CN115927520A - 一种具有减肥作用的小分子黄鳝肽粉及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有减肥作用的小分子黄鳝肽粉及其制备方法，黄鳝原料经蛋白酶解、膜分离技术制备得到小分子肽，肽含量在90％以上，80％以上的肽分子量分布在<1000道尔顿。经斑马鱼动物试验验证，前述黄鳝肽具有促进脂肪分解、抑制脂肪吸收的功效。

Description

一种具有减肥作用的小分子黄鳝肽粉及其制备方法

技术领域

本发明涉及蛋白肽加工技术领域，具体涉及一种具有减肥作用的小分子黄鳝肽粉及其制备方法。

背景技术

肥胖已成为全球性的重大公共卫生问题，在中国肥胖或超重人群比例也越来越高。中国居民营养与慢性病状况报告(2020年)显示，我国成年人中超重和肥胖比率已超过50％，超重肥胖人数位居全球第一位。肥胖不仅是糖尿病、高血压、心脑血管疾病、甚至部分癌症等疾病的重要诱发因素，而且还很容易引起人的社会、心理问题。肥胖和超重的根本原因就是能量不平衡，即能量摄入与能量消耗之间的不平衡。目前治疗手段主要包括生活方式干预(膳食和体育运动)、药物及外科手术等。手术存在一定风险，减肥药物存在安全性不明确、副作用大等缺点。因此，具有减肥作用的健康食品越来越受到消费者的青睐。

市面上具有减肥作用的健康食品，主要分为两大类，一类是代餐类食品，包含代餐粉、代餐棒、代餐饼干、代餐粥等，该类产品主要通过部分或全部取代正餐，控制人体能量摄入达到减肥的目的。另外一类是减肥功能食品，通过在产品中添加具有减肥作用的原料或成分，例如市面上常见的抑制食欲类的白芸豆提取物产品，促进新陈代谢类的咖啡或茶提取物产品等。这两类减肥食品随着近几年减肥趋势的流行，以及新电商时代的营销模式的推动，在消费市场呈现出快速增长的趋势。产品品类看上去繁多，细究之下不难发现，多数产品配方雷同，缺少具有市场差异化的原料，且很多产品或原料宣称的功效没有研究数据支撑。市场缺乏具有减肥作用的新原料。

利用食物中的蛋白质制备不同功能的活性肽，是近年来蛋白质深加工领域的研究热点。大量的科学研究表明，食源性活性肽不仅可以调节免疫力和新陈代谢、促进矿物质吸收，还具有抗氧化、降血脂、降压、降糖、减肥等生理功能。小分子肽是由2至15个氨基酸组成的肽，其低分子量的特点使其具备机体吸收率高，吸收速度快的优势，且小分子肽具有很多与多肽和蛋白质不同的独特的性质，不论在结构和生理活性方面都显示出巨大的优势，有望成为新一代高活性物质。目前，文献中关于肽的减肥作用研究，主要有大豆小分子肽、火麻仁肽等([1]余承高,杨国燕,陈栋梁.高活性大豆肽增强免疫及减肥作用的研究[J].中国食品工业,2010.[2]徐梅,王常青,赵大洲.火麻仁多肽的制备及减肥功能研究[J].现代食品,2022(007):028.)。

黄鳝(Monopterusalbus)，俗称长鱼、鳝鱼和无鳞公子等，隶属硬骨鱼纲、合鳃目、合鳃科、黄鳝属，为温热带地区的淡水底栖生活型鱼类，是重要的名优淡水水产品，在湖北、湖南、四川等省广泛分布。黄鳝的肉质细嫩、营养丰富，属于高蛋白、低脂肪食品，具有较高的食用和药用价值，是典型的药食同源食品。然而黄鳝的蛋白质资源利用方式单一，以直接食用为主要方式，但很多人不喜甚至惧怕黄鳝的外形，不敢食用黄鳝，市场又缺乏高值化应用的黄鳝蛋白质深加工产品，不能很好利用黄鳝蛋白质资源。

因此，亟需一种对黄鳝蛋白质进行深加工的方法，获得减肥健康食品。

发明内容

有鉴于此，本发明针对现有技术存在的问题，提供一种具有减肥作用的小分子黄鳝肽粉及其制备方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种具有减肥作用的小分子黄鳝肽的制备方法，包含如下步骤：

