JP2018531036A6 - 酵素生産能が優秀である伝統発酵食品由来の新たな菌株及びこれを用いた穀物発酵酵素食品の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、新たなバチルス・アミロリケファシエンス菌株、前記菌株を用いた穀物発酵物の製造方法、前記菌株を用いて製造された穀物発酵物、及び前記穀物発酵物を含む、血栓分解用、消化改善用、腸炎症、腸膜の弱化または腸損傷の予防、改善または治療用、または抗酸化用の組成物に関する。
【解決手段】
【選択図】図4
【解決手段】
【選択図】図4
Description
本発明は、新たなバチルス・アミロリケファシエンス菌株、前記菌株を用いた穀物発酵物の製造方法、前記菌株を含む穀物発酵物、及び前記菌株または穀物発酵物を含む、血栓分解用;消化改善用;腸炎症、腸膜の弱化または腸損傷の予防、改善または治療用;または抗酸化用組成物に関する。
酵素とは、体内の代謝活動に作用する重要なタンパク質であり、化学作用における触媒の役割をする物質を称する。大別して、体内で生成できず外部から摂取しなければならない食品酵素、体内で生成され消化に必要な役割をする消化酵素、消化以外の代謝作用に必要な役割をする代謝酵素がある。このうち、食品酵素は、消化吸収作用、分解排出作用、抗炎・抗菌作用、解毒殺菌作用、血液浄化作用及び細胞賦活作用などの生理作用をすることが報告されている(シンヒョンジェ、酵素治療、p.29−41、2013)。
酵素食品は、前記酵素の機能を強化させるために食用原料に食用微生物を培養して酵素を多量に含有させたもの、食品から酵素を含有した部分を抽出したもの、またはこれらを加工したものを通称する言葉である。前記酵素食品は、食品自体の酵素と微生物の発酵及び熟成過程を通じて、様々な生理活性物質及び栄養素の生成作用と有益菌の増殖作用により、消化・吸収を助ける様々な微量元素及び生理活性物質が増加すると報告されている(Huh、SH and Kim、MH The modern health and health food、1997 Hongikjea press.Korea、p.35−36)。
このような背景の下、本発明者らは、酵素食品として利用できる穀物発酵物を開発するために研究と努力を重ねた結果、澱粉および蛋白質分解能力に優れた菌株をスクリーニングし、これを利用して穀物発酵物を製造し、これから様々な効果を確認することにより、本発明を完成した。
本発明の一つの目的は、新たなバチルス・アミロリケファシエンスBA245菌株を提供することである。
本発明の他の目的は、(a)穀物に、本発明の菌株を接種するステップ;(b)前記菌株を培養して、穀物発酵物を得るステップを備える、穀物発酵物の製造方法を提供することである。
本発明の更に他の目的は、本発明の菌株を含む穀物発酵物を提供することである。
本発明の更に他の目的は、本発明の菌株または穀物発酵物を含む血栓分解用;消化改善用;腸炎症、腸膜の弱化または腸損傷の予防、改善または治療用;または抗酸化用組成物、および本発明の菌株または穀物発酵物を含む食品組成物(例えば、酵素食品組成物)を提供することである。
前記目的を達成するため本発明の一様態では、バチルス・アミロリケファシエンスBA245菌株(KCTC 12905BP)を提供する。
具体的に、本発明のバチルス・アミロリケファシエンスBA245菌株は強力な活性の澱粉及びタンパク分解酵素を生産し、高分子の炭水化物及びタンパク質を加水分解して低分子化することにより、微生物が利用しやすい糖類に分解して微生物の作用を助けることだけでではなく、低分子化されたペプチドを提供して消化・吸収率を大幅に高める。また、本発明のバチルス・アミロリケファシエンスBA245菌株は、穀物の主要構成成分である炭水化物を利用して活発に生育しながら菌体を構成するタンパク質に転換させるため、酵素食品内の粗たんぱくの含量が相対的に増加する。BA245菌株を用いた発酵により食物繊維の含量も増加するが、食物繊維は排便を助け、腸内有益菌の重要な栄養素として有益菌の数を増加させ健康な腸内環境の造成を助ける。
本発明のバチルス・アミロリケファシエンスBA245菌株は、伝統的発酵食品から由来した菌株の中で、澱粉及びタンパク分解酵素生成能が最も優秀な菌株を選別したものであり、酵母から分離した菌株である。
選別したBA245を同定するために、16S rRNA遺伝子を塩基配列分析した結果、BA245菌株は配列番号1の16S rRNA遺伝子の塩基配列を有することを確認した。前記配列を用いて公知菌株との配列相同性の比較及び系統分類学的類縁関係を分析した結果、BA245菌株はバチルス・アミロリケファシエンスと99.9%の類似性を示し(図2)、gyrase A遺伝子の塩基配列比較においてもバチルス・アミロリケファシエンスと最も類縁関係が高いことが判明した(図3を参照)。
本発明のBA245菌株をバチルス・アミロリケファシエンスBA245と命名し、ブダペスト条約に基づいて、2015年9月23日に、韓国生命工学研究院の微生物資源センター(Korean Collection for Type Cultures、KCTC)に寄託し、寄託番号はKCTC12905BPである。
本発明の他の一様態では、下記のステップを備える穀物発酵物の製造方法を提供する:(a)穀物に寄託番号KCTC12905BPのバチルス・アミロリケファシエンスBA245菌株を接種するステップ;及び、(b)前記菌株を培養して穀物発酵物を得るステップ。
以下、本発明の製造方法をステップごとに詳しく説明する。
ステップ(a):穀物の菌株を接種するステップ
本発明のステップ(a)で利用できる穀物は、小麦、小麦胚芽、ふすま、白米、玄米、発芽玄米、大麦、オート麦、赤米、黒もち米、もち米、米ぬか、大豆、鼠目太、黒豆、キヌア、レンズ豆及びハトムギからなる群より選択された一つ以上の穀物を含む。前記穀物は粉砕された形態、粉末形態、または粉砕過程なしでそのまま使用することもできる。
本発明のステップ(a)で利用できる穀物は、小麦、小麦胚芽、ふすま、白米、玄米、発芽玄米、大麦、オート麦、赤米、黒もち米、もち米、米ぬか、大豆、鼠目太、黒豆、キヌア、レンズ豆及びハトムギからなる群より選択された一つ以上の穀物を含む。前記穀物は粉砕された形態、粉末形態、または粉砕過程なしでそのまま使用することもできる。
具体的に、前記のステップ(a)の穀物は、小麦胚芽及びふすまを含む。この場合、小麦胚芽及びふすまは穀物100重量部に対して40重量部〜100重量部、50重量部〜100重量部、50重量部〜90重量部、50重量部〜80重量部または60重量部〜80重量部で含まれる。
より具体的に、前記のステップ(a)における穀物は、小麦胚芽及びふすまに、オート麦、レンズ豆、玄米、もち大麦及びキヌアで構成された群より選択される一つ以上の穀物をさらに含むことができる。各々の含量範囲は、穀物100重量部に対して1重量部〜20重量部、具体的には3重量部〜10重量部の範囲である。また、前記ステップ(a)の穀物は30%(v/w)〜70%(v/w)の水分含量を有する穀物である。具体的には、前記水分含量は、30%(v/w)〜60%(v/w)、30%(v/w)〜50%(v/w)、または30%(v/w)〜40%(v/w)である。水分含量が30%よりも低い場合には低水分によってバチルス菌の発酵速度が遅くなり、特に発酵中に蒸発される水分によって最終発酵後においてバチルス菌が生育しにくい水分含量である20%程度に達するため良くない。水分含量が70%よりも高い場合には乾燥工程で多くに費用がかかる問題が発生する恐れがある。
