CN114480249B - 马氏珠母贝黏液用于提取外泌体的用途、外泌体及其提取方法和应用 - Google Patents

马氏珠母贝黏液用于提取外泌体的用途、外泌体及其提取方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种马氏珠母贝黏液用于提取外泌体的用途、外泌体及其提取方法和应用。本发明采用超速离心法从马氏珠母贝黏液中分离得到囊泡状纳米颗粒，并鉴定为外泌体，由此为从海洋生物中提取生物活性外泌体提供了参考，同时也提高了马氏珠母贝的利用价值。本发明从马氏珠母贝黏液中提取的外泌体能够增强细胞活力，降低细胞内ROS水平，抑制NF‑κB和NLRP3通路的激活，降低相关炎症因子mRNA的表达水平，具有一定的抗炎作用。

Description

马氏珠母贝黏液用于提取外泌体的用途、外泌体及其提取方 法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种马氏珠母贝黏液用于提取外泌体的用途、外泌体及其提取方法和应用。
背景技术
外泌体和细胞外囊泡是由脂质、蛋白质、核酸等生物因子组成的球形纳米颗粒，目前国际上对于细胞外囊泡和外泌体并没有明确的分类，通常情况下，将他们称为囊泡状纳米颗粒。作为一种细胞分泌的囊泡状纳米颗粒，外泌体可以在细胞之间传递物质信息，因此外泌体已被应用于多种疾病的治疗，如抗肿瘤、抗炎症及抗氧化等。由于外泌体是细胞产物，因此，与其他治疗方法相比，使用外泌体作为治疗方法具有更低的细胞毒性和更高的生物相容性。
外泌体分布在许多生物体的体液和细胞中，但大多数外泌体的分离来源主体仍然是人类细胞，如间充质干细胞。然而，人源细胞外泌体存在许多局限性，如分离产量低和分离成本高。因此，寻找新的外泌体来源来取代人类细胞来源外泌体显得尤为重要。有研究发现外泌体已从卷心菜中分离出来，并经过鉴定，它们具有相关抗炎特性，而在海洋生物中，也有报道发现从海参中分离出具有类似抗炎作用的细胞外囊泡。此外，有研究成功从鳕鱼黏液中分离和提取出外泌体，并发现它们含有免疫相关蛋白。然而，与人类和植物来源的外泌体相比，从海洋生物中提取外泌体的研究仍相对缺乏。
发明内容
本发明解决的问题是从海洋生物中提取一种新型的外泌体。
为解决上述问题，本发明第一方面提供一种马氏珠母贝黏液用于提取外泌体的用途。
本发明第二方面提供一种外泌体的提取方法，采用超速离心法和过滤方法从马氏珠母贝黏液中提取外泌体。
较佳地，所述采用超速离心法和过滤方法从马氏珠母贝黏液中提取外泌体包括：
对所述马氏珠母贝黏液进行过滤及初步离心处理，得到待提取液；
对所述待提取液进行超速离心处理，得到第二底部沉淀；
用缓冲液重新悬浮所述第二底部沉淀，所得重悬液即为所述外泌体。
较佳地，对所述待提取液进行两次所述超速离心处理得到所述第二底部沉淀，两次所述超速离心处理的离心力均为100000g。
较佳地，所述对所述待提取液进行两次所述超速离心处理包括：
将所述待提取液置于水平转子中，进行第一次超速离心处理70min，弃去上清液，得到第一底部沉淀；
对所述第一底部沉淀进行洗涤后，进行第二次超速离心处理90min，弃去上清液，得到所述第二底部沉淀。
较佳地，采用PBS溶液对所述第一底部沉淀进行洗涤。
较佳地，所述对所述马氏珠母贝黏液进行过滤及初步离心处理包括：
对所述马氏珠母贝黏液进行过滤后，得到滤液；
对所述滤液进行第一次离心处理和第二次离心处理，得到第一上清液，其中，所述第一次离心处理的离心力为500g，离心时间为10min，所述第二次离心处理的离心力为2000g，离心时间为10min；
对所述第一上清液进行第三次离心处理，得到的第二上清液即为所述待提取液，其中，所述第三次离心处理的离心力为10000g，离心时间为30min。
较佳地，所述缓冲液包括PBS溶液。