S1、清洗粉碎：取黄鳝原料用水清洗干净，加入黄鳝原料重量3倍的0.3-0.5mol/L氯化钠溶液，20-30转/分搅拌30min，用水清洗干净，粉碎成肉糜或肉浆；

S2、酶解：按底物浓度16％加入无离子水，升温至50-55℃，调ph至6.5-7.0，加入0.65％-0.75％的1：3-4的木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，酶解6h；温度升至85-100℃维持10-40min灭酶；

S3、微滤：灭酶后冷却降温至20-50℃，过0.1μm陶瓷膜；

S4、超滤：将微滤后的清液用6000D的有机膜过滤，收集滤液；

S5、脱色脱苦：向步骤S4获得的滤液中加入其质量1.5-2％的活性炭，升温至60-65℃，保温1h，过滤收集滤液；

S6、浓缩：真空浓缩温度为60±5℃，真空度-0.070～-0.090Mpa，浓缩至固形物含量20-25％；

S7、灭菌：灭菌温度115-135℃，灭菌时间15-30min；

S8、喷雾干燥后即制得小分子黄鳝肽粉。

优选地，所述喷雾干燥的进风温度155-170℃、出风温度80-100℃。

一种具有减肥作用的小分子黄鳝肽粉，通过上述方法制备得到。

优选地，所述黄鳝肽粉为小分子肽，肽含量在90％以上，80％以上的肽的分子量小于1000道尔顿。

一种减肥产品，包含上述黄鳝肽粉。

上述黄鳝肽粉在制备减肥食品或药品中的应用。

本发明以黄鳝原料(肉、骨、下脚料等)经蛋白酶解、膜分离技术制备小分子肽，肽含量在90％以上，80％以上的肽分子量分布在<1000道尔顿。经斑马鱼动物试验验证，黄鳝肽具有促进脂肪分解、抑制脂肪吸收的减肥功效。

附图说明

图1为黄鳝肽处理后斑马鱼卵黄囊脂肪荧光强度典型图，其中，图A中虚线框为分析部位，图B为正常对照组、白藜芦醇组、黄鳝肽(31.2μg/mL)组、黄鳝肽(62.5μg/mL)组和黄鳝肽(125μg/mL)组的结果。

图2为黄鳝肽处理后斑马鱼卵黄囊脂肪荧光强度图，其中，与正常对照组比较，**p<0.01，***p<0.001。

图3为黄鳝肽处理后斑马鱼肠道和尾部血管脂肪染色强度典型图，其中，图A中虚线框为分析部位，图B为正常对照组、模型对照组、奥利司他(15.0μg/mL)、黄鳝肽(31.2μg/mL)组、黄鳝肽(62.5μg/mL)组和黄鳝肽(125μg/mL)组的结果。

图4为黄鳝肽处理后斑马鱼肠道和尾部血管脂肪染色强度图，其中，与模型对照组比较，*p<0.05，***p<0.001。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述。

实施例1

一种黄鳝肽粉的制备方法，包含如下步骤：

S1、清洗粉碎：本实施例使用冷冻的黄鳝骨作为原料，浸泡于无离子水中解冻，解冻后清洗3次，去除血污、杂质，清洗干净后加入黄鳝重量3倍的0.45mol/L氯化钠溶液，慢速搅拌30min，本实施例中选择25转/分，以去除黄鳝表面的粘液、杂质并消毒杀菌；之后用无离子水清洗3次，粉碎成肉糜；

S2、酶解：将步骤S2获得的肉糜作为酶解底物，按底物浓度16％(质量百分比)加入无离子水，升温至50℃，调ph6.8，加入0.65％(质量百分比)的1:3的木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，酶解6h；温度升至95℃维持20min灭酶；

S3、微滤：灭酶后冷却降温至20-50℃，过0.1μm陶瓷膜，以去除大的杂质、细菌；

S4、超滤：将微滤后的清液用6000D的有机膜过滤收集滤液，以截留分子量大于6000D的肽段；

S5、脱色脱苦：向步骤S4获得的滤液中加入其质量1.5％的活性炭，升温至60-65℃，加速色素及苦味物质溶出，保温1h，过滤收集滤液；具体可以采用板框过滤设备过滤；活性炭浓度为1.5％，活性炭浓度高会残留活性炭的异味，浓度低则脱色脱苦效果不好；

