CN111197066B - 具有胆酸盐吸附作用的藜麦活性肽的酶解方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有胆酸盐吸附作用的藜麦活性肽的酶解方法，包括以下的步骤：步骤1，采用碱溶酸沉法从藜麦提取藜麦蛋白质；步骤2，以藜麦蛋白质为对象，加入风味蛋白酶酶解；步骤3，酶解反应完成后产物放入95℃水浴锅中灭活8～12min，取出冷却，调节pH值至7.0，经离心收集上清液、冷冻干燥，得藜麦活性肽。本发明以藜麦为原料，采用风味蛋白酶酶解藜麦蛋白质制备活性肽，生产工艺简单，食用安全性高，且该藜麦活性肽具有较好的吸附胆酸盐作用。与未酶解的藜麦蛋白质相比，本发明所制备的藜麦活性肽，其吸附胆酸盐的总量提高了63.28％。

Description

具有胆酸盐吸附作用的藜麦活性肽的酶解方法

技术领域

本发明涉及植物提取技术领域，尤其涉及具有胆酸盐吸附作用的藜麦活性肽的酶解方法。

背景技术

藜麦，属苋科、藜属，是一种原产于南美安第斯山脉的作物，被联合国粮农组织(FAO)称为“全营养食品”。研究表明藜麦蛋白质含量较高，平均含量达15％，远高于水稻、大麦和玉米等大多数谷类；藜麦蛋白质由清蛋白(35％)、球蛋白(37％)、谷蛋白和醇溶蛋白组成，主要贮藏蛋白是清蛋白和球蛋白，由于二硫键的作用清蛋白和球蛋白稳定性都较好；藜麦蛋白质中氨基酸组成和比例均衡，其蛋白质生物学价值和牛奶相当，具有降低胆固醇、抑制脂质过氧化和抗氧化等生物活性，近年来被作为保健食品广泛推荐。

但是，藜麦作为一种优质的高蛋白杂粮，目前国内研究者对藜麦蛋白质的提取方法和基本功能特性等方面进行了大量研究，但对其活性肽的研究较少。

发明内容

本发明的目的是提供具有胆酸盐吸附作用的藜麦活性肽的酶解方法。

本发明以藜麦蛋白质为研究对象，采用风味蛋白酶将其酶解制备活性肽，制备水解度较高、胆酸盐吸附作用较好的藜麦活性肽。

本发明提供的具有胆酸盐吸附作用的藜麦活性肽的酶解方法，包括以下的步骤：

步骤1，采用碱溶酸沉法从藜麦提取藜麦蛋白质；

步骤2，以藜麦蛋白质为对象，加入风味蛋白酶，在底物浓度1～5％，酶解pH＝5.0～9.0，酶解温度40～60℃，酶添加量1000～6000U/g的条件下酶解1～3h；

步骤3，酶解反应完成后产物放入95℃水浴锅中灭活8～12min，取出冷却，调节pH值至7.0，经离心收集上清液、冷冻干燥，得藜麦活性肽。

进一步的，步骤1进一步包括：

1.1取藜麦，用30～35℃水洗涤2～4次以除去皂苷，40～50℃烘干至含水量为(10±1)％；

1.2烘干后的藜麦打粉过80目筛，加入正己烷，正己烷的加入量为藜麦的4～6倍，室温下搅拌脱脂，后抽滤；再重复脱脂和抽滤2～4次，之后挥发10～15h，得脱脂藜麦粉；

1.3在料水比为1：(10～14)、pH＝11.0、温度40～50℃的条件下，对脱脂藜麦粉进行搅拌浸提2～3h，对浸提产物离心，收集上清液；在相同条件下对沉淀物重复浸提1～3次；

1.4合并每次浸提收集的上清液用稀盐酸调pH至4.5，静置后离心,收集沉淀,用去离子水洗涤沉淀,，除去可溶性盐后，调节pH至7.0，对沉淀冷冻干燥，得藜麦粗蛋白粉。