具体的には、前記水分含量は、穀物自体の水分含量であるか、予め水分を含有させる前処理がなされた穀物であるか、または前記(a)の穀物に水分をさらに処理した後の水分含量である(すなわち、前記ステップ(a)の穀物が水分処理された穀物であり得る)。前記水分処理は穀物に適量の水を直接噴霧または混合して実施することができる。
また、本発明における穀物発酵物の製造方法は、ステップ(a)の前で穀物に熱処理するステップをさらに備えることができる。熱処理ステップがなくても穀物で菌株培養が可能であるが、熱処理によって穀物中の雑菌を死滅させるとともに、穀物の細胞壁の破壊と糊化 およびタンパク質を変性させることにより、微生物が活発に生育できる環境を提供することができるため、菌株接種量を下げて費用を低減することができる。前記熱処理は、当業界に公知された様々な方法を利用することができ、例えば、スチーム(steam)または過熱水蒸気(superheated steam)を用いて実施することができる。具体的には、70℃〜140℃のスチームで10分〜60分間の蒸煮処理、200℃〜300℃の過熱水蒸気で数秒ないし数分の短時間の熱処理などがある。より具体的に、70℃〜130℃のスチームで20分〜60分間の蒸煮処理、または、80℃〜125℃のスチームで20分〜45分間の蒸煮処理ができる。熱処理温度が低い場合や処理時間が短い場合には、雑菌の殺菌効果が低下して以降の発酵工程が円滑に行われない恐れがあり、熱処理温度が高い場合や処理時間が長くなる場合には穀物内のタンパク質の変性による発酵効率の低下で最終製品の品質が低下する恐れがある。
また、本発明の穀物発酵物の製造方法は、ステップ(a)の前に、穀物に水分処理した後に熱処理するステップをさらに備えることができる。水分処理と熱処理は、前述したとおりである。
続いて、前記穀物に寄託番号KCTC12905BPのバチルス・アミロリケファシエンスBA245菌株を接種する。
前記接種の前に、任意に熱処理された穀物を冷却するステップをさらに備えることができる。冷却は、熱処理が終了した後、自然的に、または冷却速度を高めて過熱防止と均一冷却することができる(例えば、コンベア(conveyor)式の放冷機を利用)。具体的に、冷却温度は、30℃〜50℃、35℃〜45℃であり、または35℃〜40℃に冷却する。
穀物にバチルス・アミロリケファシエンスBA245菌株の接種は、前記菌株を培養した前培養液をそのまま使用するか、分離された菌株を使用するか、または凍結乾燥などの形態で粉末化された菌株またはその培養物を使用することができる。BA245菌株の接種量は、接種直後の菌数が1×105CFU/g〜1×1010CFU/g、または1×106CFU/g〜1×109CFU/gである。接種量が1×105CFU/g未満の場合には、種菌発酵液の所要量が少ないが穀物の発酵に多くの時間がかかるため製品の生産に必要な発酵時間が長くなって雑菌が汚染される可能性が高いという短所がある。一方、接種量が1×1010CFU/gを超過する場合には、発酵時間は大幅に短縮されるが、接種用種菌の生産原価が負担になる短所がある。
ステップ(b):菌株を培養して穀物発酵物を得るステップ
ステップ(a)を実施した後、本発明の菌株を穀物と共に培養して穀物発酵物を得ることができる。下記の実施例で示すように、本発明のアミロリケファシエンスBA245菌株を穀物に培養することで前記菌株の優秀な澱粉分解酵素活性とタンパク分解酵素活性によって、得られた穀物発酵物内のタンパク質を低分子化して消化吸収率を高めることと食物繊維などの様々な有用成分を含有させて血栓分解作用;消化改善作用;腸炎症、腸膜の弱化または腸損傷の予防、改善または治療作用;または抗酸化作用などの有利な活性を持たせることができる。
ステップ(a)を実施した後、本発明の菌株を穀物と共に培養して穀物発酵物を得ることができる。下記の実施例で示すように、本発明のアミロリケファシエンスBA245菌株を穀物に培養することで前記菌株の優秀な澱粉分解酵素活性とタンパク分解酵素活性によって、得られた穀物発酵物内のタンパク質を低分子化して消化吸収率を高めることと食物繊維などの様々な有用成分を含有させて血栓分解作用;消化改善作用;腸炎症、腸膜の弱化または腸損傷の予防、改善または治療作用;または抗酸化作用などの有利な活性を持たせることができる。
前記培養は、液体培養または固体培養であり、具体的に固体培養である。培養温度は20℃〜50℃、30℃〜45℃または37℃であり、培養時間は1〜48時間、6〜48時間、6〜36時間、12〜36時間、12〜30時間、18〜30時間、22〜26時間、または24時間である。
培養方法は特に限定されないが、例えば、液状培養タンク、回転ドラム式発酵槽(rotary drum fermentor)またはトレイ発酵槽(tray fermentor)を用いて培養する。前記回転ドラム式またはトレイ発酵槽の外にも、穀物またはその混合物の発酵に有用なものであれば、その形態に関係なく本発明の方法で使用することができ、生産規模に応じて適切な装置を選択して使用する。
本発明の製造方法は、ステップ(b)で得られた穀物発酵物を乾燥および/または粉砕するステップをさらに備えることができる。前記乾燥および/または粉砕は当業界に公知された様々な方法で実施することができるが、過度に高温で乾燥した場合には穀物発酵物の中の生菌が死滅することや酵素活性が減少する恐れがあるので注意する必要がある。具体的に、本発明の菌株が死滅しなく酵素活性を維持する低温で乾燥し、低温、例えば40℃〜75℃、または50℃〜70℃で、低湿度の熱風で穀物発酵物中の水分含量が20%以下、または10%以下になるように乾燥する。粉砕工程は、穀物発酵物を利用する目的に応じて様々な大きさに粉砕し、粉砕方法は、例えば、ハンマーミル(hammer mill)などを利用することができる。
本発明の他の一様態では、寄託番号KCTC12905BPのバチルス・アミロリケファシエンスBA245菌株を含む穀物発酵物を提供する。
具体的に、前記アミロリケファシエンスBA245菌株はその培養物またはその破砕物などを含む。前記BA245菌株は、上述した通りである。
また、本発明の穀物発酵物は、以下をさらに含むことができる:(a)50〜60重量%の炭水化物;(b)20〜30重量%の粗タンパク質;(c)50〜200mg/100gのリシン;(d)15〜150mg/100gのイソロイシン;(e)100〜300mg/100gのロイシン;(f)10〜70mg/100gのメチオニン;(g)100〜300mg/100gのフェニルアラニン;(h)50〜100mg/100gのトリプトファン;及び、(i)50〜300mg/100gのバリン。具体的には、本発明の穀物発酵物は、下記の成分をさらに含むことができる:(j)25〜30重量%の食物繊維;及び(k)3〜80mg/100gのスレオニン。より具体的に、穀物発酵物中の炭水化物は53〜60重量%、食物繊維は26〜29重量%、粗タンパク質は21〜25重量%である。必須アミノ酸であるスレオニンは40〜70mg/100g、または40〜60mg/100g;リシンは70〜150mg/100g、または100〜150mg/100g;イソロイシンは70〜120mg/100g、または80〜110mg/100g;ロイシンは150〜250mg/100g、または170〜240mg/100g;メチオニンは30〜60mg/100g、または40〜50mg/100g;フェニルアラニンは150〜250mg/100g、または170〜240mg/100g;トリプトファンは60〜90 mg/100g、または65〜85mg/100g;バリンは150〜250mg/100g、または170〜240mg/100gで含まれる。