本发明第三方面提供一种外泌体，采用如上所述的外泌体的提取方法提取得到。
本发明第四方面提供一种上述的外泌体在用于治疗皮肤炎症方面的应用。
本发明相较于现有技术的优势在于：
本发明提供了一种马氏珠母贝黏液的新用途，从马氏珠母贝黏液中提取外泌体。本发明采用超速离心法从马氏珠母贝黏液中分离得到囊泡状纳米颗粒，并通过对提取的囊泡状纳米颗粒进行特征鉴定分析，鉴定结果为提取的颗粒确为外泌体，由此为从海洋生物中提取生物活性外泌体提供了参考，同时也提高了马氏珠母贝的利用价值。
本发明还通过脂多糖(LPS)刺激人角质形成细胞(HaCaT)，建立人皮肤炎症细胞体外模型，研究马氏珠母贝黏液来源外泌体对炎症的影响。结果表明：马氏珠母贝黏液来源外泌体能够增强细胞活力，降低细胞内ROS水平，抑制NF-κB和NLRP3通路的激活，降低相关炎症因子mRNA的表达水平，具有一定的抗炎作用。
附图说明
图1为本发明实施例的马氏珠母贝黏液来源外泌体的分离步骤示意图；
图2为本发明实施例的马氏珠母贝黏液来源外泌体的透射电镜图像；
图3为本发明实施例的马氏珠母贝黏液来源外泌体的NTA分析结果；
图4为本发明实施例的马氏珠母贝黏液来源外泌体在NTA中的布朗运动；
图5为本发明实施例的马氏珠母贝黏液来源外泌体的DLS分析结果；
图6为本发明实施例的马氏珠母贝黏液来源外泌体的特征蛋白鉴定结果；
图7本发明实施例中HaCaT细胞摄取马氏珠母贝黏液来源外泌体的激光共聚焦显微照片；
图8本发明实施例的马氏珠母贝黏液来源外泌体对HaCaT细胞的影响；
图9为本发明实施例的马氏珠母贝黏液来源外泌体对炎性HaCaT细胞活力的影响；
图10本发明实施例的马氏珠母贝黏液来源外泌体对炎性HaCaT细胞ROS水平的影响；
图11为本发明实施例中qRT-PCR检测HaCaT细胞中IL-6的mRNA表达水平；
图12为本发明实施例中qRT-PCR检测HaCaT细胞中IL-8的mRNA表达水平；
图13为本发明实施例中qRT-PCR检测HaCaT细胞中TNF-α的mRNA表达水平；
图14本发明实施例的马氏珠母贝黏液来源外泌体对NF-κB和NLRP3通路的影响；
图15本发明实施例的马氏珠母贝黏液来源外泌体对P65蛋白进入细胞核的影响。
具体实施方式
马氏珠母贝又称为合浦珠母贝，是一种重要的海水养殖贝类，主要用于珍珠养殖。马氏珠母贝肉大部分被食用或丢弃，有研究发现，马氏珠母贝肉含有抗氧化、抗炎、免疫等活性成分。不仅如此，除了马氏珠母贝肉外，也有研究发现马氏珠母贝黏液中含有抗氧化糖蛋白，这大大提高了马氏珠母贝及其黏液的开发潜力。此外，马氏珠母贝在治疗皮肤病方面也有相关应用。从马氏珠母贝中分离出的多肽已被鉴定为具有促进伤口愈合的功能。另外，珍珠提取物可以治疗紫外线照射下人角质形成细胞的炎症和凋亡，这表明珍珠提取物具有治疗皮肤炎的潜力。
特应性皮炎是一种常见的慢性炎症性皮肤病，其主要症状为皮肤干燥、瘙痒、湿疹，炎症损伤是特异性皮炎的重要机制。用脂多糖(LPS)/肿瘤坏死因子-α(TNF-α)/干扰素-γ(IFN-γ)刺激人角质形成细胞构建的细胞模型已被广泛用于寻找治疗皮肤炎症的特异性治疗方法和药物。
因此，基于上述相关研究，推测马氏珠母贝黏液中存在外泌体，这些外泌体具有与珍珠提取物相似的生物活性。然而，目前还没有从马氏珠母贝或其黏液中提取外泌体的研究。
本发明提供了一种马氏珠母贝黏液在提取外泌体方面的新用途，还提供了一种从马氏珠母贝黏液中提取外泌体的方法，得到一种具有抗炎作用的新型外泌体，并进一步探究了黏液来源外泌体缓解治疗皮肤炎症的机制，为马氏珠母贝黏液来源外泌体成为一种新型海洋活性物质奠定基础，同时也提高了马氏珠母贝的利用价值。