作为优选，步骤2中，底物浓度为3％，酶解pH＝7.0，酶解温度55℃，酶添加量6000U/g，酶解时间2h。

本发明所制备的藜麦活性肽，可应用于制备具有降血脂功能的药品或食品。

本发明采用上述的技术方案，取得如下的技术效果：

(1)本发明提供了一种快速高效地制备具有胆酸盐吸附作用的藜麦活性肽的方法，其是以藜麦为原料，采用风味蛋白酶水解制备藜麦活性肽，使得藜麦蛋白质的水解度适宜，进而获得了具有独特的生物活性的藜麦活性肽，表现出较好的吸附胆酸盐的能力，在最佳酶解工艺条件下酶解获得的活性肽吸附胆酸盐的总量为(7.56±0.11)mg/mL，与未酶解的藜麦蛋白质吸附胆酸盐的总量相比提高了63.28％。

(2)生产工艺简单，食用安全性高。

附图说明

图1为以酶解pH为单因素，以水解度为指标，通过甲醛滴定法测定的藜麦活性肽的水解度随酶解pH的变化图；

图2为以酶解pH为单因素，以胆酸盐吸附量为指标，通过糠醛比色法测定的藜麦活性肽的胆酸盐吸附量随酶解pH的变化图；

图3为以酶添加量为单因素，以水解度为指标，通过甲醛滴定法测定的藜麦活性肽的水解度随酶添加量的变化图；

图4为以酶添加量为单因素，以胆酸盐吸附量为指标，通过糠醛比色法测定的藜麦活性肽的胆酸盐吸附量随酶添加量的变化图；

图5为以酶解时间为单因素，以水解度为指标，通过甲醛滴定法测定的藜麦活性肽的水解度随酶解时间的变化图；

图6为以酶解时间为单因素，以胆酸盐吸附量为指标，通过糠醛比色法测定的藜麦活性肽的胆酸盐吸附量随酶解时间的变化图；

图7为以底物浓度为单因素，以水解度为指标，通过甲醛滴定法测定的藜麦活性肽的水解度随底物浓度的变化图；

图8为以底物浓度为单因素，以胆酸盐吸附量为指标，通过糠醛比色法测定的藜麦活性肽的胆酸盐吸附量随底物浓度的变化图；

图9为以酶解温度为单因素，以水解度为指标，通过甲醛滴定法测定的藜麦活性肽的水解度随酶解温度的变化图；

图10为以酶解温度为单因素，以胆酸盐吸附量为指标，通过糠醛比色法测定的藜麦活性肽的胆酸盐吸附量随酶解温度的变化图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案进行进一步的描述，使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施。

实施例1

本实施例包括以下的步骤：

步骤1，采用碱溶酸沉法提取藜麦蛋白质：

藜麦用温水洗涤3次以除去皂苷，45℃烘干至含分量为(10±1)％。烘干后的藜麦打粉过80目筛，加入正己烷脱脂，正己烷的加入量为藜麦的5倍，室温下搅拌1h后抽滤，重复2次，挥发12h。

脱脂藜麦粉在料水比1：12，pH＝11.0、温度45℃的条件下搅拌浸提3h。浸提后的产物离心30min，收集上清液；之后在相同条件下进行2次浸提，合并2次上清液用稀盐酸调pH至4.5，静置30min后离心20min,收集沉淀,用去离子水洗涤2次除去可溶性盐后调节pH至7.0，沉淀冷冻干燥得到藜麦粗蛋白质粉。

步骤2，以藜麦蛋白质为对象，加入风味蛋白酶，在底物浓度2％，酶解pH＝5.0，酶解温度50℃，酶添加量5000U/g的条件下酶解2h。

步骤3，酶解反应完成后放入95℃水浴锅中灭活10min，取出放冷，调节pH值至7.0，8000r/min离心10min，收集上清液，进行水解度和胆酸盐吸附作用测定。

本实施例中还进行了藜麦活性肽吸附胆酸盐的作用和水解度等评价指标的测定实验：

(1)水解度(DH)的测定：

采用甲醛滴定法测定。

分别吸取10.00ml未水解藜麦蛋白溶液和灭酶的藜麦蛋白质酶解液于烧杯中,加5滴30％过氧化氢，先用0.1mol/L氢氧化钠慢慢调节pH达到7.5左右后,再用0.05mol/L氢氧化钠溶液调节至pH＝8.10，并且保持1min不变。然后慢慢加入15ml中性甲醛溶液，1min后用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至pH＝8.10，分别记录消耗氢氧化钠标准溶液滴定的体积V₀、V₁。

