CN111893157A - 一种降血糖藜麦肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及食品技术领域，具体涉及一种降血糖藜麦肽的制备方法，具体包括下列步骤：(1)藜麦萌发后干燥粉碎得到藜麦粗粉；(2)与有机溶剂混合，过滤，得到脱脂藜麦粗粉；(3)碱提酸沉法提取藜麦蛋白；(4)加入蛋白酶酶解，酶解后灭酶，离心，收集上清液得到藜麦蛋白酶解物；(5)藜麦蛋白酶解物通过超滤法收集透过液，浓缩，冷冻干燥后即得藜麦肽。本发明方法操作简单，适于产业化生产，酶用量少，所得的藜麦肽具有良好的体内血糖调节作用，可广泛应用于特需食品和营养食品的制造。
Description
技术领域
本发明涉及食品加工技术领域，具体地涉及一种具有降血糖功能的藜麦肽及其制备方法和应用。
背景技术
糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是当今社会一个重大流行性疾病，已成为世界上仅次于脑血管疾病、肿瘤之后的第三位对人类健康有严重威胁的慢性疾病。2017年，中国患病人数达1.14亿，绝大多数为II型糖尿病。II型糖尿病又称非胰岛素依赖型糖尿病，主要以胰岛素分泌不足以及胰岛素抵抗为特征，呈现多尿、多饮、多食以及体重减少在内的“三多一少”的特征。
随着对II型糖尿病发病机制及相关通路的进一步研究，许多新的药物靶点被开发，以肠促胰岛素为作用靶点的药物包括胰高血糖素样肽-1(glucagon like peptide-1,GLP-1)二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidase IV,DPP-IV)的研究最为突出。GLP-1是一种由肠道L细胞分泌的肠降血糖素，可促进胰岛素分泌、减缓胃排空、抑制餐后胰高血糖素分泌以及抑制食欲等。然而，体内GLP-1的半衰期非常短，极容易被DPP-IV降解而失去活性。因此抑制DPP-IV的活性对调节血糖有积极作用，人工合成的DPP-IV抑制剂是目前研究比较充分的降低GLP-1降解速度的一种口服药，但是会产生许多副作用，如胃肠道不适、过敏反应等。因此，天然食物中的抑制DPP-IV功能因子的开发利用将成为今后糖尿病非药物治疗的重要部分。
生物活性肽是指具有特殊生理功能的肽类物质，是指蛋白经过酶水解等手段制备的含2～20个氨基酸长度且具有特定生物活性的肽段，一般分子量小于1000Da，可通过体内或体外酶解将其从母体蛋白质中释放出来而发挥特定的生理功能。研究发现，已有报道从牛乳、鸡蛋、鱼等动物蛋白以及小麦、燕麦、玉米等植物蛋白中鉴定出了不同的DPP-IV抑制活性肽中获取的生物活性肽具有非常好的DPP-IV抑制活性。利用食源性生物活性肽抑制DPP-IV抑制活性，减少GLP-1的降解，从而提高体内GLP-1水平，达到调节血糖的作用。与化学合成药物相比，食源性DPP-IV抑制活性肽具有安全、无毒副作用等优点，因而被广泛关注和研究。
藜麦是一种全营养完全蛋白碱性食物，具有减重降糖的作用。被联合国粮食及农业组织(FAO)认定为“唯一的一种单体植物即可基本满足人体基本营养需求的食物”。与传统谷物不同的是，谷物加工处理通常去除了营养丰富的胚芽和麸皮，而藜麦去皂化使富含营养的胚胎和胚乳保持完整。藜麦的蛋白质含量和品质普遍优于谷类，且含有人体所必需的9种氨基酸，没有限制性氨基酸，其含量均高于FAO的建议摄取量。与豆类相比，藜麦氨基酸谱比谷物和豆类更广。赖氨酸是谷物中的限制性氨基酸之一，而藜麦中赖氨酸含量(5.1％～6.4％)是小麦或玉米2倍，藜麦甲硫氨酸含量(0.4％～1.0％)是大豆和小麦的2倍。藜麦的必需氨基酸谱相当于酪蛋白和干全脂牛奶的氨基酸含量，是食源性活性肽的良好来源。作为一种新型多功能营养配料，藜麦肽对减重降糖具有积极作用，将其作为食源性降糖肽，宜进一步研究开发。
