을 억제하며 호산구와 비만세포의 유입이 현저히 감소하는 것을 확인하였다. 접촉성 피부염을 유도하며 MJ201을 생쥐에 경구 투여한 결과 IgE 생산이 유의적으로 감소하였으며, 분리된 CD4+ T 세포 로부터 IL-31의 발현과 IL-2의 생산이 감소 하는 것을 확인하였다. 또한 PMA와 ionomycin에 의해 활성화된 EL-4 T 세포의 IL-31발현과 IL-2의 생성이 유의적으로 감소하는 것을 확인 한 바, MJ201은 다양한 피부 질환의 가려움증을 감소시키고 피부염증, 홍반, 부종, 두께 증가와 같은 병리적 손상이 발생하는 것을 억제함으로써 다양한 피부 질환 치료제로 응용할 수 있다.

이에 본 발명자는 부평초, 사상자, 백부근으로 조성된 생약 추출물을 가려움증 감소, 피부염증, 홍반, 부종 두께 증가와 같은 병리적 손상의 발생 억제를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 부평초, 사상자 및 백부근으로 조성된 생약 추출물(MJ201)의 복합 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 알러지성 또는 비알러지성 피부 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본원에서 정의되는 복합 생약 추출물은 부평초, 사상자 및 백부근의 건조중량비(w/w)가 1~10:1~10:1, 바람직하게는 1~5:1~5:1, 더 바람직하게는 1~3:1~3:1을 포함함을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 추출물은 정제수를 포함한 물, 주정, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 아세톤, 클로로포름, 메틸렌클로리드, 헥산 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 60-90% 에탄올 혼합용매에 가용한 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 알러지성 또는 비알러지성 피부 질환의 예로는 알러지성 피부질환으로는 과민증, 알러지성 비염, 천식, 알러지성 결막염, 알러지성 피부염, 아토피성 피부염, 알러지성 접촉성 피부염, 두드러기, 곤충 알러지, 식품알러지 또는 약품 알러지, 바람직하게는 알러지성 비염, 천식, 알러지성 피부염, 아토피성 피부염, 알러지성 접촉성 피부염, 두드러기, 식품 알러지 또는 약품 알러지, 보다 바람직하게는 아토피성 피부염 또는 접촉성 피부염을 들 수 있으며; 비알러지성 피부질환으로는 비알러지성 습진 (자극성 피부염, 지루성 피부염, 화폐성 습진, 울체성 피부염, 만성 단순성 태선, 한포진, 노인성 습진), 원발성 단순 접촉성 피부염, 완선, 건선 등, 바람직하게는 자극성 피부염 또는 지루성 피부염을 포함한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

예를 들어, 건조상태의 부평초, 사상자 및 백부근 약제를 건조 중량비(W/W)가 1~10:1~10:1~10, 바람직하게는 1~5:1~5:1~5, 더 바람직하게는 1~3:1~3:1~3 비율로 혼합하는 제 1단계; 이 중량의 약 1 내지 30배, 바람직하게는 5 내지 15배 부피의(w/v%) 정제수를 포함한 물, 주정, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 아세톤, 클로로포름, 메틸렌클로리드, 헥산 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 60-90% 에탄올 혼합용매로, 약 0 내지 100℃, 바람직하게는 20 내지 60℃ 온도에서 약 1 내지 48시간, 바람직하게는 12시간 내지 36시간 동안 추출하는 제 2단계; 제 2단계를 약 1 내지 10회, 바람직하게는 2 내지 7회 반복하는 제 3단계; 이를 여과농축 및 동결 건조시키는 제 4단계를 포함하는 제조방법을 통해 본 발명의 복합 생약 추출물을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 복합 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 알러지성 또는 비알러지성 피부 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 부평초, 사상자, 백부근으로 조성된 생약 추출물은 가려움증 감소, 피부염증, 홍반, 부종 두께 증가와 같은 병리적 손상의 발생 억제를 확인하여 알러지성 또는 비알러지성 피부 질환의 치료 및 예방에 유용함을 확인하였다.