常用的外泌体分离提取方法有超速离心法、尺寸排斥色谱法、切向流动过滤法、免疫亲和捕获法以及新型微流控芯片分离法等。每种方法都有自己的优点和缺点。通过上述几种常用的分离方法对外泌体的纯度和效率进行评价，发现超速离心法是最佳方法。但是，不同来源的样品，超速离心法的方法条件也会发生变化。同时，超速离心法存在耗时长、技术要求高等缺点，因此，确定超速离心法的分离条件仍然是一个挑战。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。
本发明实施例中的马氏珠母贝黏液由广东尊鼎珍珠有限公司(广东湛江)提供，于-80℃条件下保存。本实施例采用超速离心法联合过滤技术从马氏珠母黏液中提取外泌体。
请结合图1所示，首先，对马氏珠母贝黏液进行过滤及初步离心处理，得到待提取液。
具体地，先从马氏珠母贝(Pinctada maartensii)中提取黏液，然后将马氏珠母贝黏液通过纱布过滤以去除杂质，得到的滤液经两次离心处理以去除细胞和死细胞，对两次离心处理得到的第一上清液，进行第三次离心处理以去除细胞碎片，第三次离心处理收集到的上清液作为待提取液，并于-80℃条件下保存。
其中，第一次离心处理的离心力为500g(即重力加速度g的500倍)，离心时间为10min，第二次离心处理的离心力为2000g,离心时间为10min，第三次离心处理的离心力为10000g，离心时间为30min。三次离心处理均在4℃条件下进行。
其次，采用超速离心法和过滤法分离待提取液中的外泌体。
具体地，请继续结合图1所示，将待提取液置于离心管中，并将离心管置于水平转子中，进行第一次超速离心处理，小心弃去上清液，防止沉淀在离心管底部的外泌体丢失，得到第一底部沉淀。然后采用PBS溶液对第一底部沉淀进行洗涤，通过0.22μm筛过滤，继续进行第二次超速离心处理，离心完毕后小心弃去上清液，离心管底部沉淀为第二底部沉淀。用缓冲液重新悬浮(也称为重悬)第二底部沉淀，所得重悬液即为所述外泌体，得到的外泌体样品于-80℃条件下保存。
其中，第一次超速离心处理的离心力为100000g，离心时间为70min，第二次超速离心处理的离心力为100000g，离心时间为90min，两次超速离心处理均在4℃条件下进行。缓冲液优选为PBS溶液，缓冲液用量为200μL。
最后，对提取的外泌体进行鉴定，并探讨马氏珠母贝黏液来源外泌体缓解治疗皮肤炎症的机制，包括以下方面：
1.透射电子显微镜(TEM)；
利用透射电子显微镜对马氏珠母贝黏液来源外泌体进行形态和结构分析。本实施例中，将10μL马氏珠母贝黏液来源外泌体固定于铜网上，然后使用3％磷钨酸染色，风干20min后，于透射电子显微镜下观察，结果如图2所示，图2为马氏珠母贝黏液中外泌体的透射电镜图像，其中，图2(A)为8万倍放大倍数下观察到的外泌体透射电镜图像，图2(B)为25万倍放大倍数下观察到的外泌体透射电镜图像。
结合图2，透射电子显微镜的结果显示了被提取分离的囊泡状纳米颗粒的形貌和粒径，可以看出，从马氏珠母贝黏液中提取的外泌体为球形颗粒，呈杯状结构，直径约为100nm，符合外泌体的具体特征。
2.纳米颗粒跟踪分析(NTA)和动态光散射(DLS)；
NTA:纳米颗粒跟踪分析通过粒子的布朗运动分析外泌体的粒径，并通过纳米粒子跟踪分析仪对粒子进行定量分析。本实施例中，将样品用PBS溶液稀释(1μL的样品用999μL的PBS溶液稀释)，然后按以下条件进行检测，结果如图3、图4所示。
-NTA Version:3.4Build 3.4.4
-Camera Type:sCMOS
-Laser Type:Blue405
-Camera Level:13
-Slider Shutter:1232
-Slider Gain:219
-FPS:25.0
-Number of Frames:749
DLS：用PBS溶液稀释样品(100μL的样品制剂用4900μL的PBS溶液稀释)，将稀释后的样品滴入样品池中，然后用激光粒度分析仪进行粒径检测，结果如图5所示。