现有技术中关于降糖肽开发的报道，主要是通过酶解的方法从植物或动物蛋白源获得α葡萄糖苷酶抑制肽从而抑制血糖升高，而针对藜麦肽的DPP-IV抑制活性制备降糖肽未见开发。抑制DPP-IV活性已成为糖尿病干预的新靶点，因此以抑制DPP-IV为靶点，开发一种降血糖藜麦肽及其制备方法尤为重要。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的另一目的在于提供上述降血糖藜麦肽的制备方法。该方法操作简单，适于产业化生产，酶用量少，所得的藜麦肽具有良好的体内血糖调节作用，可广泛应用于特需食品和营养食品的制造。
为了实现上述技术目的，本发明提供了一种降血糖藜麦肽及其制备方法，包括以下步骤：
(1)将藜麦洗净，经清水浸泡，萌发胚芽后，烘干，粉碎，过筛，得到藜麦粗粉；
(2)藜麦粗粉和有机溶剂混合，过滤除去脂肪，得到脱脂藜麦粗粉；
(3)采用碱溶酸沉法提取脱脂藜麦粗粉中的藜麦蛋白；
(4)藜麦蛋白粉和水混合调成藜麦蛋白溶液，分别加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶其中的一种或几种进行酶解，酶解过程中保持pH值和温度范围恒定，酶解后，灭酶，离心，取上清液，得到藜麦蛋白酶解物；
(5)藜麦蛋白酶解物通过超滤法处理，收集透过液，浓缩、冷冻干燥后得到即得藜麦肽。
上述制备方法中，步骤(1)藜麦为白藜麦、红藜麦和黑藜麦其中的一种，清水浸泡2～8小时；
更优选地，藜麦在黑暗的保温箱中萌发2～48小时，所述烘干温度为45～55℃，粉碎后过80～120目筛，得到藜麦粗粉。
步骤(2)将步骤(1)得到的藜麦粗粉与有机溶剂混合，所述有机溶剂为正己烷；所述藜麦粉与正己烷料液比为1:2～5；混合时间为60～120min；
步骤(3)用NaOH调pH至10～11，室温下搅拌2～3h后离心，取上清液用HCl调pH至4.0～4.6，离心，取沉淀洗至中性后冷冻干燥。所用离心条件为0～8℃，7000～10000g，20～40min；
本发明通过参考文献和大量实验发现，脱脂藜麦粉用碱溶酸沉法提取蛋白时，碱溶pH为10～11效果最好，在保持蛋白不变性的情况下，能够较好地溶解蛋白，酸沉pH为4.0～4.6，即藜麦蛋白等电点，能够沉降大部分蛋白质；
步骤(4)藜麦蛋白溶液浓度为20～40mg/mL；加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶其中的一种或几种(优选酶为胃蛋白酶和胰蛋白酶)，酶解后升温至90～100℃灭酶，时间5～10min。
步骤(4)中胃蛋白酶和藜麦蛋白的质量比为2～5:100，酶解温度保持35～39℃，酶解时间为1～1.5h，酶解pH保持1.5～2.5；
步骤(4)中胰蛋白酶和藜麦蛋白的质量比为2～5:100，酶解时间为3～4h，酶解温度保持35～39℃，酶解pH保持6.5～7.5；
步骤(4)中藜麦蛋白溶液加热至90～100℃，10～20min，使蛋白质变性，冷却至45～55℃后，调节pH至7.5～9.0，加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶和藜麦蛋白的质量比为2～5:100，酶解时间为3～4h，酶解温度保持45～55℃，酶解pH保持7.5～9.0；
步骤(4)中藜麦蛋白溶液加热至90～100℃，10～20min，使蛋白质变性，冷却至45～55℃后，调节pH至6.5～7.5，加入风味蛋白酶，风味蛋白酶和藜麦蛋白的质量比为2～5:100，酶解时间为3～4h，酶解温度保持45～55℃，酶解pH保持6.5～7.5；
步骤(4)中藜麦蛋白溶液加热至90～100℃，10～20min，使蛋白质变性，冷却至50～60℃后，调节pH至6.5～7.5，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶和藜麦蛋白的质量比为2～5:100，酶解时间为3～4h，酶解温度保持50～60℃，酶解pH保持6.5～7.5；