前記穀物発酵物は、5Mw(kDa)以下のペプチド含量が粗タンパク質100重量部に対して50〜80重量部であり、30Mw(kDa)以上のペプチドの含量が5〜20重量部である。具体的に、前記5Mw(kDa)以下のペプチド含量は粗タンパク質100重量部に対して55〜70重量部であり、30Mw(kDa)以上のペプチドの含量が5〜15重量部である。
また、前記穀物発酵物は、α−アミラーゼ活性が2000〜4000U/g、2000〜4000U/g、2300〜3500U/g、2500〜3500U/gまたは2500〜3000U/gである。
また、前記穀物発酵物は、プロテアーゼ活性が2000〜4000U/g、2500〜4000U/g、3000〜4000U/g、3500〜4000U/gまたは3700〜4000U/gである。
本発明の穀物発酵物は、前述した本発明の一態様である穀物発酵物の製造方法によって製造されたものである。
本発明の他の一様態では、前述した本発明の菌株または穀物発酵物を含む食品組成物が提供される。前記食品組成物は、飲用できる食品であれば特に限定されない。
具体的には、前記食品組成物は酵素食品である。本発明において「酵素食品」という用語は、酵素の機能を強化させるため食用原料に食用微生物を培養して酵素を多量に含有させたもの、食品の酵素含有部分を抽出したもの、またはこれらを加工したものを意味する。
本発明の食品組成物には健康食品組成物も含まれる。本発明の菌株または穀物発酵物を食品または健康食品組成物に利用する場合には、本発明の菌株または穀物発酵物をそのまま添加することと、他の食品または食品成分と同時に使用することができ、通常の方法で適切に使用することもできる。本発明の菌株または穀物発酵物の混合量は、使用目的(予防、健康または治療的処置)に応じて適切に決定する。前記食品組成物は、食用可能な組成物であれば制限なく含まれる。食品組成物には、肉類、ソーセージ、パン、ケーキ、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類(クッキー、クラッカーなど)、ピザ、麺類(ラーメンなど)、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、様々なスープ、ケチャップ、ソース、グレービー(gravies)、ドレッシング、飲料水、茶、ドリンク剤、アルコール飲料、および複合ビタミン剤などがある。
本発明の食品または健康食品組成物には、通常の飲料のように様々な香味剤または天然炭水化物などが追加成分として含まれる。前記天然炭水化物は、ブドウ糖とフルクトースなどのモノサッカライド、マルトース、およびスクロースなどのジサッカライド、デキストリンおよびシクロデキストリンなどのポリサッカライド、並びにキシリトール、ソルビトール、およびエリスリトールなどの糖アルコールがある。甘味料としてはソーマチン、ステビア抽出物などの天然甘味料、サッカリン、アスパルテームなどの合成甘味料などを使用することができる。前記天然炭水化物の比率は、本発明の食品または健康食品組成物100ml当たり、一般的に約0.01〜0.20g、具体的には、約0.04〜0.10gである。
前記成分の他に、本発明の食品または健康食品組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸とその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護コロイド、増粘剤、pH調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭化剤などを含有することができる。その他、本発明の食品または健康食品組成物は、天然果実ジュース、果実ジュース飲料、野菜飲料を製造に用いる果肉を含有することができる。前記成分は、独立的に、または組み合わせて用いることができる。前記添加剤の比率は、本発明の食品または健康食品組成物100重量部当たり、0.01〜0.20重量部の範囲で選択される。
本発明の他の一様態では、バチルス・アミロリケファシエンスBA245菌株またはこれを含む穀物発酵物が含有された、血栓分解用;消化改善用;腸炎症、腸膜の弱化または腸損傷の予防、改善または治療用;または抗酸化用組成物が提供される。
本発明における「予防」という用語は、目的とする疾患の発症を抑制又は遅延させる全ての行為を意味する。本発明における「改善」という用語は、発生した疾病の症状及び副作用を軽減または緩和させる全ての行為を意味する。本発明における「治療」という用語は、発生した疾病の症状及び副作用を改善、好転又は有利に変更する全ての行為を意味する。
下記実施例で示したように、本発明の菌株または穀物発酵物は、具体的にはフィブリンの分解活性を有し(実施例8);固形分の胃排出能を改善させ(実施例9);急性腸炎の動物モデルで胃透過性を改善させ(実施例10)、腸膜を強化し(実施例11)、腸組織の損傷を治療し(実施例12);抗酸化活性が高いことを確認した(実施例13)。したがって、本発明の菌株または穀物発酵物が血栓分解;消化改善;腸炎症、腸膜の弱化または腸損傷の予防、改善または治療;及び抗酸化活性があることを確認したので、血栓分解用;消化改善用;腸炎症、腸膜の弱化または腸損傷の予防、改善または治療用;または抗酸化用の医薬品および食品(または健康機能食品)に使用できることが分かる。
具体的に、前記血栓分解用組成物は、血栓の分解作用によって心筋梗塞、脈血栓症、脳卒中、脳梗塞、脳血栓症、または脳塞栓症の予防または治療に効果的である。
本発明の組成物は目的とする方法に応じて、経口投与、非経口投与(例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所適用)が可能であり、具体的に経口投与することができる。
本発明の組成物が薬剤学的組成物として使用される場合、投与のために本発明の菌株または穀物発酵物に加えて、更に薬剤学的に許容可能な担体を一つ以上含むことができる。薬剤学的に許容可能な担体は、生理食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、およびこれらの成分のうちいずれか一つ以上を混合して用いることができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、潤滑油を付加的に添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。さらに、当該分野の適切な方法、またはRemington’s Pharmaceutical Science(22nd)、Mack Publishing Company、Easton PAに開示された方法を用いて、各疾患または成分に応じて製剤化することができる。
本発明の薬剤学的組成物は、独立的に、または手術、ホルモン療法、薬物療法、および生物学的反応調節剤を用いる方法と併用して使用することができる。