또한, 본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 복합 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 알러지성 또는 비알러지성 피부 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 복합 생약 추출물을 함유하는 알러지성 또는 비알러지성 피부 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 복합 생약 추출물을 0.1 내지 50 중% 포함한다.

그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 복합생약추출물을 함유하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 복합생약추출물을 함유하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 추출물을 함유하는 조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오즈(lactose), 덱스트로즈, 수크로스(sucrose), 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 복합 생약 추출물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 1 내지 10mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 그 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 부평초, 사상자, 백부근의 복합 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 알러지성 또는 비알러지성 피부 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다. 이를 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차 비타민 복합제, 건강기능성 식품류 등이 있다.

본 발명의 상기 추출물 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명의 상기 추출물은 알러지성 또는 비알러지성 피부 질환의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 복합 생약 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 기능성 음료 조성물은 100㎖를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 복합 생약 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 추출물들은 천연 과일 쥬스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하지는 않지만 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 부평초, 사상자, 백부근으로 조성된 생약 추출물은 가려움증 감소, 피부염증, 홍반, 부종 두께 증가와 같은 병리적 손상의 발생 억제를 확인함으로써 알러지성 또는 비알러지성 피부 질환의 치료 및 예방에 유용한 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 NC/Nga 마우스에서 귀피부의 조직학적 검사결과이며, 동물에게는 식염수(Naive) 또는 MJ201(250mg/kg/day)을 6주간 투여하고. 귀 생검을 염증성 세포 및 비만세포를 검사하기 위하여 염색법(hematoxylin and eosin (H&E) (left panel) 및 toluidine blue(right panel))을 수행하고 염색된 조직을 밝은 현미경(Nikon,Japan,orignalmagnification,x200)으로 관찰한 것이며(a;Naive, b; Control, c;CsA, d;MJ201);
도 2는 NC/Nga 마우스에서 등피부의 조직학적 검사결과이며, 동물에게는 식염수(Naive) 또는 MJ201(250 mg/kg/day)을 6주간 투여하고, 등 피부 생검을 염증성 세포 및 비만세포를 검사하기 위하여 염색법(hematoxylin and eosin (H&E) (left panel) 및 toluidine blue (right panel))을 수행하고 염색된 조직을 밝은 현미경(Nikon,Japan,orignalmagnification,x200)으로 관찰한 것이며(a;Naive, b; Control, c;CsA, d;MJ201);
도 3은 NC/Nga 마우스에서의 긁는 행동에 대한 MJ201의 효과를 나타낸 결과이며, 긁은 행동을 20분간 긁는 행위 발생수를 판독한 것이며(* p<0.05,**p<0.01,***p<0.001);
도 4는 NC / Nga 마우스 피부에서의 IL -31 발현에 대한 추출물의 효과를 나타낸 도이며, IL-31 및 β-actin mRNA 의 발현 수준을 RT-PCR으로 측정한 도이며;
도 5는 CD4 + T 세포에서의 IL -31 mRNA 발현에 대한 MJ201 의 효과를 나타낸 도이며, 동물들은 접촉성 피부염을 유발시키기 위하여 DNCB 로 처치하고 연속 4일간 식염수(Naive) 또는 MJ201(250 mg/kg/day) 을 투여하고, CD4+ T 세포들 비장으로부터 분리하고 6시간동안 항(anti)-CD3 및 항(anti)-CD28 항체로 자극하고 IL-31 mRNA 수준을 정량적 실시간(real-time) PCR으로 특정한 것이며;
도 6는 CD4 + T 세포에서의 IL -2 생산에 대한 MJ201 의 효과를 나타낸 도이며, MJ201(250㎎/㎏/day)을 4일간 BALB/c 마우스에 경구투여하고, 동물들을 익일에 희생시키고 CD4+ T 세포를 분리하고 6시간 동안 항(anti)-CD3 및 항(anti)-CD28 항체로 자극하고 배양 상등액에서의 IL-2 수준을 ELISA로 측정하였으며;
도 7는 IgE 생성에 대한 MJ201 의 효과를 나타낸 도이며, IgE 의 혈청 수준을 ELISA로 측정하였으며, 개개 막대(bar)는 IgE 수준의 혈중 평균(mean S.E.M.)을 표시한 것이며(* p<0.05,**p<0.01,***p<0.001);
도 8는 활성화된 EL -4 T 세포에서 IL -31 mRNA 발현에 대한 MJ201 의 효과를 나타낸 도이며, EL-4 T 세포는 60㎍/㎖의 MJ201으로 1시간 동안 전처리하고, 6시간 동안 PMA(50ng/㎖) 및 이노마이신(Ionomycin; 0.25μM)으로 자극시키고, IL-31 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR으로 측정하고;