步骤(4)中藜麦蛋白溶液加热至90～100℃，10～20min，使蛋白质变性，冷却至40～50℃后，调节pH至6.5～7.5，加入中性蛋白酶，中性蛋白酶和藜麦蛋白的质量比为2～5:100，酶解时间为3～4h，酶解温度保持40～50℃，酶解pH保持6.5～7.5。
步骤(4)中灭酶温度为90～100℃，时间5～10min。离心条件为0～8℃，4000～6000g，10～20min，取上清液，即得藜麦蛋白酶解物；
步骤(5)用截留量为3000Da的膜超滤藜麦蛋白酶解物，收集透过液，经旋蒸浓缩、冷冻干燥后即得藜麦肽。
上述制备方法制备得到的藜麦肽属于本发明的保护范围。本发明通过实验发现，本发明上述方法制备得到的藜麦肽在体内实验中，有良好的降血糖活性。
进而，本发明提供了该藜麦肽在制备降血糖药物中的应用。含有本发明方法制得的藜麦肽的食品、保健品或药物也属于本发明的保护范围。
本发明的优点在于：
(1)本发明提出的藜麦肽制备过程，对不同藜麦原料、不同胚芽萌发时间以及不同酶酶解处理，进行藜麦肽制备过程优选，制备方法简单，较易实现产业化生产。
(2)本发明的藜麦肽具有很好的DPP-IV抑制活性，藜麦肽的体外DPP-IV抑制能力达到70％以上，藜麦肽的DPP-IV抑制活性(IC50值)小于5.84mg/mL。
(3)本发明的藜麦肽在体内具有很好的血糖调节作用，小鼠过夜禁食后，在1小时之内，服用藜麦肽组的糖尿病小鼠的基础血糖从12.7～20.4mmol·L-1降至8.9～14.2mmol·L-1；在腹腔注射葡萄糖耐量测试中，模型组0～120min曲线下面积为2450～3822mmol·L-1·min-1，服用藜麦肽组0～120min曲线下面积为1781～2084mmol·L-1·min-1，具有极显著(P<0.001)的血糖调节作用；
(4)开发的产品安全，本发明选用的原料为可食用的藜麦，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶其中的一种或几种酶进行酶解，经在温和条件下，获得特定分子量的藜麦肽，不加任何添加剂，为100％藜麦肽。
(5)本发明开发蛋白肽中分子量小于3000Da的肽的质量比例为90％以上。
具体实施方式
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1一种降血糖藜麦肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)将白藜麦淘洗干净，清水浸泡10小时后，于30℃恒温黑暗的保温箱中萌发2小时，50℃烘干，粉碎后过100目筛，得到藜麦粗粉；
(2)藜麦粗粉与正己烷溶剂按1:3比例混合，混合时间为60min，过滤，除去溶剂后风干，按照上述步骤重复处理1次，得到脱脂藜麦粉；
(3)脱脂藜麦粉和清水按料液比1:10比例混合调成浆状，用NaOH调pH至10.5，室温下搅拌2h后，在4℃，10000g的条件下离心30min，取上清液用HCl调pH至4.5，在4℃，10000g的条件下离心30min，取沉淀，用水将沉淀洗至中性后冷冻干燥，得到藜麦蛋白；
(4)藜麦蛋白粉和水混合，调成20mg/mL藜麦蛋白溶液，调pH＝2，加入胃蛋白酶，胃蛋白酶和藜麦蛋白的质量比为1:50，酶解温度为37℃，保持pH＝2，酶解时间为1.5h；调pH＝7.0，加入胰蛋白酶，胰蛋白酶和藜麦蛋白的质量比为1:50，酶解温度为37℃，保持pH＝7.0，酶解时间为3h；酶解后升温至90℃灭酶，时间5min；水解液5000g离心10min，收集上清液，即得藜麦蛋白酶解物。
(5)藜麦蛋白酶解物通过超滤法处理，用截留量为3000Da的膜超滤，收集透过液，得到分子量小于3000Da的藜麦肽液；浓缩、冷冻干燥后即得藜麦肽。