本発明の他の一様態は、投与が必要な被験者(subject)にバチルス・アミロリケファシエンスBA245菌株又は前記菌株を用いて製造された穀物発酵物及び薬剤学的にまたは食品学的に許容可能な担体を含む組成物を投与することを備える、血栓に起因する疾患の治療、改善または予防;消化機能の改善;腸炎症、腸膜の弱化または腸損傷の予防、改善または治療;または活性酸素を減少する方法を提供する。本発明における投与は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度などに応じて、さまざまな投与量で本発明の組成物を投与して実施する。本発明の穀物発酵物は、毎日の投与量が約0.0001〜600mg/kg、または約0.001〜500mg/kgであり、一日に一回ないし数回に分けて投与することができる。また、本発明の菌株は、5×104〜5×108CFU/ml、または1×106〜1×108CFU/mlの量で、一回当たり30ml〜100mlまたは50ml〜100ml、1日1回ないし4回投与する。
(a)本発明は、澱粉分解酵素活性及びタンパク分解酵素活性が優秀である新たなバチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)BA245菌株(KCTC12905BP)、前記菌株を利用して穀物発酵物を製造する方法、前記菌株を含む穀物発酵物、及び前記菌株又は前記穀物発酵物を含む様々な機能性組成物を提供する。
(b)前記菌株を種菌で用いて穀物発酵物を製造した場合、前記穀物発酵物は炭水化物及びタンパク質の加水分解による低分子化と粗タンパク含量の増加、食物繊維と必須遊離アミノ酸の増加などによって、血栓による疾患の治療または予防、消化改善、腸炎症、腸膜の弱化または腸損傷の予防、改善または治療、または抗酸化作用に効果的である。
(c)よって、穀物発酵物を用いて、栄養素の摂取、血栓溶解、消化改善、腸健康と抗酸化に効果がある高品質の医薬品及び食品(または健康食品)を提供する。
以下、実施例を用いて本発明をもっと詳しく説明する。下記の実施例は本発明をより具体的に説明するだけであり、本発明の要旨と本発明の範囲が下記の実施例により限定されないことは本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者において自明である。
実施例1:澱粉及びタンパク分解酵素を高生産する菌株の選別
本発明者らは、澱粉及びタンパク分解酵素の生成能力が優秀な菌株を分離するために、様々な伝統発酵食品(キムチ、味噌類、酵母、伝統地酒及び塩辛など)から約3000千種の微生物を分離し、これらのうち約1308種の食品適合性バチルス菌を中心に、澱粉及びタンパク分解酵素の発現が高い菌株を探した。
本発明者らは、澱粉及びタンパク分解酵素の生成能力が優秀な菌株を分離するために、様々な伝統発酵食品(キムチ、味噌類、酵母、伝統地酒及び塩辛など)から約3000千種の微生物を分離し、これらのうち約1308種の食品適合性バチルス菌を中心に、澱粉及びタンパク分解酵素の発現が高い菌株を探した。
澱粉及びタンパク分解酵素の高生産菌株の選別は、各々1%(w/v)の可溶性澱粉(Difco、USA)または2%(w/v)脱脂乳(Difco、USA)が含有されたYM寒天培地(yeast extract 3.0g、malt extract 3.0g、peptone 5.0g、dextrose 10.0g、agar 20.0g)で基質が分解されて生じる透明環のサイズを比較して選別した。
具体的に、菌株をそれぞれTSB培地(enzymatic digest of casein 17.0g、enzymatic digest of soybean meal 3.0g、NaCl 5.0g、dipotassium phosphate 2.5g、dextrose 2.5g、final pH:7.3±0.2 at 25℃)に接種した後、37℃、200rpmの条件で12時間培養し、培養液を可溶性澱粉及び脱脂乳含有YM寒天培地に1.0μlずつ点滴(spotting)した。前記寒天培地を37℃で16時間培養した後、培地上に形成された透明環の直径を測定した。
その結果、1%(w/v)の可溶性澱粉培地の透明環の直径が5.85mmであり、2%(w/v)脱脂乳(Difco、USA)培地の透明環の直径が6.14mmであり、澱粉及びタンパク分解酵素活性の両方に優秀であるBA245菌株を穀物発酵用の菌株として選別した(図1aおよび1b)。
実施例2:BA245菌株の同定
2−1.BA245菌株における16S rRNA遺伝子の塩基配列分析
実施例1で選別されたBA245菌株を同定するため、16S RNA遺伝子の塩基配列解析を韓国種菌協会付設の韓国微生物保存センターに依頼し、同定に重要な50〜900bpの塩基配列を含む1420bp(配列番号1)の塩基配列を得た。また、この塩基配列は、NCBI GenBankでKR535604のAccession numberを付与されてDBに登録された。
2−1.BA245菌株における16S rRNA遺伝子の塩基配列分析
実施例1で選別されたBA245菌株を同定するため、16S RNA遺伝子の塩基配列解析を韓国種菌協会付設の韓国微生物保存センターに依頼し、同定に重要な50〜900bpの塩基配列を含む1420bp(配列番号1)の塩基配列を得た。また、この塩基配列は、NCBI GenBankでKR535604のAccession numberを付与されてDBに登録された。
2−2.BA245菌株の16S rRNA遺伝子に対する塩基配列分析による系統樹解析
BA245菌株の系統分類学的位置を分析するため、GenBankに登録された塩基配列データを利用して、バチルス属内のBA245菌株と近く位置する多種の標準菌株の16S rRNA遺伝子の塩基配列を調査し、これらの塩基配列をBioedit program(Hall、1999)とClustal X program(Thompson et al.、1997)を利用してアライメントした。菌株の進化過程を追跡する作業は、Kimura two−parameter model(Kimura、1983)を利用し、MEGA 3 Program(Kumar et al.、2004)のneighbor−joining及びmaximum parsimony方法で系統分類学的位置を決定した(図2)。
BA245菌株の系統分類学的位置を分析するため、GenBankに登録された塩基配列データを利用して、バチルス属内のBA245菌株と近く位置する多種の標準菌株の16S rRNA遺伝子の塩基配列を調査し、これらの塩基配列をBioedit program(Hall、1999)とClustal X program(Thompson et al.、1997)を利用してアライメントした。菌株の進化過程を追跡する作業は、Kimura two−parameter model(Kimura、1983)を利用し、MEGA 3 Program(Kumar et al.、2004)のneighbor−joining及びmaximum parsimony方法で系統分類学的位置を決定した(図2)。
2−3.BA245菌株のgyraseA(gyrA)遺伝子の塩基配列による系統樹解析
gyrase A遺伝子の塩基配列に基づいた系統分類学的分析を利用して、BA245菌株を同定した。
gyrase A遺伝子の塩基配列に基づいた系統分類学的分析を利用して、BA245菌株を同定した。