도 9는 활성화된 EL -4 T 세포에서 IL -2 단백질 생산에 대한 MJ201 의 효과를 나타낸 도이며, EL-4 T 세포는 60㎍/㎖의 MJ201으로 1시간 동안 전처리하고, 6시간 동안 PMA (50ng/㎖) 및 이노마이신(Ionomycin; 0.25μM)으로 자극시키고, IL-2 단백질 생산 수준을 ELISA로 측정한 것이다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 식물추출물 MJ201 의 제조

삼각 플라스크에 허브포유사(http://www.herbforyou.net, Daejeon, Korea)에서 구입한 건조상태의 3가지 약제를 동등한 비율로 혼합하였다. 이 약제혼합물 300g에 95% 에탄올과 증류수를 80 : 20으로 혼합한 80% 에탄올로 실온에서 1일간 방치하여 추출하였다. 이 같은 방법으로 3회 반복 추출하여 얻은 추출액을 여과한 후 회전식감압농축기(Rotary evaporator)를 이용하여 감압농축 시킨 후 냉동 건조한 후 생약의 에탄올 추출물 70g을 얻고 MJ201이라 명명하였다. MJ201은 파우더 형태로 -20℃에 보관하였다.

참고예 1. 재료 및 방법

1. 재료

(1) 동물 및 세포주

NC/Nga 생쥐 (Male, 6주령), BALB/c 생쥐 (Female, 4주령)는 대한바이오링크(Korea)에서 구입하였으며, 고형사료 (삼양사료 Co.)와 물을 충분히 공급하고 실온 22 ± 2℃, 습도 50~70%, 조명시간 12시간 (08:00∼20:00), 조도 150∼300Lux로 설정하여 1주일간 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. EL-4 T lymphoma 세포는 한국세포주은행(Seuol, Korea)에서 구매하였으며 RPMI 1640에 10% fetal bovine serum(FBS)와 penicillin 100U/㎖, streptomycin 100㎍/㎖를 첨가하여 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다.

(2) 시약 및 기기

1) 시약

본 실험에 사용된 시약으로 MJ201(허브포유), anti-CD3/anti-CD28 (BDbiosciences Co., Korea), Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA), Ionomycin, 이소프로판올, 클로로포름(Sigma Co., U.S.A), Trizol, DEPC water(Invitrogen Co., U.S.A), VarioMACS(Miltenyi Biotec Co., Germany), SYBRPCR Master Mix, TaqManExpression Master Mix(Applied Biosystems Co., U.S.A), Prime Script™RT reagent kit(TAKARA Co., JAPAN), Maxime PCR PreMix Kit(iNtRON Biotechnology Co., Korea), IgE ELISA kit for mouse(SAIBAYAGI Co., Itd. JAPAN), RPMI-1640, dulbecco's phosphate buffered saline(D-PBS), fetal bovine serum(FBS), penicillin and streptomycin은 Gibco사 제품을 사용하였다.

2) 기기

본 실험에 사용된 기기는 Microplate spectrophotometer(Molecular Devices,U.S.A), CO₂ 배양기(incubator; FormascientificCo.,U.S.A), cleanbench(VisionscientificCo.,Korea), autoclave(Sanyo,Japan), micro-pipet(Gilson,France), waterbath(VisionscientificCo.,Korea), vortexmixer(VisionscientificCo.,Korea), real-time PCR(Applied Biosystems Co., U.S.A), centrifuge(Sigma Co., U.S.A), Microscopy(Nikon, JAPAN) 등을 사용하였다.