S6、浓缩：真空浓缩温度为60±5℃，真空度-0.070～-0.090Mpa，浓缩至固形物含量22.5％；

S7、灭菌：灭菌温度116℃，灭菌时间30min，以杀灭细菌、霉菌、酵母菌、芽孢；

S8、喷雾干燥：进风温度155-170℃，出风温度80-100℃，喷雾干燥后即制得黄鳝肽粉。

取9mg前述黄鳝肽粉样品进行指纹图谱构建，将样品置于EP管中，加入1ml纯净水涡旋充分溶解后于2000g离心20min，取上清用纳升级液相色谱-QEXACTIVE质谱联用系统进行分析测试。上述制备得到的黄鳝肽粉中肽的含量(以干基计)94.6％，其中82.5％的小分子肽分子量分布<1000道尔顿。

实施例2

一种黄鳝肽粉的制备方法，步骤如下：

S1、清洗粉碎：本实施例使用冷冻的黄鳝肉作为原料，浸泡于无离子水中解冻，解冻后清洗干净；加入黄鳝重量3倍的0.3mol/L氯化钠溶液，慢速搅拌30min，本实施例中选择30转/分，用无离子水清洗2次，粉碎成肉浆；

S2、酶解：将步骤S2获得的肉浆作为酶解底物，按底物浓度16％(质量百分比)加入无离子水，升温至50℃，调ph至7.0，加入0.65％(质量百分比)的1：3.2的木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，酶解6h；温度升至95℃维持20min灭酶；

S3、微滤：灭酶后冷却降温至20-50℃，过0.1μm陶瓷膜；

S4、超滤：将微滤后的清液用6000D的有机膜过滤收集滤液；

S5、脱色脱苦：向步骤S4获得的滤液中加入其质量1.5％的活性炭，升温至60-65℃，保温1h，过滤收集滤液；

S6、浓缩：真空浓缩温度为60±5℃，真空度-0.070～-0.090Mpa，浓缩至固形物含量22.5％；

S7、灭菌：灭菌温度121℃，灭菌时间15min；

S8、喷雾干燥：进风温度155-170℃，出风温度80-100℃，喷雾干燥后即制得黄鳝肽粉。

前述黄鳝肽粉样品进行指纹图谱构建，黄鳝肽粉中肽含量(以干基计)97.2％，其中80.5％的小分子肽分子量分布<1000道尔顿。

实施例3

一种黄鳝肽粉的制备方法，步骤如下：

S1、清洗粉碎：本实施例使用冷冻的黄鳝下脚料作为原料，取黄鳝下脚料浸泡于无离子水中解冻，解冻后清洗4次；加入原料重量5倍的0.5mol/L氯化钠溶液，慢速搅拌30min，本实施例中选择20转/分，用无离子水清洗3次，粉碎成肉糜；

S2、酶解：将步骤S2获得的肉糜作为酶解底物，按底物浓度16％(质量百分比)加入无离子水，升温至50℃，调ph至7.0，加入0.75％(质量百分比)的1：4木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，酶解6h；温度升至95℃维持30min灭酶；

S3、微滤：灭酶后冷却降温至20-50℃，过0.1μm陶瓷膜；

S4、超滤：将微滤后的清液用6000D的有机膜过滤收集滤液；

S5、脱色脱苦：向步骤S4获得的滤液中加入其质量2％的活性炭，升温至60-65℃，保温1h，过滤；

S6、浓缩：真空浓缩温度为60±5℃，真空度-0.070～-0.090Mpa，浓缩至固形物含量22.5％；

S7、灭菌：灭菌温度121℃，灭菌时间30min；

S8、喷雾干燥：进风温度155-170℃，出风温度80-100℃，喷雾干燥后即制得黄鳝肽粉。

前述黄鳝肽粉样品进行指纹图谱构建，黄鳝肽粉中肽含量(以干基计)92.5％，其中80.1％的小分子黄鳝肽分子量分布<1000道尔顿。

实施例4、黄鳝肽减肥功效斑马鱼试验研究

1.检测材料

1.1样品配制信息

实施例1制备的黄鳝肽粉，用超纯水配制成20.0mg/mL母液，4℃储存。

阳性对照：白藜芦醇，白色粉末，批号F2121344，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，-20℃避光储存。用DMSO配制成11.4mg/mL母液，-20℃分装储存。