gyrase A遺伝子の塩基配列を分析するため前方プライマー(配列番号2:5’−CAG TCA GGA AAT GCG TAC GTC CTT−3’)と逆方向プライマー(配列番号3:5’−CAA GGT AAT GCT CCA GGC ATT GCT−3’)を作製した後、塩基配列解析を(株)マクロジェンに依頼した。BA245菌株と近く位置する多種の標準菌株のgyrase A遺伝子の塩基配列を調査し、これらの塩基配列をBioedit program(Hall、1999)とClustal X program(Thompson et al.、1997)を利用してアライメントした。菌株の進化過程を追跡する作業は、Kimura two−parameter model(Kimura、1983)を利用し、MEGA 3 Program(Kumar et al.、2004)のneighbor−joiningとmaximum parsimony方法で系統分類学的位置を決定した(図3)。
2−4.API kitを用いたBA245の生化学的特性の分析
バチルスの同定に使用されるAPI 50CH(bioMerieux Co.、France)を用いて、バチルス・アミロリケファシエンスBA245菌株の生化学的特性を調査した。API kitは製造会社の使用指示に従って次のように実施し、その結果を下表1に示した。
バチルスの同定に使用されるAPI 50CH(bioMerieux Co.、France)を用いて、バチルス・アミロリケファシエンスBA245菌株の生化学的特性を調査した。API kitは製造会社の使用指示に従って次のように実施し、その結果を下表1に示した。
バチルス・アミロリケファシエンスBA245菌株をTSB(enzymatic digest of casein 17.0g、enzymatic digest of soybean meal 3.0g、NaCl 5.0g、dipotassium phosphate 2.5g、dextrose 2.5g、final pH:7.3±0.2 at 25℃)液体培地に接種して37℃で培養した後、チューブ(Eppendorf)に分注した後、10,000rpmで5分間遠心分離した後、細胞を回収して、滅菌生理食塩水(0.85%)で1回洗浄した。細胞は滅菌蒸留水で懸濁して無菌的に破ったAPI 50CH培地のアンプルに接種しピペッティングして均等に混ぜた後、各テストストリップのマイクロチューブに150μlずつ分注した。分注を終えた後にAPI kitは、37℃のインキュベーターで24〜48時間培養しながら、色変化を観察した。
前記生化学特性と系統分類学的類縁関係の分析結果をまとめた結果、前記選別されたBA245菌株をバチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)に同定してバチルス・アミロリケファシエンスBA245と命名し、ブダペスト条約に基づいて2015年9月23日に韓国生命工学研究院微生物資源センター(Korean Collection for Type Cultures、KCTC)に寄託し、寄託番号KCTC12905BPを付与された。
実施例3:BA245菌株を用いた穀物発酵物の製造
実施例2で選別したバチルス・アミロリケファシエンスBA245菌株(以下、「BA245菌株」と記載)を利用して、下記の穀物発酵物を製造した。
実施例2で選別したバチルス・アミロリケファシエンスBA245菌株(以下、「BA245菌株」と記載)を利用して、下記の穀物発酵物を製造した。
まず、穀物300g[ふすま;小麦胚芽;麦;玄米;キヌア;レンズ豆;もち大麦;小麦胚芽及びふすまの混合穀物(小麦胚芽60重量%及びふすま40重量%);と全穀物の混合物(小麦胚芽40重量%、ふすま30重量%、オート麦10重量%、レンズ豆大豆5重量%、玄米5重量%、もち大麦5重量%、キヌア5重量%、以下全穀物の混合物は「穀物原料」と記載)をそれぞれ300g]に水分を添加した後、121℃で30分間蒸煮し、40℃以下に冷却した。その後、前記BA245菌株をそれぞれTSB寒天培地(enzymatic digest of casein 17.0g、enzymatic digest of soybean meal 3.0g、NaCl 5.0g、dipotassium phosphate 2.5g、dextrose 2.5g、agar 15.0g、final pH:7.3±0.2 at 25℃)に塗抹し、37℃で12時間培養して菌株を活性化させた。活性化された菌株を0.8%NaCl滅菌溶液9mlに約2白金(A660nmで0.2程度に希釈)を懸濁させ、この懸濁液を種菌として用いた。本培養は、予め用意した40mlのTSB培地(enzymatic digest of casein 17.0g、enzymatic digest of soybean meal 3.0g、NaCl 5.0g、dipotassium phosphate 2.5g、dextrose 2.5g、final pH:7.3±0.2 at 25℃)に種菌懸濁液を1%接種した後、37℃、180rpmで振とう培養した。
水分含量を36%に調整して蒸煮された穀物に、培養液30ml(6.0×107cfu/ml)を入れてよく混合した後、37℃で24時間恒湿が維持される条件で静置培養する固体発酵法により穀物発酵物を製造した。
また、BA245菌株の対照群として、BA245菌株と同種に該当する菌株のバチルス・アミロリケファシエンスBA474(以下、「BA474菌株」と記載)を利用し、前記BA474菌株を用いて発酵した穀物発酵物は全穀物混合物を原料として、BA245菌株の代わりBA474菌株を用いたこと以外は、実施例3と同様に行って製造した。
実施例4:澱粉分解酵素活性の分析
穀物発酵物の澱粉分解酵素の活性を分析するために、下記の実験を行った。
穀物発酵物の澱粉分解酵素の活性を分析するために、下記の実験を行った。
実施例3のBA245菌株とBA245菌株それぞれを利用して発酵した穀物発酵物をそれぞれ60℃の乾燥機で水分含量が10%以下になるまで乾燥した後、粉砕して澱粉分解酵素活性の測定の検体《以下、各穀物発酵物を発酵に用いた菌株によって「BA245発酵物」および「BA474発酵物」と記載し、全穀物混合物(小麦胚芽40重量%、ふすま30重量%、オート麦10重量%、レンズ豆大豆5重量%、玄米5重量%、もち大麦5重量%、キヌア5重量%)を原料として使用した場合のみを原料の記載がない「BA245発酵物」と記載し、これ以外の各々の穀物または小麦胚芽及びふすまの混合穀物を原料と使用した場合には「BA245発酵物」の後段の括弧内に発酵に使用した原料を表示して記載》で用いた。澱粉分解酵素活性は、韓国食品公典「食品の基準及び規格」内の酵素食品α−アミラーゼ試験法に基づいて測定した。
具体的に、各々の検体5.0gを精密に量り、水に溶解させて100mlとした後、ろ過して検液とし、20ml試験管2本を用意して、それぞれ試験用と空試験用の試験管で使用した。試験用の試験管には1%の可溶性澱粉溶液5ml、マッキルベイン緩衝液(pH 6.0)13mlと0.1%塩化カルシウム溶液1mlを入れ37℃に加温し、検液1mlを入れた後に37℃で30分間放置して試験用反応液を製造した。これと別に、100℃で30分間加熱して活性を失った検液1mlを試験用と同様に操作して空試験用反応液を製造した。前記試験用と空試験用反応液0.2mlにヨウ素試液10mlを入れたものを試験溶液とし、水を対照液として、液層1cmの波長660nmにおける吸光度を測定した。この時、試験溶液の吸光度は空試験の吸光度よりも0.030以上低い必要がある。発色の程度が過度であって測定が困難な場合には、検液を希釈して試験し、希釈倍数を適用した。澱粉含量は、前記と同じヨウ素(I2)溶液の呈色による標準曲線で算出し、α−アミラーゼ1Unitは30分間、10mgの澱粉を消化する酵素の量で定義した。