실험예 1. NC/Nga 아토피 피부염에 미치는 효과실험

상기 실시예에 수득한 시료의 경구 투여가 NC/Nga 아토피 피부염에 미치는 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 실시하였다.(Matsuda, H et al., Development of atopic dermatitis like skin lesions with IgE hyperproduction in NC/Nga mice. Int Immunol. 9, 461-466, 1997)

(1) 아토피 피부염 모델 (NC/Nga 생쥐)

1) Nc/Nga 생쥐에서 피부염 유도 및 시료처리

6주령이 된 NC/Nga 생쥐의 등을 귀 하단부에서부터 꼬리 상단 부까지 전체를 제모 한 후 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치 하였다. 1% TNCB 용액 (아세톤 : 올리브오일 = 3 : 1 ) 100㎕를 제모 한 부위에 도포하고, 1주 후 0.2% DNCB 용액을 3주 동안 100㎕ 처리하였다. 실험은 4개의 그룹으로 나누고, 정상군, 대조군에는 생리식염수를, 양성대조군인 CsA 투여군은 격일로 12.5㎎/㎏의 용량으로 복강 주사하였으며, 실험군에는 MJ201을 250㎎/㎏의 용량으로 매일 5주간 경구 투여하였다.

2) 조직 검사

실험 종료 후에 귀 끝부분, 등 피부를 떼어내어 10% paraformaldehyde에서 24시간동안 고정하였다. 그 조직을 파라핀으로 포맷하였고, 5㎛ 두께로 block을 만들었다. Hematoxyline and Eosin(H&E)염색법을 이용하여 epidermis, dermis, keratinocytes, neutrophils/eosinophil을 염색하였으며, 톨루이딘 블루(toluidine blue)염색법을 이용하여 비만세포의 침윤을 관찰 하였다.

3) 피부 조직에 미치는 효과

MJ201이 아토피 피부염에 미치는 효과를 조사하기 위하여 NC/Nga 생쥐의 등에 TNCB를 처리하여 피부염을 유발하면서 6주간 매일 250mg/kg의 용량으로 경구 투여하였다. 실험 종료 후 귀의 일부와 등 피부를 절단 한 후 H&E 염색과 toluidine 염색을 실시하였다. H&E 염색에서 대조군의 epidermis와 dermis는 부종으로 현저하게 확장되었고, 백혈구 침윤도 관찰 되었다 (Fig. 1. b and Fig. 2. b). 이에 비해 MJ201 투여군은 대조군에 비하여 epidermis와 dermis의 두께가 감소되고 백혈구의 침윤도 억제되었다 (도 1. d 및 도 2. d). Toluidine 염색법에 의하여 비만세포를 염색하였을 때, 대조군에서는 dermis 주변에 비만세포가 현저히 침윤한 것을 관찰 할 수 있었다 (도 1. f 및 도 2. f). 반면에 MJ201 투여군에서는 그림에서 나타난 바와 같이 비만 세포를 거의 관찰 할 수 없었다 (도 1. h 및 도 2. h).

실험예 2. 소양증에 미치는 효과실험

상기 실시예에서 수득한 시료의 경구 투여가 소양증에 미치는 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 긁는 행위(Scratching behavior) 평가 실험을 실시하였다.(Oku H, Ishiguro, K Antipururitic and antidermatitic effects of extract and compounds of Impatients bal Samin L in atopic dermatitis model NC mice Phytother Res 15, 506-510, 2001; Grimstad O et al., Anti-interleukin 31-antibodies ameliorate scratching behavior in NC/Ngamice; a model of atopic dermatitis Exp Dermatol 18(1), 35-43, 2009)

소양증에 미치는 효과를 측정하기 위하여 MJ201를 투여 후 20분 동안 몸을 긁는 회수를 세어서 scratching behavior로 나타내었으며 일주일에 1번씩 5주 동안 관찰하였다 (단, 핥는 행위는 제외).