DH＝((V₁-V₀)*V*C*14.01*6.25)/(1000*M*Pro)*100％

其中：V₁为1ml水解液消耗的NaOH溶液体积(ml)；V₀为1ml空白液消耗的NaOH溶液体积(ml)；V为配料用水体积(ml)；C为滴定用NaOH溶液浓度(mol/L)；14.01为氮的摩尔质量(g/mol)；6.25为氮换算为蛋白质的系数；M为配料所加蛋白质的质量(g)；pro为配料所加物料蛋白含量(％)。

(2)体外胆酸盐吸附作用测定

采用糠醛比色法测定。

精密称取牛磺胆酸钠、胆酸钠各200mg置于50mL容量瓶中，以蒸馏水溶解并定容至刻度分别配制成4mg/mL的牛磺胆酸钠、胆酸钠溶液。分别移取4mg/mL的牛磺胆酸钠、胆酸钠溶液0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mL于具塞试管中，用蒸馏水补足体积为1.0mL。分别加入45％的硫酸6mL，混匀，再加入0.3％的糠醛1mL，混匀，置于65℃恒温水浴锅中反应30min，取出冷却至室温，于620nm波长处测吸光度值，以胆酸盐浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。

分别移取4mg/mL的牛磺胆酸钠、胆酸钠溶液各8mL于100mL锥形瓶中，分别加入藜麦蛋白质酶解液2mL，于37℃恒温下振荡反应60min，再5000r/min离心10min。分别取离心后的样液和胆酸盐空白溶液各1mL，加入45％的硫酸6mL，混匀，再加入0.3％的糠醛1mL，混匀，置65℃恒温水浴锅中反应30min，取出冷却至室温，测定在620nm波长处的吸光度值，由标准曲线求得样液中胆酸盐的浓度，以所加入胆酸盐的浓度减去样液中胆酸盐的浓度即为被藜麦蛋白质酶解物结合了的胆酸盐的浓度，而计算藜麦蛋白质酶解物对胆酸盐的吸附作用。

实施例2

本实施例包括如下步骤：

步骤1，采用碱溶酸沉法提取藜麦蛋白质：

藜麦用温水洗涤3次以除去皂苷，45℃烘干至水分含量(10±1)％。烘干后的藜麦打粉过80目筛，加入正己烷脱脂，正己烷的加入量为藜麦的5倍，室温下搅拌1h后抽滤，重复2次，挥发12h。

脱脂藜麦粉在料水比1：12，pH＝11.0、温度45℃的条件下搅拌浸提3h。浸提后的产物离心30min，收集上清液，之后在相同条件下进行2次浸提，合并2次上清液用稀盐酸调pH至4.5，静置30min后离心20min,收集沉淀,用去离子水洗涤2次除去可溶性盐后调节pH至7.0，沉淀冷冻干燥得到藜麦粗蛋白质粉。

步骤2，以藜麦蛋白质为对象，加入风味蛋白酶，在底物浓度2％，酶解pH＝6.0，酶解温度50℃，酶添加量5000U/g的条件下酶解2h。

步骤3，酶解反应完成后放入95℃水浴锅中灭活10min，取出放冷，调节pH值至7.0，8000r/min离心10min，收集上清液，进行水解度和胆酸盐吸附作用测定。

实施例3

本实施包括如下步骤：

步骤1，采用碱溶酸沉法提取藜麦蛋白质：

藜麦用温水洗涤3次以除去皂苷，45℃烘干至水分含量(10±1)％。烘干后的藜麦打粉过80目筛，加入正己烷脱脂，正己烷的加入量为藜麦的5倍，室温下搅拌1h后抽滤，重复2次，挥发12h。