実施例5:タンパク分解酵素活性の分析
BA254発酵物のタンパク分解酵素活性を比較するために、下記の実験を行った。
BA254発酵物のタンパク分解酵素活性を比較するために、下記の実験を行った。
実施例3の検体を得た後、「食品の基準及び規格」内の酵素食品プロテアーゼ試験法に基づいて測定した。
検体約5gを精密に量り、水に溶解させて100mlとした後、ろ過して検液とした。0.6%カゼイン溶液1mlを試験管に入れて37℃の恒温水浴中で加温した後、ここに検液1mlを正確に入れてよく振り混ぜた後、すぐ37℃の恒温水浴中に入れてちょうど10分間反応させた後、ここに0.4M三塩化酢酸液2mlを入れて再び37℃で25分間放置した後でろ過した。ろ過液1mlを試験管に取り、0.4M炭酸ナトリウム溶液5mlとフォリン試液(原液を3倍希釈した液)1mlを入れてよく振り混ぜた。37℃で20分間放置した後、発色した液を試験溶液とした。これと別に、検液1mlを取り試験管に入れて37℃で10分間放置した後、0.4M三塩化酢酸液2mlを入れ混和し、0.6%カゼイン溶液1mlを入れて37℃で25分間放置した後の試験溶液と同様に操作して空試験溶液とした。水を対照液として、液層1cmの波長660nmにおける吸光度を測定した。この時、試験溶液の吸光度は空試験溶液の吸光度よりも0.030以上高い必要がある。発色の程度が過度であって測定が困難な場合は、検液を希釈して試験し、希釈倍数を適用した。標準曲線は、チロシン(tyrosine)を利用して作成し、プロテアーゼ活性は測定したチロシン含量を基準に比較分析し、プロテアーゼ1Unitは1分間に生成されるチロシンのugで定義した。
前記実施例3と実施例4の結果から、発酵力価の高い穀物発酵物を含む酵素食品製造においてBA245の有用な利用が可能であることを確認した。
実施例6:低分子量タンパク質含量の分析
実施例4のBA245を利用して、穀物発酵時におけるタンパク分解酵素が優秀である穀物発酵物の製造ができることを確認したところ、穀物内のタンパク質が加水分解されたペプチドの形態で生成されるか、低分子量のタンパク質に分解されるかを確認するため、BA245発酵物の分子量範囲別タンパク質含量を分析した。
実施例4のBA245を利用して、穀物発酵時におけるタンパク分解酵素が優秀である穀物発酵物の製造ができることを確認したところ、穀物内のタンパク質が加水分解されたペプチドの形態で生成されるか、低分子量のタンパク質に分解されるかを確認するため、BA245発酵物の分子量範囲別タンパク質含量を分析した。
前記実施例3の検体0.1gを精密に量り、5mlの8MのUreaで抽出した。8,000rpmで10分間遠心分離した後、上澄み液だけを取って0.22μmシリンジフィルターでろ過して分析試料とした。注入(injection)ボリュームは25ulであり、50mMのNaPO4(pH7.2)に150mMのNaClを混合して移動相(mobile phase)で用いた。流速は0.5ml/minで、214nmのUV波長で検出(detection)した。
その結果、BA245発酵物は、穀物原料及びBA474発酵物に比べて、サイズの小さいタンパク質分子側のピーク面積が大きく、タンパク質の密度が中央バンドの方に偏っていることを確認した(図4)。図4のクロマトグラフィー上で左バンドが分子量の高いタンパク質であり、中央のバンドが分子量の低いタンパク質であり、右側のバンドは溶媒を表す。図4のクロマトグラフィーを数値化して比較した結果は下記の表4に示す。
実施例7:栄養成分の分析
BA245菌株を利用した穀物発酵時において、炭水化物の含量が減少と食物繊維の含量が増加、粗タンパク及び必須遊離アミノ酸の含量の増加により、栄養成分量及び栄養素吸収率が増加するかを確認するため、穀物原料、BA245発酵物、BA474発酵物及び市販の3社の穀物を発酵した酵素食品[発酵酵素は秘密、デサン(大象)ウェルライフ(以下、「デサン」と記載);種子発酵酵素、LG生活健康(以下、「LG」と記載);フルビタ−ネモメ穀類酵素ダイジェスト、オルガホールフード(以下、「プルムウォン」と記載)]に対して、韓国機能食品研究院に依頼して栄養成分を分析した。
BA245菌株を利用した穀物発酵時において、炭水化物の含量が減少と食物繊維の含量が増加、粗タンパク及び必須遊離アミノ酸の含量の増加により、栄養成分量及び栄養素吸収率が増加するかを確認するため、穀物原料、BA245発酵物、BA474発酵物及び市販の3社の穀物を発酵した酵素食品[発酵酵素は秘密、デサン(大象)ウェルライフ(以下、「デサン」と記載);種子発酵酵素、LG生活健康(以下、「LG」と記載);フルビタ−ネモメ穀類酵素ダイジェスト、オルガホールフード(以下、「プルムウォン」と記載)]に対して、韓国機能食品研究院に依頼して栄養成分を分析した。
実施例8:フィブリン分解酵素(fibrinolytic enzyme)の活性分析
BA245発酵物の血栓分解活性を確認するために、穀物原料及びBA245発酵物のフィブリン分解酵素の活性を測定した。対照群として、プラスミン(plasmin、1U/ml)および血栓溶解活性を有することが報告された清麹醤(テグァン社)、納豆(プルムウォン、あづま及びタカノ)と市販の酵素食品(デサン;ハイセン、(株)ハイモ自然健康事業部)を用いた。
BA245発酵物の血栓分解活性を確認するために、穀物原料及びBA245発酵物のフィブリン分解酵素の活性を測定した。対照群として、プラスミン(plasmin、1U/ml)および血栓溶解活性を有することが報告された清麹醤(テグァン社)、納豆(プルムウォン、あづま及びタカノ)と市販の酵素食品(デサン;ハイセン、(株)ハイモ自然健康事業部)を用いた。
試料1gを9mlの滅菌生理食塩水に混合した後、攪拌機(Wiseshaker、Daihan)を用いて、4℃で30分間混合しながら抽出し、遠心分離(8000g、4℃、30分)した後、ろ過して上澄み液を分析試料として利用した。
8−1.フィブリンプレート分析(Fibrin plate assay)
完全に溶解された2.4%フィブリン溶液(pH7.0)10mlに、1.5%アガロース溶液10mLを添加して混合した後、すぐにペトリ皿に注いて、ゲルが完全に固まるまで室温で2〜3時間放置しフィブリンプレートを製造した。製造されたフィブリンプレートに直径4.5mmの穴を一定にパンチングした後、分析試料20μlを各々の穴に滴加して37℃で24時間培養した。生成された透明環のサイズを鮮明に見ることができるように0.11M三塩化酢酸をフィブリンゲルに注いだ。
完全に溶解された2.4%フィブリン溶液(pH7.0)10mlに、1.5%アガロース溶液10mLを添加して混合した後、すぐにペトリ皿に注いて、ゲルが完全に固まるまで室温で2〜3時間放置しフィブリンプレートを製造した。製造されたフィブリンプレートに直径4.5mmの穴を一定にパンチングした後、分析試料20μlを各々の穴に滴加して37℃で24時間培養した。生成された透明環のサイズを鮮明に見ることができるように0.11M三塩化酢酸をフィブリンゲルに注いだ。
その結果、BA245発酵物がプラスミンに比べて220%の血栓分解活性を示し、清麹醤に比べて177%、納豆に比べて各々122%(プルムウォン)、117%(タカノ)、131%(あづま)、酵素食品に比べては119%(デサン)及び142%(ハイセン)の血栓分解活性を示すことを確認した(表7および図5)。