动态光散射和纳米追踪分析进一步证实了上述通过透射电子显微镜观察到的外泌体的形貌和粒径特征。结合图3-图5所示，图3为用NTA分析的外泌体的粒径分布和浓度，图3中横坐标size为粒径，纵坐标concentration为浓度，图4为外泌体在NTA中的布朗运动，图5为DLS分析外泌体的粒径分布，图5中横坐标size为粒径，纵坐标size distribution为粒径分布。通过分析动态光散射和纳米追踪分析的数据，囊泡状纳米颗粒的尺寸范围为30-200nm(图3-图5)。由于纳米追踪分析相较于动态光散射对大颗粒更为敏感，因此在同一样品中纳米追踪分析技术可以检测到粒径更大的颗粒(＞400nm)。然后通过Westernblotting对囊泡状纳米颗粒中的外泌体相关特征蛋白进行验证，结果如图6所示，图6为通过western blotting鉴定外泌体的特征蛋白，结果显示提取的纳米颗粒中富含外泌体所含的两种经典的特征蛋白CD9和CD63(图6)。
通过对纳米颗粒形态、大小、特征蛋白的综合鉴定，证实了本实施例所分离的纳米颗粒为外泌体。从马氏珠母贝黏液中提取的外泌体的定量信息如表1所示。
表1.马氏珠母贝黏液来源外泌体的定量信息
3、马氏珠母贝黏液来源外泌体的细胞摄入；
为了验证外泌体是否能被细胞摄入以影响于细胞,采用绿色荧光染料PKH67标记从马氏珠母贝黏液中提取的外泌体，并将其与人角质形成细胞(HaCaT)共孵育24h。
本实施例中，首先将HaCaT细胞在37℃的二氧化碳培养箱(5％CO2)中培养，使用DMEM培养基加10％(v/v)胎牛血清以及100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素。其中，人角质形成细胞从上海复旦IBS细胞资源中心获得。然后根据厂家提供说明书，将马氏珠母贝黏液外泌体与绿色荧光染料PKH67共孵育10min，采用超速离心法(100000g，4℃，70min)去除多余的荧光染料，底部沉淀用200μL PBS溶液重悬并存储于-80℃冰箱。被PKH67荧光探针标记的外泌体与人角质形成细胞于共聚焦小皿中共孵育24h,然后HaCaT细胞的细胞骨架被红色荧光探针ActinRed标记，以及使用DAPI对细胞核进行荧光染色，所有荧光染色步骤均需要避光进行。被荧光标记样品采用激光共聚焦显微镜进行成像分析，结果如图7所示，图7为HaCaT细胞摄取马氏珠母贝黏液来源的外泌体的激光共聚焦显微照片，放大倍数为40倍。
由图7可以看出，共8张照片，分布成2行4列，其中，VLNs代表从马氏珠母贝黏液中提取的外泌体，CTRL代表HaCaT细胞未摄取外泌体而采用PBS替换VLNs的空白对照组，PKH67、DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)和ActinRed均为荧光染料或探针，merge是将3张单独激光扫描共聚焦显微镜照片组合的显示方法，其中，PKH67是一种绿色荧光染料，在本实施例中用于标记外泌体，DAPI是一种对细胞进行染色的荧光燃料，在本实施例中用于对HaCaT细胞的细胞核进行染色，ActinRed是一种细胞骨架红色荧光探针，在本实施例中用于对HaCaT细胞的细胞骨架进行染色。由此，第1行的4张照片从左至右分别代表VLNs被PKH67荧光标记的显微照片，VLNs与HaCaT细胞共孵育24h后使用DAPI对HaCaT细胞的细胞核进行染色，使用ActinRed对HaCaT细胞的细胞骨架进行染色，采用Merge方法对显微照片显示分析。第2行的4张照片与第1行类似，区别在于将VLNs替换为PBS。