脱脂藜麦粉在料水比1：12，pH＝11.0、温度45℃的条件下搅拌浸提3h。浸提后的产物离心30min，收集上清液，之后在相同条件下进行2次浸提，合并2次上清液用稀盐酸调pH至4.5，静置30min后离心20min,收集沉淀,用去离子水洗涤2次除去可溶性盐后调节pH至7.0，沉淀冷冻干燥得到藜麦粗蛋白质粉。

步骤2，以藜麦蛋白质为对象，加入风味蛋白酶，在底物浓度2％，酶解pH＝7.0，酶解温度50℃，酶添加量5000U/g的条件下酶解2h。

步骤3，酶解反应完成后放入95℃水浴锅中灭活10min，取出放冷，调节pH值至7.0，8000r/min离心10min，收集上清液，进行水解度和胆酸盐吸附作用测定。

实施例4

本实施包括如下步骤：

步骤1，采用碱溶酸沉法提取藜麦蛋白质：

藜麦用温水洗涤3次以除去皂苷，45℃烘干至水分含量(10±1)％。烘干后的藜麦打粉过80目筛，加入正己烷脱脂，正己烷的加入量为藜麦的5倍，室温下搅拌1h后抽滤，重复2次，挥发12h。

脱脂藜麦粉在料水比1：12，pH＝11.0、温度45℃的条件下搅拌浸提3h。浸提后的产物离心30min，收集上清液，之后在相同条件下进行2次浸提，合并2次上清液用稀盐酸调pH至4.5，静置30min后离心20min,收集沉淀,用去离子水洗涤2次除去可溶性盐后调节pH至7.0，沉淀冷冻干燥得到藜麦粗蛋白质粉。

步骤2，以藜麦蛋白质为对象，加入风味蛋白酶，在底物浓度2％，酶解pH＝8.0，酶解温度50℃，酶添加量5000U/g的条件下酶解2h。

步骤3，酶解反应完成后放入95℃水浴锅中灭活10min，取出放冷，调节pH值至7.0，8000r/min离心10min，收集上清液，进行水解度和胆酸盐吸附作用测定。

实施例5

本实施包括如下步骤：

步骤1，采用碱溶酸沉法提取藜麦蛋白质：藜麦用温水洗涤3次以除去皂苷，45℃烘干至水分含量(10±1)％。烘干后的藜麦打粉过80目筛，加入正己烷脱脂，正己烷的加入量为藜麦的5倍，室温下搅拌1h后抽滤，重复2次，挥发12h。

脱脂藜麦粉在料水比1：12，pH＝11.0、温度45℃的条件下搅拌浸提3h。浸提后的产物离心30min，收集上清液，之后在相同条件下进行2次浸提，合并2次上清液用稀盐酸调pH至4.5，静置30min后离心20min,收集沉淀,用去离子水洗涤2次除去可溶性盐后调节pH至7.0，沉淀冷冻干燥得到藜麦粗蛋白质粉。

步骤2，以经步骤1得到的藜麦蛋白质为对象，加入风味蛋白酶，在底物浓度2％，酶解pH＝9.0，酶解温度50℃，酶添加量5000U/g的条件下酶解2h；

步骤3，酶解反应完成后放入95℃水浴锅中灭活10min，取出放冷，调节pH值至7.0，8000r/min离心10min，收集上清液，进行水解度和胆酸盐吸附作用测定。

实验例

在酶解pH＝6.0、酶添加量5000U/g、酶解时间2h、底物浓度2％、酶解温度50℃的条件下，以酶解pH、酶添加量、酶解时间、底物浓度及酶解温度为单因素，以水解度和胆酸盐吸附量为综合评价指标，分别通过甲醛滴定法和糠醛比色法对采用本发明实施例的方法得到的藜麦活性肽水解度和胆酸盐吸附量进行研究。

结果为，酶解pH、酶添加量、酶解时间、底物浓度及酶解温度分别是7.0、6000U/g、2h、3％、55℃时，酶解获得的活性肽水解度(DH)较高，胆酸盐吸附作用最好。表1、图1、图2中各实施例的其他条件均为：酶添加量5000U/g，酶解时间2h，底物浓度2％，酶解温度50℃；表2、图3、图4中各实施例的其他条件均为：pH＝6.0，酶解时间2h，底物浓度2％，酶解温度50℃；表3、图5、图6中各实施例的其他条件均为：pH＝6.0，酶添加量5000U/g，底物浓度2％，酶解温度50℃；表4、图7、图8中各实施例的其他条件均为：pH＝6.0，酶添加量5000U/g，酶解时间2h，酶解温度50℃；表5、图9、图10中各实施例的其他条件均为：pH＝6.0，酶添加量5000U/g，底物浓度2％，酶解时间2h。