가려움증에 미치는 효과

소양증에 미치는 효과를 조사하기 위하여 MJ201 투여 후 20분간 긁는 횟수를 측정하였다. 실험 기간이 경과함에 따라 정상군, 대조군, 양성 대조군, 생약, 모든 군에서 긁는 횟수가 증가하는 것을 관찰 할 수 있었으며 4주차에 그 수치가 최고치에 이르렀다. 정상군은 20분당 약 20번이 관찰 되었고, 대조군에서는 약 40번으로 그 수치가 현저히 증가되었으며, 양성대조군인 CsA (CyclosporinA) (Calbiochem, La Jolla, CA. USA) 투여군에서는 약 30번, MJ201 투여군에서도 30번으로 양성 대조군과 비슷한 수준으로 가려움증이 감소한 다는 것을 확인하였다.

실험예 3. NC / Nga 생쥐의 피부 조직에서 IL -31 mRNA 발현에 미치는 효과실험

상기 실시예에서 수득한 시료의 NC/Nga 생쥐의 피부 조직에서 IL-31mRNA 발현에 미치는 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 RT-PCR 실험을 실시하였다 (Takaoka A, Arai I et al., Expression of IL-31 gene transcripts in NC/Nga mice with atopic dermatitis Eur J Pharmacol 516(2), 180-181 2005).

NC/Nga 생쥐의 귀 피부 조직을 떼어내어 Trizol 시약을 500㎕을 넣고 튜브에 넣은 후 클로로포름을 100㎕ 넣은 후 잘 섞었다. 원심분리하여 층이 분리되면 aqueous phase 용액을 200㎕ 취해서 튜브에 옮긴 후, 동량의 이소프로판올을 넣어 상온에서 10분간 방치한 후 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 75% 에탄올을 1㎖ 넣어 잘 섞어준 후 원심분리하여 생등액을 완전히 제거하고 투명해질 때까지 말린 후 DEPC water로 RNA의 양에 따라 20~50㎕ 넣어 녹였다. RNA를 정량 하여 200ng/㎕로 맞춘 후 Prime Script™RT reagent kit를 사용하여 제조사의 지시에 따라 cDNA를 합성하였다. cDNA를 만든 후 Maxime PCR PreMix Kit에 cDNA를 넣은 후 94℃ 30초, 57℃ 30초, 72℃ 30초로 25~30회 RT-PCR을 하였다 (표 1 참조).

Mouse IL-31 primer sets
forward;	5’- TCGGTCAT AT GC CA CTGGAG -3’
reverse;	5’- GCACAGTC CTTTGGAGTTAAGTC -3’
Mouse β-actin primer sets
forward;	5’- CGGGGACCTGACTGACTACC -3’
reverse;	5’- AGGAAGGCTGGAAGAGTGC -3’

NC / Nga 생쥐의 피부 조직에서 IL -31 mRNA 발현에 미치는 효과

피부 조직으로부터 mRNA를 분리하여 IL-31의 발현 정도를 비교 한 결과, 대조군에서는 정상군에 비하여 그 발현 양이 현저히 증가하였고, 양성 대조군인 CsA 투여군은 IL-31 mRNA 발현이 현저히 억제되었으며, MJ201 투여군에서도 IL-31 mRNA 발현이 억제되었다.

실험예 4. 접촉성 피부염 모델 실험

상기 실시예에서 수득한 MJ201 추출물의 경구 투여가 접촉성 피부염 생쥐의 면역계에 미치는 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 접촉성 피부염 모델 실험을 실시하였다 (손미예, 남상해, 두충 추출물이 DNCB로 유발된 알레르기성 접촉피부염과 산화적 손상에 미치는 영향. 한국식품영양과학회지 36(12), 1517-1522, 2007; 임금선등 BALB/c 및 Nc/Nga 마우스의 아토피성 피부 질환 모델에서 생약조성물 SPZZC의 치료 효능. 약학회지 52(3), 232-239, 2008).