実施例8で製造された試料0.1mlに10mM塩化カルシウムを含有した0.1M Tris−HCl緩衝液(pH7.8)0.3mlを入れて、30℃の恒温水浴で5分間加温した。この溶液に1.2%フィブリン溶液(pH7.8)0.3mlを添加して混合した後、30℃で10分間反応させた後、0.11M三塩化酢酸液0.6mlを入れ酵素反応を抑制させて試験溶液とした。これとは別に、試料0.1mlに0.1M Tris−HCl緩衝液(pH7.8)0.3mlに入れ、30℃の恒温水浴槽で10分間反応させた後、0.11M三塩化酢酸液0.6mlを入れ混和し、1.2%フィブリン溶液(pH7.8)0.3mlを入れて空試験溶液とした。試験溶液と空試験溶液は、遠心分離(12000rpm、5分)後の上澄み液を回収し、275nmにおける吸光度を測定して血栓分解酵素の活性を定量的に比較した。
その結果、BA245で発効発酵した穀物発酵物内のフィブリン分解活性が最も優秀であるとともに、納豆に比べても著しく高いことを確認した(表8及び図6)。
その結果、表9で示すように、BA245菌株の血栓分解酵素活性が市販納豆から分離した菌株と比較して著しく優秀であることを確認した。
8週齢の雄SD(Sprague−dawley)ラットを各実験群別に10匹ずつ配置し、すべての動物を1週間の実験食餌及び環境に適応させた。適応後、胃排出能を測定するために、水は自由に飲ませて放置しながら20時間絶食させた。
実験例1は、同じ固形分を給与した条件で同一時間当たりの胃排出能を評価した。具体的には、実験当日SDラットに硫酸バリウム50%、アガロース0.6%、飼料(AIN−93、Dyets)が水に懸濁された実験食餌3gを経口投与した。実験群は総3群であり、対照群には飼料15%を給与し、実験群には穀物原料5%+飼料10%、BA245発酵物5%+飼料10%が配合された食餌を給与し、給与した固形分は同量であった。投与40分後に胃を摘出して、胃内に残っている食餌の重量を測定して胃排出能(%)を評価した。
実験例2は、実際の人体の服用法を反映したモデルであり、同じ飼料量を供給してBA245発酵物を追加給与したときにおける胃排出能の改善を評価し、この時、ヒト等価用量(human equivalent dose)は、ラット基準の6倍を適用した。対照区には飼料15%を給与し、実験群は穀物原料600mg/kg、BA245発酵物600 mg/kgをそれぞれ追加給与した。実験例1と同様に投与40分後に胃を摘出して胃内に残っている食餌の重量を測定して、胃排出能(%)を評価した。
その結果、実験例1でBA245発酵物を投与し時に、飼料のみ給与群及び穀物原料給与群に比べて、有意な胃排出能の増加(p<0.05)を確認し(表10)、実験例2でも穀物原料給与群に比べ有意的な胃排出能の増加(p<0.05)を確認した(表11)。
胃排出能は、臨床的に機能性消化不良で低下する因子として知られているので、食餌と共にBA245発酵物を摂取すれば消化能力が改善されると評価できる。
ラットにアルコールを投与して急性腸炎の動物モデルを作製し、摂取濃度の異なるBA245発酵物を食餌させ、摂取量に応じた腸機能の回復程度を測定した。
動物は、8週齢、200〜250gの体重のSDラットであり、ポリカーボネートケージで12時間ごとに変わる明/暗サイクル下で飼育した。1週間の適応期間の後、自由食餌と共に実験デザインに従って処理した。
グループ1:対照群
グループ2:エタノール
グループ3:エタノール+BA245発酵物50mg/kg/day
グループ4:エタノール+BA245発酵物100mg/kg/day
グループ5:エタノール+BA245発酵物150mg/kg/day
グループ6:エタノール+穀物原料100mg/kg/day
グループ2ないし6は、4週間アルコールを経口投与して、過敏性腸症候群を誘導し、腸機能の低下を誘発した。初期投与量は2g/kg/dayである。この時、経口投与するアルコールの量は、毎週1g/kg/dayずつ増加して、最後の4週目には5g/kg/dayを経口投与した。4週経過後の腸透過性を測定した。
グループ2:エタノール
グループ3:エタノール+BA245発酵物50mg/kg/day
グループ4:エタノール+BA245発酵物100mg/kg/day
グループ5:エタノール+BA245発酵物150mg/kg/day
グループ6:エタノール+穀物原料100mg/kg/day
グループ2ないし6は、4週間アルコールを経口投与して、過敏性腸症候群を誘導し、腸機能の低下を誘発した。初期投与量は2g/kg/dayである。この時、経口投与するアルコールの量は、毎週1g/kg/dayずつ増加して、最後の4週目には5g/kg/dayを経口投与した。4週経過後の腸透過性を測定した。
具体的に、腸透過性の測定はラットを犠牲死させた後に分離した回腸をKrebs−Henseleitバイカーボネートバッファー(KHBB:bicarbonate buffer)に浸した後に腸の一端を縫合し、100μlのFITC−dextranをルーメン(lumen)に注入した。腸の他端を縫合して8cmの腸管(gut sac)を形成した。KHBBで洗浄した後、腸管を2mLのKHBBに置いて、37℃で20分間インキュベーションした。ルーメンからインキュベーションバッファーに通過されたFITC−dextranのFD−4は、分光光度計(spectrophotometer)を用いて530nmで測定した。FD−4の透過性は、1分当たり1cmにおけるμgで表す。
その結果、BA245発酵物給与により、アルコール投与で増加された腸透過性の有意な減少を確認し、特に体重1kg当たり100mg以上投与した群では正常群に近い回復を確認した(図7)。
実施例11:急性腸炎症の動物モデルを用いたBA245発酵物摂取による腸膜強化の分析
腸膜が弱化して漿液が漏れ出るようになると漿液性炎(Serous inflammation)を誘発する。実施例10で作製した動物モデルを利用し、アルコールのせいで増加された腸透過性の回復程度を定量的に測定するために、腸透過性に関与する腸細胞の密着結合タンパク質(tight junction protein)の分析を行った。腸膜の細胞結合に関与する主要な密着結合タンパク質には、代表的にZO−1、クローディン(claudin)、オクルディン(occluding)があり、qRT−PCR解析により各タンパク質に対応する遺伝子の発現程度を測定し、腸細胞間の結合程度を確認して、発酵物摂取の効果を確認した。RNA抽出時のトリゾールを利用し、濃度はナノドロップ分光光度計(nanodrop spectrophotometer)を用いて測定した。
腸膜が弱化して漿液が漏れ出るようになると漿液性炎(Serous inflammation)を誘発する。実施例10で作製した動物モデルを利用し、アルコールのせいで増加された腸透過性の回復程度を定量的に測定するために、腸透過性に関与する腸細胞の密着結合タンパク質(tight junction protein)の分析を行った。腸膜の細胞結合に関与する主要な密着結合タンパク質には、代表的にZO−1、クローディン(claudin)、オクルディン(occluding)があり、qRT−PCR解析により各タンパク質に対応する遺伝子の発現程度を測定し、腸細胞間の結合程度を確認して、発酵物摂取の効果を確認した。RNA抽出時のトリゾールを利用し、濃度はナノドロップ分光光度計(nanodrop spectrophotometer)を用いて測定した。
その結果、BA245発酵物投与および給与濃度に比例して、クローディンとオクルディンの発現が増加し、腸膜が強化されることを確認した(p<0.05)(図8Aおよび8B)。