表1酶解pH数据统计及结果表

表2酶添加量数据统计及结果表

表3酶解时间数据统计及结果表

表4底物浓度数据统计及结果表

表5酶解温度数据统计及结果表

在单因素实验基础上，以胆酸盐吸附量为指标，通过设计酶解pH、酶添加量、底物浓度、酶解温度的四因素三水平正交试验优化藜麦蛋白质的酶解工艺条件，发现酶解pH＝7.0、酶添加量6000U/g、底物浓度3％、酶解温度55℃时为最佳酶解条件，如表6所示。

表6正交实验直观分析表

根据正交试验结果分析得到的最佳酶解条件做三次平行验证实验，同时与未酶解的藜麦蛋白质吸附胆酸盐的作用做对比研究，采用糠醛显色法测定上述最优组合和对比例中的藜麦蛋白质吸附胆酸盐的能力，结果见表7。

表7验证实验数据及结果

表8酶解前后胆酸盐吸附量显著性表

实验	平方和	df	F	P
					对比例&实施例二	12.790	1	177.551	0.000

表8中对比例指未水解藜麦蛋白溶液。由表可知，最优组合A₁D₂B₃C₂酶解获得的活性肽吸附胆酸盐的总量为(7.56±0.11)mg/mL，与未酶解的藜麦蛋白质吸附胆酸盐的总量相比提高了63.28％，表明酶解获得的藜麦活性肽与为酶解的藜麦蛋白质相比具有更强的吸附胆酸盐的能力。

本发明提供的技术方案，不受上述实施例的限制，凡是利用本发明的结构和方式，经过变换和代换所形成的技术方案，都在本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.具有胆酸盐吸附作用的藜麦活性肽的酶解方法，其特征在于，包括以下的步骤：

步骤1，采用碱溶酸沉法提取藜麦蛋白质：

1.1取藜麦用30～35℃水洗涤2～4次以除去皂苷，40～45℃烘干至水分含量(10±1)％；

1.2烘干后的藜麦打粉过80目筛，加入藜麦量4～6倍的正己烷室温下搅拌脱脂，抽滤，重复2～4次，挥发10～15h，得脱脂藜麦粉；

1.3脱脂藜麦粉加入10～14倍水、pH＝11.0、温度40～50℃的条件下搅拌浸提2～3h，浸提物离心，收集每次浸提物离心得到的上清液，相同条件下重复1～3次；

1.4合并每次浸提得到的上清液用稀盐酸调pH至4.5，静置后离心，收集沉淀，用去离子水洗涤，除去可溶性盐后调节pH为至7.0，沉淀冷冻干燥得到藜麦粗蛋白粉；

步骤2，以藜麦蛋白质为对象，加入风味蛋白酶，在底物浓度1～5％，酶解pH＝5.0～9.0，酶解温度40～60℃，酶添加量1000～6000U/g的条件下酶解1～3h；

步骤3，酶解反应完成后将产物放入95℃水浴锅中灭活8～12min，取出放冷，调节pH值至7.0，经离心收集上清液，冷冻干燥得藜麦活性肽。

2.根据权利要求1所述的具有胆酸盐吸附作用的藜麦活性肽的酶解方法，其特征在于：

步骤2中，底物浓度为3％，酶解pH＝7.0，酶解温度55℃，酶添加量6000U/g，酶解时间2h。

3.根据权利要求1-2任一所述的具有胆酸盐吸附作用的藜麦活性肽的酶解方法制备得到的藜麦活性肽。

4.根据权利要求1-2任一所述的具有胆酸盐吸附作用的藜麦活性肽制备方法制备得到的藜麦活性肽的应用，应用于制备具有降血脂活性的药品。

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