4-1. BALB /c 생쥐의 피부염 유도 및 시료처리

4주령이 된 BALB/c 생쥐의 등을 귀 하단부에서부터 꼬리 상단부까지 전체를 제모한 후 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치 하였다. 0.5%의 DNCB용액 (아세톤 : 올리브오일 = 4 : 1) 200㎕를 제모한 부위에 도포하고, 5일 후 1%의 DNCB용액 100㎕를 귀에 도포하여 피부염을 야기하였다. 실험은 5 마리씩 3개의 그룹으로 나누고, 정상군, 대조군에는 생리식염수를, 실험군으로 MJ201 (250㎎/㎏/day)을 1일 1회씩 4일 동안 각각 경구 투여하였다.

4-2. 혈청 내 IgE 생성량 측정

투여 처치 종료 후 ether로 마취한 상태에서 심장 천자법을 이용하여 채혈한 다음 원심 분리하여 혈청을 분리하였다. 혈청 내 IgE 생성량 측정은 ELISA kit를 이용하여 다음과 같이 측정하였다. 항체가 coating되어 있는 microwell을 3회 washing 완충 용액으로 세척한 후 혈청 (10배 희석) 50㎕씩 분주하였다. 이를 2시간 동안 실온에서 반응 시키고 washing 완충 용액으로 3회 세척한 다음 biotin-conjugated antibody 50㎕로 실온에서 2시간 처리하고 HRP-avidin용액 50㎕로 다시 1시간 반응 시킨 후 세척하였다. 여기에 TMB기질(chromogenic substrate)을 50㎕씩 분주하고 암소에서 20분간 방치한 다음 50㎕의 stop 용액을 처리하였다. 반응 용액은 ELISA reader 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

4-3. Splenocyte CD4 + T cell 분리

MJ201을 4일 동안 투여한 후 이틀 후에 BALB/c 마우스를 경추 탈구하여 치사시킨 후, 비장을 무균적으로 적출하여 빙냉의 RPMI 배지에 나일론 체 (70uM) 위에서 비장 조직을 갈아서 면역세포를 방출시켰다. 세포 현탁액을 원심분리한 후 세포침전물에 RBC lysis buffer를 가하여 적혈구를 용혈 시킨 후, PBS로 2회 세척하고 RPMI 1640-FBS (10% FBS 함유된 RPMI-1640) 배지를 이용하여 세포 농도를 1× 10⁷cells/㎖ 조정하여 세포용액을 조제하였다.

이 세포액에 MACS CD4+T cell kit지시에 따라 biotin-antibody cocktail과 anti-biotin microBeads, MACS buffer를 넣고 반응 시킨 후 MACS Column에 세포를 로딩하여 CD4+ T cell을 얻었다. 이를 2×10⁶cells/㎖로 조정하여 6well에 2㎖씩 분주한 후 anti-CD3/anti-CD28과 함께 37℃, 5% CO₂배양기에서 6시간 배양하였다.

4-4. Real - time PCR

Splenocyte CD4+ T cell를 6 well에 2×10⁶cells/㎖로 분주한 후 anti-CD3/anti-CD28으로 6시간 동안 자극한 뒤 세포를 얻었다. EL-4 T cell 1×10⁶cells/㎖로 60mm 플레이트에 4 ㎖씩 분주한 후 MJ201을 60㎍/㎖로 처리하고 1시간 후에 PMA(50ng/㎖)와 ionomycin(0.25μM)으로 자극한 뒤 6시간 후에 세포를 얻었다. RT-PCR과 동일한 방법으로 cDNA를 만든 후 IL-31, GAPDH primer를 적정농도로 각각 희석하여 넣고, Power SYBR Green PCR Master Mix, TaqManExpression Master Mix와 cDNA를 넣은 후 real-time PCR을 95℃ 10분 실행 후 95℃ 15초, 60℃ 1 분으로 40회 실행시켰다 (표 2 참조).