阳性对照：奥利司他胶囊(以下简称奥利司他)，胶囊内容物为白色粉末，批号085220301，山东新时代药业有限公司。用DMSO配制成15.0mg/mL母液，4℃储存。

1.2实验动物

斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450～550μS/cm；pH为6.5～8.5；硬度为50～100mg/LCaCO3)，由申请人养鱼中心繁殖提供，实验动物使用许可证号为：SYXK(浙)2022-0004，饲养管理符合国际AAALAC认证(认证编号：001458)的要求。

黑色素等位基因突变型半透明Albino品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为2dpf的斑马鱼用于样品促进脂肪分解功效最大检测浓度(MTC)测定及其功效评价；年龄为5dpf的斑马鱼用于样品抑制脂肪吸收功效MTC测定及其功效评价。

1.3仪器、耗材与试剂

解剖显微镜(SZX7，OLYMPUS，Japan)；CCD相机(VertA1，上海土森视觉科技有限公司，China)；精密电子天平(CP214，OHAUS，USA)；6孔板(NestBiotech，China)；电动聚焦连续变倍荧光显微镜(AZ100，Nikon，Japan)。

纯蛋黄粉(批号20200809，浙江艾格生物科技股份有限公司，China)；D-(+)-葡萄糖(批号L2108079，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，China)；二甲基亚砜(DMSO，批号BCCD8942，Sigma，Switzerland)；甲基纤维素(批号C2004046，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，China)；4％组织细胞固定液(批号20210828，北京索莱宝有限公司，China)；尼罗红(批号SLBP9326V，Sigma，India)；油红O(OilRedO，批号SHBN4926，Sigma，USA)；1.2-丙二醇(批号20211117，国药集团化学试剂有限公司，China)。

2.检测方法

2.1.促进脂肪分解功效最大耐受浓度(MTC)测定

随机选取2dpf黑色素等位基因突变型Albino品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。水溶给予黄鳝肽粉(浓度见表1)，同时设置正常对照组，每孔容量为3mL。28℃处理至4dpf，测定黄鳝肽粉对正常斑马鱼的MTC。

2.2.促进脂肪分解功效

随机选取2dpf黑色素等位基因突变型Albino品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。水溶给予黄鳝肽粉(浓度见表2)，阳性对照白藜芦醇11.4μg/mL浓度，同时设置正常对照组，每孔容量为3mL。28℃处理1天后，每个实验组均水溶给予尼罗红染料。28℃继续处理至4dpf，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照，用NIS-ElementsD3.20高级图像处理软件分析并采集数据，分析斑马鱼卵黄囊脂肪荧光强度，以该指标的统计学分析结果评价黄鳝肽粉促进脂肪分解功效。统计学处理结果采用mean±SE表示。用SPSS26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义。

2.3.抑制脂肪吸收功效最大耐受浓度(MTC)测定

随机选取5dpf黑色素等位基因突变斑马鱼于烧杯中，每烧杯(实验组)均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予黄鳝肽粉(浓度见表3)，同时设置正常对照组和模型对照组，每杯容量为20mL。28℃处理1h后，除正常对照组外，其余各浓度组均水溶给予蛋黄粉饲喂斑马鱼建立食物脂肪吸收模型。28℃继续处理1天后，测定黄鳝肽粉对模型斑马鱼的MTC。

2.4.抑制脂肪吸收功效

随机选取5dpf黑色素等位基因突变斑马鱼于烧杯中，每烧杯(实验组)均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予黄鳝肽粉(浓度见表4)，阳性对照奥利司他15.0μg/mL浓度，同时设置正常对照组和模型对照组，每杯容量为20mL。28℃处理1h后，除正常对照组外，其余各浓度组均水溶给予蛋黄粉饲喂斑马鱼建立食物脂肪吸收模型。28℃继续处理1天后，给予油红O进行整体脂肪染色。染色结束后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于解剖显微镜下拍照，使用NIS-ElementsD3.20高级图像处理软件采集数据，分析肠道和尾部血管脂肪染色强度，以该指标的统计学分析结果评价黄鳝肽粉抑制脂肪吸收功效。统计学处理结果采用mean±SE表示。用SPSS26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义。