需要说明的是，图7原图为彩图，其中，DAPI染色显示的为蓝色，图7中DAPI对应列的两张图中，一个一个地填充块区域为细胞核，实际显示为蓝色；ActinRed染色显示的是红色，图7中ActinRed对应列的两张图中，线条骨架为细胞骨架，实际显示为红色；图7中与Merge对应列的图中，白色箭头所指的圆点实际显示为绿色。
由图7可以看出，被PKH67荧光探针标记的外泌体与HaCaT细胞共孵育24h后，PKH67(绿色)标记的外泌体可以清晰地观察到绿色荧光，图7中第1行第3列的照片中，绿色荧光簇(图7中白色箭头)分布于HaCaT细胞内外，而空白对照组(CTRL)中未观察到绿色荧光。由此可知，马氏珠母贝黏液来源的外泌体可以被HaCaT细胞摄入。
4、马氏珠母贝黏液来源外泌体对HaCaT细胞的毒性及活力分析；
为确定马氏珠母贝黏液来源外泌体在适当浓度下对细胞的无毒作用，为后续实验提供浓度基础，本实施例，采用Cell Counting Kit-8(CCK-8，Zeta Life，USA)检测马氏珠母贝黏液衍生外泌体对HaCaT细胞的细胞毒性和细胞活力。
细胞毒性：HaCaT细胞被接种到96孔板中(5000细胞/孔),培养24h以固定,然后将0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的外泌体与HaCaT细胞共孵育24h。孵育完毕后，按照说明书将10μL CCK-8试剂添加到各孔中，避光孵育2h，用酶标仪(BioTek，USA)在450nm处测定吸光度，通过吸光度判断不同浓度马氏珠母贝黏液来源外泌体对细胞的毒性效应。
细胞活力：将HaCaT细胞接种于96孔板中，并置于二氧化碳(5％CO2，37℃)培养箱中培养24h，将外泌体添加到孔中孵育。30min后，除空白对照组外，在孔板中加入10μg/mL脂多糖(LPS，Sigma-Aldrich，O26:B6)，孵育24h。根据厂家说明书，采用CCK-8试剂检测马氏珠母母黏液来源外泌体对LPS刺激的HaCaT细胞活性的影响，用酶标仪(BioTek，USA)在450nm处测定吸光度。
结果表明，各浓度的外泌体对HaCaT细胞均无毒性作用，且均能够提高HaCaT细胞的细胞活力，如图8所示，图8为马氏珠母贝黏液来源外泌体对HaCaT细胞的影响，图8中，横坐标表示外泌体的浓度，纵坐标cell viability表示细胞活力，数据以平均SD表示(N＝3)，其中，*代表p＜0.05，**代表p＜0.01，***代表p＜0.001，****代表p＜0.0001)。由图8还可以看出，在外泌体浓度为50μg/mL时对细胞活力的促进作用最大。
5、马氏珠母贝黏液来源外泌体对炎症及相关氧化应激的治疗作用；
炎症是身体对外界刺激的一种防御反应。适当的炎症会保护身体，这是必要的，但严重的炎症会破坏身体组织及其功能，并导致疾病。脂多糖(LPS)作为一种内毒素被广泛用于诱导炎症。活性氧(ROS)是脂多糖激活NLRP3炎症小体通路的重要转导信号之一。因此，为了验证马氏珠母贝黏液来源外泌体具有抗炎作用，本实施例使用脂多糖刺激HaCaT细胞构建皮肤炎症体外细胞模型，测试了外泌体对炎症下细胞活力和ROS含量的影响。
具体地，马氏贝黏液来源外泌体(5μg/mL、10μg/mL)处理HaCaT细胞30min后，利用脂多糖(10μg/mL)刺激细胞24h，建立皮肤炎症模型。脂多糖刺激完毕后，用DCFH-DA(Solarbio，北京，中国)检测HaCaT细胞中的活性氧。根据制造商的说明书，HaCaT细胞和20nM DCFH-DA在37℃在避光条件下共孵育30分钟。然后用hoechst 33342(Beyotime，中国上海)对细胞进行归一化，用荧光酶标仪分别在488nm、346nm处测定吸光度，结果如图9、图10所示，图9和图10表示马氏珠母贝黏液来源外泌体对炎性HaCaT细胞的治疗作用，图中LPS组代表单独脂多糖刺激HaCaT细胞得到的对照组，VLNs组代表用马氏贝黏液来源外泌体处理HaCaT细胞后，再利用脂多糖刺激HaCaT细胞。其中图9为马氏珠母贝黏液来源外泌体对炎性HaCaT细胞的活力的影响，纵坐标cell viability表示细胞活力，图10为马氏珠母贝黏液来源外泌体对炎性HaCaT细胞的ROS水平的影响，纵坐标normalized DCF value表示归一化DCF值。