実施例12:腸の組織学的分析を用いて、BA245発酵物の摂取による構造損傷の緩和程度を評価
実施例10で作製した動物モデルを利用し、腸の組織学的検査を行った。各グループからサンプリングした腸組織を10%ホルマリン溶液に固定してエタノールで脱水を行った後、パラフィンで固定した。4μmの厚肉断面(thick section)にヘマトキシリン‐エオジン(hematoxylin−Eosin)染色を行い、染色された各々の切片は顕微鏡で観察した。
実施例10で作製した動物モデルを利用し、腸の組織学的検査を行った。各グループからサンプリングした腸組織を10%ホルマリン溶液に固定してエタノールで脱水を行った後、パラフィンで固定した。4μmの厚肉断面(thick section)にヘマトキシリン‐エオジン(hematoxylin−Eosin)染色を行い、染色された各々の切片は顕微鏡で観察した。
アルコールによって腸損傷が進むと、腸壁の陰窩(crypt)と絨毛(villus)の構造が崩れることを確認でき、BA245発酵物の摂取群、特に体重1kg当たり100mg以上の摂取群で正常組織に近く回復した様子を観察した(図9)。
実施例13:BA245発酵物の抗酸化活性の測定
抗酸化活性は酸化ストレスによって発病される様々な疾病(脂質と酸化物の蓄積防止、酵素の不活性化、細胞老化、動脈硬化、糖尿病、脳卒中、癌、DNA合成の減少、成人病及び老化など)を制御すると知られている。それで、穀物原料、BA245発酵物及び市販の酵素食品2種(デサンとハイセン)を比較した。
抗酸化活性は酸化ストレスによって発病される様々な疾病(脂質と酸化物の蓄積防止、酵素の不活性化、細胞老化、動脈硬化、糖尿病、脳卒中、癌、DNA合成の減少、成人病及び老化など)を制御すると知られている。それで、穀物原料、BA245発酵物及び市販の酵素食品2種(デサンとハイセン)を比較した。
具体的に、試料:70%エタノールを1:9の割合で混合した後、攪拌機(Wiseshaker、Daihan)を用いて30℃で3時間混合しながら抽出した。該当混合物は、遠心分離(8000g、4℃、10分)の後に上澄み液を各々回収し、同一過程を繰り返して抽出した後、最終的に回収した上澄み液をろ過した。ろ過された上澄み液は凍結乾燥機を使用して溶媒を完全に乾燥した後、乾燥物を分析試料として用いた。
試料10mgは70%エタノール1mlに完全に溶解させ試験液で使用した。ABTS溶液は38.5mgのABTSと6.6mgのペルオキソ二硫酸カリウム(Potassium persulfate)をそれぞれ5mlの蒸留水に溶解させて混合した後、暗室条件で12〜16時間反応させてラジカルを生成させた。その後、734nmにおける吸光度を0.7±0.02に調整しABTS溶液を製造した。
10ul試験液に990ulのABTS溶液を入れて混合した後、暗室で10分間反応させた後、734nmにおける吸光度を測定した。すべての実験は3回以上繰り返してテストした後に平均値と標準偏差を求めた。
その結果、BA245発酵物の自由ラジカル除去能が43.7%であり、穀物原料と市販の酵素食品に比べて著しく高いことを確認した(図10)。これにより、BA245菌株を利用した発酵により、抗酸化活性が増加することと、従来の酵素食品2種に比べても抗酸化活性が優秀であることがわかった。
Claims (25)
- 寄託番号KCTC12905BPで寄託されたバチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)BA245菌株。
- 下記のステップを備える穀物発酵物の製造方法:
(a)穀物に寄託番号KCTC12905BPのバチルス・アミロリケファシエンスBA245菌株を接種するステップ;及び
(b)前記菌株を培養して穀物発酵物を得るステップ。 - 前記ステップ(a)の穀物は、小麦、小麦胚芽、ふすま、白米、玄米、発芽玄米、大麦、オート麦、赤米、黒もち米、もち米、米ぬか、大豆、鼠目太、黒豆、キヌア、レンズ豆及びハトムギで構成された群より選択される一つ以上の穀物を含む、請求項2に記載の穀物発酵物の製造方法。
- 前記ステップ(a)の穀物は、小麦胚芽及びふすまを含む、請求項2に記載の穀物発酵物の製造方法。
- 前記小麦胚芽及びふすまは、ステップ(a)の穀物100重量部に対して40重量部〜100重量部であることを特徴とする、請求項4に記載の穀物発酵物の製造方法。
- 前記ステップ(a)の穀物は、オート麦、レンズ豆、玄米、もち大麦及びキヌアで構成された群より選択される一つ以上の穀物をさらに含む、請求項4に記載の穀物発酵物の製造方法。
- 前記ステップ(a)の穀物の水分含量は30%(v/w)〜70%(v/w)であることを特徴とする、請求項2に記載の穀物発酵物の製造方法。
- 前記ステップ(a)の前で、穀物に水分処理するステップをさらに備える、請求項2に記載の穀物発酵物の製造方法。
- 前記ステップ(a)の前で、穀物に熱処理するステップをさらに備える、請求項2に記載の穀物発酵物の製造方法。
- 前記ステップ(a)の前で、穀物に水分処理した後に熱処理するステップをさらに備える、請求項2に記載の穀物発酵物の製造方法。
- 前記ステップ(b)の培養は固体培養であることを特徴とする、請求項2に記載の穀物発酵物の製造方法。
- 前記ステップ(b)の培養温度は20℃〜50℃であることを特徴とする、請求項2に記載の穀物発酵物の製造方法。
- 寄託番号KCTC12905BPで寄託されたバチルス・アミロリケファシエンスBA245菌株を含む穀物発酵物。
- 前記穀物発酵物は、請求項2に記載の方法により製造されたことを特徴とする、請求項13に記載の穀物発酵物。
- 請求項1に記載のバチルス・アミロリケファシエンスBA245菌株又は請求項13に記載の穀物発酵物を含む食品組成物。
- 前記食品組成物は、酵素食品であることを特徴とする、請求項15に記載の組成物。
- 請求項1に記載のバチルス・アミロリケファシエンスBA245菌株又は請求項13に記載の穀物発酵物を含む血栓分解用組成物。
- 請求項17に記載の血栓分解用組成物は、心筋梗塞、脈血栓症、脳卒中、脳梗塞、脳血栓症、または脳塞栓症の予防、改善または治療用である、血栓分解用組成物。
- 請求項1に記載のバチルス・アミロリケファシエンスBA245菌株又は請求項13に記載の穀物発酵物を含む消化改善用の組成物。
- 請求項1に記載のバチルス・アミロリケファシエンスBA245菌株又は請求項13に記載の穀物発酵物を含む、腸炎症、腸膜の弱化または腸損傷の予防、改善または治療用の組成物。
- 請求項1に記載のバチルス・アミロリケファシエンスBA245菌株又は請求項13に記載の穀物発酵物を含む、抗酸化用組成物。
- 請求項13に記載の穀物発酵物を、前記穀物発酵物が必要な被験者(subject)に投与するステップを備える、被験者の心筋梗塞、脈血栓症、脳卒中、脳梗塞、脳血栓症、または脳塞栓症を予防、改善または治療する方法。
- 請求項13に記載の穀物発酵物を前記穀物発酵物が必要な被験者(subject)に投与するステップを備える、被験者の消化機能を改善する方法。
- 請求項13に記載の穀物発酵物を前記穀物発酵物が必要な被験者に投与するステップを備える、腸炎症、腸膜の弱化または腸損傷を予防、改善または治療する方法。
- 請求項13に記載の穀物発酵物を前記穀物発酵物が必要な被験者に投与するステップを備える、被験者における活性酸素を減少する方法。
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