实施例2一种降血糖藜麦肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)将白藜麦淘洗干净，清水浸泡10小时后，于30℃恒温黑暗的保温箱中萌发12小时，50℃烘干，粉碎后过100目筛，得到藜麦粗粉；
(2)藜麦粗粉与正己烷溶剂按1:3比例混合，混合时间为60min，过滤，除去溶剂后风干，按照上述步骤重复处理1次，得到脱脂藜麦粉；
(3)脱脂藜麦粉和清水按料液比1:10比例混合调成浆状，用NaOH调pH至10.5，室温下搅拌2h后，在4℃，10000g的条件下离心30min，取上清液用HCl调pH至4.5，在4℃，10000g的条件下离心30min，取沉淀，用水将沉淀洗至中性后冷冻干燥，得到藜麦蛋白；
(4)藜麦蛋白粉和水混合，调成40mg/mL藜麦蛋白溶液，将藜麦蛋白溶液加热至90℃，持续10min使蛋白质变性，冷却至50℃后，调节pH＝8.0，加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶和藜麦蛋白的质量比为2:50，酶解时间为4h，酶解温度保持50℃，酶解pH＝8.0；
酶解后升温至90℃灭酶，时间5min；水解液5000g离心10min，收集上清液，即得藜麦蛋白酶解物。
(5)藜麦蛋白酶解物通过超滤法处理，用截留量为3000Da的膜超滤，收集透过液，得到分子量小于3000Da的藜麦肽液；浓缩、冷冻干燥后即得藜麦肽。
试验例1藜麦肽DPP-IV抑制活性的测定试验
藜麦肽的体外DPP-IV抑制活性测定，具体如下：
在96孔酶标板中，加入25μL不同浓度的样品(溶解于100mmol/L的Tris-HCl缓冲液，pH＝8.0)；加入25μL 1.59mmol/L的底物Gly-Pro-p-NA；混合后在37℃下孵育10min；加入50μL 10U/L DPP-IV酶溶液；混匀后在37℃下精确孵育不同60min；加入100μL 1mol/L醋酸～醋酸钠(pH＝4.0)，终止反应后，在405nm波长处测定吸光值；
式中，Ac、Ab、As分别代表样本组、空白组、对照组吸光度值。
本发明的藜麦肽具有很好的DPP-IV抑制活性，藜麦肽的体外DPP-IV抑制能力达到70％以上，藜麦肽的DPP-IV抑制活性(IC50值)小于5.84mg/mL。
试验例2藜麦肽体内血糖调节的测定试验
藜麦肽的体内血糖调节作用测定，方法如下：
HFD-STZ诱导T2DM小鼠模型，具体如下：先给予高脂饮食饲养8周，诱导胰岛素抵抗，模拟T2DM发病过程，再给予小剂量30mg/kg的STZ注射破坏部分胰岛细胞，可良好模拟2型糖尿病患者糖脂毒性引起的胰岛细胞损伤。实验组灌胃给药藜麦肽，模型组给予生理盐水，28天后测定小鼠基础血糖、葡萄糖耐量和胰岛素耐量等代谢指标。
本发明的藜麦肽在体内具有很好的血糖调节作用，糖尿病小鼠过夜禁食后测定血糖，在1h之内，服用藜麦肽组的糖尿病小鼠的基础血糖从12.7～20.4mmol·L-1降至8.9～14.2mmoL·L-1；在腹腔注射葡萄糖耐量测试中，模型组0～120min曲线下面积为2450～3822mmol·L-1·min-1，服用藜麦肽组0～120min曲线下面积为1781～2084mmol·L-1·min-1，具有极显著(P<0.001)的血糖调节作用；在胰岛素耐量测试中，模型组0～120min曲线下面积为1358～2043mmol·L-1·min-1，服用藜麦肽组0～120min曲线下面积为955～1211mmol·L-1·min-1，具有极显著(P<0.001)的改善胰岛素敏感性作用。
Claims (10)
1.一种降血糖藜麦肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将藜麦淘洗干净，清水浸泡2～8小时后，于恒温黑暗下萌发2～48小时，45～55℃烘干，粉碎后过80～120目筛，得到藜麦粗粉；