结合图9、图10，结果显示，在脂多糖的刺激下，HaCaT细胞活力降低(图9)，细胞ROS水平升高(图10)。这是由于在脂多糖的刺激，引起HaCaT细胞炎症反应。在严重的炎症环境下，HaCaT细胞由于细胞焦亡而导致其细胞活力下降，同时ROS水平升高，ROS是炎症反应的重要信号分子。
炎性HaCaT细胞在加入马氏珠母贝黏液衍生外泌体作为治疗药物后，HaCaT细胞活力得到了恢复(图9)，细胞中ROS水平也明显得到降低(图10)。从以上结果可以推断，马氏珠母黏液衍生的外泌体具有抗炎作用，其抗炎作用是通过提高细胞活力和降低细胞内ROS水平来实现的。
6、马氏贝黏液来源外泌体对炎性HaCaT细胞中相关炎症因子表达的影响；
按照上述步骤构建HaCaT细胞炎症模型，用TRIzol试剂(Vazyme，中国)提取HaCaT细胞总RNA。根据厂家说明书，在加入HiScript All-in-one RT SuperMix Perfect forqPCR(Vazyme,China)后，利用热循环PCR仪(T100,Bio-Rad,USA)将总RNA逆转录为cDNA。采用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme,China)试剂并结合实时荧光定量PCR系统(CFX96 Touch,BioRad,USA)，进行qRT-PCR。数据采用2-ΔΔCT方法进行处理分析，采用β-actin作为内参归一化后得到相关基因的相对表达量。表2为相关基因引物。
表2.用于荧光实时定量PCR的相关引物序列
与正常环境相比，在炎症环境中，细胞的内部环境会发生改变，IL-6、IL-8、TNF-α作为炎症的重要标志物，其表达水平和含量会发生波动。因此，本实施例采用实时荧光定量PCR检测IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA表达水平，从基因层面上分析马氏珠母贝黏液衍生外泌体对于炎症的治疗效果。
外泌体在mRNA水平上抑制炎症因子的表达结果如图11-图13所示，图中数据以平均SD表示(N＝3)，相对于单独LPS刺激的对照组，*代表p＜0.05，***代表p＜0.001。其中，图11为qRT-PCR检测HaCaT细胞中IL-6的mRNA表达水平，图12为qRT-PCR检测HaCaT细胞中IL-8的mRNA表达水平，图13为qRT-PCR检测HaCaT细胞中TNF-α的mRNA表达水平。
结合图11-图13，结果显示，在LPS刺激下，HaCaT细胞中IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA表达水平升高，而在加入不同浓度外泌体后，发现HaCaT细胞中IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA表达水平降低。但减少的水平并没有表现出浓度依赖性(IL-8,TNF-α)。通过以上结果，揭示马氏珠母黏液来源外泌体可以通过降低相关炎症因子的mRNA水平来消除炎症，并在基因水平上实现抗炎作用。
7、马氏珠母贝黏液来源外泌体通过NF-κB和NLRP3途径调控HaCaT细胞的炎症反应；