Mouse IL-31 primer sets
forward;	5’- ATACAGCTGCCGTGTTTCAG -3’
reverse;	5’- AGCCATCTTATCACCCAAGAA -3’
Mouse GAPDH Pre-Developed TaqMan Assay Reagents (Applied Biosystems Co., U.S.A, Cat. No. 435239E)

4-5. 통계 처리

각 실험군 결과 값은 통계프로그램(unpaired student's T-test)을 사용하여 통계 처리하였으며, P<0.05 이하의 수준에서 유의성 검정을 실시하였다 (* p<0.05,**p<0.01,***p<0.001).

상기한 바와 같은 실험 결과,

4-6. CD4 + T cell 에서 IL -31 mRNA 발현 및 IL -2의 생산에 는 효과,

DNCB를 피부에 도포하여 접촉성 피부염을 유발한 생쥐의 비장으로부터 CD4+ T 세포를 분리하고 mRNA를 얻은 후, IL-31의 발현 정도를 비교 한 결과, 대조군 에서는 정상군에 비하여 그 발현 양이 현저히 증가하였고, MJ201을 투여한 군에서는 IL-31 mRNA 발현이 억제되었다(도 5). DNCB를 피부에 도포하여 접촉성 피부염을 유발한 생쥐의 비장으로부터 CD4+ T 세포를 분리하고 anti-CD3 와 anti-CD28로 활성화된 CD4+ T 세포의 상층액을 얻은 후, IL-2의 생성 정도를 비교 한 결과, 대조군은 정상군에 비해 IL-2의 생산이 2배 정도 증가 하였고, MJ201 투여군에서는 IL-2 생산이 감소하여 정상군과 비슷한 정도로 나타났다 (도 6 참조).

4-7. IgE 생산량에 미치는 효과

대조군의 혈청 중 IgE의 농도는 651.79 ± 46.68ng/㎖으로 정상군(319.47 ± 58.44ng/㎖) 보다 유의적으로 증가하였고, MJ201 투여군은 362.76 ± 62.56ng/㎖으로 유의적으로 감소하였다.

4-8. MJ201의 T 세포 활성 억제 작용

(1) EL-4 T cell에서 및 IL-2의 생산에 미치는 효과

PMA와 Ionomycin으로 활성화된 EL-4 T 세포에 MJ201(60㎍/㎖) 을 처리하여 mRNA를 얻은 후, IL-31의 발현 정도를 비교 한 결과, PBS만을 처리한 정상 세포에 비하여 PI를 처리한 대조군에서는 IL-31의 발현 양이 현저히 증가하였고, MJ201을 처리한 세포에서는 IL-31 mRNA 발현이 억제 되었다 (도 8). PMA와 Ionomycin으로 활성화된 EL-4 T 세포에 MJ201을 처리하여 상층액을 얻은 후, IL-2의 생산 정도를 비교 한 결과, 대조군은 정상군에 비해 IL-2의 생산이 증가 하였고, MJ201 투여군은 대조군보다 유의적으로 감소하였다 (도 9).

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

MJ201 추출물 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

MJ201 추출물 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

MJ201 추출물 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

MJ201 추출물 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO_{4 ,}12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

MJ201 추출물 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

MJ201 추출물 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

Claims (6)

1. 부평초(Spirodela polyrrhiza), 사상자(Torilis japonica DC) 및 백부근(Stemona japonica MIQ)의 복합 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 알러지성 피부 질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 복합 생약 추출물은 부평초, 사상자 및 백부근의 건조 혼합중량비(%)가 1~10 : 1~10 : 1~10로 구성됨을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 1항에 있어서,
   상기 추출물은 정제수를 포함한 물, 주정, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 아세톤, 클로로포름, 메틸렌클로리드, 헥산 또는 이들의 혼합용매에 가용한 추출물임을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 1항에 있어서,
   상기 알러지성 피부질환으로는 과민증, 알러지성 비염, 천식, 알러지성 결막염, 알러지성 피부염, 아토피성 피부염, 알러지성 접촉성 피부염, 두드러기, 곤충 알러지, 식품알러지 또는 약품 알러지인 조성물.
5. 부평초, 사상자, 백부근의 복합 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 알러지 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
6. 제 5항에 있어서
   상기 식품은 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 식품류 형태인 식품.
   

Images