(2)将藜麦粗粉和正己烷按1:2～5的质量比混合，混合时间60～120min，过滤，除去溶剂后风干，得到脱脂藜麦粉；
(3)将脱脂藜麦粉和清水按1:8～10的质量比混合调成浆状，用NaOH调pH至10～11，室温下搅拌2～3h后，离心，取上清液用HCl调pH至4.0～4.6，离心取沉淀，用水将沉淀洗至中性后冷冻干燥，得到藜麦蛋白粉，所述离心条件为0～8℃，7000～10000g，20～40min；
(4)给藜麦蛋白粉中加水，调成浓度为20～40mg/mL的藜麦蛋白溶液，在所得溶液中加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶其中的一种或几种进行酶解，在温度为90～100℃的条件下灭酶5～10min，在0～8℃，4000～6000g的条件下离心10～20min，取上清液，即得藜麦蛋白酶解物；
(5)藜麦蛋白酶解物通过超滤法处理，用截留量为3000Da的膜超滤，收集透过液，得到分子量小于3000Da的藜麦肽液，浓缩、冷冻干燥后即得藜麦肽。
2.根据权利要求1所述的降血糖藜麦肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述藜麦为胚芽完整的白藜麦、红藜麦和黑藜麦其中的一种，经清水浸泡2～8小时后，有完整的胚芽萌发。
3.根据权利要求1所述的降血糖藜麦肽的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述胃蛋白酶和藜麦蛋白的质量比为2～5:100，酶解时间为1～1.5h，酶解温度保持35～39℃，酶解pH保持1.5～2.5。
4.根据权利要求1所述的降血糖藜麦肽的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述胰蛋白酶和藜麦蛋白的质量比为2～5:100，酶解时间为3～4h，酶解温度保持35～39℃，酶解pH保持6.5～7.5。
5.根据权利要求1所述的降血糖藜麦肽的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述藜麦蛋白溶液加热至90～100℃，持续10～20min使蛋白质变性，冷却至45～55℃后，调节pH至7.5～9.0，加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶和藜麦蛋白的质量比为2～5:100，酶解时间为3～4h，酶解温度保持45～55℃，酶解pH保持7.5～9.0。
6.根据权利要求1所述的降血糖藜麦肽的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述藜麦蛋白溶液加热至90～100℃，持续10～20min使蛋白质变性，冷却至45～55℃后，调节pH至6.5～7.5，加入风味蛋白酶，风味蛋白酶和藜麦蛋白的质量比为2～5:100，酶解时间为3～4h，酶解温度保持45～55℃，酶解pH保持6.5～7.5。
7.根据权利要求1所述的降血糖藜麦肽的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述藜麦蛋白溶液加热至90～100℃，持续10～20min使蛋白质变性，冷却至50～60℃后，调节pH至6.5～7.5，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶和藜麦蛋白的质量比为2～5:100，酶解时间为3～4h，酶解温度保持50～60℃，酶解pH保持6.5～7.5。
8.权利要求1所述的降血糖藜麦肽的制备方法制备得到的藜麦肽。
9.权利要求8所述的藜麦肽在制备降血糖药物中的应用。
10.权利要求8所述的藜麦肽在制备降血糖食物中的应用。
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