从马氏珠母贝黏液中分离提取的外泌体具有抗炎特性，本实施例进一步分析外泌体是如何调节炎症的。NF-κB位于细胞质中，由P65、IκBα等蛋白组成。有报道称NF-κB在细胞炎症中起关键作用。同样，与NF-κB通路相关的NLRP3炎症小体通路在炎症反应中也起着类似的作用。NLRP3炎性体在正常细胞中表达水平较低，但当机体受到LPS刺激时，NLRP3炎性体表达水平升高，并带来溶酶体破裂、ROS水平升高等一系列效应。研究表明，牛奶衍生的外泌体和蜂蜜衍生的囊泡纳米颗粒都能通过抑制NLRP3炎症小体信号通路的激活以调节和抑制炎症。同样，生姜根茎的外泌体也可以通过抑制NLRP3炎性小体信号通路的激活来治疗巨噬细胞炎症。因此，本实施例通过western blot检测NLRP3通路和常见炎症通路NF-κB通路的相关蛋白的表达水平。
具体地，用含1％PMSF(Beyotime,Shanghai,China)的RIPA(Beyotime，上海，中国)溶液裂解人角质形成细胞，提取其总蛋白。蛋白用BCA试剂盒(Pierce,Thermo Fisher,USA)进行定量分析，然后采用丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移到硝酸纤维素印迹膜上。将膜与7％脱脂牛奶共孵育2h，然后在室温下用一抗和二抗分别孵育4h和2h。利用自动发光系统(Tanon-5200,ShangHai,China)对条带进行成像和记录，然后利用ImageJ软件进行定量分析。
在本实施例中，使用的抗体是TLR4(HTA125,sc-13593,SANTA CRUZ,USA)，NF-κBP65(F-6,sc-8008,SANTA CRUZ,USA)，P-NF-κB P65(27,Ser 536,sc-136548,SANTA CRUZ,USA)，IκBα(H-4,sc-1643,SANTA CRUZ,USA)，P-IκBα(B-9,sc-8404,SANTACRUZ,USA)Cryopyrin(6F12,sc-134306,SANTA CRUZ,USA)，β-Actin(C4,sc-47778,SANTA CRUZ,USA)。
结果如图14所示，图14为外泌体对NF-κB和NLRP3通路的影响。其中，图14(A)为评估蛋白表达(相对于β-actin)，图14的(B-F)为蛋白的定量分析，数据以平均SD表示(N＝3，*代表p＜0.05，**代表p＜0.01，***代表p＜0.001，相对于单独LPS刺激的对照组)，其中，图14(B)为P-IκBα/IκBα蛋白的相对表达，图14(C)为P-P65/P65蛋白的相对表达，图14(D)为TLR4蛋白的相对表达,图14(E)为NLRP3蛋白的相对表达,图14(F)为INOS蛋白的相对表达。
结合图14所示，结果表明，被LPS刺激后,细胞内的NF-κB通路和NLRP3炎症小体通路被激活，相关的蛋白质水平上升，部分蛋白被磷酸化，例如IκBα、P65。而在外泌体作为抗炎药物被添加后,可以发现IκBα和P65的磷酸化受到抑制，NLRP3炎性小体的水平也得到降低。可见，马氏珠母贝黏液衍生外泌体能够通过抑制NF-κB和NLRP3通路的激活而达到抗炎作用。
当NF-κB通路被激活时，IκBα与P65的蛋白结合体被激活，IκBα蛋白被降解，P65蛋白被磷酸化，并导致核易位，P65蛋白进入细胞核，诱导NLRP3炎性小体的产生。
进一步地，通过免疫荧光实验对P65蛋白进行荧光染色，观察其进入细胞核的情况。
具体地，将5μg/mL、10μg/mL的外泌体加入HaCaT细胞共聚焦孵育，然后按照上述步骤构建HaCaT细胞炎症模型，孵育24h后。荧光抗体(DyLight488、A23210、Abbkine)对P65蛋白进行荧光染色，DAPI用于染色细胞核。用荧光显微镜(奥林巴斯，日本)对共聚焦小皿进行成像观察，并拍照记录。结果如图15所示，图15为外泌体对P65蛋白进入细胞核的影响，放大倍数为100倍。