3.检测结果

3.1促进脂肪分解功效MTC

在本实验条件下，黄鳝肽粉浓度≥250μg/mL，斑马鱼死亡率100％；黄鳝肽粉浓度为≤125μg/mL，斑马鱼表型与正常对照组状态相似，因此确定黄鳝肽促进脂肪分解功效MTC为125μg/mL，详见表1。

表1、黄鳝肽粉促进脂肪分解功效浓度摸索实验结果(n＝30)

3.2促进脂肪分解功效

在本实验条件下，与正常对照组相比，黄鳝肽粉中、高剂量组(62.5μg/mL、125μg/mL)卵黄囊脂肪荧光信号强度明显降低，有统计学差异(p<0.01)，表明黄鳝肽粉具有促进脂肪分解功效。详见表2、图1和图2。

表2、黄鳝肽粉促进脂肪分解功效评价实验结果(n＝10)

与正常对照组比较，**p<0.01，***p<0.001。

3.3抑制脂肪吸收功效MTC

在本实验条件下，黄鳝肽粉浓度250μg/mL，斑马鱼虽未出现死亡，但较模型对照组状态严重；黄鳝肽粉浓度500μg/mL，斑马鱼死亡率80％；黄鳝肽粉浓度为≤125μg/mL，斑马鱼表型与正常对照组状态相似，因为确定黄鳝肽粉抑制脂肪吸收功效MTC为125μg/mL，详见表3。

表3、黄鳝肽粉抑制脂肪吸收功效浓度摸索实验结果(n＝30)

3.4抑制脂肪吸收功效

在本实验条件下，与模型对照组相比，黄鳝肽粉高剂量组(125μg/mL)肠道和尾部血管脂肪染色信号强度明显降低，有统计学差异(p<0.05)，表明黄鳝肽粉具有抑制脂肪吸收功效。详见表4、图3和图4。

表4、黄鳝肽粉抑制脂肪吸收功效评价实验结果(n＝10)

与模型对照组比较，*p<0.05，***p<0.001。

以上所述实施例仅表达了本发明的诸多实施方式中的少数，虽然其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种具有减肥作用的小分子黄鳝肽粉的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：

S1、清洗粉碎：取黄鳝原料用水清洗干净，加入黄鳝原料重量3倍的0.3-0.5mol/L氯化钠溶液，20-30转/分搅拌30min，用水清洗干净，粉碎成肉糜或肉浆；

S2、酶解：按底物浓度16％加入无离子水，升温至50-55℃，调ph至6.5-7.0，加入0.65％-0.75％的1：3-4的木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，酶解6h；温度升至85-100℃维持10-40min灭酶；

S3、微滤：灭酶后冷却降温至20-50℃，过0.1μm陶瓷膜；

S4、超滤：将微滤后的清液用6000D的有机膜过滤，收集滤液；

S5、脱色脱苦：向步骤S4获得的滤液中加入其质量1.5-2％的活性炭，升温至60-65℃，保温1h，过滤收集滤液；

S6、浓缩：真空浓缩温度为60±5℃，真空度-0.070～-0.090Mpa，浓缩至固形物含量20-25％；

S7、灭菌：灭菌温度115-135℃，灭菌时间15-30min；

S8、喷雾干燥后即制得小分子黄鳝肽粉。

2.根据权利要求1所述的黄鳝肽粉的制备方法，其特征在于，所述喷雾干燥的进风温度155-170℃、出风温度80-100℃。

3.一种具有减肥作用的小分子黄鳝肽粉，其特征在于，通过权利要求1和2任一项所述方法制备得到。

4.根据权利要求3所述的黄鳝肽粉，其特征在于，所述黄鳝肽粉为小分子肽，肽含量在90％以上，80％以上的肽的分子量小于1000道尔顿。

5.一种减肥产品，其特征在于，包含权利要求3或4所述的黄鳝肽粉。

6.权利要求3所述的黄鳝肽粉在制备减肥食品或药品中的应用。

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