由图15可以看出，共12张照片，分布成4行3列，其中，control表示空白组，LPS表示单独脂多糖刺激，LPS+L-VLNs表示加入低浓度外泌体后脂多糖刺激，LPS+H-VLNs表示加入高浓度外泌体后脂多糖刺激，其中LPS浓度为10μg/mL，VLNs的低浓度为5μg/mL、高浓度为10μg/mL。
需要说明的是，图15原图为彩图，其中，图中与NF-κB P65对应列的四张图片均显示绿色荧光，白色越亮的区域表示绿色荧光越强，与DAPI对应列的四张图片均显示蓝色荧光，与Merge对应列的四张图片显示为中间蓝色周边绿色荧光，例如，与Merge对应列的第一张(由上至下)图片中，细胞核部分显示为蓝色荧光，细胞核之间朦胧的部分显示为绿色荧光，其余三张图类似。
结合图15，结果显示，单独LPS处理时，细胞核内可见高亮度的绿色荧光。与LPS单独处理组相比，在细胞中加入不同浓度的外泌体后，细胞核中的绿色荧光减弱。可见，外泌体可以抑制P65蛋白进入细胞核。由此说明马氏珠母贝黏液来源外泌体能够通过抑制NF-κB和NLRP3通路的激活来缓解炎症。
综上，本发明采用超速离心法从马氏珠母贝黏液中提取外泌体，并对其表征进行鉴定，然后用CCK-8法检测马氏珠母贝黏液来源外泌体的细胞毒性，并采用脂多糖刺激人角质形成细胞(HaCaT)构建皮肤炎症体外细胞模型，探讨黏液来源外泌体缓解治疗皮肤炎症的机制。
结果表明：从马氏珠母贝黏液中提取的囊泡状纳米颗粒经鉴定为外泌体，呈杯状球形颗粒，平均粒径为130nm。同时马氏珠母贝黏液来源外泌体能够增强细胞活力，降低细胞内ROS水平，抑制NF-κB和NLRP3通路的激活，降低相关炎症因子mRNA的表达水平，具有一定的抗炎作用。
本发明提供了一种从马氏珠母贝黏液中提取的外泌体，为从海洋生物中提取生物活性外泌体提供了参考，同时也提高了马氏珠母贝的利用价值。
虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种外泌体在制备用于治疗皮肤炎症的药物中的应用，其特征在于，所述外泌体提取包括：对马氏珠母贝黏液进行过滤及初步离心处理，得到待提取液；
对所述待提取液进行超速离心处理，得到第二底部沉淀；
用缓冲液重新悬浮所述第二底部沉淀，所得重悬液即为所述外泌体。
2.根据权利要求1所述的外泌体在制备用于治疗皮肤炎症的药物中的应用，其特征在于，对所述待提取液进行两次所述超速离心处理得到所述第二底部沉淀，两次所述超速离心处理的离心力均为100000g。
3.根据权利要求2所述的外泌体在制备用于治疗皮肤炎症的药物中的应用，其特征在于，所述对所述待提取液进行两次所述超速离心处理包括：
将所述待提取液置于水平转子中，进行第一次超速离心处理70min，弃去上清液，得到第一底部沉淀；
对所述第一底部沉淀进行洗涤后，进行第二次超速离心处理90min，弃去上清液，得到所述第二底部沉淀。
4.根据权利要求3所述的外泌体在制备用于治疗皮肤炎症的药物中的应用，其特征在于，所述对所述第一底部沉淀进行洗涤包括：采用PBS溶液对所述第一底部沉淀进行洗涤。
5.根据权利要求1所述的外泌体在制备用于治疗皮肤炎症的药物中的应用，其特征在于，所述对马氏珠母贝黏液进行过滤及初步离心处理包括：
对所述马氏珠母贝黏液进行过滤后，得到滤液；
对所述滤液进行第一次离心处理和第二次离心处理，得到第一上清液，其中，所述第一次离心处理的离心力为500g，离心时间为10min，所述第二次离心处理的离心力为2000g，离心时间为10min；
对所述第一上清液进行第三次离心处理，得到的第二上清液即为所述待提取液，其中，所述第三次离心处理的离心力为10000g，离心时间为30min。
6.根据权利要求1所述的外泌体在制备用于治疗皮肤炎症的药物中的应用，其特征在于，所述缓冲液包括PBS溶液。
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